CN1829791B - 皮肤再生系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种消除或至少减少对外源性成分例如血清和饲养细胞的需求的细胞培养基和细胞培养系统。所述细胞培养基包含IGF和玻连蛋白或纤连蛋白及任选的IGFBP，且特别适用于使角质形成细胞增殖以随后用于皮肤生长和再生。本发明还涉及利用培养的角质形成细胞的气雾剂递送的用于皮肤原位生长和再生的组合物和方法。

Description

皮肤再生系统 
技术领域
本发明涉及细胞培养物。更具体地，本发明涉及使角质形成细胞增殖以随后用于皮肤生长和再生的培养基、系统和方法。本发明还涉及用于皮肤原位生长和再生的组合物。 
发明背景 
胰岛素样生长因子(IGF)IGF-I和IGF-II是参与包括增生、DNA合成、分化、细胞周期进展及细胞凋亡抑制的多种细胞过程的促有丝分裂肽生长因子(Keiss等，1994，Hormone Research 41 66；Wood & Yee，2000，J.Mammary Gland Biology and Neoplasia 51；Jones & Clemmons，1995，Endocrine Rev.163)。这些作用是通过结合其酪氨酸-激酶连接的细胞表面受体I型IGF受体(IGF-IR)而介导的。IGF还由一个称为IGFBP的特异性结合蛋白家族紧密调节，这些特异性结合蛋白主要的作用是结合游离的IGF并由此调节其半衰期、特异性和活性(Clemmons，1998，Mol.Cell.Endocrinol.14019)。 
近来，已表明玻连蛋白(VN)直接结合IGF-II(Upton等，1999.Endocrinology 140 2928-31)，而IGF-I在某些IGFBP存在下能结合VN(国际公开WO 02/24219；Kricker等，2003，Endocrinol.1442807-15)。VN，一种ECM结构和粘着分子，以与IGF-II对它的生物学相关受体IGF-IR的亲和性(Upton等，1999，同上)相似的亲和性结合IGF-II这一发现揭示了ECM中IGF作用与VN之间的特异性物理联系。另外，结合于VN的IGF-II和通过IGFBP结合于VN的IGF-I能在体外在包括人角质形成细胞的多种细胞中刺激协同功能反应(国际公开WO 02/24219；Noble等，2003，同上；Kricker等，2003，同 上)。 
创伤、烧伤和溃疡是消耗性和令人痛苦的皮肤病症，其需要精心和昂贵的治疗，许多情况下其治疗仅部分成功。例如，当前超过520000个澳大利亚人被诊断有糖尿病，而其中超过5％将患上足部溃疡。这些创伤严重损害患者的生活质量，往往导致延长的住院治疗，且可能最终导致截肢。实际上，所进行的大多数下肢截肢是由于非愈合性溃疡。 
治愈创伤、烧伤和溃疡的越来越优选的方法为用体外培养的自体或同种异体的角质形成细胞代替死的或受损的皮肤。典型地，角质形成细胞在确定成分培养基中在外源性因子例如血清或牛垂体提取物存在下培养，并通常和优化角质形成细胞生长的饲养细胞一起培养。 
发明内容
通常现有技术中的体外细胞培养系统由于包含前述的外源性因子而相对昂贵。另外，动物源的外源性因子例如血清和牛垂体提取物成分相对不易确定(poorly defined)，且可能含有例如引起CJD、HIV和其它疾病的传染性物质。 
为此，本发明的发明人发现，包含IGF-II和VN或者IGF-I和IGFBP和VN的蛋白复合物在无血清存在下刺激离体的原代细胞培养物显著增殖反应。更特别地，包含IGF-II和VN或者IGF-I和IGFBP和VN的蛋白复合物可用于增强角质形成细胞生长以用于皮肤替代、烧伤和创伤愈合以及需要离体皮肤生长的其它治疗性处理。 
因此，一方面，本发明提供一种细胞培养基，其包含： 
(i)选自IGF-I和IGF-II的至少一种IGF；和 
(ii)无血清或在不含所述的至少一种IGF的情况下不支持细胞生长的量的血清。 
在一个实施方案中，该培养基包含IGF-I和IGFBP。 
第二方面，本发明提供包含培养容器和第一方面的细胞培养基的细胞培养系统。 
应理解本发明的培养基和/或培养系统可进一步包含玻连蛋白(VN)和/或纤连蛋白(FN)或其片段。 
第三方面，本发明提供一种细胞培养方法，该方法包括在第一方面的细胞培养基和/或第二方面的细胞培养系统中培养一种或多种细胞的步骤。 
第四方面，本发明提供一种药物组合物，其包含根据第三方面的方法培养产生的一种或多种细胞以及药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。 
在一个优选的实施方案中，所述药物组合物适用于角质形成细胞或角质形成祖细胞的气雾剂递送。 
第五方面，本发明提供递送角质形成细胞或角质形成祖细胞用于皮肤原位再生的方法，所述方法包括将第四方面的药物组合物递送给个体以促进皮肤再生的步骤。 
此方面的优选实施方案提供使皮肤原位再生的方法，所述方法包括以下步骤： 
(i)将一种或多种角质形成细胞或角质形成祖细胞喷在个体的皮肤上； 
(ii)使所述角质形成细胞或角质形成祖细胞生长以原位形成再生皮肤。 
本申请的全文中，除非另外说明，“包括”、“包含”和“含有”的使用是开放式而非封闭式的，因而所述及的实体或实体组可包括一个或多个其它未述及的实体或实体组。 
附图简述 
图1：在分离蛋白复合物和饲养细胞存在而无血清存在下角质形 成细胞的生长。相对于其中胎牛血清和3t3细胞均存在的常规方法有VitroGro(+3t3细胞)的刚分离的角质形成细胞的平均生长。P0、P1和P2相对于细胞已收获和再铺板的次号(P0＝从皮肤样品分离后即刻的细胞行为表现)。数据通过MTT染色获得，MTT被生长细胞转化为有色底物。由于不同供体组织之间大的差异，因此误差棒未显示。 
图2：在分离的蛋白复合物和饲养细胞存在而无血清存在下生长后的角质形成细胞形态。细胞在胎牛血清和小鼠3t3细胞存在下生长3周(A)或在VitroGro(B；玻连蛋白、IGFBP5和IGF-I)和小鼠3t3细胞存在而无血清存在下生长3周。图解比例尺为大约200微米(μm)。 
图3：包含IGFBP3或IGFBP5的分离蛋白复合物的相对活性。对照＝补充10％胎牛血清的标准角质形成细胞生长培养基。VitroGro-3＝玻连蛋白、IGFBP3和IGF-I(无血清)。VitroGro-5＝玻连蛋白、IGFBP5和IGF-I(无血清)。所有培养物均在γ照射的小鼠3t3细胞存在下生长。 
图4：IGF蛋白复合物支持离体的角质形成细胞的扩展。来源于成人皮肤的接种于IGF蛋白复合物上的角质形成细胞存活并以与接种于照射的小鼠3T3细胞上的细胞在胎牛血清存在下相当的速度生长。通过以下方法观察细胞生长：(a)视觉检查培养形态/融合；和(b)利用MTT测定法定量。(a)由左至右：饲养层+牛血清；无饲养层或血清的对照；无饲养层或血清的IGF-I+IGFBP5+VN；(b)由左至右：Green培养基+饲养层+牛血清；Green培养基+单独的饲养层；Green培养基-胰岛素+IGF-I，+IGFBP-3+VN；Green培养基-胰岛素+IGF-I，+IGFBP-5+VN。VN以300ng/孔存在。IGF-I或IGF-II以100ng/孔存在，而IGFBP以300ng/孔存在。 
图5：补充附加生长因子的IGF蛋白复合物进一步增强角质形成细胞培养物的生长。来源于成人皮肤的角质形成细胞在加入表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的IGF蛋白复合物上培 养，并通过[3H]-亮氨酸掺入法测定蛋白质合成。接种于三聚物IGF-I、IGFBP5和VN蛋白复合物或二聚物IGF-II和VN蛋白复合物的细胞以等同于Define Keratinocyte Media(DKM，Invitrogen)的速度生长。另外加入EGF(100ng/孔)和bFGF(100ng/孔)的IGF蛋白复合物与DKM相比显著增强蛋白质合成(p＜0.05)。IGF-I或IGF-II以100ng/孔存在，VN以300ng/孔存在，而IGFBP以300ng/孔存在。 
