KR100763866B1 - 담쟁이 잎의 추출물을 제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 추출제를 사용하여 담쟁이 잎의 추출물(이는 α-헤데린을 포함함)을 제조하는 방법에 관한 것이다. 이 방법에서는, 먼저 소정량의 건조된 담쟁이 잎을 분쇄시킨 후 물을 첨가함으로써 발효시키고, 추출제를 첨가함으로써 후속 추출시킨 후, 마지막으로 추출물을 건조시킨다.

담쟁이 잎 추출물, α-헤데린, 헤데라코시드 C.

Description

담쟁이 잎의 추출물을 제조하는 방법{METHOD FOR PRODUCTION OF AN EXTRACT OF IVY LEAVES}

본 발명은 추출제를 사용하여 담쟁이 잎의 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이며, 이때 건조 추출물은 α-헤데린을 포함한다.

담쟁이 잎의 추출물은 특히 연축 억제, 가래 객출 및 폐색 방지 효과를 나타내기 때문에 오늘날 기도 질환을 치료하는데 성공적으로 사용되고 있다. 이들 효과는 특히 트리테르펜 사포닌 부류에 속하는 담쟁이 잎 추출물의 치료 면에서 중요한 구성성분에 기인한다. 이와 관련된 주요 사포닌은 비데스모시딕(bidesmosidic) 헤데라코시드 C 및 α-헤데린이며, 이는 에스테르 가수분해에 의해 제조된다. 검출된 다른 사포닌은 헤데라게닌이다.

다양한 방법에 의해 담쟁이 잎으로부터 추출물을 수득할 수 있기 때문에, 이들 추출물은 종종 상이한 효능 수준을 나타낸다. 이는 구성성분의 함량이 추출물을 제조하는데 이용되는 특정 방법에 따라 달라진다는 사실 때문이다.

수행되어 온 연구에 기초하여, 본 출원인은 특히 α-헤데린이 기관지 연축 억제에 기여함을 발견하였다. α-헤데린은 β-아드레날린 수용체를 내재화(internalization)시키는 과정을 특이적인 방식으로 억제하는 것으로 밝혀졌다. 리 간드가 β-아드레날린 수용체에 결합하면 먼저 아데닐레이트 사이클라제 시스템을 활성화시키게 되고, 이에 의해 기관지 시스템의 평활 근육 조직이 결과적으로 이완된다. 특히, 세포 내로 내재화됨으로써 하향 조절되는 막-위치된 수용체에 의해 과도한 효과가 상쇄된다.

이와 관련하여, α-헤데린이 β-아드레날린 수용체를 직접 공격하지 않고 그 대신 수용체/리간드의 세포 내로의 내재화를 억제함을 밝혀낼 수 있었다. 수용체/리간드 복합체의 내재화가 억제되면, 아데닐레이트 사이클라제 시스템이 연속적으로 활성화됨으로써 기관지의 평활 근육 조직의 이완을 강화시키게 된다(연축 억제).

한편, 성분 헤데라코시드 C 및 헤데라게닌은 내재화 과정을 억제할 수 없었다. 따라서, α-헤데린 함량이 높은 추출물이 약제로서 사용하기에 특히 적합하다.

식물 물질의 건조 추출물을 제조하는 매우 다양한 방법이 특히 제약 및 약학 제제 분야에 기재되어 있다.

식물 물질의 건조 추출물을 제조하는 방법은 예컨대 DE 101 12 168 A1 호에 개시되어 있다. 이 문헌에 개시된 방법을 이용하면, 친유성 성분과 친수성 성분의 함량을 조절할 수 있다고 기재되어 있다. 이와 관련하여, 식물 물질을 상이한 친유성을 갖는 용매로 2회 이상 추출하고, 이들 추출로부터 얻은 추출물을 별도로 단리시킨다. 추출물을 서로 별도로 건조시킨 다음 목적하는 비율로 혼합한다. 이러한 방식으로, 친유성 성분과 친수성 성분의 함량을 조정할 수 있다. 이 방법은 또한 담쟁이[헤데라 헬릭스(Hedera helix)]의 건조 추출물을 단리하는데 적합하다고 기 재되어 있다.

그러나, 이 방법은 2회의 추출을 별도로 수행해야하기 때문에 방법 전체를 수행하는 것이 매우 복잡하다는 단점이 있다.

