RS51116B - Postupak za pripremanje ekstrakta iz listova bršljana i ekstrakta pripremljenog prema tom postupku - Google Patents

Abstract

Postupak za pripremanje ekstrakta iz listova bršljana, koji sadrži delo-tvorne supstance, hederakozid C i α-hederin, a koji sačinjavaju sledeći stupnjevi:a) pripremanje prvog ekstrakta, bogatog α-hederinom, koji sadrži najmanje 3% α-hederina;b) pripremanje drugog ekstrakta, bogatog hederakozidom C, koji sadrži najmanje 5% hederakozida C; ic) mešanje, prvog i drugog ekstrakta, u ekstrakt koji sadrži podešen sadržaj hederakozida C i podešen sadržaj α-hederina.Prijava sadrži još 2 nezavisna i 6 zavisnih patentnih zahteva.

Description

Opis pronalaska

Ovaj pronalazak odnosi se na postupak za pripremanje ekstrakta iz listova bršljana, kao i na ekstrakt pripremljen prema tom postupku.

Ekstrakti iz listova bršljana do današnjeg dana se, pre svega, uspešno koriste za terapiju oboljenja disajnih puteva, pošto ekstrakt pokazuje spazmolitička, ekspektorna i antiopstruktivna dejstva. Ova dejstva potiču naročito od važnih sastojaka u ekstraktima iz listova bršljana, koji pripadaju klasi triterpensaponina. Pritom, osnovni saponin je bisdesmozidni hederakozid C, i a-hederin, dobijen iz njega hidrolizom estra. Kao dalji saponin mogao bi da se navede hederagenin.

Pošto ekstrakti iz listova bršljana mogu da se dobiju na osnovu različitih postupaka, takvi ekstrakti često imaju različite stepene dejstva. To potiče od toga, što udeo sadržanih supstanci ne zavisi samo od prirodnog sastava, već i od odgovarajućih postupaka za pripremanje ekstrakta.

U novim studijama prijavioca, moglo je da bude pokazano, da se kod cc-hederina radi upravo o delotvornoj supstanci iz listova bršljana koja doprinosi bronhospazmolizi, pošto ta supstanca putem vezivanja za p-adrenergene receptore dovodi do kaskadnog opuštanja glatke muskulature.

Ekstrakti iz biljnih materijala - naročito suvi ekstrakti - kao i postupci za pripremanje takvih ekstrakata, mnogostruko su opisani u oblasti farmacije koja se bavi pripremanjem lekovitih preparata.

Jedan od postupaka za pripremanje suvih ekstrakata iz biljnih materijala, poznat je, na primer, na osnovu DE 101 12 168 A1. Prema postupku, koji je tamo opisan, treba da je moguće da se reguliše sadržaj lipofilnih i i hidrofilnih supstanci. Pritom se biljni materijal izlaže najmanje dvema ekstrakcijama, sa rastvaračima različitih lipofilnosti, pa se iz toga ekstrati odvojeno dobijaju. Ekstrakti se suše odvojeno jedan od drugoga, pa se mešaju u željenom odnosu.

Na taj način moguće je da se podesi sadržaj lipofilnih i hidrofilnih supstanci. Postupak treba da je pogodan i za dobijanje suvih ekstrakata iz bršljana

{ Hedera helix).

U toj publikaciji ipak nije opisan ni neki ekstrakt, koji sadrži željeno podešeni sadržaj a-hederina i/ili hederakozida C, ni neki postupak prema kojem bi takav ekstrakt mogao da se pripemi.

Dalje je, na osnovu DE 30 25 223 A1, poznat, farmaceutski preparat na bazi ekstrakata bršljana i postupak za njegovo pripremanje, pri čemu preparat kao delotvornu supstancu sadrži ekstrakt koji ima 90% ili 60% hederasaponina C ili a-hederin. Ekstrakt se dobija primenom acetona i metanola. Da bi se hederasaponin C, odn. hederakozid C, preveo u a-hederin, i da bi se na taj način dobio ekstrakt samo sa a-hederinom, u pomenutoj prijavi se 90%-ni ekstakt saponifikuje pomoću natrijum-hidroksida ili kalijum-hidroksida.