图6：TISSOMAT对角质形成细胞生存力的影响。喷雾递送角质形成细胞至直径150mm的胶原蛋白包被培养皿后的细胞分布和生长。细胞以两种不同的浓度喷雾以确定覆盖喷雾面积所需的细胞数。用于喷雾的培养物最初在对照(有血清)或有IGFBP3和IGF-I的玻连蛋白(VitroGro)上生长。所有培养物均在3t3细胞存在下制备。然后在培养物于胶原蛋白包被板上于血清存在(设计为模拟递送至创面后的条件)下生长7天后以结晶紫染色。喷雾体积0.2ml，压力20psi，高度＝10cm。 
图7：TISSOMAT对角质形成细胞生存力的影响。培养物使用添加血清的常规培养基建立。(A)喷雾细胞入收集管后数分钟内进行锥虫蓝排除试验。染料不能透过成活细胞。(B)MTT转化数据为生存力的量度，其提供喷雾细胞后24小时具有代谢活性的指示。 
具体实施方式
本发明从下述发现而提出：包含IGF-II和VN或者IGF-I和IGFBP和VN的培养基在无血清存在下刺激离体的原代角质形成细胞培养物产生显著的增殖反应，血清是离体的角质形成细胞生长所一般需要的。 
另外，对饲养细胞的绝对需要可以被至少部分消除，尤其是在细胞培养物最初建立以后的细胞培养后期中。 
因而本发明提供了改进目前临床离体皮肤再生的最佳实践的技 术。另外，本发明也提供了来自组织活检物的角质形成细胞的来源和建立。在一种优选的形式中，本发明提供了角质形成细胞培养基和系统，其利用从患者自身血清分离或重组产生的自体玻连蛋白，从而进一步使对异种或同种异体的支持系统的使用最小化并且免于使用成分不太明确(poorly-defined)的补充产品。因此这将提供可转化为批准的治疗应用的基于自体细胞的组织工程系统。 
为本发明的目的，“分离的”是指已经从其天然状态中分离的或者进行了其它的人工操作的物质。分离的物质可以是基本上没有在其天然状态下通常伴随的成分，或者可以操作以使之处于人工状态，与其天然状态中通常伴随的成分共存。分离的物质可以是天然的、化学合成的或重组形式。 
如本文所用，“合成的”是指不是天然存在的，而是通过人工技术干涉而产生的。在合成的蛋白质和核酸中，这包含了通过本领域熟知的重组或化学合成和组合技术产生的分子。 
“蛋白质”是指氨基酸聚合物。所述氨基酸可以是本领域熟知的天然或非天然氨基酸，D-或L-氨基酸。 
“肽”是指具有少于五十(50)个氨基酸的蛋白质。 
“多肽”是指具有五十(50)或更多个氨基酸的蛋白质。 
在具体的方面，本发明提供细胞培养基和细胞培养系统，其包含至少IGF-I和/或IGF-II，使得不需要或需要相当低水平的外源性、动物源的因子例如血清，而细胞生长和/或生存力仍得以维持。 
应理解本发明适用于对IGF-I和/或IGF-II反应的任何哺乳动物细胞类型。 
通常，这样的细胞为来源于中胚层的细胞如上皮细胞、成肌细胞及它们的祖细胞、骨髓和树突细胞。 
在一个优选的实施方案中，本发明可应用于上皮细胞，包括皮肤上皮细胞例如角质形成细胞、角质形成祖细胞和角膜上皮细胞。实际 上，皮肤和角膜上皮细胞均可认为是“角质形成细胞”，因为它们均产生角蛋白。 
角质形成细胞和/或其祖细胞可来源于正常皮肤、例如得自创伤或溃疡或得自毛囊的外根鞘(ORS)细胞的皮肤活检物，但并不限于此。 
因此应理解，本发明的培养基、方法和系统可以有潜力地用于工程替代任何存在上皮细胞的组织，例如口腔和呼吸道粘膜(口、鼻、气管和食管的内层)和生殖-泌尿组织(例如阴道、膀胱)。这些组织也可能被烧伤和其它创伤所损伤，同样可使用以与皮肤活检物类似的方法培养的培养移植物进行治疗。 
本发明也可应用于在培养中通常也需要血清的人胚胎干(hES)细胞。 
因此，应理解“无血清或在不含所述的至少一种IGF的情况下不支持细胞生长的量的血清”指没有血清或比通常体外最佳细胞生长和/或发育所需要的血清的量或浓度的少得多。 
“血清”指来源于血液的一部分，其包含多种大分子、类脂质和微量元素的载体蛋白质、细胞附属物和扩散因子、低分子量营养物质、激素和生长因子。操作上，血清可定义为除去红细胞、血小板和凝结的血浆成分后剩余的血液蛋白质、非细胞部分。最广泛使用的细胞培养用动物血清为胎牛血清FBS，尽管成年牛血清、马血清和其蛋白质部分(例如血清白蛋白部分V)也可使用。 
典型地，哺乳动物细胞需要5-10％的血清，其根据细胞类型、培养持续时间、存在或不存在饲养细胞和/或对本领域技术人员清楚的培养系统的其它成分和其它因子。 
因而，在一个优选的实施方案中，本发明考虑少于5％的血清，更优选少于2％的血清，甚至更优选少于1％的血清或有利地不超过0.5％、0.4％、0.3％或0.2％的血清(v/v)。 
在一个特别有利的实施方案中，本发明考虑不含血清或不超过 0.1％或0.05％的血清(v/v)。 
在存在IGF-I的实施方案中，优选IGF-I为进一步包含IGFBP和玻连蛋白(VN)的蛋白复合物的一种成分。 
IGFBP选自IGFBP1、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP4、IGFBP5和IGFBP6。 
优选地，IGFBP为IGFBP3或IGFBP5。 
更优选地，IGFBP为IGFBP5。 
在一个存在IGF-II的实施方案中，优选IGF-II为进一步包含玻连蛋白(VN)的分离蛋白复合物的一种成分。 
还应理解玻连蛋白(VN)可为单体或多聚体形式。 
在一个具体的实施方案中，本发明包含纯化的自体VN。 
优选地，角质形成细胞在本领域通常使用的培养容器内培养。因此应理解，在培养期间存在的IGF、VN和IGFBP的各自的量将取决于例如培养容器的大小、容器中存在的液体培养基的量、细胞密度和本领域已知的其它因素等因素。 
为了指导，在1.9cm2孔中，优选的量如下： 
VN：50-5000ng，更优选100-500ng或有利地250-350ng； 
IGF：0.1-1000ng，更优选10-200ng或有利地50-150ng；和 
IGFBP：1-1000ng，更优选30-700ng或有利地300-500ng。 
适宜地，本发明的培养基包含其它确定成分。非限制性的、在某些情况下任选的成分包括熟知的基础培养基例如DMEM或Ham培养基、抗生素例如链霉素或青霉素、人血清白蛋白(HSA)、磷脂(例如磷脂酰胆碱)、氨基酸补充物例如L-谷氨酸、抗氧化剂例如β-巯基乙醇、运铁蛋白、缓冲液例如碳酸盐缓冲液、HEPES和通常由细胞培养箱提供的二氧化碳源。 
本发明还考虑使用调节细胞生长、分化、存活和/或迁移的其它生物活性蛋白，例如表皮生长因子(EGF；Heldin等，1981，Science 4 1122-1123)、成纤维细胞生长因子(FGF；Nurcombe等，2000，J.Biol.Chem.275 30009-30018)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF；Taraboletti等，1997，Cell Growth.Differ.8471-479)、骨桥蛋白(Nam等，2000，Endocrinol.141 1100)、血小板反应蛋白-1(Nam等，2000，同上)、腱生蛋白-C(Arai等，1996，J.Biol.Chem.271 6099)、PAI-1(Nam等，1997，Endocrinol.138 2972)、纤溶酶原(Campbell等，1998，Am.J.Physiol.275 E321)、纤连蛋白(Campbell等，1999，J.Biol.Chem 27430215)、纤维蛋白(Campbell等，1999，同上)或运铁蛋白(Weinzimer等，2001，J.Clin.Endocrinol.Metab.86 1806)。 
优选的其它生物活性蛋白为EGF和bFGF。 
其它生物活性蛋白例如EGF和bFGF可以以每1.9cm2培养孔0.1-1000ng或有利地1-100ng存在。 
在一个具体的实施方案中，本发明考虑使用具有肝素结合样结构域的任何生长因子。 
在另一个具体的实施方案中，本发明考虑除了分离蛋白复合物外使用LIF和/或抑制细胞分化的其它活性剂。 
在再一个具体的实施方案中，本发明考虑在本发明的培养基、系统和/或方法中使用聚L-赖氨酸和聚L-精氨酸和与玻连蛋白相互作用的分泌型细胞物质中的一种或多种，所述分泌型细胞物质例如胶原、纤连蛋白、粘多糖/蛋白多糖、层粘连蛋白、涎蛋白和/或粘蛋白的聚合物。 