DE 30 25 223 A1 호에서는 담쟁이 추출물을 기제로 하는 약학 제제 및 이를 제조하는 방법을 추가로 개시하고 있으며, 이 방법에서는 아세톤 및 메탄올을 사용하여 각각 60% 및 90%의 헤데라사포닌 C 함량을 갖는 담쟁이 추출물을 수득한다. 헤데라사포닌 C 또는 헤데라코시드 C를 α-헤데린으로 전환시키기 위하여, 또한 그에 따라 α-헤데린만 함유하는 추출물을 수득하기 위하여, 상기 출원에서는 90% 추출물을 수산화나트륨 또는 수산화칼륨으로 가수분해시킨다.

그러나, 이 방법은 헤데라코시드 C를 수득한 후 헤데라코시드 또는 헤데라사포닌을 α-헤데린으로 전환시키기 위해 필요한 추가적인 단계 때문에 공정이 복잡해진다는 단점이 있다.

울프(G. Wulff)의 문헌["Neuere Entwicklungen auf dem Saponingebiet(Recent developments in the saponin fiel(d)", Duetsche Apotheker Zeitung(German pharmacists' journal), 108 (No. 23), 1968, pp. 797-808]에서는 신선한 담쟁이 잎을 분쇄하고 물 중에서 하룻밤 동안 정치시키면 α-헤데린만 발견된다고 개시하고 있다. 신선한 잎에 존재하는 효소가 이러한 효과를 나타낸다.

그러나, 약학 산업에서는 건조된 약물이 안정하고 취급하기가 더욱 용이하기 때문에 건조된 약물을 사용한다. 이러한 건조된 약물에서 효소 활성을 기대하기는 어렵다.

따라서, 본 발명의 목적은 적은 단계로 시간이 오래 걸리지 않으면서 추출물, 특히 α-헤데린이 적어도 크게 강화된 건조 추출물을 수득하는데 이용될 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

도입부에 명시된 방법에 따라, 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 본 발명의 목적이 달성된다:

(a) 소정량의 건조된 담쟁이 잎을 분쇄하는 단계;

(b) 물을 첨가함으로써 발효시켜, 헤데라코시드 C를 α-헤데린으로 전환시키는 단계;

(c) 추출 용매를 첨가함으로써 추출하는 단계; 및

(d) 적절한 경우 추출물을 건조시키는 단계.

이러한 방식으로 본 발명의 목적은 완벽하게 달성된다.

따라서, 본 발명에 따른 방법을 이용하면, 활성 성분으로서 α-헤데린을 강화된 형태로 포함하는 추출물을 수득할 수 있거나, 또는 그의 제조 동안 담쟁이 잎에 원래 존재했던 헤데라코시드 C의 대부분 또는 적절한 경우 모두를 α-헤데린으로 전환시킬 수 있다.

본 발명자들은 그들의 실험에서 건조된 담쟁이 잎을 사용하는 경우 발효 단계가 헤데라코시드 C의 α-헤데린으로의 실질적으로 완전한 전환을 보장함을 밝혀냈다. 그 결과, 추출 후 수득된 구성성분에 대해 임의의 다른 반응을 수행하기 위한 추가의 단계를 필요로 하지 않는다. 반면에, 정확하게는 삽입된 발효 단계의 결과로서, 시간 절감 및 사용되어야 하는 물질과 관련하여 보다 경제적으로 전체 과정을 수행할 수 있으며, 이것이 종래 기술에 기재된 방법에 비해 주요한 이점이 된다.

본원에 사용한 "발효"는 원래 성분에 존재했던 구성성분이, 발효 매질 예를 들어 액체가 원래 성분에 첨가될 때, 다른 성분으로 분해 또는 전환됨을 의미하며, 적절한 경우 특수한 매개변수, 예를 들어 시간 및 온도가 발효 과정과 조화되어야 한다.

본 발명자들은 물이 발효 단계에 사용하기에 특히 적합함을 발견하였다. 물을 첨가하면 헤데라코시드 C의 α-헤데린으로의 전환 과정을 촉진시킨다.