U toj publikaciji, ipak nije opisan postupak, prema kojem bi mogao da se pripremi ekstrakt, u kojem se a-hederin i hederakozid C nalaze sa nekim prema želji podešenim sadržajem.

Da bi se obezbedilo terapeutsko dejstvo koje može da se reprodukuje, poželjni su upravo takvi ekstrakti bršljana, koji delotvornu supstancu sadrže u količini koja može da se podesi.

U bazi podataka BIOSIS, BIOSCIENCES INFORMATION SERVICE, PHILA-DELPHIA, PA, US; 1997, TRUTE ANDREAS ET AL: "ln vitro antispasmodic compounds of the dry extract obtained from Hedera helix" XP009041755 pristupni broj baze podataka PREV19979569819 u jednoj tabeli su navedeni različiti ekstrakti koji se dobijaju iz Hedera helix. Ovi ekstrakti imaju različite sadržaje hederakozida C i a-hederina, konkretno 11,0 i 1,2; 8,2 i 2,2; 9,1 i 1,5; 9,0 i 2,5; 5,0 i 2,3; kao i 6,2 i 1,4.

U bazi podataka EMBASE, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS, AMSTERDAM, NL; 1986, VVAGNER H. ET AL.: "Extracts of Hedera helix leaves: HPLC analvsis" XP001204524 pristupni broj baze podataka EMB-1987018570 naveden je veliki broj rezultata merenja analiza različitih ekstrakata Hedera uzoraka, pri čemu su navedeni sledeći procentualni sadržaji hederakozida C i a-hederina, konkretno 20,18 i 1,27; 24,39 i 1,38; 15,30 i 0,83; 18,30 i 1,38; 4,07 i 2,13; 6,91 i 1,09; 4,52 i 1,54; 7,19 i 1,07; 4,39 i 8,48; 10,40 i 1,55; 4,65 i 1,68; kao i 6,01 i 0,40.

U WO 2004/087183 A, koja je uzeta u obzir kao stanje tehnike prema čl. 54 (3) KEP, opisan je jedan ekstrakt koji ima sadržaj od 8,38% a-hederina i 5,88% hederakozida C.

Dalje je nedostatak do sada korišćenih ekstrakata u tome, što ovi ekstrakti moraju više puta da se primene (apliciraju), kako bi pomoću a-hederina izazvali neposrednu i postojanu bronhospazmolizu. Razlog za to može da bude nedovoljna bio-upotrebljivost a-hederina, jer je, npr. sadržaj a-hederina u posto-jećim ekstraktima već na početku uzimanja mali. S druge strane, a-hederin, prvobitno prisutan u ekstraktu,in vivose relativno brzo resorbuje, usled čega je potrebno da se više puta aplicira, kako bi se postiglo terapeutsko dejstvo.

Uzimajući u obzir gornje navode, zbog toga je zadatak ovog pronalaska da pronađe postupak za pripremanje ekstrakta (iz lišća), kao i ekstrakta (leka) koji obezbeđuje brzu bio-upotrebljivost a-hederina i održavanje bio-upotrebljivosti tokom dužeg vremenskog perioda.

Zadatak pronalaska je rešen postupkom za pripremanje ekstrakta iz listova bršljana sa sadržajem, hederakozida C i a-hederina, koji može da se podešava, pri čemu postupak sačinjavaju sledeći stupnjevi: a) pripremanje prvog ekstrakta, bogatog a-hederinom, koji sadrži najmanje 3% a-hederina; b) pripremanje drugog ekstrakta, bogatog hederakozidom C, koji sadrži najmanje 5% hederakozida C; i c) mešanje prvog i drugog ekstrakta u ekstrakt, koji sadrži podešen sadržaj hederakozida C i podešen sadržaj a-hederina.

Postupkom na osnovu pronalaska, može se dobiti ekstrakt, koji s jedne strane sadrži a-hederin, kao supstancu koja odmah deluje, a s druge strane, takođe i hederakozid C, kojiin vivobiva preveden u a-hederin. Pritom su, i prvi ekstrakt, a-hederin, i drugi ekstrakt, hederakozid C, uvek u veoma obogaćenom obliku.