还提出本发明可以在至少在细胞培养的最初建立期之后在无饲养细胞存在下促进细胞培养。 
在角质形成细胞和/或角质形成祖细胞中，饲养细胞(如照射的3t3饲养细胞)可能在无血清培养的最初6-7天存在，其后饲养细胞可以对于直至两次传代细胞不存在。 
根据前述，尽管不希望被任何具体的理论所束缚，但仍认为IGF- I与IGFBP和VN一起形成分离蛋白复合物，而IGF-II与VN一起形成复合物，从而在细胞培养中发挥生物效应。 
术语“分离蛋白复合物”在本文中与国际公开WO 02/24219和国际申请PCT/AU 2004/000117中所用的一致。 
分离蛋白复合物可以预先形成并包含在本发明的培养基中或者可在培养容器中形成。 
典型地，玻连蛋白和/或纤连蛋白结合、固定、包被或者缔合于培养容器上。添加的IGF和任选的IGFBP与结合、固定、包被或者缔合于培养容器的玻连蛋白和/或纤连蛋白一起形成复合物。 
如国际申请PCT/AU 2004/000117中所述，本发明的分离蛋白复合物可包含生长因子(例如IGF-I和IGF-II)或生长因子的能够结合关联生长因子受体(例如IGF1型受体)的至少一个结构域。 
本文中，“结构域”指生长因子的能够结合关联生长因子受体的至少那部分或区域。典型地，尽管不排出其它情况，所述关联生长因子受体由细胞表达，并且所述的生长因子的至少一个结构域与所述关联生长因子受体的结合或连接引发细胞反应如细胞生长、分化、存活和/或迁移。 
特别关于IGF-I，所述结构域合适地包含第24位氨基酸残基，其不是亮氨酸残基。 
典型地，所述残基为酪氨酸。 
特别关于IGF-II，所述结构域合适地包含第27位氨基酸残基，其不是亮氨酸残基。 
典型地，所述残基为酪氨酸。 
特别关于IGF-I，在一个实施方案中所述结构域包含或由IGF-I的第1-70位残基组成。 
在另一个实施方案中，所述结构域包含或由IGF-I的第4-70位残基组成。 
还应理解本发明的分离蛋白复合物的另一种成分为玻连蛋白或纤连蛋白的至少一个整联蛋白结合结构域。 
这包括并涵盖了VN或FN的能够结合αv整联蛋白的任何结构域。 
更优选地，该整联蛋白为αvβ3整联蛋白或αvβ5整联蛋白。 
如国际申请PCT/AU 2004/000117中所述，分离蛋白复合物的完全生物活性不需要VN(和类似的FN)的肝素结合结构域(HBD)。 
关于VN，VN(和类似的FN)的聚阴离子区域是最可能的与IGF-II或IGF-I/IGFBP复合物相互作用所需要的。 
聚阴离子区域为成熟VN序列的第53-64位氨基酸残基。 
根据前述，本发明考虑了不包含HBD和/或VN或FN的聚阴离子区域的合成嵌合蛋白的实施方案。 
关于不包含HBD和/或聚阴离子区域的VN蛋白质及其氨基酸序列，这些可以是天然蛋白质例如54kDa鸡卵黄VN(缺少HBD)或可以通过VN蛋白质或氨基酸序列的缺失、突变或截短而工程化，使得HBD和/或聚阴离子区域不存在或至少基本上无功能。 
根据前述应容易理解，本发明的分离蛋白复合物可以为非共价结合的寡蛋白复合物、共价交联(可逆或不可逆)的寡蛋白复合物的形式或合成嵌合蛋白的形式。 
因此，在一个具体的方面，本发明提供合成嵌合蛋白形式的分离蛋白复合物。 
所本文所用，“嵌合蛋白”包含衍生自VN或FN的整联蛋白受体结合结构域的连续的氨基酸序列和生长因子或生长因子的至少一个受体结合结构域。 
尽管不希望被任何具体的理论所束缚，但认为合成的嵌合蛋白可能能够共连接和共激活所述生长因子的关联受体和VN或FN的整联蛋白受体，从而刺激、诱导、增加或促进细胞迁移。 
根据本发明的嵌合蛋白的优点是它们易于通过化学合成或重组方法产生，并预期在体内更稳定，因为它们不依赖于非共价寡蛋白复合物中所需要的蛋白-蛋白相互作用。 
在这点上，尽管包含IGF-I的受体结合结构域的分离蛋白复合物也包含IGFBP，但认为根据前述的作用模式，IGFBP优选在IGF-I/VN合成嵌合体中不存在。 
优选地，嵌合蛋白进一步包含“接头序列”，其位于生长因子序列和VN或FN氨基酸序列之间并与二者相邻。 
在一个实施方案中，所述接头序列包含一个或多个甘氨酸残基和一个或多个丝氨酸残基。 
接头序列的具体实例可以选自：Gly4 Ser；Gly4 Ser3和(Gly4 Ser)3，但并不限于此。 
在另一个实施方案中，接头序列包含纤溶酶切割识别位点，例如根据序列：Leu Ile Lys Met Lys Pro。 
在再一个实施方案中，接头序列包含胶原酶-3切割识别位点，例如根据序列：Gln Pro Gln Gly Leu Ala Lys。 
上述是生长因子、生长因子结合蛋白和/或玻连蛋白/纤连蛋白的生物活性片段的实例。 
在一个实施方案中，所述“生物活性片段”具有不少于“全长”蛋白的生物活性的10％，优选不少于25％，更优选不少于50％和甚至更优选不少于75％、80％、85％、90％或至少95％。 
还考虑了根据本发明可使用的变体生长因子、生长因子结合蛋白和/或玻连蛋白/纤连蛋白和/或编码核酸。 
在一个实施方案中，“变体”具有已被不同的氨基酸置换的一或多个氨基酸。本领域中已熟知一些氨基酸可以被改变为具有广泛相似性质而不改变蛋白的活性性质的氨基酸(保守取代)。 
在一个实施方案中，变体与本文所述的氨基酸序列至少70％，优 选至少80％，更优选至少90％以及有利地至少95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性。 
优选地，序列相同性是在本发明的合成蛋白的至少60％，更优选至少75％，甚至更优选至少90％及有利地在基本全长之上测定的。 
为了确定序列相同性百分比，氨基酸和/或核苷酸序列的最佳排比可通过算法的计算机执行(Intelligenetics的Geneworks程序；Wisconsin Genetics Software Package Release7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science DriveMadison，WI，USA，引入本文作为参考)进行或通过检查和所选的各种方法中的任一个产生的最佳排比(即与比较窗相比产生的最高同源百分比)进行。也可以参考BLAST程序家族如Altschul等，1997，Nucl.Acids Res.25 3389所公开的，该文献引入本文作为参考。 
在另一个实例中，“序列相同性”可理解为指通过DNASIS计算机程序(Version 2.5 for windows；可由Hitachi Software engineering Co.，Ltd.，South San Francisco，Califomia，USA获得)计算的“匹配百分比”。 
在CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds.Ausubel等(John Wiley & Sons Inc NY，1995-1999)的Unit 19.3中可找到序列分析的详细论述。 
本发明还考虑了生长因子、生长因子结合蛋白和/或玻连蛋白/纤连蛋白的衍生物。 
如本文所用，“衍生物”例如通过本领域熟知的与其它化学基团加成、缀合或复合或者通过翻译后修饰技术加以改变。 
氨基酸的“添加”可以包括与其它肽或多肽融合。其它肽或多肽例如可有助于蛋白的纯化。例如，这些包括多组氨酸标记、麦芽糖结合蛋白、绿色荧光蛋白(GFP)、蛋白A或谷胱甘肽S-转移酶(GST)。 
本发明考虑的其它衍生物包括但不限于侧链修饰、蛋白合成中掺入非天然氨基酸和/或其衍生物以及使用交联剂和对蛋白构象施加限 制的其它方法。本发明考虑的侧链修饰的非限制实例包括如下的氨基修饰：例如通过用乙酸酐进行酰化；用琥珀酸酐和四氢邻苯二甲酸酐对氨基进行酰化；用甲基亚氨逐乙酸酯进行脒化；用氰酸盐进行氨基的甲氨酰化；用吡哆醛-5-磷酸进行赖氨酸的吡哆醛化(pyridoxylation)然后用NaBH4还原；通过与醛反应进行还原烷化然后用NaBH4还原；用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)进行氨基的三硝基苯化。 
巯基基团可通过如下的方法修饰：例如过甲酸氧化为半胱氨酸；使用4-氯汞基苯磺酸、4-氯汞基苯甲酸、2-氯汞基-4-硝基酚、氯化苯汞和其它汞制剂形成汞衍生物；和其它硫醇化合物形成混合二硫化物；与马来酰亚胺、马来酸酐或其它取代马来酰亚胺反应；用碘乙酸或碘乙酰胺进行羧甲基化；和碱性pH下用氰酸盐进行甲氨酰化。 