따라서, 본 발명에 따른 방법을 이용하여 α-헤데린 함량이 특히 높은 추출물을 생성시킬 수 있다. α-헤데린 함량이 높은 추출물은 기도 질환을 치료하는데 특히 바람직한데, 이는 본 출원인이 행한 연구 결과 이와 관련된 담당 인자가 α-헤데린임이 확인되었기 때문이다.

전술한 바와 같이, 기관지에서 연축 억제 효과를 담당하는 것은 특히 담쟁이에 존재하는 사포닌인 α-헤데린이다. 따라서, 높은 α-헤데린 함량의 결과, 이 추출물의 활성이 헤데라코시드 C 함량이 여전히 비교적 높은 추출물에 비해 상당히 개선된다.

약제 제조시, 건조된 약물은 특히 안정성과 관련하여 신선한 약물보다 취급하기가 더욱 용이하다.

약학 기술 분야에서는, 건조된 약용 식물 또는 약용 식물 부분을 정의상 "약물"이라고 한다. 이와 관련하여, "약물"로서 존재하는 이러한 약용 식물을 변화시키지않은 형태로 또는 분쇄된 형태로 사용한다.

당해 분야의 숙련자에게는, 약학 산업에서 사용되는 바와 같은 건조된 담쟁이 잎의 경우에 α-헤데린으로의 전환이 단순히 물을 첨가하는 것으로 달성될 수 있다는 것은 놀라운 일로 간주된다.

도입부에서 언급한 DE 30 25 223 A1 호의 경우, 화학적 과정을 활성화시키기 위하여 가수분해를 위해 알칼리금속 수산화물을 첨가할 필요가 있었다.

담쟁이 잎은 단계 (a)에서 ≤ 5 × 5 mm, 특히 ≤ 2 × 2 mm로 분쇄시키는 것이 또한 바람직하다.

담쟁이 잎을 전술한 치수로 분쇄시키는 것은 본 발명에 따라 제조되는 추출물의 α-헤데린 함량에 영향을 끼치는데 특히 유리하다. 이와 관련하여, 구성성분의 추출 및 발효는 잎 조각의 크기가 증가함에 따라 불량해지는 것으로 밝혀졌다.

추출제가 알콜 분획과 물 분획의 혼합물인 것이 본 발명에 따른 방법에서 또한 바람직하다.

사용되는 알콜이 C₂-C₁₀-알콜, 특히 에탄올인 것이 특히 바람직하다.

에탄올은 입증된 약학 용매이며, 약학 기술 분야에서 추출제로서 다수의 상이한 방식으로 사용된다. 그러나, 약학 제제와 관련된 추출에서 물/알콜 혼합물로서 사용될 수 있는 임의의 알콜인 다른 알콜, 예컨대 프로판올, 이소프로판올 등도 물론 사용할 수 있다.

추출제중 물/알콜 분획이 10/90 내지 90/10, 특히 70/30의 비율(m/m)인 것이 또한 바람직하다.

본 발명과 관련하여, 다양한 알콜/물 비율이 본 발명에 따른 방법을 성공적으로 수행하는데 적합하다. 이와 관련하여, 30%의 알콜 분획을 포함하는 추출제를 사용하는 것이 특히 적합한 것으로 밝혀졌다.

담쟁이 잎 대 추출제의 비율이 1:1 내지 1:50, 특히 1:12인 것이 또한 바람직하다.

본 발명에 따른 방법과 관련하여, 처리하려는 담쟁이 잎과 추출제의 특정한 정량적인 비율의 선택이 추출물 중 α-헤데린의 함량에 영향을 끼칠 수 있다. 정량적인 비율을 결정할 때, 한편으로는 적절한 경우 헤데라코시드 C가 완전히 전환되어야 한다는 사실을 고려해야 한다. 다른 한편으로는 사용되는 추출제의 양이 최적으로 낮은 수준인 동안 확실하게 성공적으로 추출하도록, 사용되는 추출제의 양이 과정과 조화을 이루어야 한다. 당해 분야의 숙련자는 이를 위하여 본 발명에 따른 방법에 다양한 정량적인 비율을 사용할 수 있음을 알 수 있다.

본 발명에 따른 방법의 한 실시태양에서는, 단계 (b)에 추출제의 물 분획을 첨가하는 것이 바람직하고, 특히 추출제의 반으로부터 유래한 물 분획만 먼저 첨가하는 것이 바람직하다.