Pritom, prvi ekstrakt može, npr. da se priprema tako, što se polazni materijal, npr. osušena lekovita biljka prvo sitni, zatim se podvrgava stupnju fermentacije, onda, npr. potapa radi prethodnog bubrenja u smešu alkohol/voda, npr. 30% etanol, pa se ekstrahuje. Na kraju, može da se vrši, npr. uparavanje u tankom sloju, ili sušenje putem raspršivanja. U zavisnosti od željenog sadržaja a-hederina, moše da se obavi fermentacija celokupne lekovite biljke, pa se na taj način celokupna količina hederakozida C, prisutna u polaznoj sirovini, prevodi u a-hederin. S druge strane, i samo jedan deo polaznog biljnog materijala može da bude fermentisan, pa da tek onda ostali delovi budu potopljeni u etanol, radi pred-bubrenja, čime se postiže jako obogaćivanje samo a-hederinom.

"Fermentiranje" ovde označava razgrađivanje, odn. prevođenje supstanci, prisutnih u nekoj prvobitnoj supstanci, u druge supstance, uz dodavanje nekog fermentacionog medijuma, npr. vode, u prvobitnu supstancu, pri čemu se, u datom slučaju, utvrđuju određeni parametri, odn. vreme i temperatura. Ovaj

novi fermentacioni stupanj otvara mogućnost pripremanja željenih ekstrakata bogatih a-hederinom.

Pritom, listovi bršljana mogu, npr. da se upotrebe kao osušena lekovita biljka. U pripremanju leka osušene lekovite biljke imaju prednost, jer su one u pogledu postojanosti, između ostalog, pogodnije za rad nego sveže lekovite biljke. Ipak, korišćenje svežih listova bršljana za ekstrakt, prema pronalasku, nije isključeno.

Osušene lekovite biljke i delovi lekovitih biljaka, u oblasti tehnike proizvodnje lekova, prema definiciji se nazivaju "lekovite biljke". Upotreba takvih lekovitih biljaka, nazvanih "lekovite biljke", može pritom da se vrši, ili u nepromenjenom, ili u isitnjenom obliku.

Drugi ekstrakt može, npr. tako da se priprema, što se osušena lekovita biljka neposredno posle sečenja tretira sa ekstrakcionim sredstvom, npr. 30% etanolom, pa se ekstrahuje pomoću uobičajenih postupaka. Alternativno, isitnjena lekovita biljka, pre ekstarkcije sa etanolom, može da se popari sa vrelom vodenom parom. Ispitivanja pronalazača su pokazala da bi takvom obradom mogao da se poveća sadržaj hederakozida C u ekstraktu, odn. stabilizuje u odnosu na početni sadržaj, a da bi sadržaj a-hederina mogao da opadne. Ekstrakti dobijeni na takav način, kao drugi (po redu), u postupku prema pronalasku, u stupnju b), mogu da sadrže ekstrakt bogatiji sa hederakozidom C. Ovaj novi stupanj parenja, otvara mogućnost za pripremanje ekstrakata sa ciljanim sadržajem hederakozida C.

Pritom je prema postupku naročito povoljno, kada ekstrakt iz stupnja a), bogat a-hederinom, sadrži najmanje 3%, a naročito 5% a-hederina.

Dalje je povoljno, kada ekstrakt iz stupnja b), bogat hederakozidom C, sadrži bar 5% hederakozida C, naročito kada je sadržaj hederakozida C najmanje 10%, a sadržaj a-hederina manji od 2%.

Pritom je povoljno, kada prema postupku, ekstrakt dobijen u stupnju C, sadrži hederakozid C od ca. 3 do ca. 10%, naročito ca. 6,5%, a sadržaj a-hederina iznosi od ca. 1 do ca. 7%, naročito ca. 4,0%.

Dalje je, zadatak pronalaska, rešen pomoću ekstrakta koji je pripremljen na osnovu pronalaska. Naročito, zadatak pronalaska je rešen pomoću ekstrakta, pripremljenog prema postupku, na osnovu pronalaska, iz listova bršljana, sa podešenim sadržajem hederakozida C, od ca. 3% do ca.10%, naročito od ca. 6,5%, i sa podešenim sadržajem a-hederina, od ca. 1% do ca. 7%, naročito sa ca. 4,0%.

