CN1827766A - 体外细胞的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及体外培养细胞的方法，该方法包括：1)获取从哺乳动物体预定部位分离得到的组织细胞或组织；2)将细胞生长调节剂添加到培养基中形成组织培养基，所述细胞生长调节剂,按该细胞生长调节剂总重量计算,含有0.01重量％－20重量％的甾醇化合物、0.001重量％－2重量％的黄芩甙和1重量％－20重量％的蜂蜡；3)在组织培养基中培养所述的分离得到的组织细胞或组织。

Description

体外细胞的培养方法

本申请是申请号为02102890.7，申请日为2002年1月29日，发明名称为“体内原位培植再生干细胞实现组织修复和器官再生的组合物”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及体外培养细胞的方法。本发明涉及一种组织生理修复和器官功能性再生的组合物，更具体而言，涉及一种组合物，它能够通过诱导体内原位多能性再生干细胞，使之增殖，实现哺乳动物和/或人体组织的生理性修复和再生具有完全功能的人体器官。本发明还涉及该组合物的使用方法和/或其他用途。

背景技术

大规模生产细胞培养物和生物材料方面的技术进步，使组织工程学行业正在加速地发展，这些产品均是在体外，即动物或人体的体外产生或合成，然后移植到宿主身上，达到组织修复或其它治疗的目的。

现代组织工程学的方法之一是将一种合成的材料移植进人体，作为结构性支架，支撑组织的生长。例如，Etex公司(该公司位于美国马里兰州剑桥)生产的α-BSM合成骨替代物可以应用于整形外科、牙科和颅面。α-BSM是一种极小的水晶状钙磷酸盐，它模仿骨骼中矿组合物含量的组成成份和结构。当这种材料与盐混合时，变为糊状，可注射进入空隙中，也可植入体内，用作可塑性的油灰。一旦这种材料置入适当位置，体温的升高会使之变硬。结果，植入物成了一个支架，最终被吸收，由新的骨组织替代。

组织工程学的另一种方法是利用与合成物相反的生物基体，为受损或患病组织的修复和再生提供基础。取新鲜的人体尸体皮肤，通过一定的控制手段，即，除去皮肤以及真皮上的细胞，但不改变细胞外基质和基底膜复合体，可制成非细胞皮肤基体[参见Wainwiright的文章：(1995)，Burns杂志的21期第243-248页]。为弥补人体尸体皮肤的匮乏，采用同样的方法，也可用新鲜的动物，如猪皮肤制成非细胞真皮基质[参见Liversey等的文章：(1995)，Transplantation杂志60：1-9]。最近LifeCell公司(位于新泽西州Branchburg)发明了用化学方法处理人体皮肤，生产出人体皮肤基质。通过这种化学方法，可以去除所有的皮肤细胞，但保留生物活性和结构性皮肤基质。有人认为，这样一种结构性、生物化学性完好无损的非细胞基质可以提供一种信息的立体式结构排列，在一个正常的再生反应中指导血管再形成和恢复。非细胞人皮肤基质可用作同种异体移植物，即从捐赠者而不是宿主本人身体获得的移植物。将基质在液氮中冷冻，然后破裂成100个微米小粒，这些直径很小的非细胞血管移植物可发育为冠状动脉分流程序中自体移植血管的替代物。

皮肤的创面愈合代表了组织工程学的一个主要目标。皮肤创面的修复涉及了炎性细胞、血管细胞、结缔细胞、组织和上皮细胞的定期平衡活性。大面积或深度创面的传统疗法采用了所谓的干燥疗法，即，使创面置于一个温暖干燥的环境中结痂。目前所用的方法用临时的敷料覆盖创面，进行局部治疗，包括使用抗生素(如SD-Ag磺胺嘧啶银)。附属发明，如外科清创，通常用于去除焦痂或已死亡的组织。对于烧伤创面，切线式切除部分或全层创面的外科方法尽管存在着一些缺陷，如在大面积创面中造成失血，却仍在广泛应用。采用此种方法时，先将创床准备好，随后用自体移植皮或临时敷料覆盖创面，以促进愈合。

自体移植皮取自于宿主，用作病人自身创面的永久性覆盖物。由于移植皮来自于病人本身，又植回到病人自身，可以避免与免疫相关的问题。移植皮可取自于病人身上相邻的未损伤部位，在质地、颜色和厚度上力求相近。对于小面积创面，通过网孔仪器，扩张自体移植皮的面积，可使愈后皮肤达到很好的质量[参见Tanner等(1964)在Plastic Reconstr.Surg.34：287-292；Richard等(1993)在Burn Care Rehabil.14：690-695]。但是，过多的网眼通常导致愈后皮肤易于被感染，且呈筐条状，在外形上不美观。研究人员还开发了一些替代方法，如Meek岛移植皮或三明治移植皮，它比网眼皮肤更容易处理，使自体皮大大扩展[参见Meek(1954)Am.J.Surg杂志96：557-558以及Kreis等(1994)Burns杂志10(增补1)S39-S42]。

但是，自体移植方法在治疗大面积创面病人时面临着不少的困难和限制。人们意识到，在治疗深度烧伤或大面积创面时，利用病人的自体皮供皮区无法使创面快速地完全封闭。在这样的病人身上很难再找到适合的健康皮肤供皮区，从同一供皮区取皮存在时间限制，通常在同一区域再次取皮需要等上几个星期，为的是等供皮区的愈合。这样，“主”创面，即原来需要治疗的创面就会延误愈合，增加了出现并发症的危险。更严重的是，采集自体皮实际上是在正常的健康皮肤上产生了第二次创面，增加了感染的危险和体液/电解质的失衡。此外，从同一供皮区重复取皮会导致外形缺陷或形成疤痕，因而造成病人容貌畸形。

为了找到以上所述的自体同源分层移植皮的替代物，人们利用复合自体同源一同种异体的皮肤置换法开发了两步走程序。这种移植皮由皮肤异体皮(除去了表皮，用作病人的真皮替代物)和用病人自身的角质细胞在体外重组的自体表皮组成[参见Cuono等(1986)，Lancet杂志，17：1123-1124；Compton等(1986)Lab.Invest.60：600-612]。这种自体表皮通常在体外组建，方法由Rheinwald和Green创立[参见(1975)Cell杂志6：331-344]。这种技术方法是：用胰岛素和嗜热菌蛋白酶消融一小块健康皮肤活组织，以便从表皮的基底层中分离出角质细胞，通过在体外培养自体角质细胞，可获得大量细胞，生成足够多的表皮，用于移植。

这种两步走的方法有不少限制，第一，在实验室生长培养表皮层至少需要3周，这将会延误创面覆盖。为了获得治疗成功，在整个表皮层生产和创床的移植过程中均要求具备非常尖端的实验室以及训练有素的医生。在缺乏这些条件的实验室和人力资源的地区，如战场和发展中国家的乡村地区，这种限制显得尤为突出。第二，这种重建的表皮层需要移植到一个干净的创床上，因为它们对细菌感染和残存的杀菌剂非常敏感。因此，正确准备创床对于这些脆弱的表皮层的存活至关重要。更值得注意的是，尽管表皮层可以依附在真皮上，但相对于天然皮肤而言，这两层的连接是人工的。由于表皮下的真皮室的再生是一个冗长的过程，因此至少在三年内皮肤很脆弱，且经常出现水泡。此外，愈合皮肤的外观不如分层皮片移植的效果好。

为了给培养的表皮层提供皮肤结构，促进移植皮的存活，同种异体皮被用来覆盖创面。清创后，将同种尸体异体皮覆盖于创面，切除异种表皮，保留创面上的异体真皮。然后，在切除了表皮的尸体异体皮上移植培养的表皮层。尸体异体皮是无生命的，因此其抗原性大大降低。

为了克服由于培养自体表皮层的时间长而耽搁移植的相关问题，在临床和实验中对异体培养表皮层进行了试验。遗憾的是，尽管异体皮不含Langerhans细胞，小鼠身上进行的移植约两周后还是出现了排斥反应[参见Rouabhia，Transplantation杂志，56：259-264]。

异种移植皮，即，其它动物的组织，也可用来覆盖大面积创面。猪的皮肤由于与人皮肤最接近，因而是最常用的异种移植皮来源。消毒(即离子放射)以及冷冻—干燥方法可以降低猪移植皮的抗原性，以及增加抑制细菌生长的能力。异种移植皮最常用作II度烧伤的临时覆盖物，特别是用在早期切痂后[参见Pellet等(1984)Burn WoundCoverings，Wise DL主编，Boca Raton，CRC出版社，佛罗里达州，1：85-114]。

为了利于培养的表皮皮片移植后能够存活，以及预防异种组织的排斥，研究人员研制了人造真皮基质用以覆盖创面。它们可用来促进大面积切除全厚皮层创面的覆盖、控制体液丢失和预防感染。这样的人造真皮基质包括：1)由尼龙或polyglactic酸网眼组成的合成网眼，成纤维细胞可在上面进行培养[参见Rennekampff等(1996)杂志：J.Surg.Res.62：288-295]；2)由成纤维细胞和牛胶原混合而成的胶原胶冻[参见Yanna等(1981)杂志：Trans.Am.Soc.Artif.Intern.Organs 27：19-23]；以冻干的胶原基质为基础的胶原海绵，成纤维细胞可在上面培养和迁移[参见Bell等(1979)杂志：Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：1274-1278及Bell等(1981)杂志：J.Invest.Dermatol.81S2-S10]；胶原膜[参见Ruszczak等(1998)杂志：Ellipse 14：33-44]；以胶原基质为基础在体外重建的类皮肤产品[参见Sabolinski(1996)杂志：Biomaterials 17：311-320]。

异种皮移植方法在创面临床治疗上有一些局限性，尤其是在免疫原性和生物相容性方面。移植宿主与器官异种移植产生反应的自然抗体水平与所用的异种动物的动物种类史距离成正比增加。在器官移植中，这些抗体的出现导致过急性排斥(一般发生在血管再形成后的几分钟和几小时内)，以及移植组织的丢失。

为了提供大量的角质细胞在体外重建自体或异种表皮层，人们投入了大量的精力进行人体角质干细胞的培养。形成表皮基底层的角质细胞具有增殖能力，因此它们有规律地经过有丝分裂、分化和向上移动，取代在环境中不断脱落的末端分化的角质化细胞。表皮依赖于角化干细胞的出现实现创面愈合。干细胞最基本的、重要的也是必不可少的特性是具有广泛的自我维持能力，至少在长达有机体的一个生命周期内，它可以增殖性地自我更新[参见Lajtha(1979)杂志：Differentiation 14：23-34]。因此，干细胞可以分裂生成短暂扩充细胞，其进而分化为一种或多种专门类型的细胞。

角质干细胞和短暂扩充细胞位于表皮基底层和毛发基体[参见Lavker等(1983)杂志：J.Invest.Dermatol.81：121s-127s；Rochat等(1994)杂志：Cell 76：1063-1073]。在制备移植用的表皮皮片时，在培养物中培养基底角质细胞，生成大量的子代。在培养环境中维持这些干细胞是有较大难度的。对角质细胞培养系统的质量必须仔细监控，如直接证实培养物中完全克隆是否出现，角质细胞参照细胞系的定期克隆分析，包括克隆形成能力和生长潜力，以及监控失败克隆的百分比等等。不当的培养条件会不可逆地加速克隆改变，迅速导致干细胞的消失，使培养的自体移植皮或异体移植皮移植无效。

除了角化干细胞，在细胞培养中也培养其它类型的干细胞，以期提供足够数量的细胞进行组织修复或用于其它治疗。在适当的条件下也可培养胚胎干细胞(ES)。Thomson等展示了来自哺乳动物胚囊的内细胞群的细胞可以在组织培养中得以维持，在这样的条件下，它们可以无限期地增殖为多能性干细胞[参见Thomson等(1998)：Science 282：1145-1147]。从胚囊的内细胞群分离出原始胚囊，接种于成纤维细胞层，在其间形成内细胞群衍生的细胞群。取出内细胞群衍生的细胞团，将其分散为游离细胞，再重新接种于胚胎滋养层。选择具有简洁形态、含高核仁/细胞质比率细胞的克隆，以及突核仁，而后培养所选克隆的细胞。用这种方法，建立了primate胚胎干细胞系。据观察，在体外经4～5个月的未分化增殖，这些细胞仍保留了发育潜力，形成胚胎滋养层和所有三个胚胎胚层的派生物，包括内脏上皮(内胚层)；软内、骨骼、平滑肌以及纹状肌(中胚层)；以及神经上皮、胚胎神经中枢和复层鳞状上皮(外胚层)。因此，可以想像，这些胚胎干细胞可以在适宜的条件下培养和调控，哄诱多能干细胞分化成某一特定类型的细胞，以及/或在体外形成各种器官。这些细胞和器官有望用作移植物，治疗各种疾病和取代功能不全的身体部位。

体外胚胎发育过程具有不知预知性，是可望不可及的。胚胎干细胞分化成一种特定类型的细胞或器官的条件难以捉摸。研究人员发现，要维持培养的胚胎干细胞的相对未分化的、多能性状态，它们就必须表达固有的转录因子Oct4，并基本接收来自细胞活素白血病抑组合物(LIF)的外来信号[参见Nichols等(1998)杂志：Cell 95：379-391]。当LIF撤出时，培养的胚胎干细胞会自动地聚合成一大堆各种类型的组织。尽管在这些细胞中基因表达的程序有些类似于发育动物的典型分化路径，但这些程序的引发是混乱无序的。

在临床上利用体外培养的干细胞进行成功的器官再生面临着诸多障碍。体外培养的干细胞一旦被移植到患病部位，就必须被指引分化为某一特定部位的显型。因此为了指导体外组织条件的设计，对这个过程所需信号需要进行完全的译解。一些研究人中获得的实验资料在技术上显示，尽管通过在培养基中添加白血病抑制剂，可实现多能人间叶细胞、小鼠神经干细胞和小鼠胚胎干细胞在体外的生长，但小鼠胚胎干细胞在体外和体内呈随机性分化。技术上的进步将有可能使小鼠胚胎干细胞(ESCs)在体外被诱导分化为多能性神经胶质细胞前驱，并把它们移植入髓磷脂不足的大鼠脑中。但是，当人们将这些从特定的组织中采集来的或从体外胚胎干细胞中分化而成的多能性干细胞植入受伤的成体组织时，它们是否能成为特定部位的组织呢？这个问题还是未能得到解答。

迄今为止，为了通过在体外培养干细胞来修复受损的组织和功能不良的器官，已经投入了大量的财力和人力。但是，利用这种方法，至今尚未见一例成功地再生具有完全功能的人体器官的报告。例如，用体外培养的角质干细胞治疗创面仅仅可以封闭创面，却不能完全恢复皮肤的生理结构和功能。因此，迫切地需要发明新的方法，摒弃上述的策略，为人类健康提供更多的益处。

发明概述

本发明涉及一个体外培养细胞的方法，该方法包括：

(a)获取从哺乳动物体预定部位分离得到的组织细胞或组织；

(b)将细胞溶于油脂中的生长调节剂添加到培养基中形成组织培养基，所述细胞生长调节剂，按该细胞生长调节剂总重量计算，含有0.01重量％-20重量％的甾醇化合物、0.001重量％-2重量％的黄芩甙和1重量％-20重量％的蜂蜡；

(c)在组织培养基中培养所述的分离得到的组织细胞或组织。

本发明为动物、特别是人类提供了一种药学或营养学方面的新组合物。该组合物能够促进细胞生长、组织修复和器官再生，尤其是在体内条件下更是如此。具体而言，一方面该组合物含有溶解在油脂中的甾醇化合物，其重量百分比至少是0.01％。优选的甾醇混合物的含量为0.01重量％～20重量％，1重量％～10重量％更佳，2重量％～6重量％最佳。

另一方面，适于口服的组合物含有溶解在食用油中的甾醇化合物，甾醇的含量范围为0.01％～20重量％。

根据这一具体情况，进一步而言，该组合物可以含蜂蜡，优选的含量范围在1％～20重量％之间，2％～10％更佳，3％～6％最佳。

该组合物也可选用含蜂胶，优选的含量范围在0.1％～30重量％之间，1％～20％更佳，5％～10％为最佳。

该组合物可以是含有少量的水，按重量计算，含少于0.5％水为好，最好是少于0.1％。

当用于口服时，本发明组合物的配伍中用了药学上可接受的、公知的载体。这些载体可使该组合物配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、乳剂、亲脂性和亲水性悬浮液、液体、胶状、糖浆、浆剂、悬浮液以及类似物，病人可通过口服吸收。

具体而言，本发明组合物适于用胶囊剂型。用于口服的胶囊形式包括由白明胶制成的填充胶囊，以及柔软的密封胶囊，由白明胶和可塑剂如甘油山梨(糖)醇构成。本发明组合物更适合包含在软胶囊内，它可以在适当的液体，如，脂肪油或液体聚乙烯乙二醇中溶解。此外，还可添加稳定剂。

用于口服的本发明组合物还可选择将其与一种固体赋形剂混合制成，可辗成混合物，而后加工颗粒物，需要的话，还可加入适当的辅助剂后，制成片剂或糖衣核。

另一方面，本发明还提供了用于临床肠道外应用/注射用的组合物，该组合物含溶解于注射用油中的甾醇化合物量至少为0.01重量％。按重量计算，优选的甾醇化合物的含量范围为0.01％～20％，1％～10％更佳，2％～6％为最佳。

可注射用油优选是经加工后适于人体临床注射用的蔬菜油，更优选的是玉米油、花生油、棉籽油、红花油、茶树油、芝麻油、橄榄油或豆油，其中豆油或芝麻油为最佳选择。

另一方面，本发明还提供了另一种胃肠外应用/注射用的组合物，它的组成包括临床上公知的含油相的脂肪乳化剂，以及可溶性的，至少0.01重量％溶于油脂中的甾醇化合物。优选的甾醇化合物的含量范围为0.01％～20重量％，1％～10％更佳，2％～6％最佳。

临床公知的脂肪乳化剂至少由一种蔬菜油组成，选用玉米油、花生油、棉籽油、红花油、茶树油、芝麻油、橄榄油或豆油为好。在本发明中可使用的，临床公知的脂肪乳化剂包括如，LIPOSYN，SOYACAL，INTRALIPID，TRAVEMULSION。本发明的配方本质上最好是不含外源性清洁剂。

根据以上的具体情况，甾醇化合物可选用动物甾醇或植物甾醇(也称植物甾醇类)。动物甾醇，如胆固醇以及所有天然或合成的，异构体及以其衍生物。甾醇化合物更优选使用豆甾醇、β-谷甾醇、菜子甾醇、角甾醇，γ-谷甾醇，菜籽甾醇，，α-菠菜甾醇，，24-去氢胆固醇、多孔甾醇，胡萝卜甙以及所有天然或合成的，异构体形式及以其衍生物。甾醇化合物最好是由豆甾醇、β-谷甾醇和菜子甾醇混合组成，在此统称为“谷甾醇”。

不言而喻，对甾醇化合物的改变，即，包括侧链修饰改变等也落入本发明的范围。而且，本发明也不限于构成一种甾醇组合物的任何特定组合。

甾醇化合物也可选择溶解于药学上可接受的、水易混合性的、非脂肪酸溶剂中，作为胃肠外用药。这种溶剂包括，但不限于，N-甲基吡咯烷酮(NMP)；1，2-丙二醇；醋酸乙酯；二甲亚砜；二甲乙酰胺；苯甲醇；2-吡咯烷酮；苯甲酸苄酯；C_2-6链烷醇；2-乙氧基乙醇；烷化酯，如醋酸乙氧乙酯，醋酸甲酯，醋酸乙酯，乙二醇乙醚，或乙二醇甲醚；(s)-(-)乳酸乙酯；丙酮；丙三醇(甘油)；烷化酮，如甲基乙基酮或二甲砜；四氢氟喃；环烷化酰胺，如caprolactam；dycylmethylsulfoxide；油酸；芳族胺如N，N-二乙基-m-甲苯甲酰胺；或1-十二烷基氮杂庚-2-酮。

在这种溶剂中也可联合使用增溶剂，使甾醇在溶液中更易溶解。在本发明中可用的增溶剂包括，但不限于：甘油三醋酸酯、聚乙二醇(如PEG300，PEG400，或与3350混合)、吐温(如吐温20，吐温40，吐温60，吐温65，或吐温80)，poloxamers(如Poloxamer124，Poloxamer188，Poloxamer237，Poloxamer338，或Poloxamer407)，聚氧乙烯醚(polyoxyethylene ethers)如聚氧2十六烷基醚(Polyoxyl 2 cetylether)，聚氧10十六烷基醚(Polyoxyl 10 cetyl ether)，聚氧20十六烷基醚(Polyoxyl 20 cetyl ether)，聚氧4月桂基醚(Polyoxyl 4 laurylether)，聚氧23月桂基醚(Polyoxyl 23 laury ether)，聚氧2油基醚(Polyoxyl 2 oleyle ether)，聚氧10油基醚(Polyoxyl 10 oleyl ether)，聚氧20油基醚(Polyoxyl 20 oleyle ether)，聚氧2硬脂酰醚(Polyoxyl 2stearyl ether)，聚氧10硬脂酰醚(Polyoxyl 10 steary ether)，聚氧20硬脂酰醚(Polyoxyl 20 stearyl ether)，聚氧100硬脂酰醚(polyoxyl 100stearyl ether)，聚氧硬脂酸盐(polyoxylstearates)(如：聚氧30硬脂酸盐(Polyoxyl 30 stearate)，聚氧40硬脂酸盐(Polyoxyl 40 stearate)，聚氧50硬脂酸盐(Polyoxyl 50 stearate)，聚氧100硬脂酸盐(Polyoxyl100 stearate))，聚乙氧基化硬脂酸盐(polyethoxylated stearates)(如聚乙氧基化12羟基硬脂酸盐(polyethoxylated 12-hydroxy stearate)，以及丁酸甘油酯。在优选的实施方案中，一方面，本发明组合物最好将药学上可接受的增溶剂排除在外。另一方面，本发明组合物最好也将聚乙氧基化蓖麻油排除在外。

根据以上任何一个优选实施方案进一步而言，本发明组合物可以进一步含有黄芩甙，优选含量范围为0.001％～2重量％，0.2％～1重量％更优选，0.5％～1重量％最佳。

同时，根据以上任何一个优选实施方案，本发明组合物还可以含有黄柏内酯，其优选含量范围为0.001％～2重量％，0.2％～1重量％更优选，0.5％～1重量％最佳。

本发明组合物也可选择地含有黄小蘖碱(obabenine)，其优选含量范围为0.001％～2重量％，0.002％～0.5重量％更优选，0.003％～0.1重量％最佳。

同样，本发明组合物也可选择地含有黄连素，优选的含量范围为0.001％～2重量％，0.002％～0.5重量％更优选，0.003％～0.1重量％最佳。

同样，本发明组合物还可选择性地含有罂粟壳碱，优选的含量范围为0.001％～2重量％，0.002％～0.5重量％更优选，0.003％～0.1重量％最佳。

同样，本发明组合物还可选择性地含有各种氨基酸，最好是含所有18种天然氨基酸，为细胞生长提供营养支持。氨基酸可以是化学合成的，也可以是来自天然的。例如，全套天然氨基酸可以通过油或酒精提取地龙获得，地龙富含蛋白质/氨基酸。

在另一个实施方案中，本发明还提供了修复受损组织或器官的方法。方法包括将一种药学上可接受的组合物应用于组织或器官受损或患病的哺乳动物，该组合物含有溶解在油脂中的甾醇类混合物，其重量百分比至少是0.01％，从而可以充分地恢复组织或器官的生理结构和功能。优选的甾醇化合物的重量百分比含量范围为0.01％～20％，1％～10％更佳，2％～6％最佳。药学上可接受的组合物可以是上述任何一种发明组合物。

