CN1856317B - 常春藤叶提取物的制备方法以及用这种方法制备的提取物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种制备包含活性成分常春藤苷C和α-常春藤素的常春藤叶提取物的方法以及用这种方法制备的提取物。根据这种方法，首先提供第一种富含α-常春藤素的提取物，然后提供第二种富含常春藤苷C的提取物。在最后一步，将这两种提取物进行混合，产生一种具有设定的常春藤苷C含量和设定的α-常春藤素含量的提取物。

Description

常春藤叶提取物的制备方法以及用这种方法制备的提取物

本发明涉及从常春藤叶制备提取物的方法，以及用这种方法制备的提取物。

目前，常春藤叶提取物已特别成功地用于治疗呼吸道疾病，因为该提取物显示出解痉、祛痰及抗阻塞的作用。这些作用特别归因于常春藤叶提取物的重要治疗性成分，该成分属于三萜皂草苷类。

其中的主要皂草苷为双糖链(bidesmosidic)常春藤苷C(hederacoside C)和α-常春藤素，后者由前者通过酯水解而形成。已检测出的另一种皂草苷为常春藤苷配基。

因为提取物可由常春藤叶通过多种方法而得到，因此这些提取物经常显示出不同的作用强度。这源于如下事实：成分的含量不但取决于天然组分，同时也取决于制备提取物所用的具体方法。

申请人近期的研究表明，α-常春藤素可能是常春藤叶中真正的活性成分，有助于支气管解痉，因为这种物质通过与β-肾上腺素能受体的结合使平滑肌松弛从而诱导级联反应。

来自于植物材料的提取物，特别是干提取物，以及制备这样的提取物的方法，在药学和药物制剂领域有很多描述。

一种从植物材料制备干提取物的方法在例如DE 101 12 168 A1中进行了公开。使用该公开内容中的方法，据说可能调节亲脂和亲水物质的含量。在该文中，植物材料用不同亲脂性的溶剂至少提取两次，分别获得提取物。将提取物彼此独立地干燥，然后按所需比例混合。通过这种方法，可能调节亲脂和亲水物质的含量。据说这种方法还适合于获得常春藤(Hederahelix)的干提取物。

但是，该公开的内容既没有提供一种调节过的、有特定α-常春藤素和/或常春藤苷C含量的提取物，也没有提供制备这样的提取物的方法。

此外，DE 30 25 223 A1公开了基于常春藤提取物的药物制剂以及制备它们的方法，所述制剂中含有作为活性成分的90％或60％含量的含常春藤皂草苷C的提取物或α-常春藤素。该提取物用丙酮和甲醇获得。为了将常春藤皂草苷C或常春藤苷C转化为α-常春藤素以由此得到仅含有α-常春藤素的提取物，在上述申请中，90％的提取物用氢氧化钠或氢氧化钾进行了水解。

但在该申请中也没有公开其中α-常春藤素和常春藤皂草苷C的含量可以根据需要进行调节的提取物的制备方法。

但是，为了保证有可再现的治疗作用，非常需要具有可确定的活性成分含量的常春藤提取物。

目前使用的提取物的更进一步的不足之处是必须给药超过一次，以便产生α-常春藤素速效和持续性的支气管解痉作用。其原因可能是α-常春藤素的生物利用度不够高，例如，提取物中α-常春藤素的含量在开始摄入时太低。另一方面，原本存在于提取物中的α-常春藤素在体内吸收相对较快，使得为了达到治疗效果需要进行多次给药。

鉴于以上陈述，本发明的目的是提供一种制备提取物的方法，以及可以保证α-常春藤素有快速的生物利用度并在长时间内维持该生物利用度的提取物。

本发明的目的通过这样的方式实现：从常春藤叶制备一种提取物，该提取物含有可调节含量的常春藤苷C和α-常春藤素，其中的方法包含下列的步骤：

a)提供第一种富含α-常春藤素的提取物；

b)提供第二种富含常春藤苷C的提取物；

c)将第一种和第二种提取物进行混合以得到一种提取物，该提取物含有经调节的常春藤苷C含量和经调节的α-常春藤素含量。

使用本发明的这种方法，可获得这样一种提取物，其一方面含有α-常春藤素这样的速效物质，另一方面含有常春藤苷C这样的在体内可以转化成α-常春藤素的物质。而且，第一种提取物包含α-常春藤素，第二种提取物包含常春藤苷C，二者均以富集的形式存在。