组氨酸残基的咪唑环可以通过用焦碳酸二乙酯进行N-乙酯基化或通过用碘乙酸衍生物进行烷基化来修饰。 
肽合成中掺入非天然氨基酸和衍生物的实例包括但不限于使用4-氨基丁酸、6-氨基己酸、4-氨基-3-羟基-5-苯戊酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、叔丁基甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、2-噻吩丙氨酸和/或氨基酸的D-异构体。 
CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds.Coligan等，John wiley&Sons NY(1995-2001)的第15章中提供了蛋白的化学衍生物的进一步实例。 
根据本发明，蛋白质可通过本领域技术人员已知的任何合适的方法制备。 
在一个实施方案中，蛋白质可为基本上纯的天然形式。 
一个具体的实例为纯化的自体玻连蛋白。 
另一个实施方案中，蛋白质可通过化学合成制备。化学合成技术为本领域众所周知的，不过本领域技术人员可以参考CURRENTPROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds.Coligan等，John Wiley& Sons NY(1995-2001)的第18章中合适方法学的实例。 
在再一个实施方案中，蛋白质可作为重组蛋白制备。 
重组蛋白为本领域所众所周知，技术人员可参考例如Sambrook等，MOLECULAR CLONING.A Laboratory Manual(Cold SpringHarbor Press，1989)，尤其是第16和17部分；CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY Eds.Ausubel等，(John Wiley&Sons，Inc.1995-1999)，尤其是第10和16章；以及CURRENT PROTOCOLS INPROTEIN SCIENCE Eds.Coligan等，(John Wiley&Sons，Inc.1995-1999)，尤其是第1、5和6章中描述的标准方案，以上文献均引入本文作为参考。 
重组蛋白可进一步包含融合配偶体(partner)。 
熟知的融合配偶体实例包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、人IgG的Fc部分、麦芽糖结合蛋白(MBP)和六组氨酸(HIS6)，它们对用通过亲和层析分离融合蛋白特别有用。对于用亲和层析纯化融合蛋白，亲和层析的相关基质分别为谷胱甘肽-、直链淀粉-及镍或钴缀合的树脂。许多此类基质可以“试剂盒”形式获得，例如用于(HIS6)融合配偶体的QIAexpressTM系统(Qiagen)和Pharmacia GST纯化系统。 
在一些情况下，融合配偶体还具有蛋白酶如因子Xa或凝血酶的切割位点，其使得相关蛋白酶部分地消化本发明的融合蛋白，从而从中释放重组蛋白。然后释放的蛋白通过随后的层析分离从融合配偶体中分离。 
根据本发明的融合蛋白也包括其范围内的“表位标记”，表位标记通常为可获得特异性抗体的短肽序列。易于获得特异性单克隆抗体的表位标记的熟知实例包括c-真菌、血细胞凝集素和FLAG标记。 
对于表达而言合适的宿主细胞可以是原核或真核细胞，例如大肠杆菌(Escherichia coli)(例如DH5α)、酵母细胞、利用杆状病毒表达系统的Sf9细胞、CHO细胞、COS、CV-1、NIH3T3和HEK293细胞， 但并不限于此。 
本发明进一步考虑了使用细胞例如角质形成细胞或角质形成祖细胞，其能够表达至少一种选自以下的重组蛋白： 
(i)重组IGF； 
(ii)重组IGFBP； 
(iii)重组玻连蛋白； 
(iv)上文所述的重组嵌合蛋白；和 
(v)其它生物活性蛋白例如EGF或bFGF。 
根据一个具体的实施方案，IGF、VN和/或IGFBP的旁分泌/自分泌表达可使角质形成细胞或角质形成祖细胞能够在不含血清的培养基中培养，且不需要向培养基中加入一种或多种生长因子、IGFBP和/或玻连蛋白。 
重组蛋白表达可通过向角质形成细胞或角质形成祖细胞中引入表达构建体而获得。 
典型地，该表达构建体包含可操作地与启动子连接或相连的表达核酸(编码重组蛋白)。 
启动子可以是组成型的或诱导型的。 
组成型或诱导型的启动子包括例如四环素阻抑型、蜕皮激素诱导型、乙醇诱导型和金属硫蛋白诱导型启动子。启动子可以是天然存在启动子(例如α结晶启动子、ADH启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)、人延长因子α启动子和病毒启动子如SV40、CMV、HTLV衍生启动子)或组合一个以上启动子元件的合成杂交启动子(例如SRα启动子)。 
在一个优选的实施方案中，表达载体包含可选择的标记基因。可选择的标记不论是对转化菌(例如bla、kanR和tetR)还是对转化哺乳动物细胞(例如潮霉素、G418和嘌呤霉素)的选择目的都有用。 
表达构建体可通过熟知的方法如电穿孔、微粒轰击、病毒介导的 基因转移、磷酸钙沉淀、DEAE-葡萄糖、阳离子脂质体、脂质转染试剂(lipofectin)、脂质转染胺试剂(lipofectamine)等引入哺乳动物细胞例如角质形成细胞或角质形成祖细胞中，但所述的方法并不限于上述方法。 
关于有潜力应用于角质形成细胞中重组生长因子蛋白表达的方法学的非限制性具体实例，可以参考Supp等，2000，J.Invest.Dermatol.1145和Supp等，2000，Wound Repair Regen.8 26-35。 
药物组合物 
本发明还提供了一种药物组合物，其包含一种或多种使用本发明的培养基和/或培养系统产生的细胞例如但不限于角质形成细胞，以及药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。 
本发明的药物组合物可用于促进或有利于细胞迁移、组织再生和伤口愈合。 
一般地，本发明的组合物可根据需要用于治疗性或预防性处理中。例如，药物组合物可以以治疗制剂或化妆品制剂形式应用于皮肤修复、创伤愈合、烧伤愈合及其它皮肤病学治疗。 
优选地，所述药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂适于给予哺乳动物，优选适于给予人。 
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含根据本发明培养的自体或同种异体的角质形成细胞。 
“药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂”是指可安全用于全身给药的固体或液体填料、稀释剂或包囊物质。根据具体的给药途径，可以使用本领域熟知的各种载体。这些载体可以选自糖、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽、明胶、滑石、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、藻酸、磷酸盐缓冲溶液、乳化剂、等渗盐水和盐如无机酸盐包括盐酸盐、氢溴酸盐和硫酸盐，有机酸盐如乙酸盐、丙酸盐和丙二酸盐及无 致热原水。 
描述药学可接受的载体、稀释剂和赋形剂的有用参考文献是Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.N.J.USA，1991)，该文献引入本文作为参考。 
在特别的实施方案中，所述药物组合物进一步包含抛射剂。 
可以使用任何安全的给药途径为患者提供本发明的组合物。例如可以使用口服、直肠、肠胃外、舌下、口含、静脉内、关节内、肌内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹膜内、脑室内、经皮等途径。 