本发明提供了配制适于动物肠胃外应用的稳定和无毒组合物的方法。这个方法具体是，将一种临床上可接受的含油相的脂肪乳剂和足够量的甾醇化合物充分混合，形成一个组合物，其含量重量百分比优选在0.01％～20％，0.2％～15％更佳，3％～6％最佳。许多熟知的方法都可以达到充分混合，例如，用超声波降解或将组合物反复通过一个，如注谢针等小孔。

以上所述的发明组合物可以有很多单一或联合给药途径，包括口服、外用、肠胃外、经腹膜内、静脉内、动脉内、经皮肤、舌下、肌肉内、直肠、经口腔、鼻内、经吸入、阴道、眼内、经局部传输(如通过导管或固定模)、皮下、脂肪内、关节内，或鞘内。

在优选的实施方案中，本发明组合物更适于通过各种给药途径局部应用到受损或患病的组织/器官部位，这些给药方法包括经皮肤、肌肉内、用导管或固定模、经腹膜内、动脉内以及阴道。本发明组合物也可以慢速释放剂型单独或联合给药。

在更优选的实施方案中，本发明组合物最好是通过直接和局部地给药应用于患病或受损器官的组织。例如，由溶解于可注射油中的甾醇组成的发明组合物可以直接注射进心肌，它可以直接被这些组织的细胞所吸收，而无需经过血管。

另外，其它用于疏水药品组合物的传输系统也可选择性地用于本发明组合物。脂质体和乳剂是人们熟知的疏水性药品的传输载体。采用长期循环，即侧去迂回脂质体为更为优选。本发明组合物还可选择性地应用于靶标药品传输系统，如涂有抗体的脂质体中，其靶标是需修复或再生的组织/器官，如特定肿瘤的抗体。这些脂质体将被相关部位选择性地作为靶标并吸收。

同样，本发明组合物还可选择使用一种持续不变的释放传输系统，如含治疗成份的固体疏水性聚合物的半渗透基质。

通过各种体内和体外的给药途径，上述所述的本发明组合物和方法在生物学和药学上具有广泛的应用领域。

值得注意的是，本发明组合物也适用作体外细胞生长培养基或体外的组织和/或器官的重建。

从形态学上而言，本发明组合物和方法可用来激发休眠的成体干细胞(ASCs)，或诱导成体组织细胞在体内和/或体外转变为成体干细胞。进一步而言，这些发明组合物可用于诱导细胞的特定组织形态形成，使细胞发生形态变化，从而可导致细胞反分化，即，一个分化的细胞复原为未分化细胞(干细胞)。此外，它们也可用来抑制细菌毒素，这大概是通过调节细菌膜的结构和功能以及改变细菌细胞循环来实现的。

在细胞内，发明组合物可用于激活各种酶如致活酶和磷酸酯酶，以及信号分子如在细胞生长和分化中起着重要作用的cAMP，从而支持了细胞生长和维持各种类型细胞的平衡，以确保修复和再生具有生理功能的组织和器官。

在细胞间，本发明组合物可用于促进同种或不同种细胞的特定组织联结，这可能是通过各种细胞粘连分子(CAM)如连结蛋白和cadherin的表达和激活的刺激，以形成各种生理性连接来实现的。

在组织水平上，本发明组合物可通过促进组织间生理连接的形成，用于促进组的特定器官组装。

作为人体和动物用药，本发明组合物可用来治疗由损伤、疾病和衰老引起的各种身体状况。正如临床上所示，本发明所披露的方法是通过原位培养再生的干细胞，进行新器官的再生或克隆。

本发明还涉及一种在体外培养真核生物，尤其是培养哺乳动物干细胞的方法，该方法包括：

将一种组织细胞与含至少0.01重量％的溶于油脂中的甾醇化合物的组合物相接触；

所述的组织细胞生成组织干细胞；

所述的组织干细胞经进一步诱导调节后分化成各种组织干细胞；

经过对所述的各种组织干细胞的培养，细胞结合形成相应的成体组织与器官。

所述的组合物还含有0.001％～99.9重量％的选自黄芩苷，黄柏内酯，黄连素，地龙油脂提取物，罂粟壳油脂提取物或其混合物。所述的组合物中的甾醇化合物含量是0.01％～20重量％。

另外，本发明还涉及一种真核生物，尤其是培养动物的干细胞的培养基，其特征在于培养基中含有脂溶性甾醇化合物，其含量是0.01重量％～20重量％。其中所述甾醇化合物是动物性甾醇或植物性甾醇。所述甾醇化合物可以是选自一种豆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇、角甾醇、γ-谷甾醇、菜子甾醇、α-菠菜甾醇、链甾醇、多孔甾醇、胡萝卜甙和其所有天然或合成的，异构和衍生的植物性甾醇。

再者，培养基中加入的甾醇化合物也可以是豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇的组合。

由此可见，本发明提供一种抗消化道溃疡药物组合物，它含有溶解在油脂中的甾醇化合物，其含量是0.01重量％～20重量％。所述油脂是动物油或植物油。植物油可以选自玉米油、花生油、棉子油、红花油、茶树油、芝麻油、橄榄油和豆油。

该组合物中所述甾醇化合物可以是动物性甾醇或植物性甾醇。其甾醇化合物可以是选自一种豆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇、角甾醇、γ-谷甾醇、菜子甾醇、α-菠菜甾醇、链甾醇、多孔甾醇和其所有天然或合成的，异构和衍生的植物性甾醇。特别是甾醇化合物可以是豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇的组合。

另外一种促毛发再生药物组合物，它含有溶解在油脂中的甾醇化合物，其含量至少是0.01重量％。优选的是所述甾醇化合物的含量是0.01～20重量％。所述油脂是动物油或植物油。所述植物油选自玉米油、花生油、棉子油、红花油、茶树油、芝麻油、橄榄油和豆油。而且该甾醇化合物可以是动物性甾醇或植物性甾醇。甾醇化合物可以选自一种豆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇、角甾醇、γ-谷甾醇、菜子甾醇、α-菠菜甾醇、链甾醇、多孔甾醇、胡萝卜甙和其所有天然或合成的，异构和衍生的植物性甾醇，特别是所述甾醇化合物是豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇的组合。

另外本发明还提供一种抑制或杀灭细菌与病毒的药物组合物，它含有溶解在油脂中的甾醇化合物，其含量至少是0.01重量％。优选的是所述甾醇化合物的含量是0.01～20重量％。该油脂是动物油或植物油。植物油可以选自玉米油、花生油、棉子油、红花油、茶树油、芝麻油、橄榄油和豆油。所述甾醇化合物可以选自一种豆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇、角甾醇、γ-谷甾醇、菜子甾醇、α-菠菜甾醇、链甾醇、多孔甾醇、胡萝卜甙和其所有天然或合成的，异构和衍生的植物性甾醇。另外，甾醇化合物是豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇的组合。

本发明还涉及一种由重要是油脂和蜂蜡构成的坏死组织清除剂，所述的油脂中的含有至少是0.01重量％甾醇化合物，蜂蜡的含量是1～20重量％。其中优选的甾醇化合物的含量是0.01～20重量％，更优选的的为1～10重量％。油脂可以包括动物油或植物油。植物油可以选自玉米油、花生油、棉子油、红花油、茶树油、芝麻油、橄榄油和豆油。所述甾醇化合物可以是动物性甾醇或植物性甾醇。这种甾醇化合物可以选自一种豆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇、角甾醇、γ-谷甾醇、菜子甾醇、α-菠菜甾醇、、链甾醇、多孔甾醇、胡萝卜甙和其所有天然或合成的，异构和衍生的植物性甾醇。而甾醇化合物也可以是豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇的组合。清除剂中可以含有黄小蘖碱(obabenine)，其含量范围为0.001重量％～2重量％。

附图说明

图1为本发明揭示的活体组织中体内原位干细胞培养组织修复与器官再生的基本原理图。

图2为本发明方法所包括的八大相关技术的说明图。

图3A和图3B为本发明组合物成功地治愈胃溃疡的动物模型。

图4为显示局部使用本发明的组合物用于人头皮上，秃发人毛发再生的比较图。

图5A显示，在伤后第1天，表皮凝固性坏死和真皮浅层胶原纤维变性。

图5A-C显示了在深II度烧伤伤后第10天细胞和组织发生的改变。

图5B显示伤后第6天，通过使用发明组合物进行治疗后，坏死组织被完全液化排除的状况。

图6所示，在伤口愈合阶段，在创面内有大量的组织干细胞活跃地繁殖。

图7所示图6在高倍放大后，可以观察到再生的干细胞间的特殊连接。

图8示出组织干细胞依据在胚胎阶段就已经确定的遗传程序，有方向性地分化成各类细胞。图中可见各种细胞向它们的同族组织起源的位置强烈地移动。

图9所示高倍放大后，可以观察到成纤维细胞的合成代谢。

图10显示在没有本发明组合物存在的情况下，成纤维细胞生长迅速，并表现出与变形细胞相似的形态。

图10B显示培养于本发明组合物中的成纤维细胞保持典型的成熟成纤维细胞的形态。

图11显示在伤后第20天，大部分伤口被复层鳞状上皮覆盖，而且大部分附件开始在真皮内形成。

图12显示在伤后第22天，再生出具有正常结构皮肤。

图13显示在电子显微镜下，可以见到真皮和表皮之间的连接。

图14显示在电子显微镜下，胶原纤维在新生皮肤内按正常三维结构的顺序排列的情况。

图15A-D显示了在试管内培养大鼠皮肤细胞，在加入和未加入本发明组合物的不同结果。其中，图15A显示在10天之内两组细胞都健康地生长的状况；图15B显示两组细胞的存活和生长发生的变化。图15C显示在第49天，在对照组有更多的细胞死亡，在治疗组细胞仍然继续旺盛地增殖状况。图15D显示在治疗组，细胞仍然强劲地生长，几乎接近融合。

图16A-C显示了在试管内培养大鼠毛囊干细胞，在加入和未加入本发明组合物的不同结果。

图17A-C显示了在试管内培养大鼠皮肤，在加入和未加入本发明组合物的不同结果。

图18显示一位20岁女性病人被汽油火焰烧伤双下肢，烧伤总面积(TBSA)35％的情况。

图19显示图18所示的女性病人观察烧伤创面组织切片镜下所见。

图20A-C显示图18所示的女性病人用特异的小鼠抗人角蛋白19型的单克隆抗体(McAb)对正常和烧伤皮肤进行免疫组织化学检查的结果。

图20D-F显示图18所示的女性病人烧伤后7天(图20D)和14天(图20E)至烧伤后21天(图20F)的状况。

图21和22所示图18所示的女性病人进入再生状态的皮肤组织切片在显微镜下检查，可见增生活跃的新生上皮组织、胶原纤维和皮肤胚胎基(EB)。

图23显示图18所示的女性病人新的人体器官能够在体原位再生，而且再生的器官无论在细胞水平还是组织水平都具有正常的结构和功能。

图24进一步显示伤后30天，该从病人身上取到的新生皮肤组织切片。

图25显示采用本发明的方法和组合物治疗后30天，皮肤组织切片。

图26显示再生的新皮肤中，胶原纤维的粗细和空间排列均正常，直径0.1μm～0.5μm，有明暗相间的周期性(64nm)横纹。

图27A和B显示在病人伤后30天对从新皮肤上取到的切片进行了免疫组织化学染色。

图28与图29显示病人伤后20天，愈合中的创面组织切片在电子显微镜下观察结果。

图29显示烧伤后20天，愈合中的创面组织切片在电子显微镜下观察结果，可见上皮细胞与基底膜之间的半桥粒连接。

图30和31显示另外一个面部全厚皮坏死烧伤病人身创面组织切片在电子显微镜下观察结果。

图32为组织切片在电子显微镜下观察结果，它显示在机体遭受创伤发生反应时，或(和)在本发明组合物所含活性成分的刺激下，残存而尚有活力皮下脂肪组织中的间充质细胞被活化，并转化为成体干细胞(ASCs)。

图33A和B为组织切片在电子显微镜下观察结果，它显示这些源于它们的母系器官的组织干细胞来相互联接，遵循在胚胎期间就已经确立的基因程序，以一种器官特殊方式相互联合。

图34为组织切片在电子显微镜下观察结果，它显示了血管和神经的器官特殊联合。

图35为组织切片在电子显微镜下观察结果，它显示在使用本发明的技术而提供的条件下，而进行的皮肤再生过程期间毛囊的形成。

图36为组织切片在电子显微镜下观察结果，它显示皮肤附件包括血管、神经和各种腺体都被再生，并且聚合在一起形成新生皮肤。

图37为蜂蜡中形成的含油滴的鸽巢样结构的示意图。

图38显示蜂蜡中形成的含油滴的鸽巢样结构电子显微镜鸽巢样三维结构，每个单独的油滴包含在鸽巢样结构里面。

图39为坏死皮肤液化与排除的说明图，其中涉及蜂蜡形成的鸽巢样结构内的油滴的释放。

图40为坏死皮肤液化与排除的说明图，其中为接触伤口的蜂蜡鸽巢样三维结构被体温加热后分解，油滴被释放。释放的油滴渗透如创面组织内将坏死组织颗粒包被在其中(步骤1)。

图41为坏死皮肤液化与排除的说明图，其中被油滴包被的坏死组织开始细胞的液化说明图。其结果各种细胞内的酶被释放出来(步骤2)。

图42为坏死皮肤液化与排除的说明图，其中释放的细胞酶进一步分解被油滴包被的坏死组织颗粒(步骤3)。

图43为坏死皮肤液化与排除的说明图，其中为通过分解的坏死组织颗粒与油滴之间的腐化和皂化反应，固体的坏死组织颗粒被液化(步骤4)。

图44为坏死皮肤液化与排除的说明图，其中通过液化组织的脂化反应，有效成分被油滴内的脂肪酸酯化，可以被排出创面(步骤5)。

图45为坏死皮肤液化与排除的说明图，其中，随着发明物的蜂蜡鸽巢样三维结构逐步崩溃，更多的含有有效成分的油滴被一起释放到创面内，去包绕剩下的坏死组织颗粒。同时，由于液化的坏死组织与残存的活组织不相容，使得这些坏死组织伴随着网状框架结构的崩溃而渗出(步骤6)。

图46为在生理性湿润环境中残存组织的“呼吸”功能说明图。

图47为本发明的组合物治疗组与对照组暴露于外界空气中的兔的烧伤创面发生活跃的水分蒸发的比较。

图48为本发明的组合物治疗组与传统干性疗法(如热烘干燥暴露疗法)治疗的创面的水分蒸发量比较。

图49为本发明的组合物治疗组与凡士林的创面的蒸发量治疗的创面的水分蒸发量比较。

图50A、B为显微镜图片，应用本发明的组合物治疗的兔的烧伤创面是湿润的，且在48小时内由表及里逐渐被液化状况。显微镜下可见，应用干燥疗法治疗的创面，在坏死组织和活组织之间有炎性细胞浸润。

图51A、B为应用本发明组合物治疗的创面，显微图片，可见在坏死组织和活组织连接处仅出现轻微的炎性细胞浸润，轻度肿胀和微血管充血。

图51C为显微镜图片，在凡士林治疗的创面上，炎性细胞在烧伤后48小时出现组织空泡和浸润。

图52为应用本发明组合物治疗的兔的创面愈合时间与未接受任何治疗的对照组的比较表。

图53A-C为显微镜图片，显示在一含有这种发明组合物的培养基上生长的破伤风杆菌细胞的形态学改变。其中，图53A显示：破伤风杆菌细胞的正常形态呈细长杆状。图53B显示：培养于含有这种发明组合物的培养基的破伤风杆菌的第一、二代呈一长杆状或细丝状。图53C显示破伤风杆菌的第三、四代在长度上呈现出很大的改变，有较多芽孢形成—呈鼓槌状，以及少许长杆状或细丝状。

图54A-C为显微镜图片，显示生长在含有这种发明组合物的培养基上的脆弱类杆菌的形态改变。其中，图54A显示：脆弱类杆菌的正常形态为中等大小杆菌。图54B显示其在含有此发明组合物的培养基上的第三、四代出现长短不一的杆菌，并且有细菌聚集融合。图54C脆弱类杆菌的第五、六代近似小球形，并有许多细菌聚集融合成不规则的圆球形。

图55A和B为显微镜图片，显示生长在含有这种发明组合物的培养基上的痤疮丙酸杆菌的形态改变。其中，图55A显示：正常的痤疮丙酸杆菌的形态是细短杆状。图55B显示培养在含有这种发明组合物的培养基上的痤疮丙酸杆菌的第三、四代呈长度不等，大小不一的杆状或细丝状。

图56A-C为显微镜图片，显示：生长在含有这种发明组合物的培养基上的白色念珠菌的形态改变。其中图56A显示：白色念珠菌的正常形态。图56B显示白色念珠菌的第三、四代在含有此发明组合物的培养基上出现大小不等的圆球形，可见到一些棒状菌体和少许芽生孢子。图56C显示白色念珠菌的第五、六代出现棒状或长杆状，可见长短不等的细菌丝，芽生孢子较少见。

图56D和E显示：白色念珠菌的芽管试验结果。白色念珠菌正常的芽管产生率是90％。图56E显示生长在含有本发明组合物的培养基上的白色念珠菌形态。

图57A和B为显微镜图片，显示：生长在含有这种发明组合物的培养基上的变形杆菌的形态改变。其中图57A显示：变形杆菌的正常形态。而图57B表示生长在含有本发明组合物的培养基上的变形杆菌的形态。

图58A和B为显微镜图片，显示：生长在含有本发明组合物的培养基上的大肠杆菌的形态改变。其中图58A显示：大肠杆菌的正常形态。图58B显示生长在含有本发明组合物的培养基上的大肠杆菌形态。

图59A和B显示：生长在含有这种发明组合物的培养基上的绿脓杆菌的形态变异。图59A显示：绿脓杆菌的正常形态。图59B显示生长在含有本发明组合物的培养基上的绿脓杆菌的形态。

图60为本发明组合物对金黄色葡萄球菌血浆凝固酶的作用。

图61本发明组合物的不同含量金黄色葡萄球细菌血浆凝固酶作用比较。

图62为本发明组合物对金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌增殖的影响。

具体实施方式

本发明为动物、特别是人类的生理性组织修复和功能性器官再生提供了新方法和新组合物。这项创新性的新发明在概念上和实践上均具有多面性，着重于通过体内再生干细胞的诱导和增殖实现组织修复和器官再生的技术。

利用皮肤——人体最大的器官作模型，发明人已经在临床上展示了损伤或丢失的人体组织和器官可在原位再生，即在体内原来的存在部位再生。例如，大面积深度烧伤病人，其皮肤的大部分被严重损伤，功能不全，康复后创面愈合不留疤痕，皮肤包括其附件的正常功能均可恢复。

相比之下，当前在组织修复和器官再生领域采用的方法主要集中于体外，即人类身体外的组织工程移植。正如在本发明的背景一章中回顾的，人们已投入大量的努力，对人体或其它动物身上来的自体和/或异体组织进行设计，以便将它们移植入人体，修复或替代功能不全的器官。利用这种方法，虽然已经取得了一定的成功，但在临床效果以及材料和人力的费用上存在着严重的制约。更值得注意的是，迄今为止在临床尚没有证据表明，利用这种方法可以使再生的器官完全恢复生理功能。例如，大面积深度烧伤病人经这种方法治疗，愈后留下疤痕，容颜尽毁，更由于皮肤功能的全部或部分丧失导致残疾。

发明人认为，利用本发明提供的方法和组合物，首次通过人类的治疗介入可以再生完全功能性的器官。构成器官的各种组织可以生理性地再生或修复，即它们的生理结构和功能达到完全恢复。与此形成对比的是，用其它方法治疗的创面，通常在大多数情况下是病理性愈合，即皮肤的功能异常或削弱。肉眼观察这种功能不全表现为形成疤痕，在显微镜下观察，可发现皮肤质地、颜色、血管分化、神经供应、反射比和生物化学属性均发生了改变。

1.成体组织修复和器官再生的基本原则

本发明揭示了成体组织在体内原位修复和再生的基本原则，如图1所示。

1)总原则

从总体而论，如果给完全发育的成体提供一个再生的环境，它有能力修复受损的组织和再生器官。如图1所示，作为对创伤或其它类型损伤的应答，损伤器官的残存成活细胞可被激活，并自己转化为成体干细胞(ASCs)，即胚胎干细胞的对应物。成体干细胞的这种诱导使它们可以提供器官再生所需的大量多种类型的细胞。

但是，这些新生的干细胞相当脆弱，各种环境因素产生的细胞毒素以及细胞对损伤的失控反应，都易引起这些干细胞的死亡。如图1所示，在本发明组合物提供的适宜的培养条件下，这些成体干细胞遵循胚胎发育阶段就已被遗传性程序化的指令，进行增殖、发育成各种多能性组织干细胞。这种多能性功能组织干细胞的生成确保各种类型的细胞的足量供应，这些细胞是形成生理性功能组织所需要的。

参见图1，在本发明组合物提供的最适宜的培养条件下，这些组织干细胞增生扩散、分化成特定类型组织的特定类型细胞。特定类型的分化细胞通过特定组织的细胞粘连彼此相互联系，形成新生组织。这种特定组织细胞的联系方式在此统称为“细胞连接”。然后，再生的新组织通过形成特定器官的组织与组织连接，并模仿发育期胎儿的组织组装过程，组合成为新生器官。在成体中这种特定器官的组织连接方式在此统称为“组织组合”。

最后，在重组的器官中的新生组织在本发明组合的调控下，发育成熟为单个的、具有功能性的组织，具有生理性平衡的细胞种类和数量。同时，这些组织通过有生命的器官网中的组织交流，经历进一步的重塑，并最终形成完全功能性的、成熟的器官(图1)。

遵循上述描述的再生途径，受损或丢失的组织可以修复，重获它们的生理结构和功能。正如用人体皮肤作模型的举例所示，本发明方法治疗皮肤严重损伤的病人时，不必经皮肤移植，愈合即可恢复全新的皮肤，皮肤包括各种皮肤附件的生理结构和功能均不会丢失。

本发明人相信，在适宜的发育条件下，通过体内原位培养再生的干细胞的方法，可以再生受损的器官，并使之完全恢复其生理结构和功能。在本发明提供的内源性和外源性材料的调控下，这个再生过程在体内自然发生。从根本上而言，成功的器官再生依赖于生理性正确的特定组织的多细胞粘连、特定器官的多组织组装和活体内多器官的自我平衡性和免疫性相容的共存。

2)“干细胞”的重新定义

基于这一基本原则和临床中在器官再生方面的成功应用，对干细胞的含义在本发明中有了重新的定义。

传统的定义中，干细胞应具备下列属性：1)它不是自身末端分化，即不处于分化的最末端；2)它可以不受限制地，或至少在动物的生命期内进行分裂；3)当它分裂时，每一个子细胞既可保持为干细胞状态，也可开始不可逆的末端分化的进程。[参见细胞分子生物学，MolecularBiology of the Cell，Alberts等主编，第三版(1994)，1155-1156页，Garland Publishing公司，纽约和伦敦]

根据这一定义，从人体组织中分离出来的干细胞，例如从人体胚泡的内细胞群分离出来的胚胎干细胞，即使完全是从一个活人身上分离出来，而后在体外的培养基中存在，它们仍旧是干细胞。这些所谓的干细胞，虽然可以不受限制地分裂和分化成各种类型的组织细胞，却未能显示具有再生一个完全功能性的人体器官的能力，更不用说在体外再生一个活人。

为避免与传统的干细胞定义混淆，本发明将干细胞称为“再生干细胞”。这个再生细胞具有以下特征：(1)它存在于活体内；(2)它受身体的生理控制和调节；(3)它与身体的组织和器官共存；(4)它在活体内可不断地进行细胞分裂；(5)它具有修复组织、再生器官、恢复再生器官的生理结构和功能的能力。