第一种提取物可以通过如下方法用起始材料例如干药草进行制备：先进行粉碎，再进行发酵，然后预溶胀并在例如醇/水混合物如30％的乙醇中进行提取。最后，有可能进行薄膜蒸发和喷雾干燥。根据期望的α-常春藤素的含量，可将全部的药草进行发酵，用这种方法，在起始植物材料中的所有常春藤苷C均被转变成α-常春藤素。另一方面，也可以只对部分起始植物材料进行发酵，要混合的其余部分只在乙醇中预溶胀，从而使α-常春藤素仅仅以高度富集的形式存在。

在这里，“发酵”表示：通过向初始物质中加入发酵介质、例如水，并对具体参数如时间和温度进行调整以适于发酵过程，而使初始物质中存在的成分分解或转化为其它物质。该新的发酵步骤使得特定地制备富含α-常春藤素的提取物成为可能。

在本发明中，常春藤叶可以干药草的形式使用。干药草在药物制剂中的优点在于，在一些情况下它们易于保存，因为它们的稳定性比新鲜的药草要好。但是，使用新鲜的常春藤叶进行提取并没有排除在本发明之外。

在制药工艺学领域，干燥的药用植物和药用植物的各部分被称为“药草”。在本文中，作为“药草”存在的这些药用植物以原形或粉碎形式使用。

第二种提取物可以通过例如如下方法制备：将干燥的药草切割后立即与提取剂，例如30％的乙醇混合，然后用常规的方法提取。或者，在用乙醇进行提取前，将粉碎的药草用过热的蒸汽蒸一下。本发明人的实验已经表明，与初期的含量相比，通过这种处理可能增加提取物中常春藤苷C的含量或使之稳定，同时α-常春藤素的含量可以降低。在这些方法中，可以获得本发明方法的步骤b)中的富含常春藤苷C的第二种提取物。这种新的蒸汽处理步骤使得特定地制备富含常春藤苷C的提取物成为可能。

此外，在该方法中特别优选步骤a)中的富含α-常春藤素的提取物具有至少3％、特别是5％的α-常春藤素含量。

进一步优选步骤b)中的富含常春藤苷C的提取物至少含有5％的常春藤苷C，特别优选至少含有10％的常春藤苷C并且α-常春藤素的含量低于2％。

此外，在该方法中还优选步骤c)中获得的提取物的常春藤苷C的含量为约3％至10％，特别优选6.5％，并且α-常春藤素的含量为约1％至7％，特别优选4.0％。

本发明的目的还可以通过用本发明的方法所制备的提取物来实现。具体地讲，本发明的目的可以通过用本发明的方法从常春藤叶制备的提取物来实现，所述提取物含有约3％至10％、特别是约6.5％的经调节的常春藤苷C含量，并含有约1％至7％、特别是约4.0％的经调节的α-常春藤素含量。

由于所述活性成分的含量经过了调节，因此本发明的提取物具有这样的优点，即，提取物在使用后，活性成分α-常春藤素最初迅速地以存在于提取物中的α-常春藤素的形式被吸收。然后，提取物中所含的除了α-常春藤素之外的常春藤苷C在一时滞后在体内被吸收，并逐渐转化为α-常春藤素，所以当原先存在的α-常春藤素用完后，从常春藤苷C转化过来的α-常春藤素仍然存在。这就有利地保证了提取物或包含提取物的药物有较长的治疗作用时间。

本发明人在他们的实验中验证了这种方法。他们证实，可以使用其中α-常春藤和常春藤苷C活性成分的含量已被调节至上述最佳范围内的本发明的提取物来达到水平的迅速升高并维持一个恒定的浓度。具有较高的常春藤苷C含量和较低的α-常春藤素含量的参比提取物，为了达到与本发明提取物相当的浓度水平，必须有更高的给药频率。所以，使用新的提取物，甚至单剂量给药就可达到支气管解痉所需的α-常春藤素浓度。