Na osnovu podešenog sadržaja, pomenutih delotvornih supstanci, ekstrakt prema pronalasku, ima prednost, zato što posle primene ekstrakta, delotvorna supstanca a-hederin brzo postaje upotrebljiva, prvo, zato što u ekstraktu, već kao takav, postoji a-hederin. Hederakozid C, koji je u ekstraktu prisutan pored a-hederina, biva pored toga,in vivo,vremenski sporije resorbovan, odn. postepeno preobraćan u a-hederin, tako da posle utroška prvobitno prisutnog a-hederina, postaje upotrebljiv a-hederin nastao iz hederakozida C, njegovim preobraćanjem. Na taj se način obezbeđuje povoljna, dugotrajnija terapeutska efikasnost ekstrakta, odn. leka koji sadrži ekstrakt.

Pronalazači su ovaj postupak dokazali sopstvenim ogledima. U vezi sa tim oni su pokazali da je sa ekstraktom prema pronalasku, u kojem je sadržaj delotvornih supstanci, a-hederina i hederakozida C, bio podešen u optimalnom opsegu, bez daljeg, mogao da se postigne brz priliv i održavanje konstantne koncentracije. Ekstrakt prema kojem je vršeno upoređivanje, sa visokim sadržajem hederakozida C i nižim sadržajem a-hederina, morao je, u poređenju sa ekstraktom prema pronalasku, da se češće aplicira, da bi se postigle uporedive vrednosti koncentracije. Prema tome, sa novim ekstraktom je moguće da se već sa jednim apliciranjem ostvari koncentracija a-hederina, koja je poželjna za primenu kod bronhospazmolize.

Pritom je naročito povoljno, kada se ekstrakt priprema prema postupku na osnovu pronalaska i kada je sadržaj hederakozida C ca. 6,5%, a sadržaj a-hederina ca. 4,0%.

Pronalazak se dalje odnosi na primenu ekstrakta na osnovu pronalaska, za pripremanje leka, naročito za tretiranje oboljenja disajnih puteva, kao leka koji sadrži ekstrakt prema pronalasku.

Ekstrakti prema pronalasku, sa podešenim sadržajem supstanci koje sadrže, a to su hederakozid C i a-hederin, veoma su povoljni za primenu kao lek, pošto se sa njihovim terapeutskim dejstvom, koje može da se reprodukuje, mogu postići terapeutski efekti, a osim toga je moguće i neposredno obezbeđivanje spazmolitički delotvorne supstance, a-hederina, pri čemu se to obezbeđivanje održava konstantnim u toku dužeg vremenskog perioda

Lek prema pronalasku, može prema tome da se primeni za tretiranje oboljenja disajnih puteva, kao npr. infekciono-zapaljivih oboljenja disajnih puteva, kao što su npr. pneumonija, traheitis, bronhitis idr., ali takođe i kod opstruktivnih i restriktivnih oboljenja pluća, kao što su hronični bronhitis, bronhijalna astma, bronhiektaze itd., dakle kod oboljenja disajnih puteva kod kojih je poželjno relaksiranje oslabljene muskulature.

Lek može biti u obliku, kapsula, tableta, dražeja, čepića, granulata, praha, rastvora, kremova, emulzija, aerosola, masti i ulja. Naročitu prednost imaju oralni oblici za davanje. Pritom, lek može da sadrži pomoćna sredstva koja se uobičajeno koriste pri pripremanju lekova. Niz pogodnih supstanci nalazi se, npr. u, A. Kibbe, Handbook od Pharmaceutical Excipients, 3. izd. 2000, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press.

Dalje prednosti se vide iz primera i priloženog nacrta. On prikazuje.

SI. 1 Hidroliza hederakozida C u a-hederin.

Podrazumeva se, da se prethodno pomenuta svojstva, kao i ona dalja kojima se vrši objašnjavanje, mogu primeniti ne samo u prikazanim odgovarajućim kombinacijama, već i u drugim kombinacijama ili sopstvenim rešenjima, a da se ne izađe iz okvira ovog pronalaska.