이 실시태양에서, 추출제의 알콜 분획 및 적절한 경우 다른 추출제는 발효 후에야 첨가된다. 물 분획을 사용한 발효 후에 추출제의 알콜 분획을 첨가하는 것은 상이한 배치(batch)에 사용되는 추출제의 양이 각각의 경우에 사전에 정밀하고 용이하게 계산된 후 사용될 수 있기 때문에 프로세스 엔지니어링의 관점에서 유리하다. 물 및 알콜의 개별적인 부피 부분을 단계 (b) 및 (c)에서 각각의 경우에 서로 별도로 첨가할 수 있거나 또는 서로 보충하면서 첨가할 수도 있다.

이와 관련하여, 발효를 위해 추출제 양의 반에 함유된 물 분획을 첨가하는 것이 특히 적합하고, 이로 인해 이 방법이 더욱 실용적이 된다. 그러나, 발효를 촉진시켜 헤데라코시드 C의 α-헤데린으로의 전환 과정에 영향을 끼치기 위하여 다른 양의 물을 첨가할 수 있는 가능성도 배제되지는 않는다.

단계 (b)를 1분 내지 120분 동안, 바람직하게는 60분 동안 수행하는 것이 바람직하다.

발효 기간을 변화시킴으로써, 본 발명에 따른 방법과 관련하여 추출물의 α-헤데린 함량을 추가로 조절할 수 있다.

이와 관련하여, 10 내지 40℃, 특히 30℃에서 발효를 수행하는 것이 특히 바람직하다.

본 발명에 따른 방법의 다른 실시태양에서는, 예비 팽윤 및 침출에 의해 단계 (c)의 추출을 수행하는 것이 바람직하다.

두 수단 모두 종래 기술, 특히 식물로부터 유도되는 약학 제제 분야에서는 통상적인 방법이다. 예비 팽윤 단계 및 침출 단계를 이용하여 담쟁이 잎을 철저하게 추출할 수 있다. 따라서, 물 분획으로 발효시킨 후에, 적절한 알콜 분획을 혼합물에 첨가한 다음 예비 팽윤을 수행한다. 침출을 위해, 특정 부분을 발효 단계 및 다른 추출 단계에 이미 사용한 나머지 추출제 부분을 바람직하게 첨가한다.

이와 관련하여, 1 시간 내지 30 시간, 특히 6 시간 동안 예비 팽윤을 수행하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 방법을 진전시킴에 있어서, 박막 기화 및 후속 분무 건조에 의해 단계 (d)의 건조를 수행하는 것이 바람직하다.

두 방법 모두 통상적인 건조 방법이고, 박막 기화는 약제 제조와 관련하여 온화한 증발 방법인 것으로 밝혀졌고, 마찬가지로 분무 건조는 액체 제제를 건조시켜, 경험에 의해 알게 된 바와 같이 특히 예컨대 다시 한 번 더 물과 용이하게 혼합되어 즉시 사용가능한 제제를 제공한다는 사실을 특징으로 하는 분말상의 최종 생성물을 형성하는데 이용될 수 있다.

담쟁이 잎 추출물 중 α-헤데린 및 헤데라코시드의 함량을 조절하는데 본 발명에 따른 방법을 사용하는 것이 또한 바람직하다.

또한, 본 발명에 따른 방법을 이용하여 추출물 중 α-헤데린의 함량을 선택적인 방식으로 조절할 수 있다. 이에 따라, 본 발명에 따른 방법을 이용하여, 담쟁이 잎 추출물에서 헤데라코시드를 α-헤데린으로 완전히 전환시키거나 헤데라코시드를 α-헤데린으로 부분적으로만 전환시킬 수 있다.

따라서, 예컨대 처음에는 약물의 소정 부분만 물로 발효시킨 다음 발효가 종결된 후에 약물의 나머지 부분을 추출시킬 수 있다. 이러한 방식으로, 헤데라코시드 C가 전량 α-헤데린으로 전환되지는 않은 건조 추출물을 선택적으로 제조할 수 있다.

