CN1824143A - 一种皖贝母提取物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种皖贝母提取物及其制备方法，该提取物含有至少50％的总生物碱，包括贝母素甲、贝母素乙、异贝母甲素、贝母辛和贝母生物碱甙。本发明所述的皖贝母提取物经药效学试验证实，它的镇咳作用与可待因比较无明显差异，并无快速耐受现象；它的祛痰作用与必嗽平比较无明显差异；它还具有平喘作用、明显减轻炎症反应及抑制炎症增殖期的作用。本发明还公开了皖贝母提取物在制备具有镇咳祛痰平喘功效药物的用途和含有它的药物。

Description

一种皖贝母提取物及其制备方法和用途

发明领域

本发明涉及一种皖贝母提取物，本发明还涉及所述皖贝母提取物的制备方法，本发明也涉及该皖贝母提取物在制备具有镇咳祛痰平喘功效药物的用途，本发明还涉及含有该皖贝母提取物的药物。

背景技术

贝母由于品种产地不同分为浙贝母、川贝母和皖贝母等，通常使用的贝母为浙贝母和川贝母，而皖贝母为安徽贝母，植物拉丁名为Fritillaria anhuiensis.S.C.Chen et S.F.Yin，是于1990年卫生部批准作为药用的一类中药材，已用于临床及制剂中，正逐步推广使用。人们在对贝母的研究中发现，贝母中含有许多生物碱，已经分离出贝母素甲、贝母素乙、异贝母甲素和贝母辛的明确化学结构的成分。但是至今没有发现将这些成分按照一定比例组合镇咳祛痰平喘的报道。本发明人在对皖贝生物总碱的进一步分析发现，它们是主要包括这些已知结构的组份及贝母生物碱甙，并且所含贝母素甲、贝母素乙、异贝母甲素和贝母辛与浙贝母中所含的这些生物碱含量完全不同，皖贝母中异贝母甲素＞贝母素乙＞贝母辛，浙贝母中贝母素乙＞贝母素甲＞异贝母甲素＞贝母辛，而在川贝母中仅含有贝母辛而不含其他三种成分。本发明人将这些成分的新组合进行药理试验发现它们具有更好的镇咳祛痰平喘功效，从而完成了本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种皖贝母提取物。

本发明的另外一个目的是提供该皖贝母提取物的制备方法。

本发明的又一个目的是提供该皖贝母提取物在制备具有镇咳祛痰平喘功效药物的用途。

本发明的还有一个目的是提供含有该皖贝母提取物的药物。

本发明所述的皖贝母提取物包括皖贝总生物碱，总生物碱以贝母素乙计，不得少于50％。皖贝总生物碱包括异贝母甲素、贝母素乙、贝母辛、贝母素甲和生物碱甙，其中异贝母甲素∶贝母素乙∶贝母辛∶贝母素甲∶贝母生物碱甙的重量比为3-5∶2-4∶1-3∶0.8-1.5∶0.5--1。优选它们之间的比例：异贝母甲素∶贝母素乙∶贝母辛∶贝母素甲∶贝母生物碱甙＝3.8∶3.5∶2.5∶1∶0.74。

本发明皖贝母提取物的制备方法可以是，但不限于，酸碱转移氯仿萃取法、离子交换树脂法以及大孔树脂吸附法。

如果采用酸碱转移氯仿萃取法从皖贝母中提取本发明的提取物，它包括下列步骤：先用乙醇温浸皖贝母，乙醇挥干后的浓缩液以酸水溶解生物碱，酸液碱化后的游离生物碱用氯仿多次萃取，氯仿萃取液水洗后脱水浓缩即得。根据皖贝母药材的生物碱含量，此方法得率在90％以上，但由于大量应用有机溶剂，尤其使用有毒价貴的氯仿，只能用于实验室而难于用于工业生产。

如果采用离子交换树脂法从皖贝母中提取本发明的提取物，它包括下列步骤：用0.05mol/L盐酸溶液作溶剂，对皖贝母进行渗漉，渗漉液通过氢型732苯乙烯磺酸型阳离子交换树脂，树脂碱化后地索氏提取器中用乙醇回流洗脱，洗脱液减压浓缩即得，通过薄层层析与药材对比，生物碱无变化，定量测定，得率可达到85-90％，此方法所得皖贝母提取物纯度较高，得率也不低，但离子交换树脂的再生需要较大量的酸碱及去离子水，工业生产用的大型索氏提取器，设备条件要求也较高。

如果采用大孔吸附树脂法从皖贝母中提取本发明的提取物，它包括下列步骤：用DA-201大孔树脂，以0.1mol/L盐酸渗漉液上柱，80％乙醇洗脱的简单易行的工艺，所得的浓缩液色泽较深，采用相当总碱量30倍的中性氧化铝柱层析脱色，乙醇洗脱液色泽浅，生物碱无变化，得率在90％左右。因此，本方法操作简单，设备要求不高，流程也较合理，生物碱收得率也较高，是一种适合工业生产的制备工艺。