Primer

1. Resorpciono ponašanje supstanci iz listova bršljanain vivo( pacovi)

U okviru resorpcione studije pomoću biofarmaceutskog klasifikacionog sistema (BCS) moglo je da bude pokazano, da se a-hederinu pripisuje srednja apsorcija (10-90%). Pod istim uslovima, hederakozid C ne prodire kroz membrane, zbog čega je trebalo da se ispita moguća resorpcija hederakozida C u obliku a-hederina. Zbog toga su izvedena resorpciona ispitivanja na pacovima.

U sledećem je ispitivan uticaj primene dva različita ekstrakta na koncentraciju a-hederina u plazmi, Zatim su ispitivane promene koncentracije a-hederina u plazmi, posle jedne aplikacije, u poređenju sa više puta ponavljanom aplikacijom ekstrakta, u različitim vremenima uzimanja krvi, posle aplikacije, kao i resorpciona kvota (udeo) a-hederina. Zatim su odabrana dva ekstrakta, čija je raspodela saponina prikazana u sledećoj tabeli 1:

Za intravensku primenu, potrebna količina ekstrakta je rastvarana u 11%

(mas./mas.) etanolu, filtrirana, pa injektovana. Pritom je se nastojalo da aplicirana zapremina iznosi 2 ml ekstrakcionog rastvora (pojedinačna doza [mg/kg telesne mase]: 25). Životinjama je uzorak krvi uziman 5 minuta posle aplikacije. Za uzorak je bilo potrebno oko 2 ml pune krvi, uz dodatak EDTA, radi sprečavanja koagulacije.

Za peroralnu aplikaciju pripremane su suspenzije ekstrakata u glicerinu. Životinjama je preko sonde kroz grlo davano ca. 2 ml ove supsenzije (pojedinačna doza [mg/kg telesne mase]: 1000 i 166,66). Uvek, posle 1 i 3 sata od poslednje aplikacije životinjama je uvek uzimano 2 ml krvi. Prosečna masa životinja iznosila je ca. 200 g, a zapremina krvi ca. 20 ml.

Podaci o analizama prikazani su u sledećoj tabeli 2:

Hederakozid C nije mogao da bude detektovan ni u jednoj probi. Kako se može videti iz gornje tabele 2, pri aplikaciji ponovljenoj više puta, ekstrakta siromašnog a-hederinom, bila je izmerena veća koncentracija a-hedrina, u plazmi, nego pri uporednoj aplikaciji ekstrakta bogatijeg sa a-hederinom. Ovaj rezultat mogao je da se objasni proračunavanjem, koje je prikazano u sledećoj tabeli 3.

Ukupni sadržaj saponina dat je uzimanjem u obzir molske mase obe prisutne supstance i odnosi se na a-hederin. Za ovde dat ekstrakt A, ukupni sadržaj saponina iznosi 9,8%, računato prema a-hederinu. Uzimana je zapremina krvi od 20 ml.

Proračuni za ekstrakt B prikazani su u sledećoj tabeli 4:

Ukupni sadržaj saponina dat je uzimanjem u obzir molske mase obe prisutne supstance i odnosi se na a-hederin. Za ovde dat ekstrakt B, ukupni sadržaj saponina iznosi 9,8%, računato prema a-hederinu. Uzimana je zapremina krvi od 20 ml.

Ukratko može se reći, da više puta ponovljena aplikacija ekstrakta bogatog sa a-hederinom i jedna aplikacija ekstrakta siromašnog sa a-hederinom, daju uporedive koncentracije a-hederina u plazmi. Ako se ipak uzme u obzir sadržaj hederakozida C u oba ekstrakta pa odredi ukupan sadržaj oba saponina, obračunat kao a-hederin, onda se oba ekstrakta razlikuju samo neznatno. Na osnovu ovih podataka odatle mora proisteći, da sein vivoodigrava cepanje šećera sa 28 C atoma, hederakozida C, što omogućuje nastajanje a-hederina koji može da se resorbuje. Ovaj proces - dakle pretvaranje hederakozida C u a-hederin - prikazan je na si. 1.