이에 따라 추출물 중 α-헤데린의 함량을 특이적인 방식으로 조절할 수 있다. 예를 들어 추출물 중 α-헤데린 부분이 너무 많아서는 안되는 경우, 심지어 소정 분량의 헤데라코시드 C가 여전히 존재해야 하는 경우에는, 이것이 바람직하다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법을 이용하여 제조된 담쟁이 잎의 추출물에 관한 것이다.

α-헤데린이 고도로 농축된 형태로 존재하는 경우, 이것이 고도로 농축된 형태로 존재하는 잎의 가장 활성적인 구성성분이기 때문에, 높은 α-헤데린 함량을 갖는 추출물은 예를 들어 기도 질환 치료와 관련하여 유리하다.

본 발명은 또한 약제를 제조하기 위한, 특히 기도 질환 치료용 약제를 제조하기 위한, 본 발명에 따라 제조된 추출물, 특히 건조 추출물의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법을 이용하여 제조된 추출물을 포함하는 약제에 관한 것이다.

이와 관련하여, 약제는 캡슐, 정제, 당의정, 좌약, 과립제, 분말제, 용액, 크림, 어멀션, 에어로졸, 연고 및 오일의 형태로 존재할 수 있다. 이와 관련하여, 경구 투여형이 특히 바람직하다. 이와 관련하여, 약제는 약제의 제조에 통상적으로 사용되는 보조 성분을 포함할 수 있다. 다수의 적합한 성분은 예컨대 키브(A. Kibbe)의 문헌[Handbook of Pharmaceutical Excipients, 제3판, 2000, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press]에서 찾아볼 수 있다.

상기 언급된 특징 및 아래 설명되는 특징은 본 발명의 영역으로부터 벗어나지 않으면서 각각의 경우에 명시된 조합으로뿐만 아니라 다른 조합으로도 또는 단독으로도 이용될 수 있음을 알 것이다.

상세한 설명 및 첨부된 도면으로부터 다른 이점을 알 수 있다:

도 1a는 어떠한 방식으로도 발효되지 않은 샘플의 크로마토그램을 도시한다.

도 1b는 발효된 샘플의 크로마토그램을 도시한다.

종래 기술에서 기존에 수행되었던 추출 방법은 건조된 약물을 잘게 부순 직후 건조된 약물에 30% 에탄올(m/m)을 첨가하는 다단계 추출 방법을 포함한다. 건조 추출물중 헤데라코시드 C/α-헤데린 비율은 대략 약물의 이 비율에 상응한다. 최근 제조된 추출물을 분석한 결과, 전체 추출물 중 약 5% 내지 20%의 헤데라코시드 C 함량을 나타내는 반면, α-헤데린은 전체 추출물의 약 1% 내지 5%를 구성한다. 따라서, 종래 기술에서 공지된 방법에 기초하여, 헤데라코시드 C의 α-헤데린으로의 전환이 추출 방법에 포함될 수 있는 방법이 제공되어야 한다. 이러한 목적을 명심하면서, 몇몇 예비 실험을 먼저 수행하였다:

1. 신선하고 아직 건조되지 않은 잎의 폭넓고 강력한 분쇄 및 약물의 후속 건조

약물 및 후속 추출물에 대한 수확후 처리의 영향을 연구하기 위하여, 손으로 담쟁이 잎을 신선하고 조심스럽게 수확하였다. 모든 잎을 동시에 같은 장소에서 수거하고, 수확 후에는 상이한 방법을 수행하였다. 이어, 샘플을 다음과 같이 분석하였다: 건조된 약물 약 200 mg에 상응하는 하나의 샘플 분량을 밀(mill)에서 분말화시키고 45%(v/v) 에탄올 30 ml와 함께 1 시간 동안 진탕시켰다. 혼합물을 크로마토 그래피 튜브로 옮긴 후, 새로운 45%(v/v) 에탄올로 100 ml의 부피까지 침출시켰다. 상이한 샘플을 수득하기 위하여, 분쇄 시간 및 건조 시간을 변화시켰다:

샘플 1: 신선한 잎을 3 × 3 mm 크기의 조각으로 절단하고 12 시간 저장한 후에나 건조시켰다.

샘플 2: 신선한 잎을 3 × 3 mm 크기의 조각으로 절단한 후 즉시 건조시켰다.

샘플 3: 수확한 후 절단하지 않은 잎을 50℃에서 건조시키고, 추출 과정 직전에 약 3 × 3 mm 크기의 조각으로 분쇄하였다.