3)体内的自然再生

人体有着巨大的再生能力。具有细胞更新高比率的组织，如血液和上皮在整个生命过程中都不断地再生。其它组织，如肝脏、骨骼、肌肉、血管和肾上腺皮层当受到损伤时会出现再生。肝脏通过补偿性的增生进行再生，而其它组织可能是通过增大间叶细胞派生的组织再生，激活储备干细胞或祖细胞来实现再生，或是在再生的组织中实现再生。例如，造血细胞，如T细胞，B细胞，中性粒细胞，以及红血球均由骨髓中的造血干细胞再生而来。如果手指被切除了末梢到末端的指关节，指尖仍可再生。但是，无论是骨骼还是肌肉都不能越过间隙再生，而且其它器官如皮肤、胰腺、心脏和脊髓受到损伤后，愈后常会留下瘢痕组织。

本发明中披露的独特而新颖的方法的焦点是，利用身体本身固有的能力进行自我修复和再生。在适宜的生理条件下，如浸泡在温暖的无菌羊水中，胎儿可以自然愈合创面，不会留下疤痕，也不会失去功能。遗憾的是，完全发育的人类却是生存在一个完全不同的、更为敌对的环境中。在外在的和内在的条件下，自然的成体创面愈合和生长经历一个稍微不同的轨迹，最终往往留下疤痕，出现器官功能不全。这种自然愈合过程完全是被动的，不受治疗方法的控制，是一个混乱无序的细胞增殖、分化和再生组织重建的过程。

4)在原则应用中发展的方法论

本发明提供了积极地控制组织修复和器官再生整个过程的方法和组合物。在这个过程中，细胞——生命的最小单位受到刺激，进行增殖、分化和彼此结合，生理性地修复受损组织或再生被各种情况，如创面和疾病破坏的组织。这些初生的组织然后连结在一起，形成具有完全功能的器官。

为了在成人身上实现这种结果，就需要一个特殊的、积极的人类介入疗法。在本发明中展示的这种措施的总指导原则是：1)对于损伤或损坏的组织，应最大限度地保留残存组织中的成活细胞；2)应尽快去除坏死细胞或组织；3)在一个模仿再生细胞自身原始生理条件内应激活和增殖再生细胞；4)对再生器官应用细胞生长和分化的调节剂，以指导组织的正确生理修复。

具体来说，本发明的方法论包括以下八大技术，如图2所示。

a)成体干细胞(ASCs)的激活和调节

多能性成体干细胞在体原位的产生依赖于a)激活休眠的组织干细胞，如上皮干细胞，它们可能存在于毛囊的隆突部位；b)诱导完全已分化的细胞进行反向分化，将其转变为ASCs。

b)ASCs在体内原位的培养

在生理的湿润环境中培养脆弱的初生ASCs，使之快速生长和定向分化。

c)液化坏死组织的排出和渗出

去除皮肤创面的坏死组织时，不采用传统的清创方法，即侵入性的外科切除，而是用本发明组合物对其由表入里地液化，从创面自动渗出坏死组织，从而大大降低了对残存的成活组织产生物理或化学损伤的危险。

d)外源性培养基中的组织原位培养

本发明提供外源性培养基，使ASCs和分化的细胞在其间迅速生长、结合和移动，从而生理性地修复损伤的组织或再生丢失的组织。

e)非杀菌方式抑制细菌毒性

不采取外用抗生素杀死细菌细胞的方式抑制引起创面感染的细菌毒性，而是允许细菌细胞进行遗传性复制，然后在本发明组合物提供的环境下改变其形态，从而降低毒素产生，因此可以大大降低因身体对细菌毒素的免疫反应而引起的炎症。

f)皮肤再生的生理湿润环境的产生

创面的过度干燥会导致结痂和损害成活组织。用本发明组合物可预防创面的水份蒸发，但与用凡士林作敷料相比，又不会引起创面的过度潮湿。

g)创面与外界环境的微观隔离

在创面应用本发明组合物可在创面形成一层透明膜，它将创面与外界环境隔离开，但又可以使营养组合物和氧渗透到底下的组织中。这种半渗透性的膜酷似羊膜，它所包绕的环境是一个相对无菌的环境，适于里面组织的再生。从而组织根据一个类似于胚胎发育的系统，获得再生和重建，形成一个完全功能性的器官。

h)再生所需的氧和营养的供应

各种营养组合物，如全套天然氨基酸、多糖、脂肪酸和磷酸盐经外源性提供。细胞生长所需的氧可通过这层膜渗透到底下的组织。同时，细菌和其它环境污染物与进行创面愈合的组织被隔离开。

5)本发明方法学与其它方法在技术的对比

目前临床上使用的替代损坏的器官和组织的方法是器官移植和植入仿生装置。器官移植的主要缺点是供体短缺和免抑制疫力的副作用。仿生装置值入的缺点是无法生产出与天生组织一样的耐久力、强度、形式、功能和生物相容性的人造材料。

在二十世纪九十年代出现的再生医学，目前尚处于试验阶段，它着重于两个主要策略：力求在移植部位形成新的组织的细胞移植和植入体外组建的生物人造组织。

细胞移植包括干细胞的体外培养和增殖，而后将它们或它们分化的产品移植到器官受损的位置。虽然生育学的进步已使细胞移植有望应用于临床，但仍存在多种实际的限制，而且临床结果在生理学和美学上也不尽如人意。这种方法的其中之一限制是难以在众多的组织中鉴别和分离多能性干细胞。尽管最近已经培养了多能性人体胚胎干细胞(ESC)系，ESCs的定向分化仍旧是个谜。从动物实验中得来的结果虽然很鼓舞人心，但仍不能在机能上转化为人们依赖的人体疗法。例如，体外神经干细胞派生出来的小鼠神经元细胞和神经胶质细胞，以及在体外来自ESCs的心肌细胞，当注射入成体脑部和心脏时，它们会分别与周围组织结合。多能人类神经干细胞注射进正在发育的小鼠脑部时，它们会在整个脑部移动，并在特定部位分化。

利用体外培养的干细胞实现器官的成功再生，还面临许多的障碍。体外培养的干细胞一旦移植入患病区域，它们必须被引导向特定显型分化。这就必须完全译解这个过程所需的信号，以便指导设计体外组织培养条件。一些研究人员在技术上得到的试验资料表明，尽管通过在培养基中添加白血病抑制因子，可实现多能性人间叶细胞、小鼠神经干细胞和小鼠胚胎干细胞在体外的生长，但小鼠ESCs在体内和体外均随机性分化。技术上的进步将有可能使小鼠胚胎干细胞(ESCs)在体外被诱导分化为多能性神经胶质细胞前驱，并把它们移植入髓磷脂不足的大鼠脑中。但是，当人们将这些从特定的组织中采集来的或从体外胚胎干细胞中分化而来的多能性干细胞植入受伤的成体组织时，它们是否能成为特定部位的组织呢，这个问题还是未能得到解答。

移植产生的免疫排斥是细胞移植中另一个主要问题。由于异源细胞可用于一些实例中(如，来自骨髓的间叶干细胞)，大多数移植的细胞将是异源的。研究人员已试图采用遗传改变和细胞生物的策略，以促进异体或异种移植宿主的耐受性，如将二倍体的体细胞置于去除细胞核的人体或其它哺乳动物的受精卵中，用由此产生的胚囊产生干细胞，这些方法引起了对生物伦理的关注，这是一个更为棘手的问题。

植入在体外组建的人造生物组织也面临不少障碍。例如，合成仿生植入物所用的支架材料即是一大挑战，因为仿生植入物需要有精确的地形学、表面属性、生长和分化的信号，以利于细胞移动、粘连、增殖和分化，以及具有塑成各种组织和器官形状的可塑性。当前正在使用或试验的人造生物材料包括各种陶瓷、聚亚安酯人造橡胶、聚酯、聚酐以及聚磷腈。这些材料为细胞提供了机械支撑、移动渠道以及粘连的表面。

与上述简述的技术背景相对立的是，本发明提供了成体组织修复和器官再生的一种创新性方法。该方法与目前这一领域的研究人员所采用的流行的体外干细胞培养方法形成强烈对比，它关注于成体干细胞在体内原位的激活和培养。通过利用身体本身固有的自我修复和再生能力，该方法为身体的自然再生提供了一个适宜的条件，这是一个模仿健康胎儿发育所需的再生环境。本发明提供的组合物可激活休眠的干细胞进行增殖，或诱导成体组织细胞转变化再生干细胞，以及维持这些干细胞的活跃增殖以及定向地分化为体内原位再生所需的所有细胞。活性成份的新配方也促进形成一个生理湿润的、营养的和自我平衡的环境，以确保组织和器官的修复和再生，使之完全恢复它们的生理结构和功能。

正如此说明书的后一部分所示，这种方法已成功地应用于临床，治疗器官丢失或功能不全的病人，如深度烧伤病人、慢性溃疡病人、创伤病人、肠道溃疡病人和患秃发症的人。经此方法治疗后，病人愈后组织得到修复，器官再生，其生理性结构和功能均无本质的损失。

6)在再生医学中原则的应用

在本发明阐述的基本原则和方法的指导下，人们可以预想到本发明在细胞生育学领域和医药学实践中有广泛的应用，而且它已经在动物模型和人体治疗上显示了成功。

根据体外实验模型和临床试验收集到的强有力的证据，发明人相信，只要提供适宜的再生环境，作为对组织修复信号，即创面的反应，人体内任何器官的组织细胞均可被激活，生成再生干细胞。与早期妊娠阶段胎儿的无疤合创面愈合不同，实现完全发育的成体的生理性组织修复和功能性器官再生的唯一途径，是通过体内原位提供外源性培养基，刺激并维持成体干细胞的快速增殖和定向分化，并确保各种器官特定组织的正确组装，而不致在结构和功能上出现实质性的丢失。

发明人相信，尽管很难标定和分离多能性成体干细胞(ASCs)，但可以通过体内原位激活休眠的组织干细胞以及/或诱导成体组织细胞转变为ASCs(图1)得以产生成体干细胞。最近在干细胞研究方面的新进展以及本发明中阐述的基本原则应用于实验和临床试验所取得的资料均佐证了这一观点。

最近，在肝脏、胰腺以及中枢神经系统中均发现了ASCs。从骨髓中分离出了间叶干细胞，而且有证据表明类似的细胞甚至可能存在于整个身体组织的结缔组织室。研究人员曾大范围地搜索了ASCs的位置，并推测它们可能存在于特定的小生境中。正如在“实施例”中详细所述的那样，在全厚皮层烧伤后，利用本发明方法提供的适宜环境，可以诱导真皮层的脂肪层中的间叶细胞产生再生的ASCs，实现皮肤再生。

不论各种ASCs的精确位置在哪里，本发明所提供的方法和组合物均可用于激活体内ASCs，在体内原位修复损伤组织和再生功能不全的器官。可以预见，这种创新性的方法可以用来恢复哺乳动物，尤其是人类体内的任何组织和任何器官的生理结构和功能。以下将描述数个应用例。

a)通过体内原位培养表皮干细胞再生或更新皮肤

皮肤为动物的最大器官，由外表皮、真皮及皮下组织构成，正常的有生理功能的皮肤具有三层相互作用而结构上各有特色的组织。

表皮是一种不断地在更新、分层的鳞状上皮组织，表皮的大部分细胞为角质细胞排列成层，表示它们的不同分化阶段，外层为角质层，作为屏障保护身体与外界环境隔开，并有助于维持内部环境。

真皮为皮肤的结缔组织的基质，使皮肤具有结构强度，可以保护身体不受损伤、贮存水分，并与表皮相互作用，真皮乳突反映表皮的形状轮廓，即在表皮下面的交替的皮脊及皮谷。

皮肤是有完整功能的器官，由神经、血管、毛囊及分泌腺所组成为皮肤附件。皮肤的各种组成部分有不同的功能，包括保护身体不受外界的损害，阻止水分丢失，吸收及阻挡辐射调节体温、感光及免疫监督。

血管及淋巴管在皮肤中起重要作用，可以提供营养，调节体温及血压，皮肤血管床的种类取决于它们灌注的皮肤的种类、皮肤附件的类型和数量以及真皮与皮下组织的厚度。

皮肤神经包含有感觉及交感(自主)神经、交感神经运动纤维在真皮中与感觉神经纤维混合，最终延引分枝到汗腺、血管及立毛肌中，感光纤维与专门化的小体末端器官为触摸、疼痛、痒以及物理和化学的刺激的受体，人类感觉皮质的大部分从面部以及手的皮肤接收感觉信息。

分泌腺为皮肤附件，包括顶分泌腺、外分泌腺、混合腺、颊腺及皮脂腺。各种类型的腺体有其独特的形态特征与功能。所有这些皮肤附件均来自胚胎的表皮。

毛发为复合的角蛋白圆锥物，其中有紧密的鳞覆的皮质鳞片环状围绕物，毛发可分为(1)毫毛：细，无髓鞘，无色素，较短；(2)终毛：粗，较长，大多有色素，有髓鞘。还有中间状态的毛发，所有胎儿的毛发均称胎毛。

毛囊为主要的表皮附件，它与表皮都是从同一个胚胎源衍生而来的，位于皮肤的表面，毛囊是由一个外根鞘(ORS)与表皮相邻，和一个内根鞘(IRS)和毛干本身组成。正处于活跃地分裂中的细胞能产生内根鞘及毛干，称为基质细胞。在毛囊球中有专门化的间质细胞袋，称为真皮乳突，是一群过渡性的分裂中的上皮细胞。

成年人毛囊的下段经历活泼生长期(毛发生长初期)和破坏期(毛发生长中期/毛发生长终期)。随着基质细胞的增殖能力的耗尽，毛囊退化，把真皮乳突拖上毛囊的永久性的上皮部分称为隆突，隆突被认为是公知的毛囊干细胞之家。接受到真皮乳突传出的刺激，隆突中的一个或每个细胞作为反应可再生毛囊。

皮下组织也称脂层，有一层脂肪，皮肤组织的主要功能是调节温度，缓冲机械创伤，保持身体外形，填充空间，而最重要的则是作为备用的能量来源，皮下组织包括三层脂肪层由结缔组织鞘(网眼皮retinocula cutis)将它们分隔开。

真皮分为乳突层和网状层，前者外形与表皮一样，后者从乳突底部延伸到皮下组织，真皮乳突含有很多III型胶原，这些胶原由半径很小的纤维组成小的纤维束(宽度1-10μm)。网状层真皮主要由I型胶原组成，这类胶原由大直径的纤维织成大的纤维束(宽度大于40μm)。

在显微镜下，胶原纤维束排列成正交结构，即，每层与其上一层和下一层均成正角。

无疤痕的胎儿创伤愈合的组织学特点是，真皮附件中及周围肌肉的再生。但是，人们普遍认为，深度部分真皮烧伤或全厚皮层烧伤的成人，愈合只能是疤痕性的再生，而且附件的结构及功能也受到实质性的损失。

皮肤生成疤痕是正常结构外观的破坏，由于皮肤结构、颜色、血管供应、神经供应、反射能力、生化特性的改变，造成了愈合部位或凸起或凹陷[参见Ferguson等(1996)Plast，Reconstru Surg 97：854]。从组织学方面来说，疤痕是组织微观结构的改变，其胶原沉积和组列不同于周围未损伤的组织。

将外源性生长因子用于伤口局部，在实验室里可以提高伤口修复的速率。但是，在伤口部位应用外源性生长因子的疗法，在临床上已被证实效果不尽如人意。TGF-β不能改善伤口愈合，已获FDA批准上市的PDGF-BB只对慢性伤口愈口有一点点好处。更令人失望的是，这一点点好处还只是在彻底清创和重量下卸的情况下，由经验丰富的医生操作才能取得。

人体的慢性创伤的环境不能在实验动物中复制，临床医生想用外源性的生长因子治疗伤口，却面临着与蛋白质到人体的传输相关的各种挑战。例如加进去的外源性生长因子会很快就被蛋白溶解酶和氧化剂所破坏，另一挑战是慢性伤口中的成纤维细胞对生长因子往往没有反应。

正如本说明后面的部分中所述，本发明提供了一种创新的方法，使动物特别是人体通过在体内原位培育再生性干细胞而完成组织修复或器官再生。例如，深度大面积烧伤通过原位成体干细胞的诱导可以再生新的皮肤，这种干细胞发育成为胚胎表皮干细胞和各种再生皮肤所需的其他组织干细胞。再生的皮肤保持正常的结构和功能而且具有全套附件，这些“奇迹般”的临床成果表明本发明的方法学可以用来再生各种组织和器官。

一方面，本发明的方法可以用来生理性地修复损伤的皮肤而不留疤痕，如深II度烧伤(或部分真皮烧伤)，表皮基底层已被破坏，真皮也严重受损，但是一部分真皮还在皮肤存活，本方法也可用来再生皮肤，修复表皮、真皮和各种皮肤附件的结构和功能。例如，一位病人表皮和真皮均被火烧伤或化学烧伤，即浅III度或全厚皮层烧伤，可采用本方法治疗，愈合皮肤包括附件的生理功能均没有实质性丧失。

此外，本发明的方法可用于再生其他类型的创伤，包括但不限于创伤、手术伤口及感染创口；体表溃疡包括但不仅限于慢性溃疡、糖尿病溃疡、褥疮溃疡和下肢血管疾病以及其他由于血流不畅引起的不愈伤口；由细菌或病毒感染造成的伤口及/或糜烂，如阴道炎、宫颈糜烂、牙龈炎；由于静脉扩张及/或扩大造成的伤口，如痔疮；由风寒造成的冻伤及皮肤皲裂。采用本发明提供的组合物，这些伤口均可生理性愈合而没有畸形或残废。

为了在皮肤上实现这些功能性效果，本发明组合物用于损伤皮肤的原位，通过激活再生性干细胞、特定组织的细胞粘连和再生性组织的特定组，产生治疗作用。

再生性皮肤干细胞可存在于皮肤的存活组织中，例如损伤皮肤可通过激活处于表皮基底层的表皮干细胞得到修复，本发明组合物可用以促进损伤的表皮的生理性愈合而不形成疤痕。

此外，本发明组合物可用作化妆品，提高皮肤美观。例如，通过化学的传输媒介如微脂粒或油，或物理的方法如超声传输，将该组合物导入基底层。对于由于内部或外部因素如痤疮、黑色斑及皱纹所造成的不规则的皮肤表面及/或颜色异常，可用化学方法(例如乙醇酸或酶)或物理方法(热或光能)除去部分或整个皮肤表面，然后将本发明组合物用于有存活真皮的皮肤上，残存基底层的表皮干细胞或皮肤其它组织中的再生性干细胞可以被激活，促进皮肤再生，使皮肤看上去更年轻，而不产生疤痕。

例如，在各种皮肤组织，如毛囊中的再生性干细胞可被刺激起来。一系列实验动物和人体的资料表明，毛囊隆突是表皮和毛囊干细胞的聚集地，隆突细胞有很长的细胞外周[Morris Potten(1994)Cell Prolif27：279-289]，而且在培养基中可以培养出最佳的毛囊角质细胞(Yang[1993]J.Invest Dermatol 101：652-659)。皮肤的其它组织，如血管及外分泌腺也聚集有再生性干细胞，他们可以被激活并分化成为各种修复皮肤和再生表皮所需的细胞。

对于真皮和表皮都完全损毁和/或损失功能的皮肤，本发明组合物可用以激活或诱导皮下组织中的再生性干细胞如软组织中的间质细胞。

当皮肤的全部组成部分，即表皮、真皮、皮下组织完全被破坏和/或损失功能时，本发明组合物可以用来激活肌肉层的结缔组织中来的再生性干细胞以及骨髓中的间质干细胞。

必须指出，本发明的方法及组合物也可以用来促进细胞的反分化，即：把分化的细胞转变为成体干细胞，然后，作为再生性干细胞参与组织修复和器官再生的过程。

b)恢复组织内环境稳定的平衡以预防和治疗癌症

本发明描述的方法可用于预防和治疗各种癌症，癌症通常被视为细胞内和细胞之间的内环境稳定调节发生紊乱的结果，一旦内环境稳定的平衡失去了，就会发生恶性病变。微环境的因子如基质组成成分的降解，以及宿主和肿瘤间的相互作用都是恶性细胞生存和生长的不可少的条件。

本发明表明，采用本发明的组合物和方法，组织内的内环境稳定的平衡是可以恢复的，而且不会失去生理功能。本发明组合物可以调节细胞之间的信息交换，通过刺激各种细胞膜蛋白质如联接蛋白和Cadherin介导的交叉对话，结果使细胞的生长、分化、凋亡和迁移得到协调的调节。

本发明的组合物可通过促进宿主细胞与前期癌细胞或癌细胞的间隙接合点的生长而恢复组织内环境稳定的平衡，间隙接合点是一种特殊类型的细胞之间的接合，在大部分动物细胞中都有。两个相邻的细胞相互作用，通过细胞膜蛋白质联接蛋白而进行。联接蛋白形成间隙接合点，6个相同的联接蛋白形成一个联接蛋白，两个联接蛋白相连跨过细胞的间隙形成连续的水通道，把两个细胞连接起来。每个间隙接合点是一簇均匀的膜内的粒子与浆膜的细胞浆折断面的结合。每个膜内粒子对应于一个联接蛋白，间隙接合点使细胞之间的小分子，可以有通道，与各种生命过程如发育、细胞代谢及细胞生长控制有关。

大部分联接蛋白转移后被磷酸化，主要是作用在丝氨酸等氨基酸部位上，联接蛋白是各种蛋白质激酶的靶子，其中有些酶已确认，为蛋白质激酶C，促有丝分裂原激活的蛋白质激酶以及v-Src酶氨酸蛋白质激酶。磷酸化与许多连接过程的调节有关，如交换、组合/折离、降解以及间隙接合通道的控制。

此外，另一种细胞膜蛋白Cadherin也对细胞与细胞粘连和迁移起着重要的作用，在蛋白质酶氨酸激酶(PTK)变形的细胞中Cadherin介导的细胞与细胞的粘连作用受到干扰，而Cadherin本身则不是PTK的良好培养基；它们的细胞质结合伴侣Arm catenins却是PTK的优良底物，因此，可以作为介导PTK诱发的Caderin行为的症变的良好候选物。例如β-catenin与经典的cadherin的细胞质区结合，并可以调节吸着作用并/或作为cadherin与肌纤维蛋白细胞骨骼的桥梁。

本发明组合物很可能可以激活这些激酶，这些激酶然后把联接蛋白和Cadherin的细胞结合伴侣为Caterins磷酸化。通过这些蛋白质的磷酸化以及细胞与细胞的粘连作用，肿瘤细胞与宿主细胞之间的信息交换通道得以修复。肿瘤与宿主的连接修复后，肿瘤细胞受到了宿主的调控，在宿主的调控之下，肿瘤细胞可以发生凋亡(程序控制的细胞死亡)，或分化成为非致肿瘤的细胞，这样，组织的内环境稳定的平衡得到恢复，可以预防或抑制肿瘤的恶变。

一方面，本发明的方法可用以治疗或预防过度增生性的疾病或前期癌变，影响到皮肤的上皮细胞如牛皮癣或其他皮肤病，包括过度增生性、前期癌变或紫外线诱发的皮肤疾病。

本发明的方法进而也可用于预防皮肤癌或减少皮肤癌发展的可能性，以及降低由于日照导致的光老化的严重程度。

另一方面，本发明的方法可用于治疗和预防过度增生性疾病或前期癌变，它影响了内部器官的上皮细胞如胃肠道器官，口服本发明的组合物或局部注射可以恢复这些器官的内部环境稳定平衡，重建在前期癌变细胞与宿主健康细胞的细胞与细胞间的交叉对话。