Sain vitrodokazom, spazmolitičke aktivnosti a-hederina nasuprot hede-rakozidu C, i ponovnog nalaženja a-hederina u plazmi nasuprot hede-rakozidu C, može se odatle zaključiti, da je koncentracija a-hederina u krvi, u srazmernoj korelaciji sa terapeutskim dejstvom potvrđenim mno-gim kliničkim studijama.

U vezi sa terapeutskim dejstvom optimiziranog ekstrakta, trebalo bi zbog toga da se brzo dostigne neka jedinstvena koncentracija u plazmi, koja se takođe održava i sa više puta ponavljanim aplikacijama ekstrakta. Takav ekstrakt predstavlja ekstrakt B, čija aplikacija - nasuprot ekstraktu A - već posle jednog sata dovodi do koncentracije u plazmi koja je upo-rediva sa koncentracijom u plazmi, kada se aplikacija više puta ponavlja. Ekstrakt B, sa sadržajem hederakozida C od 6,5% i 4,0% a-hederina, odlikuje se brzim nastupanjem dejstva i reproduktivnošću terapeutskog delovanja.

Optimalan opseg za terapeutsko dejstvo, u pogledu sadržaja hederakozida C i a-hederina u ekstraktu, može dakle, na osnovu ekstrakta B, da iznosi

2. Pripremanje optimiziranog ekstrakta bršljana

Za optimizirani ekstrakt bršljena, karakteristično je, da u određenim granicama, ima ujednačen sastav sadržajnog spektra - računato na supstance koje sadrži, hederakozid C i a-hederin. Pritom bi specifirani sadržaj hederakozida C trebalo da iznosi od 50 do 80 mg/g, a sadržaj a-hederina od 30 do 50 mg/g. Da bi se ova specifikacija održavala, meša se više ekstrakata. Ekstrakti koji se dobijaju konvencionalnim postupcima, ipak su samo uslovno pogodni za takve procese mešanja, pošto oni često nemaju dovoljno visok sadržaj prisutnih delotvorni supstanci.

U daljem su opisani ekstrakcioni postupci kojima se vrši ekstrakcija listova bršljana, koji se uvek odlikuju visokim sadržajem jednog od oba hedera-saponina, dok se istovremeno drugi hedera-saponin dobija samo u vrlo malim količinama.

a) Pripremanje ekstrakta bogatog sa a- hederinom

U ovom ekstrakcionom postupku, za podešavanje odnosa hederakozida

C, prema a-hederinu, osnovno je

da se ekstrakcioni postupak podesi tako da dođe do određenog cepanja šećera sa 28 C atoma. Pošto se skoro kvantitativno odigrava prelazak hederakozida C u a-hederin, praktično je pogodna svaka šarža listova, kao polaznog materijala, za pripremanje ekstrakta bogatog a-hederinom.

Posle ispitivanja, kvaliteta i pogodnosti za ekstrahovanje, putem kontrole kvaliteta, jedan deo lekovite biljke (listovi bršljana DAC) se u mlinu dobro isitni, pri čemu zaštitno prosejavanje obezbeđuje veličinu fragmenata od maksimalno 2x2 mm. Zatim se prosejani materijal ispita optički radi uklanjanja krupnijih delova i nečistoće.

U isitnjenu probu dodat je udeo vode sa 6 delova ekstrakcionog sredstva (30% etanol (mas./mas.)). Ova šarža je mešana na 30 °C uz istovremeno međusobno mešanje materijala, radi 60 minutne fermentacije.

Zatim je dodat udeo 96% etanola sa 6 delova ekstrakcionog sredstva pa je šarža homogenizovana mešanjem.

Posle 6-časovne faze pred-bubrenja eluat je odvojen pa je preostala lekovita biljka perkolirana sa preostalih 6 delova ekstrakcionog sredstva.

Sjedinjeni eluati su još jednom profiltrirani i homogenizovani radi odstranjivanja malih čestica lekovite biljke, pre nego što su putem tankoslojnog otparavanja, na 55 °C i 150 mbar, osušeni do spisuma suspenzije. Ona je homogenizovana i zatim putem sušenja raspršivanjem na 45 do 60 °C osušena do suvog ekstrakta iz listova bršljena.