剂型包括片剂、分散剂、混悬剂、注射剂、溶液剂、糖浆、锭剂、胶囊剂、栓剂、气雾剂、经皮贴剂等。这些剂型还可包括用于此目的特别设计的注射或植入的控释装置或者修改的以此方式作用的其它植入物形式。 
控释制剂可以通过例如用疏水性聚合物包括丙烯酸树脂、蜡、高级脂族醇、聚乳酸和聚乙醇酸和某些纤维素衍生物如羟丙基甲基纤维素包衣而得到。控释可以通过使用其它聚合物基质、脂质体和/或微球而实现。控释制剂和递送装置的非限制性实例包括渗透泵、聚丙交酯共乙交酯(PLG)聚合物基微球、水凝胶基聚合物、化学交联的葡聚糖凝胶例如OctoDEXTM和右旋乳酸盐-HEMA。 
上述组合物可以与剂型相容的方式和药学有效量给予。在本发明中给予患者的剂量应足以在适当的一段时间内在患者体内产生有益的应答。给予的活性剂的量可由要治疗的对象的年龄、性别、体重及其一般健康状况和医生判断而决定的因素来决定。 
关于用于创伤愈合的药物组合物，特别参见美国专利5,936,064及国际公开WO 99/62536，两篇文献引入本文作为参考。 
在一个具体的实施方案中，本发明的组合物适用于原位喷雾递送。 
术语“喷雾”涵盖和包括通常描述小滴形式的液体悬浮液的术语例如“气雾剂”或“雾剂”或“冷凝剂”。 
根据本发明，尽管任选，不过该喷雾或气雾剂组合物可进一步包含选自IGF-I和IGF-II的至少一种IGF或在一个具体的实施方案中包含含有IGF、VN和IGFBP的分离蛋白复合物，以促进皮肤细胞原位生长和迁移。还可以包含其它生物活性蛋白如EGF和/或bFGF。 
尽管不希望被任何具体的理论所束缚，但本发明考虑存在于所述喷雾组合物中的IGF复合物中的VN的固有“粘性”会有利于IGF-I、IGF-II和其它生长因子如EGF和bFGF的递送。 
典型地，本发明的喷雾组合物将通过诸如配备有递送出口的密封罐来递送。 
例如用于猪模型中伤口愈合的气雾化角质形成细胞递送系统的实例已由Navarro等，2000，J Burn Care Rehabil 21 513提供。还参见Grant等，2002，Br J Plast Surg 55 219，其描述了气雾化角质形成细胞和纤维蛋白胶用于猪模型中伤口愈合的应用。 
优选地，本发明的喷雾组合物基本上不含血清。 
在一个具体的实施方案中，本发明的皮肤喷雾组合物包含 
Figure S04822144120060221D000191
(Baxter Healthcare)，其有利于纤维蛋白胶的喷雾施用，通过递送进入调节器控制的压缩医用级气体流中使液体气雾化。在10-30psi之间的压力是适宜的，不过观察到随着压力增加生存力降低。喷雾的细胞的浓度可以为每毫升50-150万个。在20psi下施用0.2毫升的细胞悬液足以覆盖约25平方厘米的面积(基于体外生长7天后细胞覆盖表面积的测量)。细胞优选在无血清生长培养基中递送，但也可悬浮于纤维蛋白胶如可商购获得的Tisseel/Tissucol(BaxterHealthcare)中。 
还考虑了使用注射器(如配有喷雾帽的注射器)递送本发明的组合物可以获得相似的功效。 
治疗应用 
在一个具体的方面，本发明提供治疗烧伤、创伤和溃疡的方法以及与化妆品皮肤治疗有关的方法，用以改善或增强皮肤质量或皮肤外观。 
这些方法特别针对于哺乳动物，更特别是人的治疗。不过，还应理解本发明可以具有用于治疗驯养动物、家畜和工作动物的兽医学应用。 
在一个优选的实施方案中，本发明提供用于使离体的原代角质形成细胞增殖的培养基、系统和方法，这些细胞可根据本发明给予个体。 
在一个具体的实施方案中，角质形成细胞为根据本发明培养的自体或同种异体的角质形成细胞。 
这些方法包括给予上文所述的药物组合物，并且可以是如美国专利6,090,790所述的通过显微针注射入特定的组织部位的方式，可以是如美国专利6,054,122所述的施用于创伤、烧伤或溃疡的局部软膏、洗剂或密封敷料的方式，或者可以是如国际公开WO 99/47070所述的释放该组合物的植入物的方式。 
还存在为产生皮肤替代物的目的通过其对皮肤细胞进行遗传修饰的方法，例如通过对所需要的生长因子的表达进行遗传工程化(Supp等，2000，J.Invest.Dermatol.114 5)。Bevan等，Biotechnol.Gent.Eng.Rev.16 231提供了这一领域的综述的实例。 
还考虑了用转染或转化的细胞“接种”受者，如国际公开WO99/11789所述。 
这些方法可用于刺激细胞迁移并从而有利于或促进创伤和烧伤愈合、皮肤损伤如溃疡的修复、如通过体外培养自体皮肤而进行的组织替代和移植、内脏如肾和肺的表皮细胞再生以及损伤的神经组织的修复。 
皮肤替代治疗在本领域中已熟知，可使用共培养的上皮/角质形成细胞系，例如Kehe等，1999，Arch.Dermatol.Res.291 600所述，或 体外培养的原代(通常是自体的)表皮、真皮和/或角质形成细胞。这些技术也可利用工程化的生物材料和合成的聚合物“支架”。 
Terskikh & Vasiliev，1999，Int.Rev.Cytol.188 41和Eaglestein&Falanga，1998，Cutis 62 1提供了本领域综述的一般实例。 
更具体地，Izumi等，2000，J.Dent.Res.79 798描述了在颅面外科中有用的替代口腔粘膜的制备。胎儿角质形成细胞和真皮成纤维细胞可于体外扩展产生移植用皮肤以治疗皮肤损伤，如Fauza等，J.Pediatr.Surg.33 357所述，而来自体外在透明质酸来源的生物材料上培养的真皮和表皮成分的皮肤替代物已经显示出在烧伤治疗中的潜在应用(Zacchi等，1998，J.Biomed.Mater.Res.40 187)。 
本发明还考虑了聚合物支架用于促进替代皮肤工程化，如Sheridan等，2000，J.Control Release 14 91和Fauza等，1998，同上中所述，以及微球制剂用于将皮肤细胞递送至创伤和烧伤部位(LaFrance&Armstrong，1999，Tissue Eng.5 153)。 
通常为治疗用途制备的角质形成细胞片是烧伤伤口最终闭合的原因。该片移植技术适用于所有的部分皮层烧伤且在治疗无外界帮助伤口和供体部位几乎不可能较早永久闭合的大表面积创伤中最有用。这是在最近的巴厘岛爆炸中导致烧伤患者死亡的损伤类型。 
目前，从患者皮肤活检一片50分币大小的皮肤生长成足以覆盖整个成人的皮肤是可能的。此培养过程需要17天。 
不过，急需更早的皮肤替代以减少患者创伤、感染风险、形成瘢痕和目前对永久性皮肤移植之前昂贵的暂时皮肤替代的需求。另外，培养的皮片包含许多皮肤细胞，一些是成熟的而一些是未成熟的。允许培养的角质形成细胞达到融合(这对产生皮肤片是必需的)的简单行为造成细胞过早地丧失其原始特征即分化。当施用培养的皮肤片时，仅有未成熟细胞能够附着于患者并生长。因为仅小部分面积粘附，所以这些片因患者的摩擦或移动很容易引起损伤，而且有时导致整个 移植片的失去。另外，在片移植中，片中的成熟细胞越多，越可能不发生移植以及细胞本身将不在创面本身上增生和迁移。因而很清楚，越早施用未成熟的皮肤细胞将产生越好的移植发生并减少瘢痕。 
因此本发明提供一种喷雾或气雾剂递送方法，该方法将离体培养的皮肤细胞递送于患者烧伤、溃烂或创伤的皮肤上，能够比现有的片移植技术早得多地以未成熟皮肤细胞覆盖患者身体的更大表面积。此可早至仅7天。这也将显著减少瘢痕形成、休克和热量损失，并将能够更快恢复部分皮层烧伤以及全皮层烧伤的皮肤功能。 
根据本发明，尽管任选，所给予的喷雾剂或气雾剂可进一步包含含有IGF、VN和IGFBP以及EGF和/或bFGF的分离蛋白复合物以促进皮肤细胞原位生长和迁移。 
患者自身的皮肤细胞(自体皮肤)和供者皮肤细胞(同种异体或异种皮肤)可培养并用于早期烧伤闭合。供者细胞不表达移植抗原，因此它们不引起患者的免疫反应。不过供者皮肤细胞最终被患者自身的皮肤细胞所替代。 
尽管优选自体细胞，但皮肤喷雾剂中同种异体或异种细胞的使用可允许立即施用于急需的患者。或者，可在大约七天内培养足够的自体皮肤细胞用于治疗性喷雾。 
本发明考虑的另一治疗为治疗烧伤患者实现全皮层创伤的早期闭合，因为在去除了皮肤表面(表皮)和深层(真皮)的创面上不易获得培养皮肤。本发明考虑了使用真皮替代物联合皮肤喷雾剂来实现这些最严重损伤的早期永久性闭合。考虑的替代物为生物及合成的真皮替代物。例如，来源于尸体的去表皮、去细胞的包含本发明的分离蛋白复合物的真皮支架可以用合成表皮(敷料)来覆盖。约7天后，该真皮本发明的发明人假设该真皮将被自体内皮细胞高度浸润。此时，合成真皮将被移走，而患者自身离体扩展的成纤维细胞和角质形成细胞将被施用于该异体真皮(allo-dermis)。 