本发明所述的皖贝母提取物优选采用大孔树脂法，具体步骤如下：

(1)药材渗漉：

将皖贝母经挑选干净的干品磨成粗粉，以0.1mol/L盐酸溶液作溶剂，浸渍24小时后装入渗漉罐，以合适的速度进行渗漉，收集渗漉液，渗漉液的体积与生药重量之比为11ml∶1g；

(2)树脂吸附：

将处理好的DA-201大孔吸附树脂装柱，以去离子水充分洗去残留的乙醇，将渗漉液加入大孔吸附树脂柱缓缓通过，流速根据树脂用量决定，上样量每1cm³树脂体积可上相当4.6g生药的量或相当本发明皖贝母提取物2.1mg的量。渗漉完成后加适量去离子水洗去未吸附杂质，再以乙醇洗脱至无生物碱反应为止，收集洗脱液，减压浓缩。

(3)脱色：

将洗脱浓缩液加于已活化好的中性氧化铝柱上，上样量为30g中性氧化铝可上相当本发明药物组合物1g的量，用乙醇洗脱至无生物碱反应为止。洗脱液减压浓缩至无醇味，即本发明皖贝母提取物的溶液，此溶液真空干燥，即得。

本发明所述的皖贝母提取物优选的制备方法是用0.1mol/L的盐酸溶液浸渍24小时后，渗漉，得到渗漉液，渗漉液的体积与生药重量之比为11ml∶1g，将其上到预处理过的装有DA-201大孔树脂的大孔树脂柱上，用去离子水洗至pH为5，再用80％的乙醇洗脱，将洗脱液减压浓缩回收乙醇，将浓缩液上到中性氧化铝柱上脱色，上样量为30g中性氧化铝可上相当皖贝母总碱1g的量，用医用乙醇洗脱至无生物碱反应为止，将洗脱液减压浓缩回收乙醇，浓缩液在70℃真空干燥，得到。

现根据本发明皖贝母提取物的组份性质，采用正交试验对皖贝母提取方法的工艺参数进行研究，筛选出最佳工艺条件，为充分利用皖贝母资源提供可靠的合理的方法。

(一)实验材料：

原料：皖贝母(安徽贝母Fritillaria anhuiensis.S.C.Chen et S.F.Yin的干燥鳞茎)，霍山产，购自霍山县医药公司，粉碎过16目筛。

仪器：万分之一分析天平

电热恒温真空干燥箱

岛津UV-240紫外分光光度计

试剂与药品：贝母素乙标准品，中国药品生物制品检定所

DA-201型大孔吸附树脂

中性氧化铝(层析用100-200目)

乙醇(化学纯)、盐酸(分析纯)、氯仿(分析纯)。

(二)实验方法：

1、提取工艺流程：

2、提取物的含量测定：

采用酸性染料比色法测定皖贝总碱含量，经岛津UV-240紫外分光光度计进行波长扫描测定，离子对最大吸收波长为410nm，且在70分钟内稳定，标准曲线显示皖贝总碱的量(以贝母素素计)在2.0-10.0ug/ml范围内符合比尔定律，可作含量测定的依据。

(1)标准溶液的配制：

精密称取贝母素乙标准品2.5mg置50ml量瓶中，加氯仿溶解，定容至刻度，摇匀。

(2)标准曲线的制备：

精密吸取标准溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml于60ml分液漏斗中，分别准确加入氯仿至25ml，再加入pH5邻苯二甲酸氢钾缓冲液2.0ml及2.0ml溴麝香草酚兰溶液0.001mol/L，密塞，剧烈振摇5分钟，静置20分钟使其充分分层后，分取氯仿层于置有0.25g无水硫酸钠(105℃干燥4小时)的干燥具塞容器中，密塞，摇匀。随行空白对照，于岛津UV-240紫外分光光度计410nm处测定吸收度，用最小二乘法求得回归方程为：

Y＝-0.0013+0.04245X，r＝0.9999

(3)供试品溶液的制备

精密称取皖贝母提取物约20mg，置50ml量瓶中，加14％氨水0.2ml，再加混合溶剂(乙醚-氯仿-95％乙醇，25∶8∶2.5)至刻度，振摇使溶解，放置，精密吸取上清液25ml，水浴蒸干，于105℃加热30分钟，残渣用氯仿分次溶解，定量移入50ml量瓶中，加氯仿至刻度，摇匀。

(4)供试品的测定：

精密吸取供试品溶液1ml依标准曲线项下操作测定吸收度，按下式计算供试品中总生物碱含量(以贝母素乙计)

式中：y为吸收度；n为稀释倍数；w为称样量(g)

(三)正交实验

1、实验设计

①正交试验因素与水平选择，见表1

表1

水平	因素
						A	B	C	D	E
	渗漉溶剂(HCl)浓度mol/L	大孔树脂用量g/cm3△	树脂乙醇冲洗浓度％v/v	中性氧化铝用量g/g△△	中性氧化铝柱乙醇冲洗浓度％v/v
						1	0.05	4.6	80	6.6	94
2	0.1	2.3	94	3.3	80