Radi provere tog proizvodnog postupka pripremljeni su sledeći ekstrakti: polazeći od listova bršljana, sa sadržajem od 3,91% hederakozida C i 0,20% a-hederina, jedanput je ekstrakt pripremljen prema konvencional-nom postupku (sitnjenje osušenog uzorka sa neposrednim dodavanjem 30% (mas./mas.) etanola i ekstrakcijom), a jedanput prema novom postupku. U sledećoj tabeli 5, prikazani su hromatografski rezultati koji se odnose na sadržaj a-hederina i hederakozida C:

Kao što se iz tabele može videti, novi ekstrakcioni postupak omogućava potpunu konverziju hederakozida C, koji je prisutan u lišću, u a-hederin.

Pošto se ukupan sadržaj saponina, obračunat kao hederakozid C, kreće u istom redu veličine, moguće je, proceniti finalni sadržaj a-hederina u ekstraktu, poznavanjem odgovarajuće koncentracije saponina u lekovitoj biljci, vodeći računa o faktoru obogaćivanja, od ca. 2 do 3.

Prema tome, da bi se samo jedan deo hederakozida C, prisutan u lekovitoj biljci, preveo u a-hederin, moguće je da se samo određena frakcija lekovite biljke fermentira sa vodom, pri čemu se svi drugi parametri drže konstantnim. Posle 60-minutne fermentacije, radi 6-časovnog pred-bubrenja dodaju se preostala lekovita biljka i etanol. Kada se zna odgovarajuća koncentracija saponina u lekovitoj biljci i uzimajući u obzir faktor obogaćivanja, od ca. 2-3, može se proceniti konačni sadržaj a-hederina u ekstraktu.

Prema tome, pomoću postupka na osnovu pronalaska moguće je, uvođenjem fermentacije, znatno promeniti spektar sadržanih supstanci u suvom ekstraktu llišća bršljana, bez primene većeg utroška vremena i troškova. Na kraju, u mnogobrojnim publikacijama o delotvornom dejstvu a-hederina potvrđuje se ostvareni pozitivan uticaj sadržaja a-hederina u suvom ekstraktu, odn. leku, na delotvorno dejstvo ekstrakta.

b) Pripremanje suvih ekstrakata, iz listova bršljana, sa povišenim sadržajem hederakozida C

Osnova za podešavanje odnosa hederakozida C prema a-hederinu, jeste da se planski sprečava cepanje šećera sa 28 C atoma, hederakozida C, za vreme postupka ekstrakcije. Prilikom izbora šarže sa lekovitim biljkama trebalo bi voditi računa o tome da se upotrebe šarže listova sa nižim sadržajem a-hederina. Preporučljivo je da sadržaj a-hederina, u odnosu na osušenu lekovitu biljku iznosi ispod 0,5%.

Homogena proba listova bršljana, u pogledu sadržaja oba saponina, imala je sledeći analitički sastav.

Polazeći od lekovite biljke, izvedene su po tri ekstrakcije prema sledećim ekstrakcionim postupcima: Količina od 3 g osušene i na ca. 3 x 3 mm isitnjene lekovite biljke naparava se, nekoliko sekundi, sa vrelom vodenom parom. Tako pripremljena lekovita biljka se ca. 6 sati izlaže pred-bubrenju, sa 18 g ekstrakcionog sredstva (30% etanol (mas./mas.)). Posle otvaranja micela, preostala lekovita biljka je perkolirana sa još 18 g ekstrakcionog sredstva. Ove micele su osušene u vakuum-sušnici. Alternativno, sušenje može, npr. da se izvede uparavanjem tankog filma npr. na 55 °C i 150 mbar, pa zatim sušenjem putem raspršivanja na 45 - 60 °C.

Ekstrakciona temperatura je prvenstveno, između ca. 20 i ca. 40 °C, naročito na ca. 30 °C. Pritom je odnos lekovite biljke prema ekstrakcionom sredstvu, npr. 1:12.