预期皮肤喷雾剂而非表皮片会成功，因为真皮替代物作为营养稳定支架将促进皮肤细胞以及通常皮肤中存在的其它重要细胞的迁移和固着。这将在全皮层皮肤损伤中导致改善的培养皮肤细胞的获得。 
为了使本发明更易于理解和用于实际应用，本领域技术人员参考下面的非限制性实施例。 
实施例 
实施例1 
无血清存在下人原代角质形成细胞的生长 
材料和方法 
生长因子浓度/对培养塑胶的预吸附 
加入VN、IGF和IGFBP的标准方法用于所有的研究中。培养塑胶通过在37℃下在无血清培养基中与150ng/cm2的玻连蛋白温育2小时来制备。然后去除VN溶液，并用含有IGFBP(250ng/cm2)、IGF-I(50ng/cm2)和EGF(50ng/cm2)的无血清培养基替代。生长因子于4℃(冰箱中)下过夜以吸附于VN处理的塑胶上。第二天，去除生长因子溶液，并用含有50ng/ml VN、50ng/ml IGFBP、15ng/cm IGF-I和15ng/cm EGF的生长培养基(如下所定义)替代。细胞以下面给出的密度加入。培养基一般每3天换一次。每一培养物培养约6天然后传代：即每代之间约有6天。 
生长培养基 
基础培养基为Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)和Ham’sF12培养基的3∶1混合物，常规补充有L-谷氨酰胺(2mM)、霍乱毒素(0.1μg/ml)、腺嘌呤(180μM)、氢化可的松(0.4μg/ml)和非必需氨基酸混合物(1％v/v)。 
阳性对照培养基包含附加的10％胎牛血清、胰岛素(5μg/ml)和表皮生长因子(EGF，10ng/ml)。 
接种密度 
培养物在25×104/cm2密度的生长停止的小鼠3t3细胞存在下培养。3t3细胞通过使用前立即用γ照射来使得“生长停止”。 
角质形成细胞根据传代数以两种不同的密度接种。初始培养物(P0)通过接种3.8×104/cm2细胞来建立。接着的培养物(P1、P2等)通过再接种6.4×103/cm2密度的收获细胞来建立。P0培养物使用较高的接种密度是因为仅有一部分新收获的细胞将在培养中显示进行的增殖。因而，培养这些细胞能够扩展增殖亚群。 
结果 
与用含血清的常规生长培养基培养的培养物的比较 
参照图1，此图显示了相对于其中胎牛血清和3t3细胞均存在的常规方法，有VitroGro(+3t3细胞)的新分离的角质形成细胞的平均生长。P0、P1和P2相对于细胞已收获和再接种的次号(P0＝从皮肤样品分离后即刻的细胞行为表现)。数据通过MTT染色获得。数据显示在分离蛋白复合物存在而无血清存在下的培养物持续地达到在10％血清存在下达到的细胞生长的至少90％。 
参照图2A和2B，VitroGro上生长的皮肤细胞显示与胎牛血清存在下生长的那些皮肤细胞具有相似的外观(图2A)。目前正在进行基于分子标记物的存在的更详细的比较以确定这一结论。应用的技术将包括免疫细胞化学、荧光活化细胞分类(FACS)分析法、蛋白质印迹法和聚合酶链反应(PCR)方法。也考虑使用最新技术蛋白质组学(proteonomic)和基因阵列技术。研究的主要标记物将包括细胞角蛋白(CK1和CK10，CK6，CK14和CK19)和推定的角质形成祖细胞标记物(例如p63、α9-整联蛋白、α6-整联蛋白bri/CD71dim)。特别地应将注意力放在比较推定的祖细胞标记物的表达上，因为它们很可能关系到移植后培养物的临床功效。另外，也可进行常规的体外功能测定检测细胞的反应(粘附、迁移、增殖)。 
参照图3，很清楚包含IGFBP5的分离蛋白复合物比含有IGFBP3的复合物就角质形成细胞产生而言更有效。 
实施例2 
无血清存在下有或无饲养细胞的人原代角质形成细胞的生长 
材料和方法 
原代角质形成细胞培养 
使用基本上与Rheinwald&Green，1977，Nature 265 421的原始报道相同的标准方法从成人皮肤分离出角质形成细胞。简单地，其包括37℃下在Dispase II溶液中消化皮肤样品一小时。之后将回收的上皮细胞在37℃下用0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA再消化10分钟以分离细胞。灭活残余的胰蛋白酶活性，然后清洗回收的细胞，共接种在含或不含致死量照射的3T3小鼠成纤维细胞的组织培养皿中。使用这些标准条件培养的“对照”细胞在补充有10％胎牛血清、0.1％青霉素-链霉素溶液、0.4μg/ml氢化可的松、0.1μg/ml的霍乱毒素、10ng/ml人重组表皮生长因子(EGF)、5μg/ml胰岛素、5μg/ml运铁蛋白和2nM三碘甲状腺原氨酸的DMEM/F12培养基中生长，而用分离生长因子复合物处理的细胞使用除了不含胰岛素外其它均相同的培养基。在用以与分离蛋白复合物处理组合的培养基中不含胰岛素以最小化胰岛素与1型IGF受体的竞争性结合。分离生长因子复合物包被皿上培养的细胞也不同于根据标准方法培养的细胞，因为这些细胞将接种在不具有照射的小鼠成纤维细胞的板上。 
蛋白合成测定 
角质形成细胞来源于成人皮肤活检物，并采用加入Green培养基、血清和饲养细胞的标准方法扩展直至第2代。然后评价这些细胞在IGF+VN复合物存在或不存在下对蛋白合成的刺激。这里，24孔板以300ng玻连蛋白包被2小时，然后清洗去除未结合的玻连蛋白。 然后孔与要检测的生长因子以及胰岛素样生长因子结合蛋白-5一起培养，所述的生长因子即：表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II，加入孔中，并允许与玻连蛋白过夜结合。第二天清洗孔两次以去除任何未结合的生长因子，使板风干。然后收获角质形成细胞并以1×105个细胞/孔的密度与1uCi/孔的[3H]-亮氨酸一起接种在无血清的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中。在选择的孔中，将细胞接种在Define KeratinocyteMedia(DKM)(Invitrogen)中，Define Keratinocyte Media是一种可商购获得的用于角质形成细胞无血清培养的产品。然后将板培养48小时，然后清洗去除任何未掺入的[3H]-亮氨酸。通过从溶解的蛋白沉淀物取样进行β-闪烁计数来测定[3H]-亮氨酸对重新合成的蛋白的掺入。 
MTT-Esta测定 
使用带有受致死量照射的小鼠3T3细胞饲养层的全补充Green培养基的标准培养技术分离人角质形成细胞并建立培养物。细胞扩展至第3代并接种于胎牛血清(FCS)和3T3细胞存在或不存在的Green培养基的24孔板中。在选择的处理中，孔用分离蛋白复合物包被。孔与300ng玻连蛋白一起温育2小时，然后吸出，之后加入IGF-I和IGFBP3或IGFBP5，或IGF-II。将培养板过夜培养并在接种细胞前吸出。评价培养物的代谢活性，采用以前描述的MTT-esta测定法(Ealey等，1988，J Mol Endocrinol 1：R1-R4)来测定。 
结果 
鉴于细胞系中用分离生长因子复合物得到显著增强的功能反应(国际公开WO 02/24219；Noble等，2003，同上；Kricker等，2003，同上)，我们最近将我们的研究扩展至源自成人皮肤的角质形成细胞的培养物。特别地，我们检测了分离生长因子复合物替代目前用于分层自体移植的角质形成细胞的离体扩展的最佳临床实践中的血清和饲养细胞的潜能。尽管该方法是烧伤患者可利用的具有显著进步的治 疗，但是源自患者的角质形成细胞的培养是在胎牛血清(FBS)存在下进行的，胎牛血清是成分半确定(semi-defined)的生物异源产品，是一种潜在的病原。另外，在角质形成细胞衍生和建立的早期，使用源于另一种物质即小鼠3T3成纤维细胞的饲养层作为细胞因子和基质成分的来源以促进细胞附着和生长。FBS也对这些作用有贡献。 