하기 표 1은 α-헤데린 및 헤데라코시드 C 함량과 관련된 크로마토그래피 연구 결과를 기록한 것이다.

	α-헤데린	헤데라코시드 C(%)	헤데라코시드 C로서 계산한 총 사포닌
샘플 1	1.25	6.05	8.08
샘플 2	1.40	5.45	7.73
샘플 3	1.13	5.75	7.59

결과는 서로 비슷하고, 신선한 상태에서 절단한 잎의 경우 헤데라코시드 C/α-헤데린 비율이 α-헤데린 쪽으로 약간 이동하였으나 서로 크게 상이하지 않다.

다른 연구에서는, 담쟁이 잎을 분쇄하는 정도 및 함량을 결정하는 시간과 관련하여 변화시켰다:

샘플 1: 신선한 잎을 미세하게 분쇄한 즉시 45%(v/v) 에탄올로 추출하였다.

샘플 2: 신선한 잎을 미세하게 분쇄하고 45 분 동안 지연시킨 후 45%(v/v) 에탄올로 추출하였다.

샘플 3: 절단하지 않은 잎을 수확 후 50℃에서 건조시키고 추출 과정 직전에 분쇄하였다.

α-헤데린 및 헤데라코시드 C 함량과 관련한 크로마토그래피 연구 결과가 하기 표 2에 기록되어 있다:

	α-헤데린	헤데라코시드 C(%)	헤데라코시드 C로서 계산된 총 사포닌
샘플 1	3.74	0.37	6.45
샘플 2	3.17	0.19	5.34
샘플 3	1.13	5.75	7.59

상기 표 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 강력하게 분쇄시키면 헤데라코시드 C가 거의 전부 α-헤데린으로 전환되었다.

2. 건조 및 분쇄된 약물의 추출전 발효

세포의 완전성을 파괴하기 위하여, 헤데라코시드 C의 α-헤데린으로의 전환 과정을 폭넓은 분쇄 및 물 첨가에 의해 촉진시켰다. 이는 다음 실험에 의해 입증되었다:

미리 결정된 헤데라코시드 C 함량이 7.94%이고 α-헤데린 함량이 0.59%인 건조된 온전한 담쟁이 잎을 다음과 같이 처리하였다:

샘플 1: 폭넓게 분쇄된 잎 200 mg에 물 20 ml를 첨가한다. 물을 진공에서 증발시킨 후, 혼합물을 45%(v/v) 에탄올로 통상적으로 추출한다.

샘플 2: 약물을 샘플 1과 같이 처리하지만 물 대신 30%(m/m) 에탄올을 사용한다.

α-헤데린 함량 및 헤데라코시드 C 함량과 관련된 크로마토그래피 결과는 하기 표 3에 기록되어 있다:

	α-헤데린	헤데라코시드 C(%)	헤데라코시드 C로서 계산된 총 사포닌
샘플 1	4.40	0	7.15
샘플 2	1.12	6.51	8.33
출발	0.59	7.94	8.90

데이터로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 분쇄된 약물에 물을 첨가함으로써 헤데라코시드 C를 α-헤데린으로 완전히 전환시켰다.

도 1은 HPLC에 의해 수득된 샘플 1의 크로마토그램(도 1b) 및 샘플 2의 크로마토그램(도 1a)을 도시한다. 도면에서, 성분 헤데라코시드 C에 대해 수득된 피크는 "HC"로 라벨링되어 있는 반면, α-헤데린에 대해 수득된 피크는 각각의 경우에 "α-H"로 라벨링되어 있다. 도 1a 및 도 1b의 피크를 비교함으로써 볼 수 있는 바와 같이, 헤데라코시드 C의 함량은 α-헤데린을 증가시키면서 거의 완전히 감소되었으며, 이는 헤데라코시드 C가 모두 전환되었음을 입증한다.

30%(m/m) 에탄올에서의 발효에 의해서도 헤데라코시드 C가 분해되었지만, 이 분해의 정도는 현저히 더 낮았다.