在本文中，特别优选根据本发明的方法制备的、其常春藤苷C的含量约为6.5％，α-常春藤素的含量约为4.0％的提取物。

本发明还涉及本发明的提取物用于制备药物、特别是用于治疗呼吸道疾病的药物的用途以及包含本发明提取物的药物。

具有经调节的常春藤苷C含量和α-常春藤素含量的本发明提取物，在作为药物使用时具有特别的优点，因为可用它们获得可再现的治疗作用，除此之外，还可以迅速提供具有支气管解痉活性的活性成分α-常春藤素并在长时间内保持恒定地提供该活性成分。

所以，本发明的药物可以用于治疗呼吸系统疾病，如感染性炎症性呼吸系统疾病如肺炎、气管炎、支气管炎等等。但也用于阻塞性和限制性肺部疾病如慢性支气管炎、支气管哮喘、支气管扩张等等，即用于需要松弛平滑肌的呼吸系统疾病。

在本文中，药物可以以胶囊剂、片剂、包衣片剂、栓剂、颗粒剂、粉剂、溶液剂、乳膏剂、乳剂、气雾剂、软膏剂及油的形式存在。在本文中，特别优选口服给药的剂型。在本文中，药物可包含药物制备中常规使用的赋形剂。例如在A.Kibbe的《药用赋形剂手册》(Handbook ofPharmaceutical Excipients，第3版，2000，American PharmaceuticalAssociation and Pharmaceutical Press)中可发现大量适宜的物质。

从实施例和附图中可以了解到更多的优点，其中：图1显示了常春藤苷C到α-常春藤素的水解过程

可以理解：上文提到的并且在下文中仍将进行解释的各个特征不仅可以以所示的特定组合进行应用，而且还可以以其它组合或它们本身进行应用而不背离本发明的范围。

实施例

1.常春藤叶成分的体内吸收特性(大鼠)

用生物药学分类系统(BCS)进行的吸收研究表明，α-常春藤素有中等程度的吸收(10-90％)。在同样的条件下，常春藤苷则C无法透过膜，因此，需要研究常春藤苷C是否能以α-常春藤素的形式被吸收。为此，进行了大鼠的吸收研究。

随后对两种不同提取物的给药对α-常春藤素血浆药物浓度的影响进行了研究。对于提取物单次和多次给药后血浆中α-常春藤素在不同时间取血点的浓度变化进行了比较，也比较了α-常春藤素的吸收率。所选择的两种提取物的皂草苷分布列于下表1中：

表1.提取物中皂草苷的分布

	常春藤苷C含量[％]	α-常春藤素含量[％]
			提取物A	14.5	0.9
提取物B	6.5	4.0

对于静脉注射而言，将所需量的提取物溶解在11％(m/m)的乙醇中，过滤，注射。给药体积为2ml提取物溶液(给药剂量为25毫克/千克体重)。给药后5分钟取血样。每个样品取约2ml全血，加入乙二胺四乙酸以抗凝。

制备提取物在甘油中的混悬液，用于口服给药。动物灌胃给药约2ml这些混悬液(给药剂量为1000和166.66毫克/千克体重)。每只动物在最后一次给药后1和3小时取2ml血。动物的平均体重约为200克，血容量约为20ml。

分析的结果列于下表2中：

表2.给药/α-常春藤素血浆浓度的总结

样品类型	给药方式	给药的提取物	给药剂量[mg/kg]	取血样时间	α-常春藤素血浆浓度[μg/ml]
						空白样品	无	-	-	-	0.0
参比样品	静脉注射	A	25	给药后5分钟	2.3
						样品	口服单次给药	A	1000	给药后1小时	3.3
样品	口服单次给药	A	1000	给药后3小时	6.3
						样品	口服3天，每天2次	A	166.66	最后一次给药后1小时	20.8
参比样品	静脉注射	B	25	给药后5分钟	10.0
						样品	口服单次给药	B	1000	给药后1小时	11.1
样品	口服单次给药	B	1000	给药后3小时	14.4
						样品	口服3天，每天2次	B	166.66	最后一次给药后1小时	14.9