因为(i)IGF占饲养细胞分泌的细胞因子的大部分；(ii)我们已经确定，VN代替对血清的任何需要而促进以低密度接种的原代培养的角质形成细胞对塑料器皿的附着；(iii)我们用在分离生长因子复合物上培养的角质形成细胞系获得的效果与用含10％FBS的培养基得到的效果相当，所以我们假设补充有分离生长因子复合物的培养基具有提供更好的自体角质形成细胞工程应用的潜力。此假设由IGF为刺激角质形成细胞增殖的关键促分裂原，而角质形成细胞本身并不分泌IGF-I的事实所支持。尽管无血清培养基如KGMTM(Clonetics)和EpiLifeTM(Sigma-Aldrich)已商业化地开发出来用于角质形成细胞的扩展，但是这些培养基需要加入牛垂体提取物，其也是成分不确定(undefined)的生物异源物质和潜在的病原，或者需要加入昂贵的补充物。另外，当前大多数无血清角质形成细胞培养基的应用要求非常高的接种密度，这使试图快速培养大量的角质形成细胞的目的失败并导致这些实践很少被常规临床应用所采用。 
我们直接检验了我们的假设，结果例示于图4中。在此实验中，角质形成细胞源自成人皮肤并使用常规方法建立，生长7天。然后细胞通过胰蛋白酶作用传代并以低密度(8500个角质形成细胞/cm2)接种于分离生长因子复合物包被的组织培养塑胶上，并且在无饲养细胞、去除FBS和胰岛素(图4)下再培养7天。发现在这些条件下培养的细胞比仅采用目前最佳临床实践(即在FBS和3T3存在下培养；图4)培养的细胞扩展更快速。在分离蛋白复合物存在下生长的集落的边缘表明角质形成细胞外观上是移动的、健康的和正在增殖的。图4中所示 的最里面的细胞显示在接近融合的角质形成细胞培养物中观察到的典型扁平形态，以及在该情况下仅7天得到的融合。通过MTT测定法对在这些蛋白复合物存在下角质形成细胞增殖的定量证实了这些结果(图4B)。 
后来的数据趋于表明角质形成细胞在无饲养细胞(也无血清)存在下生长良好的能力限于细胞培养的后期，因为饲养细胞似乎对来自初始活检物的培养物的建立是重要的。 
其它生长因子EGF和bFGF的作用显示于图5中。我们检测了第3代人皮肤角质形成细胞(源自成人皮肤活检物)并评价了通过补充IGF+VN复合物48小时对蛋白合成的刺激。这些处理用在确定的角质形成细胞-SFM(DKM)(Invitrogen)中培养的细胞平行测试，确定的角质形成细胞-SFM是可商购获得的用于角质形成细胞无血清培养的产品，其包含不确定量的胰岛素、EGF和bFGF。发现DKM刺激蛋白质合成的增加高于对照孔(-VN)148％，其显著性地高于(p＜0.05)单独使用VN(+VN)或无VN和生长因子(-VN)的作用。二聚物IGF-II+VN复合物和三聚物IGF-II+VN+IGFBP-5复合物也分别显著地刺激蛋白质合成增加134％和161％(p＜0.05)。实际上对于DKM、二聚复合物和三聚复合物观察到的蛋白质合成的刺激作用没有显著性差异(p＞0.05)，表明这两种复合物与商购的DKM相比在刺激角质形成细胞蛋白质合成上是等效的。 
当EGF、bFGF或两种生长因子组合加入三聚复合物中时，观察到有216％、248％和213％的增加。所有这些反应均显著高于DKM(p＜0.05)。另外，当EGF或者EGF和bFGF加入二聚复合物中时，分别得到蛋白质合成192％和198％的显著地增加，其也显著地高于DKM(p＜0.05)。这些结果突出表明将EGF和bFGF加入蛋白复合物中刺激比商购获得的用于角质形成细胞无血清和无饲养培养的产品更高的蛋白质合成。 
实施例3 
皮肤喷雾技术 
材料和方法 
这有两点要强调。首先，VitroGro上产生了足够数量的细胞以支持一周内的喷雾细胞悬液的施用。因此该技术与已商用的技术(Clinical Cell Culture Ltd)相当，但具有无血清的优点。第二，VitroGro上生长的细胞喷雾后保持存活。我们所用的递送系统为 
Figure S04822144120060221D000291
(Baxter Healthcare)。Tissomat递送系统被设计用于纤维蛋白胶的喷雾施用，通过递送进入调节器控制的压缩医用级气体流中使液体气雾化。不过，我们也预期使用其它的喷雾方法(配有喷雾帽的注射器)能获得相似的结果。在10-30psi之间的压力是适宜的，不过观察到随着压力增加生存力降低。喷雾的细胞的浓度可以为每毫升50-150万个。在20psi下施用0.2毫升的细胞悬液足以覆盖大约25平方厘米的面积(基于体外生长7天后细胞覆盖表面积的测量)。细胞可在无血清生长培养基中递送，但也可悬浮于纤维蛋白胶例如可商购获得的Tisseel/Tissucol(Baxter Healthcare)中。我们的研究表明纤维蛋白胶应在使用前调整，通过用注射用无菌水稀释至等渗状态并进一步用无菌盐水将最终的纤维蛋白胶成分调整至1-10mg/ml的纤维蛋白原和10-100单位/ml的凝血酶。 
结果 
图6显示喷雾递送角质形成细胞至直径150mm的胶原蛋白包被的培养皿后细胞分布和生长。重要地，喷雾后VitroGro上生长的细胞显示良好的生存力。细胞以两种不同的浓度喷雾以确定所需覆盖喷雾面积的细胞数。用于喷雾的培养物最初在对照(有血清)或有IGFBP3和IGF-I的玻连蛋白(VitroGro)上生长。所有培养物在3t3细胞存在下制备。喷雾后，细胞在血清存在下生长以模拟在创面上可能经历的 条件。培养物用结晶紫染色以显示细胞分布。 
如图7中所示，可见用Tissomat递送系统喷雾培养的角质形成细胞的效果。对于这些初步实验，培养物使用添加血清和饲养细胞的常规培养基建立。图7A中，锥虫蓝排除试验在喷雾细胞入收集管后数分钟内进行，其基于染料不能透过成活细胞的原理进行。如图7B中所示，MTT转化数据为更有力的生存力的量度，因为其提供喷雾后细胞24小时具有代谢活性的指示。 
在图7A和7B中，可以看到最佳的递送压力为10-20psi，不过在30psi的递送压力下生存力仍是可接受的。 
实施例4 
皮肤喷雾临床试验 
皮肤活检物的获得 
选择合适的供体部位，并通过剃毛和用消毒剂擦拭来准备。在手术室中局麻下取大约10平方厘米面积的分层皮肤移植物。将该活检物置于含抗生素的无菌盐水溶液中，并立即送至皮肤培养实验室进行处理。供体部位将根据参见的外科医生的判断以Opsite或其它敷料敷盖。 
角质形成细胞的分离和培养 
当皮肤培养物运送到时，每个患者的活检物将在无菌缓冲液中清洗并在室温下于抗生素中温育1小时以减小在随后的培养中污染的可能性。表皮和真皮层将通过胰蛋白酶消化分离。刮擦该分离组织的对面，刮下的细胞(主要为基底角质形成细胞)经清洗并重悬于含大豆胰蛋白酶抑制剂的无血清培养基中。将最终的细胞悬液接种在含有生长停止的小鼠3t3成纤维细胞(2.5×104/cm2)和5ml DMEM/F12培养基的25cm2的组织培养瓶中，该DMEM/F12培养基中补充有玻连蛋白(VN，50ng/cm2)、胰岛素样生长因子I(IGF-I，15ng/cm2)、胰岛素 样生长因子结合蛋白5(IGFBP5，50ng/cm2)、表皮生长因子(EGF，15ng/cm2)、腺嘌呤(180μM)、霍乱毒素(0.1μg/ml)、L-谷氨酰胺(2mM)、氢化可的松(0.4μg/ml)和非必需氨基酸(1％v/v)。培养瓶用VN(300ng/cm2)、IGF-I(100ng/cm2)、IGFBP5(500ng/cm2)和EGF(100ng/cm2)预处理以促进蛋白复合物的预吸附。培养3天后使用新鲜培养基。培养6天后，通过在含EDTA的缓冲盐水中温育去除3t3细胞。剩下的角质形成细胞通过再与胰蛋白酶/EDTA温育来收获，并在含大豆胰蛋白酶抑制剂的缓冲盐水中洗涤。将回收的细胞调至2×106/ml的浓度并于含0.2％人血清白蛋白的缓冲盐水中送至手术室。 
角质形成细胞悬液的制备和递送 
根据厂商说明书将TISSEEL Duo  
Figure S04822144120060221D000311