此外，本发明的方法也可以用于治疗上、下胃肠道的癌症，例如上胃肠道癌，包括但不仅限于(1)由过量使用酒精、碱摄入、弛缓不能、吸烟、接触硝胺类化合物Barrett’s粘膜、胼胝形成、霉菌毒素、变形病毒的感染如人乳头瘤病毒(HPV)、单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)及Epson-Barr病毒(EBV)普文二氏综合症等引起的食道癌；(2)由于胃酸缺乏、幽门螺旋菌感染、过去的胃切除手术以及Billroth II操作引起的胃癌；(3)由吸烟、接触β-萘胺、联苯胺及慢性胰腺炎引起的胰腺癌；(4)由乙肝病毒、慢性肝病如慢性活动性肝炎及肝硬变、接触霉菌毒素、电离辐射、甾体激素及硬化物引起的肝癌，以及(5)由于硬化性胆管类，寄生虫感染及甾体激素引起的胆管癌。下胃肠里的癌症包括大肠癌如结肠直肠癌，原发性淋巴瘤、黑瘤、大肠肉瘤。腺癌占大肠癌的90％以上，类癌瘤占结肠直肠以上的其它肿瘤的大部分。

c)预防和治疗胃肠道疾病

本发明组合物以及方法可用以激活或诱导胃肠道组织中的再生性干细胞，以修复在胃肠道中的器官的黏膜的损伤及疾患。

在小肠的内衬中，细胞排列成单层的上皮组织，这种上皮组织覆盖在绒毛的表皮向肠膜突出。分泌黏液的杯状细胞散布在上皮组织的吸附性刷状缘细胞中，上皮组织还衬着隐窝，这些隐窝向下伸向下面的结缔组织，每个隐窝由250个上皮细胞组成，其中包括上皮干细胞，这些多功能性干细胞位于隐窝的底部或其附近[参见Loeffleretal(1993)J.Theer Biol 160：471-491]。肠上皮干细胞能对间质的生存或分化的指令作出反应。在正常情况下，这些细胞循环周期缓慢，很像毛囊干细胞，其中有些转变快速但暂时性地增殖性细胞，它们移动到中段，随后分化为吸收性的刷状缘肠细胞或分泌黏液的杯状细胞或绒毛的肠内分泌细胞，为了维持内环境稳定的平衡，分化了的细胞随后死亡并从绒毛上脱落进入肠腔。

与此相关，本发明提供的组合物可以治疗人体消化道疾患，即给病人的消化道使用一种含溶解于油中的甾醇化合物的组合物，其中甾醇化合物含量的重量百分比为0.01％-20％，最好是选用食用油，而且组合物含有蜂蜡，其含量的重量百分比为1％-20％。

消化道疾病可能是由于人体消化道器官或营养通道包括口、食道、胃及大小肠的损伤或紊乱所造成，消化道紊乱包括胃溃疡、肠道类疾病及其他损伤。

胃肠道紊乱的一个通常的原因是幽门螺杆菌感染，这些感染可引起活动性的慢性胃炎及频发的有关病症，如十二指肠溃疡、胃溃疡、MALT淋巴瘤或Menetrier’s综合症，消灭或抑制幽门螺杆菌可以减少十二指肠和胃溃疡的复发。

持久性的胃炎与幽门螺杆菌感染有关，往往在胃粘膜上出现相似于肠道的特点，这种情况称为肠(样)组织变形(IM)，可能是胃癌风险加大的信号，在全球是第二大因癌致死的病症。

IM的病因尚不清楚，可能是一种突变性的适应作用，或是对幽门螺杆菌的防御作用，有人推测变形的粘膜可能产生粘液或其他组合物创造一种对抗幽门螺杆菌的环境，因此，对幽门螺杆菌进行普遍治疗应当可以降低胃癌的发病率。

本发明人认为本发明的组合物可以有效地修复损伤的粘膜，在胃肠中，特别是在胃中提供再生的条件，在胃肠道中使用本组合物后，药物与胃粘膜混合，形成保护膜，其中含有粘蛋白，可将粘膜与食物以及胃中的其他组合物的进一步刺激隔开，在这种情况下，组合物中的甾醇化合物及其他有效成分被释放出来激活再生性干细胞，促进粘膜加快修复。此外，本发明组合物也可以通过使细菌的形态改变有效地抑制幽门螺杆菌的毒性，通过健康的胃肠道的再生，有利于幽门螺杆菌的溃疡状况得到改善，间接地抑制细菌的生长。

本发明的组合物可用于治疗幽门螺杆菌及与之有关的的疾病(如溃疡、胃癌、非溃疡性消化不良、胃炎及食管疾病和胃一食管回流病)。本组合物可用于治疗这些疾病是因为它对胃肠道有总体的保护作用，而且它还能促进粘膜完整性的维护。

该组合物可用来抑制幽门螺杆菌有粘膜上吸着或形成菌落，可以用来促进与幽门螺杆菌感染有关的损伤组织的愈合，在这一方面，很重要的是本组合物要加到融合的肠上皮细胞的受损的单层上，以激活隐窝中上皮干细胞，增加上皮细胞移入伤口的速率。

正如本组合物可用来保护胃肠道或营养通道如肠一样，它也可用于保护口腔及食管免受因放疗和化疗造成的损伤。

本组合物也可用来保护及/或治疗通常由酒精或药物造成的损伤。

d)促进头发生长并治疗秃发

本发明组合物也可用于促进毛发生长或恢复毛囊及其周围的组织如血管、皮脂腺的生理功能。

毛发是丝状角质结构，由上皮衍生而成，毛发分为二大类：毫毛，特点是短、窄、覆盖于大部分体表；终毛，其特点是厚，、长、往往色素较深。终毛包括头皮、眉毛、睫毛、青春期后腋窝及趾骨的毛、多数男性面部及身上的毛。

每根毛发由毛干及根组成，毛干则由专门的角质细胞组成，毛根位于毛囊中，可以深入到皮下组织或在真皮浅表处，毛囊由于表皮相连的外根鞘(ORS)和内根鞘(IRS)组成，活跃分裂的细胞生成内根鞘及毛干，称为基质细胞。根的近端扩张形成毛球，由一个锥形管状的上表乳突使之凹入深表，毛球包括了芽的基质和生角区，毛球中有一个专门化的间质细胞袋，称为真皮乳突，为一群暂时性的分裂中的上皮细胞。这群多功能细胞覆盖表皮乳突，具有丝分裂的能力，能产生毛发及其周围的内根鞘。有丝分裂产生的细胞，在顶端移动，沿几种不同的途径分化。

成人毛囊中的下段，经历活跃生长期(毛发生长初期)和破坏期(毛发生长中期/毛发生长终期)。随着基质细胞的增殖能力耗尽，毛囊退化，把真皮乳突的细胞袋拖到永久性的毛囊上皮部位去，称为隆突。隆突被认为是公知的毛囊干细胞的家。对真皮乳突的刺激作出反应，一个或多个隆突的干细胞再生成为毛囊。

毛囊的发育依赖于真皮与表皮之间的一系列信息传递。在胚胎发育期，由于表皮与间质之间的相互作用形成毛囊。毛囊的真皮组件(即真皮乳突和真皮鞘)，是从一群间质细胞衍生而来的。毛囊的启动及发育源于真皮生纤维细胞及表皮的角质细胞的聚集。表皮细胞增殖，渗透到真皮中成为塞子，随后，表皮衍生的细胞包围真皮的聚集体，把它引入组织袋中，即真皮乳突中。一般认为毛囊及真皮乳突，是胚胎生长时形成的，在产后并没有明显发育。

毛发生长受毛囊基质细胞的增殖的影响，有三个不同分期：再生期毛发活跃生长；退化期毛囊活性下降；静止期细胞不再增殖。在典型的人的头皮中，再生期可延续几年，而退化期只有几周，静止期则有数月[参见Bertolino etal(1993)“Bialogy of Hair Folicle”inDermatology in General Medicine，pp.289-93.Fitzpatrick et al.，eds.McGraw-Hill]。这个更新循环时间根据动物种类和动物内不同部位而有所不同。静止期过后，毛发脱落，另一周期开始，毛发生长的不同期中表皮、真皮及脂肪层的厚度也在变化。而且终毛在再生期伴有黑素生成，因为毛囊中的黑素细胞产生黑素，进入毛干中[参见Denileako etal1996Mol.Med Today 2：460-67]。

这些周期受多种因素的影响。例如：不同的生长因子，如甾体激素，真皮-表皮的相互作用，真皮的血管供应，神经、外胚层因子及免疫系统均参与其中[参见Stern etal(1996)Dermatol Clin 14：167-96及lindler etal(1997)Am.J.Pathal 151：1601-17]。

秃发分为几种，原因各异。秃头位于头顶及前部是很常见的男性型秃头，秃头也可以累及整个头部为全秃。不同的秃发分为(1)全秃：全部头皮无毛发，即头皮全秃但身体其他部位的毛发正常；(2)全身脱毛：不仅是头皮，而且整个身体无毛；(3)斑形脱发：是局部脱发，对妇女来说，脱发通常发生在生育小孩之后或停止服用避孕药之后；(4)化疗引起的脱发，往往是暂时性的；(5)放疗引起的秃发往往是永久性的，因为毛囊受辐射，发生了不可逆性的损伤；(6)男性型秃发(也称秃顶)为常见的男性秃发，位于头顶前部及顶部，是遗传因素造成的。

秃毛为哺乳动物的自然过程，在健康成人，尤其是男人中极为常见，秃发也可由化学和物理的因素所引起(如抗癌化疗)，也可能由于年龄增长和某些特殊的疾病所引起。典型的秃发是由于毛发更新周期紊乱，首先是周期频率加快，毛囊从再生期很快进入静止期。正常情况下，人头上大约有150,000根头发，约10％是处在静止期。在皮肤上的秃毛，显然是较多的毛囊是处在静止期，最后毛囊退化，这个过程表现为毛发不断变细，这是毛发的第一个质量变化(即绒毛多而终毛少)，最后在这个皮肤区里的毛的数量减少。

除了脱发，在极少数的情况下也会有不正常的毛发生长过重，如过度依赖雄性激素导致的妇女多毛病以及与雄性激素无关的多毛症(Bertolino等(1993)″Disorders of Eidermal 35 Appendages and relateddisorders″in Dematology in General Medicine，pp 671-95，Fitzpatrick等主编，McGraw-Hill，这种情况对患者个人来说会产生深远的社会后果。

秃发、多毛症及其他毛发生长紊乱很普遍，开发有效的化妆品和临床治疗剂有很大的意义。但是，尽管有这种需求，有效的预防和治疗的方法仍然很缺，例如对许多秃发病人(如接受化疗的病人和老年人等)不能得到有效的治疗，如可用毛发移植手术。但外科手术最多的也只是治疗方法的一部分，电刺激曾被建议用来促进毛发生长(见US Patent No 5,800,477及其中引用的文献)，但这些方法的疗效尚有问题。

e)组织修复与其他器官的再生

本发明的组合物也可通过体内和原位培育再生性干细胞，用于修复组织或再生身体的其他器官，包括不仅限于心脏、肾、肺、肝、胰、眼、脑、动脉、神经及骨。例如本组合物可局部注射于心肌，以直接激活/诱导心脏的成体干细胞(ASCs)，以治疗各种心脏病及心血管病，并在心脏发作后再生心脏。该组合物也可局部应用于肝脏，以激活/诱导肝脏干细胞，使由于不同原因，如饮酒过多而受损的肝脏得以修复。所述的组合物还可以用于肺部以再生其中的组织，如肺泡。

本组合物还可用于修复受损的肾小球及其他引起慢性肾衰竭的小球疾病。在肾中，小球结构很小(直径100-200μm)散布在肾皮质中(3×10⁴-1×10⁶小球/肾)，因此，常规方法如移植法难于找到耙子，直接注射本组合物可充分刺激小球，以激活/诱导其中的再生性干细胞。

此外，本组合物及方法通过激活或诱导再生性干细胞，可以治疗其它由于损失或减少可更新细胞群引起的疾患，包括血液病及涉及免疫功能损伤或损失的疾病，也可以用来刺激分化细胞的生长，并维持生理平衡，包括现有的分化细胞继续表达其表型，以及将老化的表型逆转为年轻的表型。这对于治疗组织疾患特别有用，即由于代谢功能减退或丧失，细胞衰老或静止而损失功能的疾病，如老化细胞及/或骨质疏松及神经退化疾病，包括早老性痴呆症。

2、本组合物的细胞及分子的作用机理

本发明提供一种新型的组合物及方法以修复组织并再生器官，当前主要的学派思想认为，完全的组织再生只能通过体外重组的自体皮或异体皮移植实现。本发明的基本概念正好与此相反，认为一个完全发育的成人，其严重受损的组织和/或器官，具有本能，可以适当的环境中对内在的或外来的信号作出反应，实现自我修复和器官再生。这种再生环境，必须有外源的组合物来支持，以促进器官再生而不实质性地损失生理结构和功能。应用本发明组合物在体内并原位创造一种环境，使器官按照胚胎发育过程自然地再生，恢复其生理结构及功能。

本发明人认为细胞作为生命的最小单位，其活性在生理性的组织修复及器官再生过程中起着关键作用。尽管许多生长因子都参与了这个过程，但最终必须把细胞活性整体地调节好，才能获得内环境稳定的平衡再生，组织修复和器官再生只通过调控信号或某些生长因子，可能会导致生理结构与功能的不完全恢复。因为生命的精细的平衡是身体通过自己调节其细胞的复杂活性来保持的，而不是只由一些生长因子来控制的。

如前所述，本发明人揭示了在成体组织修复及器官再生，作为对内源性的和外源性的信号的反应的基本原理，在再生条件下，采用本发明的方法，在进行自然再生的器官中，可以观察到细胞的新奇的反应和细胞间的相互作用。这些现象也只有在应用本发明组合物时，才能观察到，例如，深II度烧伤在对照组中或在用常规的SD-Ag(磺胺嘧啶银)治疗组中，都是有疤痕愈合。对浅III度烧伤则需植皮。用传统方法治疗的创面，细胞与组织间的相互作用是混乱无序的，导致愈合后皮肤有畸形疤痕、残废和功能障碍。为了使损伤的成体组织及器官能恢复正常的生理结构及功能，必须施加外源性的组合物于该部位，以提供再生环境，调节在体内及原位的细胞的活性。

本组合物的每一成分在再生过程中各自发挥它的作用。本发明人不希望被理论所约束，在本发明中提出合理的分子和细胞水平的作用机理是基于(1)了解胚胎发育以及在胚胎及成人之间的创伤愈合过程的差别；(2)有效成分的物理、化学及药代动力学特性；(3)本组合物调节下，对细胞生长、组织修复及器官再生的临床前和临床的观察。

1)人体胚胎发育

人类同其他各细胞的动植物一样，是一种有序的细胞的克隆，含有相同的染色体组，但专门化的途径不同，虽然最后的结构可能是很复杂的，但人的生命就是由这些有限的细胞活动即细胞生长、分裂和死亡的技能所生成的。人体细胞通过启动及关闭特殊蛋白质的合成而进行分化，人染色体组内在程序控制这一过程，并受不同环境因素的影响，细胞产生分子信号影响相邻的细胞，并对相邻细胞传来的信号作出反应。通常认为在每个细胞中，相同的重复的染色体组决定着细胞对不同刺激的反应的规则，并指导错综复杂的各细胞的发育过程。通过这种发育过程，胚胎发育成为成人的器官。

受精卵是一个大细胞，不断进行有丝分裂成为许多小细胞称为裂球，其总质量没有变。这一过程叫做卵细胞分裂。在这一阶段DNA自制及有丝分裂是高速度的，分裂的胚胎几乎完全取决于RNA、蛋白质、膜及其他组合物在卵中储备。分裂期之后，细胞分裂速度减慢，胚胎染色体组的转录开始，这种变化称为囊胚中间过渡。开始时，胚胎细胞不仅是机械地结合在一起，而且是由能通过离子和小分子的间隙连接点结合起来的，这一特点使信息能够很有效地传递，有助于细胞行为的相互协调，同时胚胎的最外边的裂球之间紧密连接形成一个密封区，将胚胎的内部与外部媒介隔开，大约在16个细胞期，Na⁺开始穿过细胞膜进入胚胎内部，细胞间的空隙因为形成了渗透区梯度所以水分也随着进入。结果，使细胞间的裂缝在胚胎深处扩大形成空腔，称为囊腔，在这一阶段，胚胎叫做囊胚。

构成囊胚的外层的细胞变成一个上皮层，为原肠胚形成的协调运动提供舞台，这一戏剧性的过程，把简单的细胞空球转变为各层的结构。囊胚的多层结构分内、外、中三层，中央肠管把早期胚胎的外层细胞卷入内部而形成囊胚的内层。

因原肠胚形成的三层结构，最内部为原始肠管，是内胚层；最外面为外部上皮，是外胚层；这两层之间有一个由间质细胞组成的松散的组织层，是中胚层，胚胎的这种三层结构，大体上相当于成人的肠在内部，表皮在外部，而结缔组织及肌肉在中间的结构。

哺乳动物胚胎发育的早期是高度调控的，每个细胞的命运都由其与相邻细胞的相互作用来决定。发育的环境不正常时，胚胎细胞失去控制。例如正常的早期小鼠胚胎被移植到成年小鼠的肾或睾丸中时，它的组成很快就紊乱了。正常的细胞增殖中断，结果是一种稀奇古怪的东西生长，称为畸胎瘤。畸胎瘤是一群紊乱的细胞，包括各种分化的组织，如皮肤、骨头、腺的上皮，这些分化的细胞与未分化的干细胞混在一起，继续分裂生成更多的分化的组织。

胚胎干细胞非常能适应环境的信号，以指导他们在不同分化途径中作出选择。在适当的环境中，胚胎干细胞能启动或关闭发育时钟——驱使细胞从胚胎向成熟态发展的过程，例如性质相似的干细胞，可以从正常的内层细胞群在培养基中衍生而来，他们繁殖以后细胞就分散开来，一旦分散，有些细胞在适当的环境里可以继续无限制的分裂而不改变其特性，所生成的干细胞系可以无限制的分裂而不分化。培养基中的蛋白质生长因子或cytokine即白血病抑制因子(LIF)的存在对这些发育过程是至关重要的[Nichols等(1998)Cell 95：379-39及Niwa等(1998)Genes Dev 12：到12：2048-2060]。将LIF移去后，培养基中的胚胎干细胞即自动聚集成为类胚胎的组合物，可以分化成为许多细胞谱系，包括跳动的心肌细胞、血岛、神经元、色素细胞、巨噬细胞、上皮细胞及生脂肪细胞[Bradley(1990)Curr.Opin.Cell Biol.2：1013-1017]。但启动这些发育程序是混乱无序的。生成的则是混杂的组织“百宝囊”(Fuchs等(2000)Cell 100：143-155)

这种在培养基中，无序的不可控制的胚胎干细胞体外发育，对一些试图体外再生器官，然后移植给病人以恢复生理结构及功能的人们来说，是一种挑战。要从胚胎干细胞在体外重建功能完全的器官，是一项极大的挑战，就是要从“银河”般的环境信号中，挑选出一个“星座”的信号，可以选择性地“诱导”胚胎干细胞放弃一切其他途径，而走向特定谱系的发育途径。曾经试图用各种方法从胚胎干细胞产生“纯”的特殊类型的细胞，例如能表达神经胶质前身的标志的，纯多功能祖先细胞群，可以从小鼠胚胎干细胞获得[Brustle等(1999)Science285：754-756]。整个过程是煞费苦心的，培育的胚胎干细胞聚集体连续地在培养基中繁殖。培养基上(1)首先只含有成纤维细胞生长因子(FGF2)；(2)然后是FGF2与表皮生长因子(EGF)混合；(3)最后是FGF2与血小板衍生生长因子(PDGF)混合。结果，这些多功能的干细胞用“设计者的鸡尾酒”含多种生长因子的混合液浸泡，可以在培养基里维持许多代。能产生纯的特定的一种组织类型的细胞群，这些成果虽然是显著而无序的，但并没有达到体外再生器官的目标。必须认识到单一类型的细胞群并非组织。要重建生理性的活组织细胞，至少需要有二种类型的细胞，这些细胞必须能通过细胞间信号传导途径，在生理环境中进行交叉谈话。尽管使用了生长因子调成的“鸡尾酒”做了大量工作，在这些信号解译之前，和还没有像身体自己所有的合适的生理环境的情况下，要在体外重建功能齐全的器官，很可能要失败。

与之相反，本发明在临床表明，严重受损的人体器官可以在体内和原位再生，而无需移植。是采用本发明的组合物和方法的一个重要的贡献因素在于，成人干细胞被诱导并繁殖以提供各种类型的再生性细胞，以再建各种组织，因为这些再生性细胞在体内并原位生长，而不是移到体外。它们的生长和分化遵循胚胎发育时就设定了的基因程序。但是这些再生性成人干细胞是处在和胎儿完全不同的、恶劣的环境之中，这些干细胞的命运，不仅受内在的调节机理所控制，还受到外来的干扰，如细菌感染及空气污染物等。因此，必须提供外来的组合物以促进成人干细胞的繁殖，生成大量再生所需的组织细胞，而且成人干细胞的分化应该由一个有利的、模拟胚胎发育的环境来调控，相同或不同的类型的细胞之间的相互作用也应该加以调控，以促进组织专一性的回归和粘着。这样，组织间的相互作用可以促进再生的组织按照器官的专一性来组合，成为在体内的功能器官。

采用烧伤皮肤愈合作为成体器官再生模型，本发明人试验了本发明组合物对干细胞的生长及分化的影响，以及对特殊的细胞-细胞，细胞-组织以及组织-组织间的相互作用。此外，还在体外模型中观察了本组合物的这些作用。

2)表皮干细胞

要替换本身不会分裂的分化了的细胞，就需要干细胞，在皮肤的最外层(表皮)的细胞，分化到了最终，不能再分裂以补充死亡的角化细胞。表皮干细胞位于基底层，表皮与真皮的交接处，能不断分裂产生子细胞，再分化成为各种角化细胞以更新皮肤。

表皮是多层的上皮，主要由角化细胞所组成，角化细胞具有特殊活性，可以合成丝蛋白的中间体称为角蛋白，角化细胞根据分化的不同阶段表达各种不同类型的角蛋白，如角蛋白-1、-9、-10和-16，特别是角蛋白-19(K-19)是在胎儿表皮的基底细胞层中和人胚胎毛发发育期的隆突中发现的[Dale等(1985)J.Cell Biol.101：1257-1269；Moll等(1982)Differentiation 23：170-178；Akiyama等(2000)J.Invest Dermatol.114：321-327]。表达K-19的角化细胞已被认为是公知的表皮干细胞。

从表皮干细胞分化的角化细胞，其每一层的外观都不一样。最内层连接下面的基底板，为基底细胞，能有丝分裂，生成更多的上皮细胞；基底细胞上面为几层较大的带刺的细胞，它们的大量桥粒为角蛋白丝提供了停泊之地；有刺的细胞之外是薄的颗粒细胞层，它标明了代谢活跃的内层与外层之间的界线，外层含有死亡的细胞，这细胞的细胞器都已消失，变成扁平鳞状或鳞屑，填以纵密的角蛋白。

当一些基底细胞正在分裂，使基底层的细胞数量增加时，其他类型的角化细胞溜出基底细胞层，进入带刺细胞层。当他们到达颗粒层，细胞核和胞浆中的细胞器丢失，转变成角质层中的角化的鳞屑。最后，这些鳞屑从皮肤表面脱落。通常细胞从皮肤的基底层由表皮干细胞生出到身体的表面脱落的时间，根据身体的部位为2周到4周不一。

原则上，表皮干细胞可生成二种起初是相似的子细胞，但随后，环境使它们命运不同为了保证新的皮肤细胞的供应，每个自我与日俱增新的皮表补钉必须在每一代的细胞里至少有一个“永生的”细胞。其后代在遥远的将来的皮肤补钉中仍然存在。根据情况，干细胞的生产可能增多，例如当一处表皮补钉破坏时，损伤处被周围的健康的表皮细胞修复，这些表皮细胞移动并增殖，以覆盖裸露的区域，在这个过程中，形成了一个新的自我更新的表皮补钉，表明另一些干细胞已经产生，以补偿损失。

为了产生更多干细胞，干细胞的子细胞可能也是干细胞而不进入向终端分化的路途。这些干细胞的命运由情况来决定，一种可能的决定因素是与基底板或创口的暴露的结缔组织接触，失去这种接触则启动终端分化，保持接触则保存干细胞的潜能。已经发现，与细胞之外的基质的接触，对细胞的命运有重要影响。如果细胞保持悬浮而不下沉到培养皿底部，它们就全部停止分裂和分化。而且还发现，在正常生理条件下，角化细胞占据纤维结合蛋白受体。把细胞留在基底板里以保持他们作为干细胞，如果受体丢失或失活，则细胞就从基底层被排放出去，确认他们要分化。其他原因造成细胞从基底层放出导致丢失受体，使细胞在未成熟时就分化了。