在任何样品中都没有可检测浓度的常春藤苷C。从上表2可以看出，低α-常春藤素含量的提取物多次给药后所测得的α-常春藤素的血浆浓度，比类似给药的富含α-常春藤素的提取物的血浆浓度要高。这一结果可以通过重新计算来解释，重新计算的结果见下表3：

表3：提取物A(14.5％的常春藤苷C和0.9％的α-常春藤素)给药后的吸收率

给药方式/血样抽取	α-常春藤素血浆浓度[μg/ml]	最大可达到的浓度(理论值)	吸收率[％]	最大可达到的血液浓度，考虑总的皂草苷含量[μg/ml]	吸收率[％]
						单次给药/给药后1小时	3.3	90	3.7	980	0.33
单次给药/给药后3小时	6.3	90	7.0	980	0.64
						多次给药/给药后1小时	20.8	90	23.1	980	2.12

总的皂草苷含量考虑了两种成分的摩尔质量，以α-常春藤素计。提取物A中皂草苷总含量为9.8％，以α-常春藤素计。假定血容量为20ml。

提取物B的计算结果见下表4：

表4：提取物B(6.5％的常春藤苷C和4.0％的α-常春藤素)给药后的吸收率

给药方式/血样抽取	α-常春藤素血浆浓度[μg/ml]	最大可达到的浓度(理论值)	吸收率[％]	最大可达到的血液浓度，考虑总的皂草苷含量[μg/ml]	吸收率[％]
						单次给药/给药后1小时	11.1	400	2.8	800	1.38
单次给药/给药后3小时	14.4	400	3.6	800	1.80
						多次给药/给药后1小时	14.9	400	3.7	800	1.86

总的皂草苷含量考虑了两种成分的摩尔质量，以α-常春藤素计。提取物B中皂草苷总含量为9.8％，以α-常春藤素计。假定血容量为20ml。

总之，可以说富含α-常春藤素的提取物和含α-常春藤素较少的提取物的多次给药产生了可比的α-常春藤素血浆浓度。但是，如果将这两种提取物中的常春藤苷C含量考虑在内并且测定两种皂草苷的总含量，折算成α-常春藤素后，这两种提取物只有轻微的差别。基于这些结果，可以假定常春藤苷C的C28上的糖在体内发生了消除，并产生了可以吸收的α-常春藤素。这个过程，即常春藤苷C转化成α-常春藤素的过程，如图1所示。

根据体外确定的α-常春藤素与常春藤苷C相比的解痉活性，以及从血浆中回收的α-常春藤素和常春藤苷C的比较结果，可以假定，α-常春藤素在血液中的浓度与在许多临床研究中所证实的治疗作用之间有着决定性的相关性。

因此，使用针对治疗作用而优化的提取物，应当可迅速产生平稳的血浆浓度，这样的血浆浓度在提取物的多次给药中也可维持。提取物B代表了这样一种提取物，与提取物A相比，其给药一小时后就产生了与多次给药相当的血浆浓度。提取物B含有6.5％的常春藤苷C和4.0％的α-常春藤素，其优越之处在于迅速起效和治疗作用的可再现性。

因此，基于提取物B，可以说，具有最佳治疗作用的提取物中，常春藤苷C和α-常春藤素的含量范围如下：

常春藤苷C：       5-8％

α-常春藤素：     3-5％

2.最优化的常春藤提取物的制备

最优化的常春藤提取物的优越之处在于常春藤苷C和α-常春藤素的含量范围在批与批之间是一致的，保持在一定的限度之内。就此而言，常春藤苷C含量的指定范围为50至80mg/g，α-常春藤素为30至50mg/g。为了符合这些质量标准，可将多种提取物混合在一起。但是，用常规方法制备的提取物只有偶尔才适于进行这样的混合，这是因为它们的相关活性成分的含量通常不够高。