置于37℃下解冻。一旦解冻，纤维蛋白原和凝血酶注射器从其各自的固定器上移出并施予到无菌塑胶管中。纤维蛋白原成分用注射用无菌水1∶1稀释，然后进一步用储备的患者细胞悬液(2×106个细胞/ml，如步骤2中制备)1∶4稀释。凝血酶成分将用注射用无菌水1∶0.25(即4∶1)稀释。将等体积的每种改进成分(纤维蛋白原+细胞和凝血酶)装入单独的1ml注射器中并经由Duploject喷雾嘴与TISSOMAT连接。施用中，两个注射器相等地下压使得各成分进一步1∶1混合。因而，喷雾产品中的最终浓度为：0.8×106个细胞/ml、170IU/ml的凝血酶和4.7mg/ml的纤维蛋白原。大约0.5ml的混合溶液将从10cm的高度在20psi下连续地递送至每个20cm2的分层创面上。因此施用细胞的平均接种密度将为0.2×105/cm2。每次喷雾的高度和距离(interval)与手宽(高度)和三个手指的总宽(距离)近似。在进行常规的分层自体移植(烧伤治疗或挛缩缓解)的过程中，进行伤口的治疗。喷雾中每个伤口均约有一半用无菌罩覆盖用作未经治疗的对照。可以使用两个供体部位：一个经治疗的，另一个未经治疗的。每个伤口将在细胞悬液施用之前和之后进行拍照。治疗的伤口将用Opsite硅酮敷料覆盖。 
根据已建立的方案进行手术后的临床护理和评价。 
实施例5 
ORS来源的细胞的生长和迁移 
原代外根鞘(ORS)培养物来源于从同意的糖尿病患者的头皮获得的生长期毛囊并用Limat & Hunziker，2002，Cells Tissues Organs 17279-85和国际公开WO 01/59442所述的方法培养。细胞将使用预形成的人有丝分裂后真皮成纤维细胞饲养层和上述的用于皮肤来源的角质形成细胞的补充有胎牛血清的培养基进行离体扩展。培养物将维持在亚融合状态以用于最大量的三代传代及进行分离蛋白复合物存在而无血清和饲养细胞存在下的细胞生长的形态和功能评价。 
对确定为皮肤来源的角质形成细胞生长的最佳的特定复合物进行测试。 
建立了离体扩展的ORS来源的角质形成祖细胞在分离蛋白复合物存在下的生长和迁移，然后确定来自生长期ORS的细胞的初始衍生以及其后的原代培养是否也能在无血清和无饲养细胞条件下进行。因此，生长期毛囊的ORS将外植至细胞培养插入物的微孔膜上，并且代替用有丝分裂后真皮成纤维细胞饲养层包被膜插入物的下面，将用分离蛋白复合物包被该下表面。细胞将只在无血清培养基中或得自患者的自体血清补充的培养基中或含有分离蛋白复合物的培养基中生长。使用标准方法将分离蛋白复合物存在下培养的ORS来源细胞的生长速度与插入物上培养的细胞相比较。 
也将通过如Limat&Hunziker，2002，同上所述的将细胞与空气接触来制备表皮等价物(equivalent)，并通过组织学、超微结构(例如基底膜样结构、透明角质颗粒、角蛋白小体)和免疫组织化学(例如角蛋白、整联蛋白、gp80、内皮蛋白、丝角蛋白)标准进行表征。如果成功，ORS来源祖细胞和此生长因子+VN技术的使用将不仅显著减少 生产成本，也将增加安全性，从而加速与基于细胞的治疗的批准相关的管理问题。 
实施例6 
纯玻连蛋白的制备 
患者血液纯化的自体VN(典型以0.4mg/ml存在)将用于支持患者自身的角质形成细胞的离体生长。我们将评价针对玻连蛋白产生的单克隆抗体，其已成功用于从人血清中纯化玻连蛋白(Underwood等，2001，J Immunol Methods.247 217-24)。选择用于评价的单克隆抗体将采用与从血清中纯化VN所述的相似方法来与支持纯化基质偶联。此时，我们估计将需要0.25mg VN来培养1m2的患者细胞，这应当很容易从20 ml患者血液中得到。将改良Underwood等，2001，同上的纯化方法，重点在于最小操作性和简单化：目的是研发出理想地仅需2-3步清洗步骤的一次性亲和纯化基质。由于VN将来自患者自身，因此对纯VN的需求降低，只要得到的VN仍能有效地促进细胞生长。因此将评价使用研发的方案纯化的VN对于促进角质形成细胞生长的功效，以及通过标准生化分析例如SDS-PAGE、N-末端蛋白质测序、电喷雾质量分析、IGF-和IGFBP-结合来评价，并与从Promega Pty.Ltd购买的VN相比较。 
本说明书的目的是描述本发明的优选实施方案，而不将本发明限定于任一个实施方案或特定的特征集合。因此，本领域技术人员会理解，根据本发明公开的内容，可以对举例的具体实施方案进行各种不偏离本发明范围的修饰和改变。 
本文提及的所有计算机程序、算法、专利和科学文献在此均引入本文作为参考。 

Claims (30)

1.一种哺乳动物上皮细胞培养基，其包含：
(i)选自IGF-I和IGF-II的至少一种IGF，其中，当IGF-I以非IGF-I/VN合成嵌合体的形式存在时，所述培养基包含选自IGFBP3和IGFBP5的胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)；
(ii)玻连蛋白(VN)或其整联蛋白结合结构域；
(iii)表皮生长因子(EGF)和/或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)；和
(iv)无血清或在不含所述的至少一种IGF的情况下不支持上皮细胞生长的量的血清。
2.权利要求1的哺乳动物上皮细胞培养基，其中血清不存在或以不超过1％v/v的浓度存在。
3.权利要求2的哺乳动物上皮细胞培养基，其中血清以不超过0.5％v/v的浓度存在。
4.权利要求3的哺乳动物上皮细胞培养基，其中血清以不超过0.1％v/v的浓度存在。
5.权利要求1的哺乳动物上皮细胞培养基，其中血清不存在。
6.权利要求1的哺乳动物上皮细胞培养基，其中所述IGF为IGF-II。
7.权利要求1的哺乳动物上皮细胞培养基，其中所述IGF为IGF-I。
8.权利要求1的哺乳动物上皮细胞培养基，其中所述IGFBP为IGFBP3。
9.权利要求1的哺乳动物上皮细胞培养基，其中所述VN结构域不包含肝素结合结构域(HBD)。
10.权利要求9的哺乳动物上皮细胞培养基，其中所述VN结构域包含聚阴离子区域。
11.权利要求10的哺乳动物上皮细胞培养基，其中所述VN结构域能够结合αv整联蛋白受体。
12.权利要求11的哺乳动物上皮细胞培养基，其中所述VN结构域能够结合选自αvβ3整联蛋白或αvβ5整联蛋白的整联蛋白受体。
13.权利要求1的哺乳动物上皮细胞培养基，其中玻连蛋白(VN)为纯化的自体玻连蛋白(VN)。
14.权利要求1的哺乳动物上皮细胞培养基，其包含分离蛋白复合物形式的IGF-I、IGFBP和玻连蛋白或其整联蛋白结合结构域。
15.权利要求1的哺乳动物上皮细胞培养基，其包含分离蛋白复合物形式的IGF-II和玻连蛋白或其整联蛋白结合结构域。
16.权利要求13或权利要求14的哺乳动物上皮细胞培养基，其中所述分离蛋白复合物为合成的嵌合蛋白。
17.权利要求1的哺乳动物上皮细胞培养基，其用于培养上皮细胞。
18.一种哺乳动物上皮细胞培养系统，其包含培养容器和权利要求1-17之任一项的哺乳动物上皮细胞培养基。
19.权利要求18的哺乳动物上皮细胞培养系统，其包含固定、结合或缔合于所述培养容器的玻连蛋白和/或纤连蛋白或其整联蛋白结合结构域。
20.一种哺乳动物上皮细胞培养方法，所述方法包括在权利要求18或权利要求19的哺乳动物上皮细胞培养系统中培养一种或多种哺乳动物上皮细胞的步骤。
21.权利要求20的方法，其中至少部分的培养持续时间中不存在饲养细胞。
22.权利要求20或权利要求21的方法，其中所述的一种或多种哺乳动物上皮细胞为角质形成细胞或角质形成祖细胞。
23.权利要求20或权利要求21的方法，其中所述的一种或多种哺乳动物上皮细胞为角膜细胞。
24.一种制备用于气雾剂递送角质形成细胞或角质形成祖细胞的药物组合物的方法，其包括以下步骤：根据权利要求20-22之任一项的方法培养一种或多种角质形成细胞；和将所培养的角质形成细胞与药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合。
25.权利要求24的方法，所述药物组合物进一步包含抛射剂。
26.权利要求25的方法，所述药物组合物进一步包含纤维蛋白胶。
27.权利要求26的方法，所述药物组合物进一步包含选自IGF-I和IGF-II的至少一种IGF。
28.权利要求27的方法，所述药物组合物包含分离蛋白复合物形式的IGF-I、IGFBP和玻连蛋白或其片段。
29.权利要求27的方法，所述药物组合物包含分离蛋白复合物形式的IGF-II和玻连蛋白或其片段。
30.根据权利要求24-29之任一项的方法制备的药物组合物在用于皮肤原位再生的药物的制备中的用途。
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