细胞之间，细胞与组织之间的生理的相互作用，对于干细胞保持非分化状态更为重要。正如在本描述后面所显示的，在干细胞生长和分化的体内模型中，成人干细胞被激活，在一种组织专一性的方式下，相互作用，定向地分化成为皮肤的全部组织包括附件所需的各种类型的细胞。这些专一性的相互作用在深度及大面积烧伤皮肤，接受本发明组合物治疗的伤口愈合的过程中已被观察到。在后面还要提到在体外模型中，如果没有本发明组合物推动细胞-细胞间的适当的相互作用，大鼠毛囊就不能进行克隆繁殖，形成皮肤组织。

3)成人伤口愈合

成人伤口愈合是复杂的过程，经历三个阶段：凝结、发炎、增殖及重塑。

首先，起初的凝结过程涉及血小板与纤维蛋白及胶原的接触，纤维蛋白突出层的沉积，对伤口愈合第一个刺激是最通常的损伤-诱致，花生油烯酸介导的组织补体的激活，这种刺激将分叶核粒细胞吸引到损伤区域，作为一种对感染的防御。如果血管在损伤时已经破裂，内皮下的胶原蛋白被暴露于血小板，结果启动了凝血机制。被激活的血小板开始释放生化介体引起血管收缩，从而减少失血。血小板也与受损组织相互作用，引起凝血酶释放，使可溶的循环的纤维蛋白原转化为纤维蛋白，依次构成捕集器和激活血小板，最终形成整体的止血“栓子”。当这些激活的血小板脱粒，它们的α-颗粒释放各种细胞活素和生长因子，它们是炎性细胞如中性白细胞、单核细胞的广泛的化学引剂(趋化性)，和作用于非炎性细胞纤维原细胞和内皮细胞的分裂素，它们被涉及到下面的伤口愈合。纤维蛋白凝块也作为支架，在其之上和通过它这些细胞能够增殖和移动。另外，被激活的血小板参与伤口愈合的合成需要的细胞外基质(ECM)的调节，例如由血小板分泌的细胞活素和生长因子包括血小板衍化生长因子(PDGF)，转化生长因子β₁和β₂(TGF-β₁和TGF-β₂)、血小板衍化上皮生长因子(PDEGF)、血小板激活因子(PAF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、粘连蛋白、5-羟色胺。

第二，炎性期开始于凝结启动的几小时之内。这一过程是一个对感染抵抗和新生细胞与损伤组织之间的桥梁。在此期间，炎性细胞被吸引到损伤区域并激活。在凝结(或止血)的末期，一旦出血停止，随之而来的就是血管扩展和毛细血管通透性增加。

急性炎症的特征，中性白细胞，然后巨噬细胞移动到伤口。这些炎性细胞吞噬细菌和清除损伤组织。发展下去是慢性炎症，在那里淋巴细胞和单核细胞浸润伤口。然后转变为巨噬细胞，它被认为是成人伤口愈合的主要协调因子。

中性白细胞吞噬污染伤口的细菌和消化纤维蛋白基体，为新组织作准备。它们也分泌血管扩张介子和细胞活素，它们激活成纤维细胞和角化细胞，并将巨噬细胞吸引到损伤部位。巨噬细胞吞噬潜在的病原体，清除伤口，分泌细胞活素和生长因子，如成纤维细胞生长因子(FGF)、上皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子(TNF-a)、白细胞间素-1(IL-1)和干扰素-gamma(IFN-γ)。这些化学讯号也刺激成纤维细胞和内皮细胞的渗透、增殖和移动，导致血管生成。

随后，成纤维细胞进入伤口将业已存在的纤维基体替换为氨基葡萄糖和蛋白聚糖。愈合中的细胞外基质(ECM)同样含有许多糖蛋白，包括纤维合成素和tenascin。纤维合成素促进酶解物粘附，tenascin通过对抗纤维合成素促进酶解物的移动。

更进一步，成纤维细胞和内皮细胞将溶解的氧分子转化为过氧化物，这对抵御伤口感染，也对发出的有氧信号进一步促进生长因子的生成是重要的。

第三，在接下来的日子里，多种多样的细胞在加大增殖并移动到伤口，包括巨噬细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、上皮细胞(即角化细胞)和构成血管的内皮细胞。在迁移和增殖过程中，这些细胞被补充到愈合中的伤口经历快速的有丝分裂，变为最终定型的疤痕的结构。

在此期间，一个称之为上皮化的过程出现，使得伤口边缘重新上皮化。在上皮化过程期间，一个以角质化细胞为主构成的上皮覆盖开始迁移，并且经历层化和分化来重建表皮的屏障功能。这一过程也促进细胞外基质(ECM)的生成、生长因子和细胞活素的表达以及通过生长因子(如角化细胞生长因子)的释放生成血管。角化细胞通过释放成纤维细胞生长因子(FGF)和血管内皮生长因子(VEGF)促进血管形成。它们也分泌发挥化学吸引和有丝分裂作用的TGF-α，以及涉及到基体生成的PDGF。成纤维细胞的进一步迁移和增殖导致胶原蛋白沉积代替蛋白聚糖。另外，内皮细胞的增殖建立了新生血管化，即血管形成。

一旦单层角化细胞覆盖了伤口表面，增殖和合成活动减速，迁移停止，在分化和层化的帮助下建立一个带有基础薄层的新分层表皮。

虽然疤痕在这一阶段开始形成。但是底部结缔组织的收缩有助于新表皮的形成。结缔组织通过将伤口的边缘拉到一起而使伤口封闭。当结缔组织没有收缩而是持续堆积时就形成更大的疤痕。另外，当伤口暴露于干燥空气中，无力支撑上面的细胞时，就形成了结痂。常规干性疗法治疗的成人伤口，都是以挛缩疤痕和严重的毁容的方式愈合。

最后，当增殖和迁移活动开始减慢时，组织的重塑就开始了。这一阶段涉及到细胞外蛋白和蛋白聚糖的合成，以及胶原蛋白的溶解和合成之间的平衡。虽然巨噬细胞和淋巴细胞也参与到这一过程，但是在增殖和迁移占主导地位的细胞类型包括上皮细胞、成纤维细胞和内皮细胞。这一过程依赖于有效新陈代谢基体的特性、氧含量和生长因子。重塑可以持续几个星期、几个月、甚至几年的时间。在此期间，成纤维细胞是主导的活动细胞，因为它们与新基体的沉积、重建组织的连续性和决定疤痕形成的程度有关。因此，成纤维细胞的生长和分化应该被特殊加以调节，以便预防它们过度的胶原蛋白沉积活动。

在伤口愈合的过程中，生长因子已经被涉足到各种活动中，如有丝分裂发生、motogenesis、血管形成、趋化性、游走和重建。尤其是因为TGF-β直接与纤维化有关，所以对它做的研究最多。它是由许多参与炎性反应的细胞包括血小板、单核细胞和巨噬细胞释放的，并且被包含在愈合的几乎所有阶段。据了解，它的作用包括化学吸引炎性细胞、增加胶原沉积、抑制蚀原酶、调节细胞外基质成分、阻断纤维蛋白溶酶原抑制因子和促进血管形成[参见Chang等(1995)Aesth.Plast.Surg.19：237-241]。消除由于减少过量的血管形成、炎性细胞渗透和其它生长因子的过度调节而造成的结果的影响。

令人失望的是提高TGF-β的水平，并不一定意味着与疤痕质量的改善有关联。使用外源的TGF-β的结果是提高炎性细胞和成纤维细胞的水平、胶原的沉积和纤维[参见Shah等(1992)Lancer339：213-214]。因此，生长因子的平衡在伤口的愈合方面可以起到至关重要的作用。

目前，这一领域中的流行的观点是成年人的创面愈合必须是疤痕愈合，因为在成人身上，“正常”的炎性伤口愈合是为了降低感染的危险而牺牲愈合的质量。正如本项发明证明那样，成年人大面积深度烧伤无疤痕愈合这一事实，将这个教条改变了。细胞在细胞和组织水平上的动态改变这一令人注目的临床证据，说明了在利用本项发明方法提供的环境下，成年创面愈合过程类似于胚胎无疤痕伤口愈合。

4)胎儿伤口无疤痕愈合

与成年人本能的和自发的伤口愈合相比较，胎儿创伤愈合在炎性反应和生长因子方面有着明显的不同。在胎儿伤口愈合内内源性免疫球蛋白浸润程度低。[参见Longaker et al.(1990)J.Pediatr Surg.25：63-69]。这种中性白细胞浸润的降低并不是因为胚胎没有能力生成中性白细胞。更进一步，在发育更为成熟的胚胎内巨噬细胞聚集的增加与疤痕的增加有着直接的关系[参见Hopkinson et al.(1994)J.Cell.Sci.107：1159-1167]。

在胚胎愈合和成体愈合中，生长因子的形象是有差别的。在胚胎伤口内通过免疫组织化学技术可测量到微量的TGF-β和基本FGF[见于Whitby and Ferguson(1991)Dev.Biol.147：207-215]。同时PDGFs在胚胎伤口和成体伤口的最初阶段内都存在，但在胚胎伤口消失得更快。这可以被解释为与胚胎伤口内轻度巨噬细胞浸润有关。虽然，生长因子脱粒的缺乏能够解释炎性细胞聚集的降低。这可以进一步导致其它生长因子在胚胎伤口处于较低的水平。另外，浸泡在温暖无菌的羊水中，胎儿有可能在这样一个生理湿润和隔离的环境下愈合伤口，并且不留疤痕，不丧失功能。

5)利用本发明方法提供的条件实现的伤口愈合

成人以完整的器官发育的形式完成伤口的愈合，是在与胎儿相比更为恶劣的环境下进行的。伤口对于在创面上机体对创伤产生的“正常”炎性反映，外源的因素如细菌引起的感染和进一步的炎性反映等负面影响，是敏感的。如上讨论过的，在创伤治疗方面流行的思维模式认为成人伤口的愈合必须是疤痕愈合，因为在成人身上，“正常”的炎性伤口愈合是为了降低感染的危险而牺牲愈合的质量。目前的这项发明改变了这一教条，它展示了如果外界提供适当的条件，那么成体拥有的内在的自我修复和再生的能力就会完全发挥出来，对损伤产生反应，伤口的愈合过程能够模拟妊娠早期胚胎伤口愈合的过程，实现严重皮肤损伤的无疤痕愈合。

发明人利用皮肤，这一人体最大的器官，作为组织修复和再生的模型，展示了成人的皮肤能够通过原位培植具有再生能力的成体干细胞，实现再生复制，而且不丢失它的结构和功能，包括皮肤附件。在使用本项发明所包含的技术的情况下控制着伤口愈合过程中的细胞和组织内动态变化。

图5A-C显示了在深II度烧伤后第10天细胞和组织发生的改变。如图5A显示，在伤后第1天，表皮凝固性坏死和真皮浅层胶原纤维变性。在这一阶段，成体细胞对损伤作出反应，开始激活和诱导(将在这一段的下一部分介绍)。伤后第6天，通过使用发明的成分进行的治疗，坏死组织被完全液化排除(图5B)。因为坏死组织是用液化的方法而不是外科的方法排除的，所以残存的活组织被保留下来，避免了由于外科手术而引起的二次伤害。在这种条件下活组织内成体组织细胞被诱导转化为成体干细胞，然后它们发育皮肤再生所需要的成各种组织干细胞，如血管、毛囊、胶原纤维、间质组织和神经。正如图5C所显示的，在伤后第10天，创面上有非常活跃的再生出现。如图6所示，在伤口愈合阶段，在创面内有大量的组织干细胞活跃地繁殖。在高倍放大后，可以观察到再生的干细胞间的特殊连接(图7)。

这些组织干细胞依据在胚胎阶段就已经确定的遗传程序，有方向性地分化成各类细胞。如图8所示，各种细胞向它们的同族组织起源的位置强烈地移动。比如，属于真皮层的细胞向下移动(灰色尖头所指示的)，而表皮细胞则向上移动(黑色尖头所指示的)。高倍放大后，可以观察到成纤维细胞的合成代谢(图9)。成纤维细胞在创面的愈合方面起着重要的作用，产生保持皮肤结构的胶原。然而，在本能的、自发的创面愈合或在常规方法的治疗下产生的愈合期间，由于对感染作出的反应而增加的生长因子，使成纤维细胞的生长比正常的情况下更为活跃。成纤维细胞的增殖导致产生过量的胶原，它们聚集在一起形成紊乱的纤维，当然也就会在伤口封闭后形成疤痕。

相比之下，使用这里介绍的方法，创伤皮肤的再生在深II度烧伤上没有疤痕形成，在III度烧伤上仅留下平滑的、柔软的疤痕。发明人相信成纤维细胞的增长可以被控制，成纤维细胞和上皮细胞的比例会被保持在一个生理水平。使用本发明组合物治疗的伤口，成纤维细胞的胶原的沉积和成纤维细胞和上皮细胞的比例被控制在一个生理水平，可能的原因是本发明组合物促进成纤维细胞成熟。试管内进行的大鼠成纤维细胞培养实验中，在没有本发明组合物存在的情况下，成纤维细胞生长迅速，并表现出与变形细胞相似的形态(图10A)，这与临床的结果是相吻合的。相比之下，培养于本发明组合物中的成纤维细胞保持典型的成熟成纤维细胞的形态(图10B)。

在伤后第20天，大部分伤口被复层鳞状上皮覆盖，而且大部分附件开始在真皮内形成(图11)。同时，细胞代谢废物也从新生成的表皮上不断地渗出。

在伤后第22天，再生出具有正常结构皮肤(图12)。在高倍放大的电子显微镜下，可以见到真皮和表皮之间的连接是完全自然的(图13)。还有，胶原纤维在新生皮肤内按正常三维结构的顺序排列(图14)。

在试管内进行的动物细胞和组织培养实验也证明本发明组合物具有促进哺乳动物已分化细胞和干细胞的增殖以及组织特殊粘连独特的活性，借以保持器官结构的完整性。这与临床上本发明组合物在烧伤病人康复期间对细胞和组织产生的效果是一致的。

图15A-D显示了在试管内培养大鼠皮肤细胞，在加入和未加入本发明组合物的不同结果。在10天之内两组细胞都健康地生长(图15A)。但是，紧接下去两组细胞的存活和生长发生了急剧的变化。在对照组，在30天时细胞开始死亡；但在治疗组，细胞仍然存活并保持着正常的形态(图15B)。在第49天，在对照组有更多的细胞死亡，在治疗组细胞仍然继续旺盛地增殖(图15C)。在第70天，在对照组的细胞全部死亡。与之截然相反，在治疗组，细胞仍然强劲地生长，几乎接近融合(图15D)。在为期6个月的观察期间，治疗组的细胞一直保持着增殖，没有显示出不正常的形态。

这一结果显示本发明组合物是有能力促进初级细胞的生长，据推测是通过将皮肤初级细胞转化为具有持续增殖潜能的表皮干细胞。这与使用本发明组合物，在人体治疗上取得的对成体细胞的效果是一致的。

图16A-C显示了在试管内培养大鼠毛囊干细胞，在加入和未加入本发明组合物的不同结果。如右列的图16显示，对照组的干细胞存活着，但以单个细胞的形式生长。相反，在治疗组干细胞增殖并相互粘连形成细胞团(左列的图16)。在第41天有许多细胞团形成，表现出类似组织的形态；在对照组，干细胞也增殖，但是保持着分散状态，没有形成任何细胞团。

这些结果证明本发明组合物不仅有能力促进增殖，同时也促进干细胞的特殊组织粘连。这也与使用本发明组合物，在人体治疗上取得的对成体细胞的效果是一致的。

图17A-C显示了在试管内培养大鼠皮肤，在加入和未加入本发明组合物的不同结果。如右列的图17显示，在对照组有细胞的游走和分散。相反，在治疗组几乎没有细胞的游走和分散，新生成的细胞保持着与皮块的粘连(左列的图16显示)。在第44天，治疗组持续增殖并与皮块联成一体，在显微镜下显示出明显的分界线。相反，在对照组，持续从皮块上脱落，在培养中分散。

这些结果证明本发明组合物有能力促进细胞与其母系组织的粘连，并保持一个正常皮肤结构的完整性。这也与使用本发明组合物，在人体治疗上取得的对成体细胞的效果是一致的。

为了监测成体器官原位再生过程中细胞生长和分化的动态变化，利用深度烧伤的创面愈合为临床模型，展示了用本项发明的方法进行治疗时，成体细胞如何对内源和外源因素产生反应。

如下面显示的，本项发明第一次证明在有利于生理性组织修复和器官再生的条件下，在成人身上胚胎表皮干细胞被诱导和激活，能够增殖。这些条件是通过应用本项发明揭开的技术和组合物所提供的。

在治疗浅III度烧伤的成年病人的过程中，需要再生不同皮肤组织的再生干细胞在本发明的组合物成分所提供的最适条件下被激活。在这些再生性细胞中，采用免疫组织化学和免疫荧光技术，特异性地检测了表达角蛋白19型标记物的胚胎性表皮干细胞，即K-19角化细胞。而且在该病人皮肤再生的不同时相点，连续监测了表达K-19再生细胞的动态变化。

一位20岁女性病人被汽油火焰烧伤双下肢，烧伤总面积(TBSA)35％(图18)。病理检查证实为15％的深II度和20％的浅III度烧伤。显微镜下观察烧伤创面组织切片，表明全层皮肤细胞坏死，真皮胶原纤维变性、结构紊乱，微循环瘀滞(图19)。

用特异的小鼠抗人角蛋白19型的单克隆抗体(McAb)对正常和烧伤皮肤进行免疫组织化学检查。观察结果表明，该例病人的正常皮肤表皮可见很少量角蛋白19型阳性细胞(图20A)。相对应的，烧伤创面皮肤在伤后24小时K-19染色阳性的表皮再生干细胞数量就中等程度增加(图20B)。烧伤后4天，在汗腺、毛细血管和毛囊周围可见开始增多的潜在表皮干细胞(图20C)。进入再生状态的皮肤组织切片在显微镜下检查，可见增生活跃的新生上皮组织、胶原纤维和皮肤胚胎基(EB)(图21和22)。

烧伤后7天(图20D)和14天(图20E)表皮再生干细胞继续增多，并达到峰值。至烧伤后21天(图20F)和28天，再生干细胞数量又减至一定的水平。

伤后20天，愈合中的创面组织切片在电子显微镜下观察，可见上皮细胞与基底膜之间的半桥粒连接(图29)。更进一步，棘状细胞之间的桥粒连接也形成了(图28)。

伤后30天，该从病人身上取到的新生皮肤组织切片，在电子显微镜下观察显示，采用本发明的方法治疗，使再生的皮肤恢复了正常的生理结构(图24)。而且再生的新皮肤中，胶原纤维的粗细和空间排列均正常，直径0.1μm～0.5μm，有明暗相间的周期性(64nm)横纹(图26)。嗜银染色切片显示，采用本发明的方法和组合物治疗后30天，表皮基层基底膜再生活跃(图25)。

为确认新皮肤是病人自体再生的而不是外源性的，在病人伤后30天对从新皮肤上取到的切片进行了免疫组织化学染色。对用AE₃染色的组织切片进行的免疫组织化学分析，发现其为AE₃阳性的鳞状上皮，表明皮肤是自身再生的表明取该的(图27A)。再生皮肤进行和与此相一致，AE₁染色的组织切片显示AE₁腺上皮蛋白呈阴性(图27B)。这些结果首次证实，新的人体器官能够在体原位再生，而且再生的器官无论在细胞水平还是组织水平都具有正常的结构和功能(图23)。

在深II度(深度部分真皮烧伤)或者更深的烧伤创面，存在于表皮基底层的表皮干细胞已经完全毁损。更有意义和更具挑战性的是在浅III度烧伤(全厚皮烧伤)，表皮和真皮都全层被破坏，只有皮下组织和脂肪层尚健在。用常规方法即干性疗法和植皮治疗全厚皮烧伤烧伤，结果伤口封闭带有毁容疤痕和实质上的皮肤附件的功能丧失。

然而，正如上述，双下肢遭受深II度和III度烧伤的成年病人，其皮肤能够再生痊愈，没有它的实质结构和功能的丧失。那么，组成这一再生器官的组织细胞的来源在哪里呢？

在这里，本发明通过临床实践为该问题作了回答，临床治疗研究的结果证实，如果不是全部的话，至少部分表皮细胞来源于再生表皮干细胞。如图20B-G所示，当肌体处于活跃的组织修复和皮肤再生时，这些干细胞呈K-19阳性细胞。这些再生表皮干细胞增殖、分化，形成能合成不同角蛋白(如9型角蛋白、16型角蛋白)的特殊类型的角化细胞，这些角化细胞向上移动直达表皮。这些细胞可以继续向上移动，进一步分化为能合成较硬角蛋白(如1型角蛋白、10型角蛋白)的角化细胞，这些是成熟表皮细胞所含的典型角蛋白。

不过应该注意的是，这里只有用K-19作为检测标记物的标记细胞是再生表皮干细胞。其它组织如血管、毛囊、胶原纤维、间质组织和神经等的再生干细胞也肯定同时被活化、增殖、分化，形成各种组织细胞，以实现一个具有完整功能的器官在体原位再生。

下一个需要回答的问题是：“再生细胞来自何处？”在正常的生理条件下，有些细胞长期停滞于细胞周期的G₀期或G₁期，在条件变得有利的情况下才出现增殖活动。有些细胞可在有机体的整个生命过程中持续进行分裂活动，连续不断地提供干细胞。干细胞分裂后的部分子细胞分化为执行一定特殊机能的成熟细胞，另一部分子细胞则一直保持连续增殖能力。为了保持正常皮肤的完整性，皮肤表皮基底层干细胞可不断进行分裂增殖。新生的细胞向上方表皮方向移动。在到达棘层深部时可再分裂二或三次，然后失去细胞分裂增殖能力。

如上所述，在深II度和III度烧伤，创面的表皮和真皮深层均已经被损坏，表皮基底层的干细胞也全部毁损。根据在细胞和组织水平观察到的这种创面的愈合过程，发明人认为，皮下组织中毛囊、汗腺和毛细血管等周围的残存而尚有活性的间充质细胞是大部分(如果不是全部的话)再生干细胞的来源，包括多功能表皮干细胞。

这一理论得到了从另外一个面部全厚皮坏死烧伤病人身上获得的资料的支持(图30)。如图31所示。

在机体遭受创伤发生反应时，或(和)在本发明组合物所含活性成分的刺激下，残存而尚有活力皮下脂肪组织中的间充质细胞被活化，并转化为成体干细胞(ASCs)。这些成体干细胞是多能性的，在本发明组合物提供的再生条件下，这些成体干细胞可向不同方向定向分化，生成形成各种组织的组织干细胞，如真皮、表皮、血管、毛囊、胶原纤维、间质组织和神经等(图32)。这些源于它们的母系器官的组织干细胞来相互联接，遵循在胚胎期间就已经确立的基因程序，以一种器官特殊方式相互联合(图33A和B)。