提取方法的描述如下，该方法可以使常春藤叶提取物含有高含量的两种常春藤皂草苷中的一种，同时另一种皂草苷的含量非常低。

a)富含α-常春藤素提取物的制备

在该提取方法中，控制常春藤苷C与α-常春藤素的比例的基础在于提取过程中常春藤苷C的C28上糖的消除。由于常春藤苷C向α-常春藤素的转化几乎是定量进行的，所以任何批次的叶子都适合于用作制备富含α-常春藤素的提取物的起始材料。

在质检部门完成质量检验之后，将一部分药草(DAC常春藤叶)在粉碎机中高度粉碎，用防护筛确保碎片的最大尺寸为2×2mm。此外，目测过筛材料中的较大颗粒及污染物。

向粉碎的样品中加入6份提取剂(30％(m/m)乙醇)中的水部分。在偶尔混合/搅拌的条件下，将该混合物于30℃发酵60分钟。

然后加入6份提取剂中的96％乙醇部分，通过搅拌将混合物匀化。

预溶胀6小时后，分离出洗脱液，将残留下来的药草用剩余的6份提取剂进行渗滤。

将合并的洗脱液再次过滤，以除去药草小颗粒，使之匀化后，于55℃和150mbar下通过薄膜蒸发将其干燥得到浓缩物。将该浓缩物匀化，然后于45至60℃通过喷雾干燥进行干燥，得到干燥的常春藤叶提取物。

为了检查该制备方法，制备以下提取物：从常春藤苷C含量为3.91％且α-常春藤素含量为0.20％的常春藤叶开始进行，一方面按照常规方法(粉碎干燥样品，随后直接加入30％(m/m)乙醇并提取)制备提取物，另一方面按照新方法制备提取物。在下表5中记录了关于α-常春藤素和常春藤苷C含量的色谱结果：

表5：提取物中α-常春藤素和常春藤苷C的含量

	α-常春藤素(％)	常春藤苷C(％)	按常春藤苷C计算的总皂草苷
				常规方法	0.53	8.68	9.54
新方法	4.74	0	7.71

从表中可以看出：新提取方法有可能使叶子中存在的常春藤苷C完全转化为α-常春藤素。

因为按常春藤苷C计算的总皂草苷的含量具有相同数量级，因此在已知药草中相应的皂草苷浓度并考虑约2至3的富集因子的情形下，可能估计出提取物中α-常春藤素的最终含量。

因此，为了仅使药草中存在的部分常春藤苷C转化为α-常春藤素，可以仅将一部分的药草用水进行发酵，而同时保持所有其它参数不变。在60分钟的发酵结束后，加入剩余的药草和乙醇预溶胀6小时。提取物中α-常春藤素的最终含量可以根据药草中适当的皂草苷浓度并考虑约2至3的富集因子估计出来。

因此，使用本发明的方法，通过采用发酵来显著改变常春藤叶干提取物中成分的范围是可能的，而无需投入大量的时间和资源。特别如大量关于α-常春藤素活性的文献所证实的那样：选择性地影响干提取物或药物中α-常春藤素的含量，对提取物的活性具有积极作用。

b)富含常春藤苷C的常春藤叶干燥提取物的制备

在本提取过程中，控制常春藤苷C与α-常春藤素比例的基础在于特定地抑制常春藤苷C的C28上的糖的消除。应仔细选择叶子含α-常春藤素低的批次。建议以干药草计，α-常春藤素的含量应低于0.5％。

对常春藤叶子的均一样品进行分析，两种皂草苷的含量如下：

常春藤苷C：6.37％

α-常春藤素：0.85％

用下列方法对药草进行提取，共进行三次。

将3克已经被粉碎至约3×3mm大小的干燥药草用过热蒸汽蒸几秒钟。经过这样处理的药草用18克提取剂(30％(m/m)乙醇)预溶胀约6小时。在混合液被移去后，药草再用18克的提取剂进行渗滤。混合液在真空干燥炉中进行干燥。或者，干燥也可用例如薄膜蒸发法进行，例如在55℃和150毫巴下进行，然后在45-60℃下喷雾干燥。