Posle analize dobijenih ekstrakata rezultati bi mogli da se prikažu u sledećoj tabeli 6:

Ekstrakt suvih listova pripremljen prema ovom postupku imao je, prema tome, maksimalnu količinu a-hederina koja je bila prisutna u upotreblje-nim listovima. Prema tome, dobijeni su ekstrakti stabilni za čuvanje sa visokim sadržajem hederakozida C i vrlo niskim sadržajem a-hederina. Pri upotrebi šarži listova sa sadržajem a-hederina ispod 0,5%. za dobijeni ekstrakt se može takođe uzeti da je najviši sadržaj a-hederina 0,5%.

c) Smeša dva obogaćena ekstrakta

Pomoću ekstrakcionih postupaka opisanih pod 2a) i 2b), mogu se

pripremiti ekstrakti listova bršljana koji uvek sadrže jedan od dva hederasaponina u obogaćenom obliku.

Sa oba obogaćena ekstrakta na kraju se priprema mešavina za izradu specijalnog ekstrakta sa sadržajem hederakozida C od 5-8% i a-hederina od 3-5%.

Primer:

1 deo ekstrakta A, sa ca. 7,5% a-hederina +

1 deo ekstrakta B, sa ca. 13,0% hederakozida C i 0,5% a-hederina

—> ekstrakt sa 6,5% hederakozida C i 4,0% a-hederina.

Razume se da ovaj proračun uvek treba podesiti prema vrednostima sadržanim u oba obogaćena ekstrakta, međutim ipak, prilikom podešavanja, putem mešanja, različito obogaćenih ekstrakta, treba imati u vidu koncentracije navedene u primeru.

Od sada je moguće formulisati lek, koji već pri jednom uzimanju omogu-ćuje, da odgovarajuća delotvorna supstanca (a-hederin) vrlo brzo može da se iskoristi u telu. Uz istovremenu pomoć visokog sadržaja hederakozida C, u dužem vremenskom periodu može dobro da se održava visok nivo a-hederina, pošto u telu hederakozid C stalno prelazi u a-hederin.

Na ovaj način, lek ne mora da se uzima više puta, što je za pacijenta udobnije. Oblast u kojoj se primenjuju ekstrakti bršljana, jesu oboljenja disajnih puteva, koja se često javljaju kod dece. Pošto deca često nerado uzimaju lek, od sada je moguće uspešno tretiranje sa redim davanjem leka.

Claims (9)

1. Postupak za pripremanje ekstrakta iz listova bršljana, koji sadrži delotvorne supstance, hederakozid C i a-hederin, a koji sačinjavaju sledeći stupnjevi: a) pripremanje prvog ekstrakta, bogatog a-hederinom, koji sadrži najmanje 3% a-hederina; b) pripremanje drugog ekstrakta, bogatog hederakozidom C, koji sadrži najmanje 5% hederakozida C; i c) mešanje, prvog i drugog ekstrakta, u ekstrakt koji sadrži podešen sadržaj hederakozida C i podešen sadržaj a-hederina.

2. Postupak, prema zahtevu 1,naznačen time,što ekstrakt bogat a-hederinom sadrži najmanje 5% a-hederina.

3. Postupak, prema zahtevima 1 ili 2,naznačen time,što ekstrakt bogat hederakozidom C sadrži najmanje 10% hederakozida C, a sadržaj a-hederina je manji od 2%.

4. Postupak, prema bilo kom od zahteva 1 do 3,naznačen time,što ekstrakt koji treba da se dobije u stupnju c) ima podešen sadržaj hederakozida C, od ca. 6,5%, i podešen sadržaj a-hederina, od ca. 4%.

5. Ekstrakt, pripremljen na osnovu postupka, prema bilo kom od zahteva 1 do 4,naznačen time,što on ima sadržaj hederakozida C od najmanje 5%, a sadržaj a-hederina od najmanje 3%, sa izuzetkom ekstrakta koji sadrži 5,88% hederakozida C i 8,38% a-hederina.

6. Ekstrakt, prema zahtevu 5,naznačen time,što ekstrakt ima sadržaj hederakozida C od 6,5%, a sadržaj a-hederina od 4,0%.

7. Primena ekstrakta, prema zahtevima 5 ili 6, za pripremanje leka.

8. Primena, prema zahtevu 7,naznačena time,što se lek koristi za tretiranje oboljenja disajnih puteva.

9. Lek, koji sadrži ekstrakt, prema zahtevima 5 ili 6.