这些特殊的组织干细胞在本发明组合物提供的再生条件下进行原位培养生成子代干细胞，部分子代干细胞被诱导可进行组织特异性分化，形成各种组织细胞，以实现在体内原位再生一个具有完整功能的器官。这些细胞通过形成它们母系器官所具有的特殊的和典型的连接实现相互之间的联合(例如，图28显示的两个棘状细胞之间的桥粒连接)，这样导致新生组织的再生。图34显示了血管和神经的器官特殊联合；以及图35显示的在使用本发明的技术而提供的条件下，而进行的皮肤再生过程期间毛囊的形成。再生的新生组织被培养在本项发明的组合物提供的有利条件下，通过形成它们的母系器官具有的特殊的、典型的连接相互联系在一起，如图29所显示的上皮细胞与基底板之间的半桥粒连接。然后，这些新生组织以器官特有的方式聚合在一起构成新的器官。如图36所示，皮肤附件包括血管、神经和各种腺体都被再生，并且聚合在一起形成新生皮肤。最终，新生器官内的组织逐渐发育成熟，形成与之对应的成体组织，从而构成再生的、全功能的器官。通过在生命体内细胞与细胞、细胞与组织和组织与组织之间的联系，组织和器官能够被再生并修复它们的生理结构与功能。例如，在上面证明的，一位身体丢失了明显的大部分表皮和真皮的成年人，能够重新恢复新的、具有正常结构和功能的皮肤(图25)。

这些发现和发明具有重大的理论意义和实践意义。首先，它们首次表明，通过在体内原位干细胞的培养，成体组织和器官可以实现修复和再生，恢复全部的生理功能。科学家们和医师们都一直梦想着实现这样美妙的结果，却从来没有在临床上实现。发明人认为，通过移植体外培养的干细胞，尽管在修复损伤的表皮和真皮方面取得了一定的成就，但这样的创面愈合并非生理性的。换言之，利用移植方法修复的皮肤留下了畸形的瘢痕，失去了皮肤附件如毛囊、顶泌和分泌性汗腺等的生理功能。在显微镜下，只有本发明中，创面的愈合表现为同一组织的细胞间连接和相邻组织间(如表皮和真皮)的连接在结构和功能上达到了完全生理性的恢复。相比之下，利用其它方法修复的组织间的连接是病理性的重建，失去了原有自然的结构和功能。

其次，这是第一次在完全发育成熟的人体中，在自身组织修复和器官再生过程中，多能性胚胎干细胞被诱导或激活。如上所述，利用本发明的方法引导的创面生理性愈合过程中，创面中大量的再生干细胞表达为K-19型。众所周知，19型角蛋白在胎儿表皮的基底细胞层和人体胎儿的发育毛发中表达。因此，在体内原位培养这些胚胎干细胞，实现成体组织的修复和器官的再生，不仅是医学上的创新，而且对发育生物学和细胞生物学具有深远的影响。

4.用于组织修复和器官再生的组合物配方及用药方式

本发明为动物、特别是人类提供了一种药学或营养学方面的新的药用组合物。

在一方面，该组合物能够促进细胞生长、组织修复和器官再生，尤其是在体内条件下。需要注明的是，这些成分可以被作为试管内细胞生长培养基或在体外重建组织和/或器官。

该组合物含有溶解在油脂中的甾醇类混化合物，其重量百分比至少是0.01％。优选的甾醇化合物的含量重量百分比为0.01％～20％，1％～10％更佳，2％～6％最佳。

甾醇化合物可以是一种动物性甾醇或一种植物性甾醇(也称植物甾醇)。例如，动物性甾醇包括胆固醇以及它的所有天然的或合成的异构体和衍生物。甾醇化合物更好的选择是选用豆甾醇、β-谷甾醇、菜子甾醇、角甾醇，γ-谷甾醇，菜籽甾醇，，α-菠菜甾醇，24-去氢胆固醇、多孔甾醇，胡萝卜甙以及所有天然或合成的同质异构形式及以上述的派生物。甾醇化合物最好是由豆甾醇、β-谷甾醇和菜子甾醇混合组成，在此统称为“谷甾醇”。

虽然不希望受到有关甾醇在组织修复和器官再生中的作用机理的理论限制，发明人认为，甾醇化合物在通过改变细胞膜的流动性和渗透性来诱导细胞形态方面发挥重要作用。如结果显示，很多细胞膜有关的蛋白如激酶和磷酸酶可以被激活来刺激细胞生长。也许休眠的干细胞由于细胞膜形态的改变而被激活。更进一步，不同的成体组织细胞也会被诱导转化为一个无区别型即进入被称作“反分化”的过程。随着细胞膜渗透性的改变，其它分裂素和调节分子可以更容易被细胞膜接受，模拟一个广谱的细胞生长，以满足生理性组织修复和功能性器官的再生的需要。细胞连粘分子(CAMs)的表达和磷酸化可以被模仿，具推测是由于在形态形成过程中的细胞膜约束蛋白的激活，从而进一步提高同族细胞的协作形成特定的组织，同族组织的聚合在体内形成全功能的器官。

进一步而言，该组合物还包含蜂蜡，其含量按重量计算，范围在1％～20％之间，2％～10％更佳，3％～6％最佳。

蜂蜡很久以来就被用作赋形剂来生产外用药。在中国传统医学中，蜂蜡具有解毒、生肌、定痛。治急心痛，下痢脓血，久泻不止，胎动下血，疮痈内攻，久溃不敛，水火烫伤。(《中国中药大词典》，上海科技出版社，1986，2581页)。

蜂蜡的组成可以被分为4类即脂类、游离酸类、游离醇类和烃类。蜂蜡也含有微量的挥发油和色素。在脂类里包括软脂酸蜂花酯、蜡酸蜂花酯和蜂花生油酸蜂花酯。在游离酸类中有蜡酸、廿四酸、褐煤酸、蜂花酸、叶虱酸、落花生油酸、新蜡酸。在游离醇类中有正廿八醇、蜂花醇。在烃类中有廿五烷、廿七烷、廿九烷卅一烷，和称作蜂花烯的石蜡。一种芳香性有色组合物，名为虫蜡素，也被在蜂蜡中发现。

蜂蜡在发明的成分中为溶解在游内的甾醇提供支持结构。在下面说明书详细描述部分，蜂蜡能形成鸽巢样三维结构，其中包含溶有甾醇的油滴。当以软胶囊服用一个口服剂量时，蜂蜡能在胃肠粘膜上形成一层保护膜，并且鸽巢样三维结构以逐渐瓦解的方式将其内包含的油滴会按时释放到损伤区域。

该组合物也可选择性地含有蜂胶，含量按重量计算，范围在0.1％～30％之间，1％～20％更佳，5％～10％为最佳。

众所周知，蜂胶是一种粘性的、橡胶样组合物，它被用来构筑蜂巢。完整的蜂胶内含各种微量成分以单一混合物形式存在，其中松香、蜂蜡、挥发油和花粉是主要成分，也有其它成分如黄酮类似物和苯酚羧基酸。天然蜂胶几乎不溶于水，并有特殊的气味。蜂胶可以用有机溶剂如乙醇、乙醚和三氯甲烷从蜂巢中提取。

该组合物可以含有少量的水，按重量计算，含少于0.5％水为好，最好是少于0.1％。

当用于口服时，本发明组合物的配伍中用了药学上可接受的、在技术上众所周知的载体。这些载体可使复合物配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、乳剂、亲脂性和亲水性悬浮液、液体、胶状、糖浆、浆剂、悬浮液以及类似物，病人可通过口服吸收。

在另一种实施方案中，本发明组合物选择了胶囊剂型。用于口服的胶囊形式包括由白明胶制成的填充胶囊，以及柔软的密封胶囊，由白明胶和可塑剂如甘油或山梨(糖)醇构成。这种填充胶囊能够将有效成分与填装物如乳糖，包装剂如淀粉，和/或润滑剂如滑石或镁硬脂酸盐，和随机的稳定剂一起包裹在内。胶囊本发明组合物更适宜含在软胶囊内。它可以在适当的液体被溶解或被悬浮，如脂肪油或液体聚乙烯乙二醇中溶解。此外，还可添加稳定剂。所有口服的成品应该是符合口服的剂量。

用于口服的本发明组合物还可选择将本发明组合物与一种固体赋形剂混合制成，可辗成混合物，而后加工颗粒组合物，如希望的话，还可加入适当的辅助剂后，制成片剂或糖衣核。合适的赋形剂是，特别是，填装物如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖或山梨糖；纤维素备制，例如，玉米淀粉、小麦粉、米粉、土豆淀粉、白明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟丙丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、和/或聚乙烯吡咯酮(PVP)。如果需要，一些磨碎剂可以被添加进去，如交环聚乙烯吡咯酮、藿香或褐藻酸或盐，比如褐藻酸钠。

糖丸要有适当的涂层。为了这个目的，可以使用浓缩糖溶液，其中可以选择性地含有阿拉伯树脂、滑石、聚乙烯吡咯酮、聚羰乙烯凝胶体、聚乙烯乙二醇、和/或二氧化钛、漆溶液和适当的有机溶剂或混合溶剂。药片或糖衣可以加上染料或色素，用于确认或标记有效混合物的剂量的不同的组合。

应用于口腔时，本发明组合物可以按照常规制成片剂或糖锭。

用于吸入，本发明组合物将根据本发明从压力容器或喷雾器以气雾颗粒飞沫形式方便地释放出来，使用适当的推进剂，例如：二氯二氟甲烷、三氯氟乙烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适当的气体，或自由推进、干粉吸入器。在加压气雾颗粒的情况下，剂量单位是通过一个刻度阀门控制的。胶囊和药筒的，例如在吸入器和吹入器内使用的白明胶可以被制作成混有合成物的粉末，和如以乳糖或淀粉为基质的适当的粉末。

另一方面，本发明组合物还提供了另一种药物形式，它含有药理上合适的成分，其组成包括：溶于注射油中的甾醇化合物，含量按重量计算，至少为0.01％。优选的甾醇化合物的含量范围为0.01％～20重量％，1％～10重量％更佳，2％～6重量％为最佳。

可注射油选用经加工后适于人体临床注射用的蔬菜油，玉米油、花生油、棉籽油、红花油、茶树油、芝麻油、橄榄油或豆油更佳，优选为豆油。列举的加工植物油被记载在美国专利3,798,246号(使用二氧化硅凝胶体与一种洗提有机溶剂化合)和4,101,673号(使用二氧化硅凝胶体或硅酸)，以及4,588,745号中；和Min等人(1972)J.Am.OilChem.Soc.49：675-677，和Singleton等人(1966)J.Am.Oil Chem.Soc.43：592-595中。植物油可以通过氧化硅凝胶体或酸黏土去除异味，然后再过滤。

例如，注射用油可以是通过使用美国专利4,588,745号中描述的方法，从植物油中得到的甘油三酯。这种可用于注射的油是一种甘油三酯，酯内的每一个脂肪酸含有12到20个碳原子；基于原料油，它含有更多的游离脂肪酸；含有减量的三亚油酸；含有减量的甘油二酯和减量的维生素E。

另一方面，本发明还提供了另一种胃肠外应用/注射用的组合物，它的组分包括临床上认可的含油相的脂肪乳化剂，以及溶解于油相中的甾醇化合物，甾醇化合物的含量按重量计算为0.01％～20％。

应该知道的是，甾醇混合物的修饰即包含侧链也在本发明所涉及的范围内。本发明不受任何特别配制的多种甾醇混合物的限制。换言之，任何单独的甾醇化合物或是与其它甾醇化合物根据最终的形式的自然特性，以不同的比率按要求配制，这些都在这项发明所涉及的范围内。

本发明中使用的甾醇化合物从各种天然来源中获取。例如，植物甾醇类可以从加工过的植物油(包括水生植物)中获取，如玉米油、小麦籽油、大豆提取物、大米提取物、米糠油、油菜籽油、芝麻油、和其它植物油、和鱼油。没有限制上述组合物的一般性，现在知道甾醇化合物还有其它来源如海洋动物，从中可以制备本发明组合物。例如，甾醇化合物可以从植物油泥中使用溶剂，如甲醇，被制备出来。另外可选择的方法是从林业的副产品高油树脂或肥皂中被提取。

公知的脂肪乳化剂至少由一种蔬菜油组成，选用玉米油、花生油、棉籽油、红花油、茶树油、芝麻油、橄榄油或豆油为好。在本发明中可用的临床上公知的脂肪乳化剂包括如，Liposyn、Soyacal，Intralipid、Travemusion。本发明的配方在本质上最好是不含外源性清洁剂。

为了制备胃肠外应用的混合物，要求使用商业上和临床上认可的油相脂肪乳化剂。这些脂肪乳化剂以INTRALIPID(Kabi-Vitrum ofEmoryvill，Calif.And Stockholm，Sweden)；LIPOSYN(AbbottLaboratories，North Chicago，III.)；SOYACAL(Alpha Therapeutic Corp.，555Valley Blvd.，Los Angeles，Calif.)；和TRAVEMULSION(TravenolLabs，Inc.，1 Baxter Parkway，Deerfield，III.)等为代表。这些在临床使用的商业脂肪乳化剂是被认可的，并且具有2年或2年以上的存放有效期。这些实用的，带有注册商标的脂肪乳化剂一般含有10-20重量％的植物油，虽然红花油和其它植物油也可相对适用，但常用的还是豆油。

甾醇化合物也可选择溶解于药学上可接受的、水易混合性的、非脂肪酸溶剂中，作胃肠道用药。这种溶液剂包括，但不限于，N-甲基吡咯烷酮(NMP)；丙烯乙二醇；乙酸乙酯；二甲基亚砜；二甲乙酰胺；苯甲醇；2-吡咯烷酮；苯甲酸苄酯；C_2-6链烷醇；2-乙氧基乙醇；烷化酯，如醋酸乙氧乙酯、醋酸甲酯、醋酸乙酯、乙二醇乙醚、或乙二醇甲醚；(s)-(-)乳酸乙酯；丙酮；丙三醇(甘油)；烷化酮，如甲基乙基酮或二甲砜；四氢氟喃；环烷化酰胺，如己内酰胺；癸甲基亚砜；油酸；芳香胺如N，N-二乙基-m-2-甲甲酰胺；或1-dodecylazacycloheptan-2-one。

在这种溶剂中也可联合使用增溶剂，使甾醇在溶液中更易溶解。该溶剂是典型双性的—这些分子具有双重特性，既是极性的又是无极性的—在这种溶液具有增加那些不溶或微溶组合物的溶解度，在分散剂中。这些溶剂经常具有表面活性剂的特性。它们的功能可以是增进溶解物在溶液中的溶解度，而不仅仅是一个溶剂，虽然在例外的情况下，一个单独的化合物同时具有溶解和溶剂的特征。在本发明中可用的增溶剂包括，但不限于：在这种溶剂中也可联合使用增溶剂，使甾醇在溶液中更易溶解。在本发明中可用的增溶剂包括，但不限于：甘油三醋酸酯、聚乙二醇(如PEG300，PEG400，或与3350混合)、吐温(如吐温20，吐温40，吐温60，吐温65，或吐温80)，poloxamers(如Poloxamer 124，Poloxamer 188，Poloxamer 237，Poloxamer 338，或Poloxamer 407)，聚氧乙烯醚(polyoxyethylene ethers)如聚氧2十六烷基醚(Polyoxyl 2 cetyl ether)，聚氧10十六烷基醚(Polyoxyl 10cetyl ether)，聚氧20十六烷基醚(Polyoxyl 20 cetyl ether)，聚氧4月桂基醚(Polyoxyl 4 lauryl ether)，聚氧23月桂基醚(Polyoxyl 23 lauryether)，聚氧2油基醚(Polyoxyl 2 oleyle ether)，聚氧10油基醚(Polyoxyl 10 oleyl ether)，聚氧20油基醚(Polyoxyl 20 oleyle ether)，聚氧2硬脂酰醚(Polyoxyl 2 stearyl ether)，聚氧10硬脂酰醚(Polyoxyl10 steary ether)，聚氧20硬脂酰醚(Polyoxyl 20 stearyl ether)，聚氧100硬脂酰醚(polyoxyl 100 stearyl ether)，聚氧硬脂酸盐(polyoxylstearates)(如：聚氧30硬脂酸盐(Polyoxyl 30 stearate)，聚氧40硬脂酸盐(Polyoxyl 40 stearate)，聚氧50硬脂酸盐(Polyoxyl 50stearate)，聚氧100硬脂酸盐(Polyoxyl 100 stearate))，聚乙氧基化硬脂酸盐(polyethoxylated stearates)(如聚乙氧基化12羟基硬脂酸盐(polyethoxylated 12-hydroxy stearate)以及丁酸甘油酯。在一个优选的实施方案，本发明组合物最好排除药学上可接受的增溶剂。在另一实施方案里，本发明组合物最好排除聚乙氧基化蓖麻油(polyoxyethylatedcastor oil)。

本发明组合物可进一步含黄芩甙，按重量计算，优选的含量范围为0.001％～2％，0.2％～1％更佳，0.5％～1％最佳。黄芩甙可对损伤或疾病组织具有抗炎作用，有助于为器官再生提供一个低炎性环境，模仿与在妊娠早期胚胎伤口无疤痕愈合相似的环境。黄芩甙可以抑止细胞膜多聚糖受体和促进细胞的粘连。

黄芩甙可以从黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)中提取，可以使用油、酒精或其它有机溶剂，优选使用100℃的油，更优选的温度是在120-200℃之间，最优选的温度是在160-180℃。更优选的是使用黄芩的根，可以从同属植物中的一种或几种被获取，唇形科的粘毛黄芩、滇黄芩、甘肃黄芩、薄叶黄芩、丽江黄芩和川黄芩。《中国中药大词典》，上海科技出版社，1986，2017-2021页。

本发明组合物还可以含黄柏内酯(柠檬苦酸)，按重量计算，优选的含量范围为0.001％～2％，0.2％～1％更佳，0.5％～1％最佳。黄柏内酯可以从黄柏中提取(Phellodendron amurense Rupr)，可以使用油、酒精或其它有机溶剂，优选使用100℃的油，更优选的温度是在120-200℃之间，最优选的温度是在160-180℃。另外黄柏内酯也可以使用乙醇从黄柏中提取。更优选的是使用黄柏的树皮，可以从同属植物中的一种或几种被获取，黄皮树、秃叶黄皮树峨嵋黄皮树、云南黄皮树、镰刀叶和黄皮树。《中国中药大词典》，上海科技出版社，1986，2031-2035页。

本发明组合物也可选择含有黄小蘖碱(obabenine)，按重量计算，优选含量范围为0.001％～2％，0.002％～0.5％更佳，0.003％～0.1％最佳。

黄小蘖碱可以从黄芩、黄柏和/或黄连(Coptis chinensis Franch)中提取，可以使用油、酒精或其它有机溶剂。黄连的根适于使用。黄连可以从同属植物中的一种或几种被获取，毛莨科的三角叶黄连、峨嵋黄连、云南黄连。《中国中药大词典》，上海科技出版社，1986，2022-2030页

同样，本发明组合物也可选择性地含有黄连素，按重量计算，优选含量范围为0.001％～2％，0.002％～0.5％更佳，0.003％～0.1％最佳。

同样，本发明组合物还可选择含罂粟壳碱，按重量计算，优选含量范围为0.001％～2％，0.002％～0.5％更佳，0.003％～0.1％最佳。

黄小蘖碱、黄连素和罂粟壳碱单独或联合可以通过抑制平滑肌痉挛达到消除损伤组织疼痛目的。

本发明组合物还可选择含各种氨基酸，最好是所有天然的18种氨基酸，为细胞生长提供营养支持。氨基酸可以是化学合成的，也可以是来自天然的。例如，天然氨基酸的完整谱系可以通过油或酒精提取地龙获得，地龙富含蛋白质/氨基酸。本发明组合物可进一步含有基础核酸如腺嘌呤、胞啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿苷。

在另一实施方案中，本发明组合物在制备修复受损组织或器官药物中的应用。这种应用是，将一种药学上可接受的组合物应用于组织或器官受损或患病的哺乳动物，该组合物含一种甾醇化合物，可在至少0.01％含量(按重量计算)的油中溶解，以便充分地恢复组织或器官的生理结构和功能。优选的甾醇化合物的含量范围为0.01％～20重量％，1％～10％更佳，2％～6％最佳。药学上可接受的组合物可以是上述任何一种发明组合物。

本发明提供了配制适于非肠胃应用于动物的稳定和无毒组合物的方法。这个方法具体是，将一种临床上可接受的含油相的脂肪乳剂和足够量的甾醇化合物充分混合，形成一个组合物，含量按重量计甾醇优选为占0.01％～20％，0.2％～15％，1％～10％更佳，3％～6％最佳。许多公知的方法都可以达到充分混合，如，用超声波降解或通过反复通过一个如注射针的小孔来完成。本发明组合物适于非肠胃应用，通过注射即药丸注射或持续灌注。注射的剂型可以制作成单位剂量即在安瓿中或加入防腐剂的多剂量容器内。本组合物可以采用如下形式如油的或水的载体的悬浮体、溶液或乳剂，可以包含剂型方面的因素如悬浮的、稳定的和/或分散的因素。

另一方面，本组合物可以通过新的作用机理来减轻动物身上的疼痛。发明人发现平滑肌痉挛的可逆抑制能够减轻各种原因引起的疼痛，如外伤和烧伤。在一个试管试验中，小鼠的小肠被斩断后，立即切成7段1cm长的片段，然后浸泡在生理盐水中。小肠片段的收缩率是平均6次/分钟。在生理盐水中加入本发明组合物后，小肠片段的收缩逐渐降低，最后停止。可是，当这些小肠片段重新浸泡在不含本发明组合物的普通生理盐水中后，收缩重新出现。本发明组合物也能够抑制位于真皮层靠近基底层与毛囊相连的立毛肌的收缩。在临床上，使用本发明组合物，有效地减轻了外伤和烧伤病人的疼痛。

具体来说，本发明组合物用于止痛，它包含有生物碱，它们是从含有那可托灵、罂粟碱、黄连碱、黄柏碱、黄小蘖碱、黄连素、蚯吲素和它们的化合物的品系中挑选出来的。例如，有那可托灵和罂粟碱可以用乙醇、油或其它溶剂从干的罂粟荚壳中提取出来。黄连碱可以用乙醇、油或其它溶剂从黄连根中提取出来。黄柏碱和黄连素可以用乙醇、油或其它溶剂从黄柏树皮中提取出来。黄小蘖碱可以用乙醇、油或其它溶剂从黄连、黄柏和/或黄芩中提取出来。蚯吲素可以用乙醇、油或其它溶剂从黄连根中提取出来。

具体来说，该组合物中含有的生物碱适于从黄连、黄柏和黄芩中提取。本组合物还可以进一步包含从罂粟荚壳中提取的那可托灵。

本发明组合物可以用来减轻身体各部位的疼痛。例如，它可以被用作外用药，通过抑制或松弛受伤真皮内的立毛肌的收缩，减轻由外伤、淤伤、烧伤和各种伤害引起的疼痛。它也可以在内脏器官内被局部使用，通过抑制或松弛平滑肌的收缩，减轻由感染、外伤和其它原因引起的疼痛。

本发明组合物可以有很多单一或联合给药途径，包括口服、外用、经非肠胃、经腹膜内、静脉内、动脉内、经皮肤、舌下、肌肉内、直肠、经口腔、鼻内、经吸入、阴道、眼内、经局部传输(如通过导管或固定模)、皮下、脂肪内、关节内，或鞘内。

具体来说，本发明组合物更适于通过各种给药途径局部应用到受损或患病的组织/器官部位，这些给药方法包括经皮肤、肌肉内、用导管或固定模、经腥膜内、动脉内以及阴道。本发明组合物也可以慢速释放剂型单独或联合给药。

由此可见，本发明的组合物可以用来制备美容化妆品，它含有溶解在油脂中的甾醇化合物，其含量至少是0.01重量％。甾醇化合物的优选含量是0.01-20重量％。

本发明的组合物也可以用来制备一种漱口液，漱口液含有溶解在油脂中的甾醇化合物，其含量至少是0.01～20重量％。

本发明的组合物也可以用来制备一种牙膏或者牙粉，其特征在于含有溶解在油脂中的甾醇化合物，其含量至少是0.01～20重量％。

更具体地说，本发明组合物最好是通过直接和局部地给药应用于患病或受损器官的组织。例如，由溶于可注射油中的甾醇组成的发明组合物可以直接注射进心肌，它可以直接被这些组织的细胞所吸收，而无需经过血管。