다른 연구에서는, 약물의 분쇄 정도 및 공급되는 물의 양이 전환 정도에 결정적으로 중요한 것으로 밝혀졌다. 물에서 상기 기재된 바와 같이 발효된 약 5 × 5 mm 크기의 잎 분절을 사용한 추출 실험은 헤데라코시드 C를 희생시켜 α-헤데린을 강화시켰으나 대다수의 세포가 온전한 상태로 유지되었기 때문에 전환이 불완전하였다. 미세하게 분쇄된 잎을 물로 가볍게 분무한 실험에서도 헤데라코시드 C의 전환이 불완전하였다.

헤데라코시드 C의 α-헤데린으로의 전환과 관련하여 이미 수득된 상기 발견을 성공적인 추출 절차로 전환시키기 위하여, 추출 방법을 다음과 같이 변화시켜 수행하였다:

추출물 1: 분쇄된 담쟁이 잎(5 × 5 mm) 3.0 g을 30%(m/m) 에탄올 소정량으로 12회 추출하였다(통상적인 추출).

추출물 2: 분쇄된 담쟁이 잎(5 × 5 mm) 3.0 g을 크로마토그래피 칼럼에서 물로 덮었다. 1 시간 후, 배수전을 통해 물을 배수시키고, 잎을 30%(m/m) 에탄올 소정량으로 12회 추출하였다.

추출물 3: 추출제(30%(m/m) 에탄올) 12 부로부터의 물을 분쇄된 담쟁이 잎(5 × 5 mm) 3.0 g에 첨가하였다. 1 시간 동안 발효시킨 후, 잎을 추출하기 위하여 추출제 12 부로부터의 에탄올 부분을 첨가하였다.

크로마토그래피 분석 결과는 하기 표 4에 나타냈다:

	α-헤데린	헤데라코시드 C(%)	헤데라코시드 C로서 계산된 총 사포닌
추출물 1	0.48	19.80	20.58
추출물 2	4.11	1.38	8.06
추출물 3	8.38	5.88	19.51

이들 추출에서는 약물을 5 × 5 mm로만 분쇄시켰기 때문에 전환이 완전하지 않았다. 상기 표 4로부터, 발효수를 배수시키면(추출물 2) 구성성분이 상실됨을 명확하게 알 수 있다.

상기 예비 실험을 조합하여, 담쟁이 잎 건조 추출물 중 α-헤데린의 함량을 조절하는데 이용될 수 있는 다른 추출 방법을 개발하였다.

3. 조절가능한 α- 헤데린 함량을 갖는 담쟁이 잎 건조 추출물을 제조하기 위한 추출 방법

품질 및 방출을 시험하기 위하여 품질 평가를 이용한 후, 약물(DAC 담쟁이 잎)의 일부를 밀에서 폭넓게 분쇄하고, 분절의 크기가 2 × 2 mm 이하임을 보장하도록 보호 선별을 수행하였다. 또한, 선별된 물질을 보다 큰 입자 및 불순물에 대해 눈으로 시험하였다.

추출제(30%(m/m) 에탄올) 6 부로부터의 물 분획을 분쇄된 샘플에 첨가하였다. 이 혼합물을 가끔씩 혼합/교반하면서 30℃에서 60분간 발효시켰다.

이어, 추출제 6 부로부터의 96% 에탄올 부분을 첨가하고, 교반에 의해 혼합물을 균질화시켰다.

6 시간 동안의 예비 팽윤 기간을 거친 후, 용리물을 분리해내고, 남겨진 약물을 잔류하는 추출제 6 부로 침출시켰다.

작은 약물 입자를 배제하기 위하여 모아진 용리물을 다시 한 번 여과하고 균질화시킨 후, 55℃ 및 150 밀리바에서의 박막 기화에 의해 건조시켜 점성 페이스트를 생성시켰다. 이 페이스트를 균질화시킨 다음, 45 내지 60℃에서 분무 건조에 의해 건조시켜 건조된 담쟁이 잎 추출물을 제공하였다.