提取温度优选约20-40℃，特别优选约30℃。在本例中药草与提取剂的比例是1∶12。

在分析获得的提取物之后，记录到列于表6的结果：

表6：用蒸汽处理后提取物中常春藤苷C和α-常春藤素的含量

样品	常春藤苷C含量[％]	α-常春藤素含量[％]	以常春藤苷C计的常春藤皂草苷含量[％]
				初始的药草	6.37	0.85	7.75
经蒸汽处理的提取物1	14.33	0.85	15.71
				经蒸汽处理的提取物2	14.26	0.85	15.64
经蒸汽处理的提取物3	14.57	0.71	15.72

用这种方法制备的叶子干提取物相应地含有存在于所用叶子中的最大α-常春藤素含量。所以，总的来说，获得了常春藤苷C含量高而α-常春藤素含量很低的可稳定储藏的提取物。如果使用α-常春藤素含量低于0.5％的叶子批次，则有可能假定获得的提取物中α-常春藤素的最大含量为0.5％。

c)两种富集提取物的混合

通过描述于2a)和2b)的提取方法，可以制得分别含有富集形式的两种常春藤皂草苷中的一种的常春藤叶提取物。

最后，将这两种富集的提取物用于制备混合物，以得到含有5-8％的常春藤苷C和3-5％的α-常春藤素的最终的特定提取物。

实施例：

1份约含7.5％α-常春藤素的提取物A+

1份约含13.0％常春藤苷C和0.5％α-常春藤素的提取物B

→含有6.5％常春藤苷C和4.0％α-常春藤素的提取物。

当然，该计算结果每次都必须针对两种富集提取物的含量水平进行调整，但是，通过混合不同的富集提取物而将两种富集提取物调节到实施例中所提到的浓度也是可行的。

现在已经可能配制一种即使单次给药也能确保真正的活性成分(α-常春藤素)可迅速进入体内的药物。同时存在的高含量的常春藤苷C意味着可以在一个长时段内维持α-常春藤素的高浓度，因为常春藤苷C在体内可以连续地转化成α-常春藤素。

这就意味着该药品不必服用一次以上，这可增加病人的依从性。经常出现在儿童中的呼吸系统疾病是常春藤提取物的应用领域之一。由于儿童通常不愿意服药，现已可以用较少的给药次数成功地进行治疗。

Claims (8)

1.一种从常春藤叶制备包含活性成分常春藤苷C和α-常春藤素的提取物的方法，步骤如下：

a)通过将粉碎的常春藤叶用水发酵将常春藤苷C转变成α-常春藤素来提供第一种富含α-常春藤素的提取物，其含有至少3％的α-常春藤素；

b)通过将粉碎的常春藤叶用过热的蒸汽处理以抑制常春藤苷C转变成α-常春藤素来提供第二种富含常春藤苷C的提取物，其含有至少5％的常春藤苷C；

c)将第一种和第二种提取物进行混合以得到一种提取物，该提取物含有经调节的常春藤苷C含量和经调节的α-常春藤素含量。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于富含α-常春藤素的提取物中α-常春藤素的含量至少为5％。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于富含常春藤苷C的提取物中常春藤苷C的含量至少为10％，并且α-常春藤素的含量少于2％。

4.如权利要求1至3中的任何一项所述的方法，其特征在于步骤c)获得的提取物含有经调节的约6.5％的常春藤苷C含量，和经调节的约4％的α-常春藤素含量。

5.按照权利要求1至4中的任何一项所述的方法所制备的提取物，其特征在于提取物中常春藤苷C的含量至少为5％，α-常春藤素的含量至少为3％。

6.如权利要求5所述的提取物，其特征在于提取物中常春藤苷C的含量为6.5％，α-常春藤素的含量为4％。

7.如权利要求5或6所述的提取物用于制备用于治疗呼吸系统疾病的药物的用途。

8.以如权利要求5或6所述的提取物作为唯一活性成分的药物。