作为选择，其它用于疏水药品组合物的传输系统也可用于本发明组合物。脂质体和乳剂是人们熟知的疏水性药品的传输载体。采用远距离循环，即侧去迂回脂质体为适宜。这样的脂质体在Woodle等美国专利No.5,013,556条中被常规地记述，其中的学说被按引用结合。

本发明组合物还可选择应用于靶标药品传输系统，如涂有抗体的脂质体中，其靶标是需修复或再生的组织/器官，如特定肿瘤的抗体。该脂质体将被相关部位选择性地作为靶标和吸收(即肿瘤细胞)。

同样，本发明组合物还可选择使用一种持续不变的释放传输系统，如含治疗成份的固体疏水性聚合物的半渗透基质。各种类型的释放传输组合物已经被建立，这方面的成熟技术也被广泛知晓。释放传输胶囊，依赖于它们的化学天然特性，在7天到100天以上的时间内释放本发明组合物。

通过各种体内和体外的各种给药途径，上述所述的本发明组合物和方法在生物学和药学上具有广泛的应用领域。

从形态学角度，本发明组合物和方法可以被用来激活或在体内或体外休眠的成体干细胞(ASCs)，诱导成体组织细胞转化为ASCs。更进一步讲，本发明组合物可以用于将细胞的组织特殊形态分化诱导为细胞的形态学的改变，这可以导致特殊细胞形态的消失，即分化的细胞返祖成未分化细胞(干细胞)。另外，它们也能被用作抑制细菌毒性，据推测是通过调节细菌细胞膜的结构和功能，以及改变细菌的细胞循环。

在细胞内的，本发明组合物可以被用来激活各种酶如激酶和磷酸酶，以及信号分子如环腺苷酸，在细胞生长和分化中发挥重要作用，从而支持细胞的生长和保持各种细胞类型的平衡，以保证生理功能的组织和器官的修复和再生。

细胞内的，本发明组合物可以被用来促进同类细胞和非同类细胞之间特殊组织连接的形成，据推测是通过激活各种粘连分子(CAM)的表达和活性，如构成各种生理连接的连接蛋白和cadherin。

在组织水平，本发明组合物可以被用来促进组织的特殊器官组合，通过促进这些组织之间的生理连接。

在人类医学和兽医学，本发明组合物可以被用来治疗各种由受伤、疾病和老化引起的疾病。如临床结果显示，本发明揭示的方法学被用于通过原位再生干细胞培植，即在器官原来所处的位置，再生或复制一个新的器官。这样的一个全新的方法使再生医学领域发生了革命，使人类健康受益，改善生活质量。

5.对残存活细胞造成最小伤害的清除坏死组织的组合物和方法

本发明也提供造成最小伤害的清除坏死组织的组合物和方法，以保存疾病或损伤组织或器官内的残存活细胞。

在疾病或损伤组织内，细胞对于各种来源于微环境的信号产生一系列生物化学反应，经常是以细胞死亡为结局。细胞有两种死亡方式：坏死和凋亡。坏死是细胞被物理性力量，如对组织热学的、锐器的和外源性化学的损伤，后常见的死亡方式。凋亡或程序化的细胞死亡，换句话说，是一种由它们的内在的自毁基因程序控制的，对如化疗和凋亡调节蛋白的表现作出的反应。

不管细胞的死亡方式，组织内死亡的细胞需要被清除以便促进组织的再生。如果坏死细胞留在疾病或损伤部位，来源于这些细胞的各种生物化学产物将引发身体的炎性反应，这会阻碍组织的再生和加重对残存活细胞的损害。

与常规的结痂和坏死组织的外科清创方法相反，本发明提供一种全新的方法来解决许多医生在治疗创伤和溃疡时所遇到的这个问题。传统的外科清创经常导致残存活组织的二次外科损伤，根据本发明这对组织和器官的再生是不利的。用蛋白酶进行的酶法清创普遍对存活细胞有细胞毒害作用。

根据本发明，坏死组织通过液化排出的方式被从伤口清除。为了取得这一效果，新组合物具有独有的三维物理结构。

在本发明的一个实施方案中，组合物中含有蜂蜡，在低于25℃的条件下形成鸽巢样的三维框架结构，油滴被包裹在蜂蜡鸽巢中。

更进一步讲，本发明的组合物还可以包含1重量％～20重量％的蜂蜡，优选为2重量％～15重量％，5重量％～10重量％最好。

发明人已经通过发掘蜂蜡和油的不同热学-物理学特性设计出了类似鸽巢样三维结构。采用公知的技术，将蜂蜡加热70-80℃时溶化。下一步，将溶化的蜂蜡与油混合，如动物或植物油(如豆油、芝麻油和玉米油)，然后开始逐渐冷却的环境温度(也就是20-25℃)。因为蜂蜡比油冷却得快，变硬的蜂蜡形成小“鸽巢”内包有油滴的三维框架结构。图37描绘出了蜂蜡形成的鸽巢样结构内含油滴。理想情况下，油滴分别包含在各自的鸽巢内，相互之间没有接触。鸽巢的尺寸在5～50μm较好，10～30μm更好，15～20μm最好。

图38显示电子显微镜下具体的成分大约10％的蜂蜡。如图38所示蜂蜡实质上形成了鸽巢样三维结构，每个单独的油滴包含在里面。

为了维持结构的完整性，成分中可以含有极少量的水，水的重量低于1％较好，低于0.1％更好，低于0.01％最好。

发明物所独有的结构在使用它液化清除坏死组织时发挥着重要作用。当发明物被涂抹到损坏组织如烧伤病人的创面，蜂蜡形成的鸽巢内的油滴的释放(图39)，引发一系列生物化学反应。由于并不希望被反应的精确分子机制所束缚，发明人相信在创面上油滴和坏死组织之间至少发生五种生物化学反应，包括水化、酶解、腐化、皂化和脂化。

第一步，当发明物用于伤口创面上时，接触伤口蜂蜡鸽巢样三维结构被体温加热后分解，油滴被释放(图40)。释放的油滴渗透如创面组织内将坏死组织颗粒包绕在其中。

第二步，被油滴包绕的坏死组织开始细胞的水化(图41)，结果各种细胞内的酶被释放出来。

第三步，释放的细胞酶进一步分解被油滴包绕的坏死组织颗粒。

第四步，通过分解的坏死组织颗粒与油滴之间的腐化和皂化反应，固体的坏死组织颗粒被液化。

第五步，通过液化组织的脂化反应，有效成分被油滴内的脂肪酸脂化，可以被排出创面(图44)。

最后，随着发明物的蜂蜡鸽巢样三维结构逐步崩溃，更多的含有有效成分的油滴被一起释放到创面内，去包绕剩下的坏死组织颗粒。同时，由于液化的坏死组织与残存的活组织不相容，使得这些坏死组织伴随着网状框架结构的崩溃而渗出(图45)。

根据这一发明组合物的作用机制，通过传统方法(如外科清创术)很难清除的固体坏死组织能被转变成自动排出创面的液体，对活组织不造成损伤。

这个非侵入性方法在某些方面是非常有益的。首先，坏死组织被迅速清除，从而防止身体产生炎症反应。第二，随着坏死组织被有效地清除，促使细菌生长的环境被破坏，这样就有力地减少了细菌感染的危险。

尤其重要的是，当坏死组织被完全清除时，残留的活组织未被药油所封闭，相反，残留的活组织被形成于这些组织表面的一层几乎透明的膜保护起来。如图46所描述的，在皮肤活组织表面形成一层透明的蛋白膜，通过这种蛋白膜，组合物中的活性成分能渗透入活组织，同时代谢产物和其他排泄物能得到引流，从而促进再生。这种膜能起使再生活跃的脆弱的肉芽组织与恶劣的外界环境隔离开的保护层的作用。在某种程度上，它可作为表皮的替代物，防止皮肤中的活组织免于外界环境的侵袭。如图46所述，这种膜具有“呼吸”功能，能使代谢产物自动引流，以及促进再生的细胞和组织吸收营养组合物和氧气。

另外，这种由蜂蜡组成的将植物精制油液溶含其中的独特结构，使创面置于生理性湿润环境中。这种微小的立体框架结构将创面与外界环境隔离，防止创面过度干燥，还促进药膜下面的活组织进行有效地“呼吸”。如图47所述，暴露于外界空气中的兔的烧伤创面发生活跃的水分蒸发，造成伤口过度干燥。相反，经这种发明的组合物(IC)治疗的伤口的蒸发量则很低，并在生理上保持一较低水平。与自身对照组相类似，应用传统干性疗法(如热烘干燥暴露疗法)治疗的创面的水分蒸发量就比应用此组合物治疗的创面的水分蒸发量高(图48)。

重要的是，当使创面置于生理性湿润环境时，这种发明的组合物不会象凡士林那样导致组织过度浸渍。如图49中所做的比较，覆盖有凡士林的创面的蒸发量被抑制在比覆盖有IC的创面低两倍的水平。在生理上，如图50A和B所做的比较，应用IC治疗的兔的烧伤创面是湿润的，且在48小时内由表及里逐渐被液化(图50A)。相反，覆盖有凡士林的兔的烧伤创面出现浸渍，呈现出组织脱落的迹象；而且创面周围的正常皮肤也发生过度浸渍。显微镜下可见，应用干燥疗法治疗的创面，在坏死组织和活组织之间有炎性细胞浸润(图51A)。相反，应用此独创组合物治疗的创面，在坏死组织和活组织连接处仅出现轻微的炎性细胞浸润，轻度肿胀和微血管充血(图51B)。在凡士林治疗的创面上，炎性细胞在烧伤后48小时出现组织空泡和浸润(图51C)。同样如图52的表中所示，应用IC治疗的兔的创面愈合时间(15天)比未接受任何治疗的对照组(20天)更快。这些结果证实，这种具有三维立体结构的独创组合物具有作为保护层取代皮肤和维持皮肤生理性湿润环境的能力。

需要强调的是，此药物除了采用将精制油液溶含其中的网状框架结构的蜂蜡外还有用其他原料组成的药物成分也包含在此次申报的发明中。

这种创新性组合物可作为大量各种药品、nutraceuticals和化妆品的基质。许多活性成分可溶解或悬浮于药油中，然后这些油液被溶含在蜂蜡形成的网状框架中。合成的剂型可局部、口服、通过吸入或其他适当的给药方法来用药。

6.通过非杀菌性方式抑制细菌毒性

本发明还提供了能够抑制广谱细菌毒性的成分和方法。与应用抗菌素和含酒精的消毒剂的传统疗法相比，本发明的抑菌模式完全不同。通常，应用此独创的组合物后，细菌细胞没有立即死亡。相反，细菌细胞仍然具有遗传复制的能力，并且，细菌的毒性还由于此独创组合物干扰细菌细胞分裂产生的毒素而得到有力地抑制。根据广泛的细胞生物学和显微镜研究结果，这种抑制作用是通过调整细菌细胞的形态学和细胞结构，以及通过改变细胞生长的生态学而实现的。

细菌细胞是属于多数自然界环境中发现的形成最简单的有机体的原核细胞。典型的细菌细胞呈球形或杆状，一般有几微米长，细菌细胞的结构相当简单。在被称为细胞壁的保护层的下面，细胞膜包绕着单一的含有DNA、RNA、蛋白质和小分子的细胞质。

遵循一种被称为二分裂的细胞复制方式，细菌可迅速复制。在最理想的条件下，单个细菌细胞每20分钟分裂一次，从而在不到11个小时内产生50亿个细胞。某种类型的细菌通过产生靶向受感染的宿主动物的免疫应答的细菌毒素对动物产生毒性，导致炎症和器官损伤。如果不能及时地控制细菌感染，就能导致严重的器官损伤，甚至有时造成受感染的宿主死亡。

最普遍的抑菌方法是应用抗菌素的杀菌作用。为了预防细菌感染，许多抗菌素是由真菌类制成。几乎所有已知的抗菌素是通过在基因复制阶段干扰细菌的细胞周期发挥它们的杀菌作用。例如，利福霉素在DNA转录成RNA的阶段抑制细菌的基因复制。利福霉素能通过结合RNA聚合酶阻断RNA链的起始。然而，多数抗菌素在基因复制的翻译阶段干扰细菌生长。这些抗菌素与细菌核糖体的不同区域相结合，从而抑制蛋白质合成过程中不同的步骤。例如，链霉素阻止翻译起始复合体向延长核糖体的链的转换，还造成错编密码。四环素阻断氨酰基tRNA与核糖体A端的连接。在蛋白质合成的多肽链延长期间，多肽链羧基的末端被从位于小核糖体亚基的P端的tRNA分子上分开，且被一肽键连接到A端与tRNA分子相连的氨基酸上。这种蛋白质合成的中心反应被肽酰转移酶所催化。氯霉素能阻断肽酰转移酶对核糖体的作用。当核糖体准确地沿着mRNA分子向前移动三个核苷时，A端的新肽酰tRNA被移位到P端。这个步骤需要能量，且被在某一核糖体成分内被GTP分子的水解所诱导而发生的一系列构象的改变推动。红霉素能阻碍这种作用于核糖体的移位。这些药物利用原核和真核核糖体之间结构和功能的不同来有选择地干扰原核核糖体的功能。

然而，一些抗生素能在基因翻译阶段作用于原核生物，例如细菌，真核生物，如哺乳动物。例如，嘌呤霉素能通过添加到生长链端造成新生多肽链不成熟的释放。另一方面，放射菌素D通过结合DNA和为了抑制RNA合成阻碍RNA聚合酶的运动来干扰基因转录。另一种杀灭细菌的普遍方法是在治疗表面上(如创面)应用酒精，例如乙醇或异丙醇。酒精对于杀灭细菌非常有效，这可能是通过细菌细胞壁的完全分解而直接导致坏死细胞死亡来实现。然而，这些酒精性试剂在杀死细胞方面没有选择性，且会过于刺激以至于损伤创面新生的脆弱的再生细胞。

7.在体外促进干细胞生长的成分

本发明也为在体外培养真核细胞(如人类细胞)提供了方法和组合物。在一种实施方案中，组织培养基用来在体外促进细胞的生长和/或维持滋养特殊的细胞系或细胞类型。

在一种实施方案中，为培养真核生物细胞尤其是在体外培养动物的干细胞提供一种组合物。这种组合物含有溶解于有机溶剂中的含量至少为0.01重量％的甾醇类化合物。这种甾醇类化合物优选的含量范围是0.01％～20重量％，较优选的为0.01％～10％，最佳含量为1％～5％。可以选择的是，这种甾醇类化合物在培养基内可与脂质相结合，被传递到培养细胞中。

本发明还提供一种培养真核生物，尤其是在体外培养动物的干细胞的细胞方法。该方法包括：将细胞或组织培养物与含有含量为至少0.01重量％的甾醇类化合物的组合物相接触。甾醇类化合物优选的含量范围是0.01％～20重量％，较优选的含量为0.5％～10％，最佳含量为1％～5％。

这种组合物和方法可用于促进细胞生长，而不发生突变或基因改变，尤其是，培养基内的细胞可无限分裂，且可防止发生分化。

这些组合物和方法还可把变异的基因转移到细胞内用来确定初级细胞系。原代培养物事先取自一有机体的组织，有或没有初始的细胞分离分级步骤。在多数情况下，原代培养物中的细胞能被从培养皿中移除，用来形成大量中级培养物；这些细胞可用这种方法重复传代培养数周或数月。这样的细胞经常显示出许多属于它们的起源物的不同特性：纤维原细胞持续分泌胶原蛋白；起源于胚胎骨骼肌的细胞在培养皿中相融合以形成大的自主收缩的肌纤维；神经细胞伸展具有电兴奋性的神经轴突，以及和其他的神经细胞形成神经突触；上皮细胞形成具有完整的上皮细胞所拥有的许多特性的大面积细胞层。然而，在正常条件下原代培养物通常在50代之后就死亡。正如对生长在含有这种发明的组合物的培养基中小鼠皮肤进行的实验所证实的(实施例1，图15A-D)，细胞能够增殖，而不表现出任何异常或转化的显型。

这种组合物能以一定的量被添加到常规的组织培养基中，以适合于生长某种特殊的细胞或组织类型的数量。尽管组织培养基含有特定数量的小分子，例如盐、葡萄糖、氨基酸和维生素，但是多数培养基内还含有界定不明确的大分子混合物，有马血清或胎牛血清或鸡胚的天然提取物。化学上确定的不含血清的培养基包括利于细胞在培养基内生存和增殖的各种生长因子。这类培养基还包括携带铁到细胞的运铁蛋白。其他蛋白质信号分子对于特殊细胞类型的生存、发育和增殖是必不可少的。

这种发明组合物可促进某些或所有的某个适合于培植哺乳动物细胞的典型培养基的成分的功能。以下列举了这些组织培养试剂的种类，当然并不仅限于这些，1)氨基酸，如精氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸；2)维生素，如生物素、胆碱、叶酸、烟碱、泛酸、维生素B6、维生素B1和核黄素；3)盐，如NaCl，Kcl，NaHPO₄，NaHCO₃，CaCl₂和MgCl₂；4)蛋白质，如胰岛素、运铁蛋白、特殊的生长因子；5)其他：葡萄糖、青霉素、链霉素、酚红和全血清。

实施例

以下实施例1-3表示哺乳类动物细胞在含本发明组合物的培养基内的生长状况。

在以下的实施例中，体外实验证实本发明独创的组合物对于促进正常分化的哺乳类动物和哺乳类动物的干细胞的增殖和组织特异性附着具有独特的作用，同时还保持皮肤结构的完整性。皮肤组织细胞，毛囊干细胞和皮片均取样自大鼠或小鼠，且在体外进行培养。细胞或者组织被分成两组：对照组在常规的细胞培养基内培养(完全的MEM)，治疗组在加入此独创组合物的常规培养基内培养。

实施例1小鼠皮肤细胞培养

将小鼠致死后立即采取其新鲜皮肤，并在6孔培养皿(大约10⁴个细胞/ml，7ml/池)中的MEM中进行培养。三天后，可见这些细胞生长正常，在培养的第八天，这些细胞黏附于细胞培养皿的基底层。在治疗组中加入该组合物约3g，本发明组合物由约0.01％的谷甾醇，约0.3％的黄芩素和约0.2％的黄连素组成，以上组合物均被混合在芝麻油中。在对照组中加入2ml的MEM。将两组生长培养基每4-5天更换一次，每2-3天记录培养物的显微镜下表现。

图15A-D显示对于小鼠皮肤细胞培养物在有本发明组合物存在，或没有的情况下的体外实验结果。右栏图片取自对照组，左栏的来自治疗组。第十天，两组的细胞可见生长状态良好(图15A)。然而，两组细胞的生存率和生长状态出现显著改变。在对照组，细胞开始在第30天死亡，治疗组的细胞仍然存活，且保持了正常的形态(图15B)。在第49天，更多对照组细胞死亡，治疗组的细胞继续保持活跃增殖(图15C)。在第70天，对照组的所有细胞都死亡了。与之明显不同的是，治疗组的细胞仍然生长有力且几乎融合(图15D)。在为期六个月的观察期内，治疗组的细胞始终增殖，且没有出现不正常的形态改变。

这些结果证实，这种发明的组合物具有促进原代细胞生长发育的能力，据推测是通过将原代皮肤细胞转换成具有潜在的持续增殖能力的表皮干细胞来实现的。这与对用本发明组合物治疗的成体细胞的作用是一致的。

实施例2大鼠毛囊干细胞的培养

将大鼠致死后立即从毛囊的隆突部采取大鼠的毛囊干细胞，在含有24孔MEM/5％FCS培养皿(每孔有2ml)中进行培养。5天后，可见这些细胞生长良好，且黏附于细胞培养皿的基底部。治疗组中加入约1g本发明组合物，该组合物含有溶于绵子油中豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇，含量为6重量％，1ml的MEM被加入对照组。对培养物观察了41天，记录了培养物的显微镜表现。

图16A-C显示：大鼠的毛囊干细胞在含有或不含本发明组合物的培养基内进行的体外实验结果。右栏图片显示对照组，左栏来自治疗组。如图16右栏所示，对照组的干细胞存活了，但是呈单独生长。相反，治疗组的干细胞发生增殖，并且开始互相融合形成克隆(见图16左栏)。第41天，治疗组形成了许多克隆，出现类似组织的形态。然而，对照组的细胞尽管也增殖了，但是仍然分散开，未形成任何克隆。

这些结果证实，本发明组合物不仅具有促进繁殖的能力，还促进干细胞组织特异性黏附力。这与用此组合物治疗的成体细胞所产生的作用是一致的。

实施例3小鼠皮肤组织培养

将小鼠致死后立即采取其新鲜皮肤，分切成片状，培养在MEM培养皿和6池MEM/15％FCS培养皿中(5ml/池含有3片皮肤)。4天后，这些皮片附着于细胞培养皿基底部。在治疗组加入了约6g本发明组合物，该组合物溶于大豆油中的1重量％的α-菠菜甾醇和0.001重量％黄小蘖碱。在对照组加入了6mlMEM。对这些培养物观察了44天，记录了培养物的显微镜下表现。

图17A-B显示小鼠皮肤组织在有或无该组合物的培养基内进行体外实验的结果。右栏图片来自对照组，左栏来自治疗组如图17的右栏图片所示，对照组内出现细胞迁移和分散，相反，治疗组的细胞迁移和扩散少见，且新生的细胞仍然附着于皮片(图16左栏)。第44天，治疗组的细胞继续增殖，与皮片融合，且显微镜下可见清晰的边缘。相反，细胞持续从皮片转移，在培养基内扩散。

这些结果证实，本发明组合物具有促进细胞与其同类组织融合及维持正常皮肤结构的完整的能力。这与应用该组合物治疗的人类成体细胞的作用是一致的。

实施例4表皮干细胞在体内和原位的诱导与繁殖

以下实施例首次证实，胚胎表皮干细胞被诱导和激活，能够在有利于组织的生理学修复和器官再生的条件下在成人体内繁殖。这样的再生条件是通过应用这种方法和本发明组合物完成的。此外，这些胚胎表皮干细胞的动态变化是在对应用该方法和组合物治疗产生反应的经历皮肤再生的皮肤上检测到的。

在对一患有浅III度烧伤的成年人的治疗期间，需要用来再生各种皮肤组织的再生性干细胞被含有本发明组合物提供的理想条件所激活。在这些再生的细胞之间，表达标记物角蛋白19型的胚胎表皮干细胞是通过应用免疫组织化学和免疫荧光技术特别检测到的。表达再生细胞的19型角蛋白的动态变化也在这位患者的皮肤再生期间在不同的时间检测到的。

该患者使用本发明的组合物中含有占组合物总重量20％重量的溶于玉米油当中的豆甾醇进行治疗。该组合物中黄芩苷的含量为2重量％。

一位20岁女性的四肢被汽油烧伤，面积为35％TBSA(图18)。病理学分析显示有15％的深度部分真皮烧伤和20％浅全厚皮层烧伤。取自烧伤创面的部分组织的显微镜检查显示全厚层皮肤细胞坏死、退化和真皮内胶原蛋白纤维的结构紊乱以及微循环阻滞。(图19)。

受伤区域的皮肤和组织分别在第24小时和第4、7、14、21和28天采取自患者烧伤后，并把它们保存在试管内与液氮冷冻，然后被包埋入Tissue-Tek OCT化合物中并和液氮冷冻。10μm厚的切片是在可进行温度调节的冷冻箱内制得的。

应用一生物素-抗生物素蛋白DCS系统对切片进行非直接免疫荧光染色。冷冻切片与10％的马血清的温度保持在4℃恒温下20分钟，然后加入小鼠抗人角蛋白19型单克隆抗体(第一种抗体)的1∶20的稀释溶液。这些切片再次被保持在4℃的恒温一整晚。用磷酸盐缓冲液冲洗后，在切片中加入5μg/ml的生物素化的马抗小鼠IgG抗体(第二种抗体)(产自美国加利福尼亚州Burlingame Vector实验室)，然后在4℃恒温下保存一个小时。这些切片被冲洗和放置在含有10％PBS和1％的对苯二胺的甘油中。作为对照组的正常皮肤的切片以同种方式进行染色，但不加入第一种抗体。标本在Olympus反射荧光显微镜下进行观察，用ASA400柯达胶卷照相。