이 제조 방법을 시험하기 위하여, 다음과 같은 추출물을 제조하였다: 3.91% 헤데라코시드 C 및 0.20% α-헤데린 함량을 갖는 담쟁이 잎으로부터 착수하여, 한편으로는 통상적인 방법(건조된 샘플을 분쇄한 후 30%(m/m) 에탄올을 바로 첨가하고 추출함)에 따라 추출물을 제조하고, 다른 한편으로는 신규 방법에 따라 추출물을 제조하였다. α-헤데린 함량 및 헤데라코시드의 함량과 관련된 크로마토그래피 결과가 하기 표 5에 기록되어 있다:

	α-헤데린(%)	헤데라코시드 C(%)	헤데라코시드 C로서 계산된 총 사포닌
통상적인 방법	0.53	8.68	9.54
신규 방법	4.74	0	7.71

상기 표 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 신규 추출 방법은 잎에 존재했던 헤데라코시드 C를 α-헤데린으로 완전히 전환시킬 수 있었다.

헤데라코시드 C로서 계산된 총 사포닌 함량이 또한 동일한 정도이므로, 약물 중 상응하는 사포닌 농도를 알고 약 2 내지 3의 강화 인자를 고려하면 추출물 중 α-헤데린의 최종 함량을 추정할 수 있다.

따라서, 약물에 존재하는 헤데라코시드 C의 일부만을 α-헤데린으로 전환시키기 위해서는, 다른 모든 매개변수를 일정하게 유지시키면서 약물의 한정된 부분만을 물에 의해 발효시킬 수 있다. 60 분 동안의 발효가 끝난 후에 6 시간 동안의 예비 팽윤을 위해 나머지 약물 및 에탄올을 첨가한다.

따라서, 발효를 도입함으로써, 시간 및 자원을 크게 투입하지 않고도, 담쟁이 잎 건조 추출물의 구성성분 스펙트럼을 현저하게 변화시키는데 본 발명에 따른 방법을 이용할 수 있다. 특히 α-헤데린의 활성에 대한 다수의 문헌에 의해 확인되는 바와 같이, 건조 추출물 또는 약제의 α-헤데린 함량에 선택적으로 영향을 주는 것은 추출물의 활성에 긍정적인 효과를 갖는다.

Claims (28)

1. (a) 소정량의 건조된 담쟁이 잎을 분쇄하는 단계;

   (b) 물을 첨가함으로써 발효시켜, 헤데라코시드 C를 α-헤데린으로 전환시키는 단계; 및

   (c) 추출 용매를 첨가함으로써 추출하는 단계;

   를 포함하는 것을 특징으로 하는, 추출 용매를 사용하여 α-헤데린을 포함하는 담쟁이 잎의 추출물을 제조하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 단계 (a)에서 담쟁이 잎을 5 × 5 mm 이하로 분쇄시키는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제2항에 있어서, 담쟁이 잎을 2 × 2 mm 이하로 분쇄시키는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 알콜 분획과 물 분획의 혼합물을 추출 용매로서 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 추출 용매에 사용되는 알콜이 C₂-C₁₀-알콜인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 사용되는 알콜이 96% 에탄올인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 추출 용매 중 물/알콜 분획이 10/90 내지 90/10의 비율(m/m)로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 물/알콜 비율이 70/30인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 담쟁이 잎 대 추출 용매의 비율이 1:1 내지 1:50인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제9항에 있어서, 담쟁이 잎 대 추출 용매의 비율이 1:12인 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서 추출 용매의 물 분획을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제11항에 있어서, 단계 (b)에서 추출 용매 총량의 반으로부터 유래한 물 분획을 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제11항에 있어서, 추출 용매 6 부로부터의 물 분획을 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 1분 내지 120분 동안 단계 (b)를 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제14항에 있어서, 단계 (b)를 60분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 10 내지 40℃에서 단계 (b)를 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제16항에 있어서, 30℃에서 단계 (b)를 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서의 추출은 예비 팽윤 및 침출에 의해 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제18항에 있어서, 1 내지 30 시간 동안 예비 팽윤을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제19항에 있어서, 6 시간 동안 예비 팽윤을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
21. 삭제
22. 삭제
23. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 방법을 이용하여 제조된 것을 특징으로 하는 담쟁이 잎의 추출물.
24. 삭제
25. 제23항에 기재된 추출물을 포함하는, 급성 기관지염 및 만성 기관지염으로부터 선택되는 기도 질환 치료를 위한 약제.
26. 삭제
27. 제1항에 있어서,

    (d) 추출물을 건조시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
28. 제27항에 있어서, 단계 (d)에서의 건조는 박막 기화 및 후속 분무 건조에 의해 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.

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