此例是应用特殊的小鼠抗人角蛋白19型单克隆抗体治疗来对正常的和烧伤皮肤进行免疫组织化学检查。结果揭示了在这位患者的正常表皮中，少数细胞呈角蛋白19阳性(图20A)。相反，烧伤后24小时，创面的皮肤中存在中等数量的角蛋白19染色呈阳性的再生的表皮干细胞(图20B)。烧伤后4小时，汗腺、毛细血管和毛囊周围再生的表皮干细胞的数量升高(图20C)。再生皮肤的切片的显微镜检查显示，胶原纤维和皮肤胚胎基底部的新生上皮组织增生活跃(图21和22)。

在第7天(图20D)和第14天(图20E)，表皮干细胞继续增多，在此期间达到最高峰。直到第21天(图20F)和第28天，再生的干细胞的数量降低到一低水平。

烧伤后第20天，采取自愈合的创面的切片的显微镜检查显示，上皮细胞和基底膜之间形成了半桥粒连接(图29)。此外，棘状细胞之间也形成了桥粒连接(图28)。

烧伤后30天，采取自患者的新生皮肤的切片的电子显微镜检查显示，通过应用此呈报的发明技术再生的皮肤保持了自身正常的生理结构(图24)。同样，再生的新皮肤的胶原纤维的大小和立体排列都是正常的，大小是0.1-0.5μm，具有典型的明岸相间的周期横纹(63nm)(图26)。切片的嗜银染色显示，应用别人发明的方法和组合物治疗30天后，上皮基底层的基底膜增生活跃(图25)。

为了确定皮肤是再生自患者自体而不是来自其他外在来源，在患者烧伤后30天采取其再生皮肤的切片以进行免疫组织化学染色。用AE3染色的切片的免疫组织化学分析可见鳞状上皮的阳性蛋白，表示皮肤自发的自我再生(图27A)。与此相一致地，用AE1染色的切片显示了腺上皮阴性蛋白(图27B)。这些结果首次证实，人类一新器官可在体内和原位复制，且在细胞和组织水平保持正常的生理结构和功能(图23)。

在深II度(深度部分皮层烧伤)或更差的烧伤创面上，位于表皮基底层的表皮干细胞受损。更有趣且富有挑战性的是，浅III度(全厚层烧伤)的烧伤创面上，完整的表皮和真皮和皮下组织受损，皮肤的脂肪层仍然存活。应用干性疗法和皮肤移植等传统疗法对全厚层烧伤的治疗可导致伤口疤痕愈合和皮肤附属物的正常功能丧失。然而，如上所示，患有深II度和III度烧伤的成人的皮肤可以再生修复且不丧失皮肤结构和功能。构成再生器官的组织是哪些细胞来源组成的呢？

本发明通过临床上证明至少部分(如果不是全部)的表皮细胞起源于再生性表皮干细胞提供了问题的答案。如图20B-G所示，这些干细胞染色呈角蛋白19型阳性反应，此时身体的组织修复和皮肤再生活跃。这些再生性表皮干细胞增殖和分化以产生特殊类型的能合成其他类型角蛋白的角化细胞，例如，角蛋白9型和角蛋白16型，它们可向上往表皮方向移动。这些分化的细胞继续向上、向前分化以产生具有合成更强的角蛋白的角化细胞的能力，例如角蛋白1型和角蛋白10型，它们是成熟的表皮细胞的典型角蛋白。

然而，还需要强调的是，只有再生性表皮干细胞通过应用作为探测标记物的角蛋白19型得到标记。其他组织的再生性干细胞，如血管、毛囊、胶原纤维、间质组织和神经也被激活，在体内和原位增殖分化以产生某个功能完善的器官再生所需的所有细胞(图6和11)。

另一个问题是：“这些再生性细胞来自哪里？”在正常的生理条件下，某些细胞长期处于细胞周期的G₀和G₁期，且它们的增殖仅仅在这些条件变的有利的情况下才开始。然而，某些细胞的增殖持续贯穿与人体生命的始终，这样，就需要干细胞的持续供应。部分干细胞的子代细胞分化成熟，特化的细胞和它们的一部分保持增殖能力。在正常的未损伤的皮肤，表皮基底层的干细胞具有持续增殖的能力。新增殖的细胞向上朝表皮方向移动。当到达棘层的深部区域时，增殖出现两到三次，然后就丧失它们的增殖能力。

如上所讨论的，在深II度和III度烧伤创面上，表皮和真皮的深层受损，表皮基底层的干细胞也受损。基于对创面愈合过程在细胞和组织水平的观察，发明者相信，位于皮下组织毛囊、汗腺和毛细血管周围残存的间叶细胞(图31)可提供多数(如果不是全部)再生性干细胞，包括多潜能的表皮干细胞。在残留的活组织内的间叶细胞被激活而因为对身体受伤和/或通过此发明组合物内的活性成分的刺激产生反应而转变成成体干细胞(ASCs)。这些成体干细胞是多潜能的，且在由此发明组合物提供的再生条件下，成体干细胞能被诱导直接分化成各种组织干细胞，例如真皮、表皮、血管、毛囊、胶原纤维、间质组织和神经。这些特化的组织干细胞是由此发明组合物提供的再生环境中培植以产生子代干细胞，它们的一部分被诱导，组织特异性地在体内或原位分化成某个功能器官再生所需要的各种细胞。

例如，提供各种类型角化细胞的表皮干细胞可能起源于间叶细胞。对损伤的反应以及在由此发明组合物所提供的再生环境下，受损区域残留的活组织内的间叶细胞转变为成体干细胞，它们的一部分然后直接分化成再生性表皮干细胞。这种表皮干细胞能合成特殊的细胞角蛋白19型，这样就能通过免疫分子化学方法得到确定。此时，通过应用抗人角蛋白19型单克隆抗体，在深II度和浅III度烧伤创面的皮下组织中，可明确地检测到再生性表皮干细胞。

如上显示，在使用本发明的方法治疗之后，表达再生性干细胞的K-19的数量随着伤口的逐渐愈合而增加，达到一个高峰值，然后当几乎所有组织再生后数量下降。这些结果显示，即使对于一个导致表皮和真皮全层破坏的III度烧伤，通过应用本发明的方法提供的条件，再生的表皮干细胞仍然能够从残存的活组织中被激活和诱导。

在创面上使用本发明组合物，并且实施合理的临床管理，人体再生的干细胞会被激活和增殖以确保健康皮肤的自发的、生理性再生，实现深II度烧伤的无疤痕性愈合，和在浅III度烧伤仅形成平滑柔软的疤痕。

上述结果表明，胚胎表皮干细胞(K-19角质形成细胞)因对烧伤创面的反应而被诱导或激活，并且在本发明的组合物提供的再生环境下增殖。这些干细胞的数量在皮肤再生的过程中发生急剧的改变，首次揭示了在外界提供的有利条件下，通过激活和增殖自体干细胞，成人身体是如何在体内和原位引导自身组织修复和器官再生的。这些再生干细胞被认为是表皮细胞的来源，即使不是全部，也是皮肤再生所必需的。

更进一步，基于在组织和细胞水平的临床观察，发明者相信成体干细胞产生组织干细胞之后，一种特殊组织类型的组织干细胞(例如表皮干细胞)被诱导生成可再生成它们同源组织所需要的各种类型的细胞(例如各种类型的角化细胞，如K-1、K-9、K-10和K-16)。这些细胞通过形成特有的、具有同源组织特征的连接而相互传递信息(如图28显示的两个棘状细胞之间的桥粒连接)，从而导致新生组织的再生。再生的新生组织在本项发明的合成物提供的有利条件下被培植，通过形成特有的、具有同源组织特征的连接而相互传递信息，例如图29显示的上皮细胞与基底膜之间的半桥粒连接。此外，这些新生的组织以器官特异性的形式聚合在一起构成一个新生器官。最后，新生器官中的组织发育成熟为它们相应的成体组织，构成再生的、全能的器官。通过这些在生命体内的细胞-细胞、细胞-组织和组织-组织之间的联合，组织和器官能够重建它们生理结构和功能的情况下再生。例如，在上面所证实的，一个损失了她身体非常大面积的表皮和真皮的成人，能重新被具有正常结构和功能的新皮肤覆盖(图23和24)。

这些发现和发明在理论上和实践中都具有重要的意义。首先，它们第一次揭示了通过原位培植干细胞，成体组织和器官能够在保留完整的生理功能的情况下再生修复。这个成果是从事这一领域工作的科学家和医生们梦寐以求的，但是在此之前从未在临床上实现。发明者相信即使移植体外培植的干细胞在修复受损表皮和真皮方面取得了可喜的、有限的成功，但是，这种创面的愈合不是生理性的。换句话说，使用这种移植方法修复皮肤可导致毁容性疤痕和皮肤附属器(如毛囊、顶浆分泌的和外分泌腺的汗腺)生理功能的丧失。显微镜下，只有本项申报的发明证实，同一组织中细胞之间和相邻组织之间(例如表皮和真皮)的连接能够实现完全的结构和功能上的生理性重建。与之相反，使用这一领域中的其它方法，组织间的连接重建呈病理性，表现出不正常的结构和功能。

其次，这是第一次在一个发育完全的人体内，在其自身组织修复和器官再生期间，多潜能的胚胎干细胞被诱导和激活，如上所示，使用本项发明的方法，在创面生理性愈合过程中，创面中大量的再生干细胞表达角蛋白19型。众所周知，19型角蛋白在胎儿表皮基底层细胞和在人类胎儿生长的毛发的隆突部位被表达。在体内和原位培植这些胚胎干细胞，用于成体组织修复和器官再生，不仅是一项医学创新，而且对发育生物学和细胞生物学有着深远的影响。

实施例5胃肠道组织的干细胞分化

本发明组合物以及方法可用以激活或诱导胃肠道组织中的再生性干细胞，以修复在胃肠道中的器官的黏膜的损伤及疾患。本发明提供的组合物可以治疗人体消化道疾患，本实施例中给大鼠消化道使用一种含溶解于油中的甾醇化合物的组合物，其中甾醇化合物，β-谷甾醇，含量的重量百分比为20％，其油脂为花生油。得到的结果如图3治愈的胃溃疡的动物模型。

本发明人认为本发明的组合物可以有效地修复损伤的粘膜，在胃肠中，特别是在胃中提供再生的条件，在胃肠道中使用本组合物后，药物与胃粘膜混合，形成保护膜，其中含有粘蛋白，可将粘膜与食物以及胃中的其他组合物的进一步刺激隔开，在这种情况下，组合物中的甾醇化合物及其他有效成分被释放出来激活再生性干细胞，促进粘膜加快修复，此外，本发明组合物也可以通过使细菌的形态改变有效地抑制幽门螺杆菌的毒性，通过健康的胃肠道的再生，有利于幽门螺杆菌的溃疡状况得到改善，间接地抑制细菌的生长。

实施例6激活毛囊干细胞

头皮上局部涂覆使用本发明的组合物，该组合物包括10重量％豆甾醇，1重量％的黄柏内酯(柠檬苦酸)。采用现有技术的方法将其溶于橄榄油中。如图4所示，可使秃发男人毛发再生。本发明人认为，本组合物有效地激活毛囊干细胞，这种干细胞可能存在于毛囊隆突之中。再生性干细胞的增殖和分化为形成强壮健康的毛干提供了足够的毛发细胞

实施例7抑制和/或杀灭细菌与病毒的药物组合物

与应用抗生素和消毒剂传统的方法相比，本发明披露了通过非杀菌性作用机制抑制细菌毒性的新的组合物及其使用方法。这种发明组合物提供的独特成分中含有溶解在含量至少为0.01％油脂中的动物甾醇类或脂溶性植物甾醇类。。本实施例中，使用现有技术的方法加工成的组合物中，含有溶解在动物脂肪，例如牛脂肪中的，按重量计算，0.2重量％的链甾醇。

虽然不希望被通过这种发明的组合物抑制细菌毒性的作用机制所局限，发明者在本发明中提出，某种动物甾醇类或植物甾醇类一旦与细菌的细胞膜相结合，就可能改变细菌细胞膜的结构和流动性，导致细胞形态学上的改变。细菌细胞的形态发生对细菌造成严重的生物物理学和生物化学改变，这种改变可能是通过抑制细胞分裂和细菌毒素的产生实现的。

大量实验证据支持这一假设。在含有各种细菌的培养基上进行体外实验，细菌包括破伤风杆菌、脆弱类杆菌、痤疮丙酸杆菌、变形杆菌属、大肠杆菌和绿脓杆菌。

图53A-C显示：在一含有这种发明组合物的培养基上生长的破伤风杆菌细胞的形态学改变。图53A显示：破伤风杆菌细胞的正常形态呈细长杆状。培养于含有这种发明组合物的培养基的破伤风杆菌的第一、二代呈一长杆状或细丝状(图53B)。破伤风杆菌的第三、四代在长度上呈现出很大的改变，有较多芽孢形成一呈鼓槌状，以及少许长杆状或细丝状(图53C)。

图54A-C显示：生长在含有这种发明组合物的培养基上的脆弱类杆菌的形态改变。图54A显示：脆弱类杆菌的正常形态为中等大小杆菌。其在含有此发明组合物的培养基上的第三、四代出现长短不一的杆菌，并且有细菌聚集融合(图54B)。脆弱类杆菌的第五、六代近似小球形，并有许多细菌聚集融合成不规则的圆球形(图54C)。

图55A和B显示：生长在含有这种发明组合物的培养基上的痤疮丙酸杆菌的形态改变。图55A显示：正常的痤疮丙酸杆菌的形态是细短杆状。相反，培养在含有这种发明组合物的培养基上的痤疮丙酸杆菌的第三、四代呈长度不等，大小不一的杆状或细丝状(图55B)。

图56A-C显示：生长在含有这种发明组合物的培养基上的白色念珠菌的形态改变。图56A显示：白色念珠菌的正常形态是卵圆形，可见较多的芽生孢子。白色念珠菌的第三、四代在含有此发明组合物的培养基上出现大小不等的圆球形，可见到一些棒状菌体和少许芽生孢子(图56B)。白色念珠菌的第五、六代出现棒状或长杆状，可见长短不等的细菌丝，芽生孢子较少见(图56C)。

图56D和E显示：白色念珠菌的芽管试验结果。白色念珠菌正常的芽管产生率是90％。相反，生长在含有这种发明组合物的培养基上的白色念珠菌的第五、六代的芽管产生率仅约为0.5-2％(图56E)。

图57A和B显示：生长在含有这种发明组合物的培养基上的变形杆菌的形态改变。图57A显示：变形杆菌的正常形态是细短杆状。相反，生长在含有这种发明组合物的培养基上的变形杆菌的第一、二代呈更长，更大的杆状或长细丝状(图57B)。

图58A和B显示：生长在含有这种发明组合物的培养基上的大肠杆菌的形态改变。图58A显示：大肠杆菌的正常形态是短杆状。相反，生长在含有这种发明组合物的培养基上的大肠杆菌的第五、六代呈更长，更大的杆状或长细丝状(图58B)。

图59A和B显示：生长在含有这种发明组合物的培养基上的绿脓杆菌的形态变异。图59A显示：绿脓杆菌的正常形态是短杆状。相反，生长在含有这种发明组合物的培养基上的绿脓杆菌的第五、六代呈各种更长的的杆状或长细丝状(图59B)。

这些结果确定了这种发明组合物具有在不造成细胞直接死亡的情况下使细菌的形态发生变异的能力。这些细胞仍持续发生遗传复制，显然还可以改变细菌的侵袭力。这种作用模式与那些利用抗生素逐渐在转录和翻译阶段抑制遗传复制的方式截然不同。

为了证实本发明组合物不仅导致细菌的形态变异还改变它的毒性，进行体外实验以测试这种组合物对于金黄色葡萄球菌的血浆凝固酶的影响。如图60的表格所示，对照组的细胞培养物具有高度的酶活性，含有许多大菌落的液体清澈。相反，生长在含有本发明组合物的培养基中的细胞的酶活性被逐渐减弱。传代至第七、八代，在浑浊的培养物中出现较少的小菌落。如图61所示，显示对于的不同含量的本发明组合物，细菌有一个不同的剂量反应。含量较低时，细菌需要用较长的时间来降低血浆凝固酶的活性。

本发明组合物对金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的增殖的影响已经得到确定。如图62所示，这两种类型的细菌传代至第十代后，细菌总数减少了20-30倍。

尽管细菌细胞的数量没有显著减少，但是应用这种发明的组合物治疗后，细菌的侵袭力被明显减弱了。同样如图62所示，动物的病理学检查显示了这种差别。在对照组动物的皮下组织中，出现充血、水肿、炎性细胞浸润和化脓，表明有金黄色葡萄球菌的完全感染。相反，在被细菌感染的动物的皮下组织和横纹肌中，存在没有化脓现象的少许炎性细胞的浸润。

如上所述，这种在植物油中含有甾醇类的发明组合物不仅能够使细菌的形态发生明显变异，还能杀灭细菌，显著地削弱细菌的毒性和侵袭力。同样，在对此含有甾醇类的组合物进行的动物和临床试验中，细菌对创面的毒性显著地得到抑制，而再生的新的动物细胞能与细菌共同生存，且可迅速生长以保证体内的组织迅速修复和器官再生。

发明者相信，不同的细菌细胞对于甾醇类与细菌的细胞膜相结合有不同的反应。膜的成分和流动性的差别可能导致真核细胞和原核细胞之间在形态变异和细胞周期方面的不同反应。

在原核细胞(例如细菌)中，DNA的分裂和细胞质的分裂直接相结合。当DNA复制时，双份拷贝的染色体被连接在细胞膜的特殊区域，以及被细胞膜间的生长逐渐分隔。分离发生在这两个附着物上，这样每一个子代细胞获得一个染色体。

革兰氏阴性菌(如大肠杆菌)有两层细胞膜：内膜和外膜。内、外液体双分子膜之间有高度多孔渗水的、坚固的由蛋白质和构成细菌细胞壁的多糖的肽聚酶；在外膜肽聚酶与脂蛋白相结合，填充入周质的间隙内。这个间隙还含有各种可溶性蛋白质分子。革兰氏阳性菌(如葡萄球菌和链球菌)有单层细胞膜，但是有较厚的细胞壁。它们的单层膜和革兰氏阴性菌的内膜相似。

细菌的细胞膜由脂质双分子层构成，这是细胞膜基本的结构基础。细胞膜的脂质是两性分子，不溶于水但易溶解于有机溶剂中。大约50％的多数动物的细胞膜由它们组成，其余的几乎都是蛋白质。细胞膜富含磷脂，磷脂具有极性的顶端和疏水的碳氢化合物的尾端。尾端通常是脂肪酸，它们在长度上是不同的(正常的含有14-24个碳原子)。长度的不同和脂肪酸尾端的位置是重要的，因为它们影响磷脂分子互相充塞的能力，且因为这个原因它们影响膜的流动性。

脂质双分子层是二维液体结构，可使单个脂质分子在脂质双分子层内自由扩散。细胞膜的准确的流动性具有重要的生物学意义。例如，当这种双分子层的粘度增强超过起始水平时，可见膜的运输过程和酶活性被终止。脂质双分子层的流动性取决于它的成分和温度。细菌、酵母菌和其他微生物的温度随适合它们的细胞膜脂质的脂肪酸成分的环境而波动，以至于保持一相对稳定的流动性。

真核生物的细胞膜尤其含有大量胆固醇——每个磷脂分子有一个胆固醇分子。胆固醇分子具有加强脂质双分子层的通透性屏障性能的作用。它们应用自身的接近磷脂分子极性端的羟基确定在双分子层内的位置；它们坚固的盘状类固醇环影响和部分地固定烃链上的那些与极性端最接近的区域。通过降低第一个少数磷脂分子烃链的CH2基的活性，胆固醇使脂质双分子层在这个区域不易变形，从而削弱双分子层对小的水溶性分子的通透性。

多数真核细胞的细胞膜是不同的，不仅在所包含的大量胆固醇方面，还在含有不同的磷脂混合物上。许多哺乳类动物细胞的细胞膜中有四种主要的磷脂占有优势：卵磷脂、鞘磷脂、磷酸酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺。

相反，细菌的细胞膜通常由一类主要的磷脂组成，且不含有胆固醇。这些细胞膜的机械稳定性是由被覆在外的细胞壁加强的。这样，动物甾醇类(如胆固醇)和植物甾醇类(如谷甾醇)相结合改变细菌细胞膜的正常成分和结构，导致流动性和通透性发生改变。细菌的分裂被抑制可能是流动性发生改变的结果，表示巨大的或被拉长的细胞在DNA复制不减弱的情况下的成长状况。

另外对病毒，例如感冒病毒，肝炎病毒等也观察得到相同的结果。

这种运用甾醇类的独特机制可被用来构成在药物、nutraceutical、化妆品和家庭日用品(如漱口水、牙膏或者牙粉)中广泛应用的新型抗菌成分，且不会象抗菌素那样经常产生副作用。

本文引用了多种参考文献，其所公开的全部内容仅供参考。本发明并非限制在本文中描述的特定实施方案的范围内。确实，除了那些在本文中所描述的以外，描述中对本发明的多种修正对本领域的技术人员是显而易见的。本申请旨在将这类修正落入到权利要求保护的范围之内。

Claims (21)

1.一个体外培养细胞的方法，该方法包括：

获取从哺乳动物体预定部位分离得到的组织细胞或组织；

将溶于油脂中的细胞生长调节剂添加到培养基中形成组织培养基，所述细胞生长调节剂，按该细胞生长调节剂总重量计算，含有0.01重量％-20重量％的甾醇化合物、0.001重量％-2重量％的黄芩甙和1重量％-20重量％的蜂蜡；

在组织培养基中培养所述的分离得到的组织细胞或组织。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的组织细胞或组织分离自啮齿类动物或人。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的组织细胞或组织分离自活体哺乳动物。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的获得的组织细胞或组织来自哺乳动物的除胚胎干细胞和囊胚泡之外的肠和/或肠粘膜、毛囊、皮肤。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的组织在体外处理以产生细胞，然后分离该细胞并在组织培养基中进行培养以产生组织—器官。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在组织培养基中激活所述的分离的组织细胞或组织所含有的细胞，并继续增殖和分化至180天。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的油脂包括植物油或动物油。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的油脂包括一个选自玉米油、花生油、棉子油、红花油、茶树油、芝麻油、橄榄油或豆油的油。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的油脂包括芝麻油。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的甾醇化合物是动物甾醇或植物甾醇。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的甾醇化合物包括胆固醇以及所有天然或合成的、异构体或其衍生物。

13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的甾醇化合物选自豆甾醇、β-谷甾醇、角甾醇、γ-谷甾醇、菜子甾醇、α-菠菜甾醇、24-去氢胆固醇、多孔甾醇、胡萝卜甙或所有天然或合成的，异构体或衍生物及其组合。

14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甾醇化合物是豆甾醇、β-谷甾醇和菜籽甾醇的组合。

15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，按该细胞生长调节剂总重量计算，该细胞调节剂中的甾醇化合物的量为1重量％-10重量％。

16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蜂蜡，按该细胞生长调节剂总重量计算，其含量为2重量％-10重量％。

17.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的培养基还含有蜂胶，按该细胞生长调节剂总重量计算，其含量为0.1重量％-30重量％。

18.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的黄芩甙，按该细胞生长调节剂总重量计算，其含量为0.2重量％-1重量％。

19.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞生长调节剂还含有黄柏内酯，按该细胞生长调节剂总重量计算，其含量为0.001重量％-2重量％。

20.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞生长调节剂还含有黄小蘖碱，按该细胞生长调节剂总重量计算，其含量为0.001重量％-2重量％。

21.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞生长调节剂还含有黄连素，按该细胞生长调节剂总重量计算，其含量为0.001重量％-2重量％。

22.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞生长调节剂还含有罂粟壳碱，按该细胞生长调节剂总重量计算，其含量为0.001重量％-2重量％。

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