注：△g/cm³表示生药量/树脂体积  △△表示生药量/中性氧化铝量

②实验按L₈(2⁷)正交分布安排，结果见表2

表2

列号试验号	A		B	C	D	E		总碱含量％	总碱得率(g)×100
										1	2	3	4	5	6	7
	1	1	1	1	1	1	1										1	67	37
2								1	1	1	2	2	2	2	55	24
	3	1	2	2	1	1	2										2	38	38
4								1	2	2	2	2	1	1	51	27

5	2	1	2	1	2	1	2	73	27
										6	2	1	2	2	1	2	1	61	28
7	2	2	1	1	2	2	1	64	42
										8	2	2	1	2	1	1	2	60	38

2、实验结果与分析：

(1)含量数据分析表：见表3

表3

	A		B	C	D	E
								I	211	256	246	242	226	251	243
II	258	213	223	227	243	218	226
								I-II	-47	43	23	15	-17	33	17

(2)得率数据分析表：见表4

表4

	A		B	C	D	E
								I	126	126	141	154	141	139	134
II	145	145	130	117	130	132	137
								I-II	-19	-19	11	37	11	7	-3

(3)直观分析：

①通过含量数据分析表可见影响含量指标的因素，由极差(I-II)的大小确定由主到次的因素为A→E→B→D→C，其较好的因素水平为A₂B₁C₁D₂E₁。

②通过得率数据分析表可见影响得率指标的因素由极差(I-II)的大小确定由主到次因素为C→A→B、D→E，较好因素水平为A₂B₁C₁D₁E₁。

③通过以上两表可见D因素均为次要因素，对含量指标和得率指标的影响不大，可以任意选择，考虑到经济因素，故选用D₁，所以综合以上两表选取最佳工艺水平为A₂B₁C₁D₁E₁。

4、方差分析

本实验为二水平试验，所以列变动的计算采用下列算式：

①含量的方差分析：

$S_1=\frac{{(I-\mathrm{II})}^2}{8}=\frac{{(-47)}^2}{8}=276.125$

以下同S₂＝231.125

      S₃＝66.125

      S₄＝28.125

      S₅＝36.125

      S₆＝136.125

      S₇＝36.125

据正交表头设计有：

S_A＝S₁＝276.125                f_A＝f₁＝1

S_R＝S₃＝66.125                 f_R＝f_a＝1

S_C＝S₄＝28.125                 f_C＝f₄＝1

S_D＝S₅＝36.125                 f_D＝fs＝1

S_E＝S₆＝136.125                f_E＝f₆＝1

S_误＝S₂+S₇＝267.125            f_误＝f₂+f₇＝2

因为

因为

所以因子B、C、D的变动并入误差得

S^△ _误＝S_误+S_B+S_C+S_D＝397.625      f^△ _误＝f_误+F_B+f_C+f_D＝5

方差分析见表5

表5

方差名称	S	f	V	F	显著性
						A	276.125	1	276.125	3.47	*
B△	66.125	1	66.125
						C△	28.125	1	28.125

D△	36.125	1	36.125
						E	136.125	1	136.125	1.71	*
误	267.125	2	133.625
						误△	397.125	5	79.525

注：^*符号表示对得率指标有较大影响，F0.10(1，5)＝4.06

                                    F0.25(1，5)＝1.69

△记号的那些因子将其变动归入误差

根据以上方差分析表可见A和E对含量指标有较大影响，B、C、D因素对含量指标影响很小，可以任意选择，考虑到经济因素选B₁C₁D₁较适宜，所以从含量指标来看，最佳工艺条件为A₂B₁C₁D₁E₁。

②得率的方差分析

计算方法同上，方差分析表见表6

表6

方差名称	S	f	V	F	显著性
						A	45.125	1	45.125	2.73	*
B△	15.125	1	15.125
						C△	171.125	1	171.125
D△	15.125	1	15.125
						E△	6.125	1	6.125	10.35	**
误	46.125	2	23.125
						误△	82.625	5	16.525

注；^*符号表示对得率指标有较大影响，F0.10(1，5)＝16.62 F0.10(1，5)＝4.06

^**符号表示对得率指标有显著影响，F0.05(1，5)＝6.61 F0.10(1，5)＝4.06 F0.25(1，5)＝1.69

△符号表该因子其变动归入误差

根据以上分析表可见因素C的变化对得率指标有显著影响，A因素的变化对得率指标有较大影响。B、D、E因素应选E₁，考虑到经济因素B、D应选B₁、D₁所以从得率指标看，最佳工艺条件为A₂B₁C₁D₁E₁。

③综合含量指标和得率指标来看，B、D因素对两者影响不大，可任意选择，考虑到经济因素应选B₁D₁。而A因素对含量指标和得率指标都有较大影响，都应选A₂，而因素E对含量指标有较大影响，而对得率指标影响不大，所以应选C₁，综合以上分析，选择最佳工艺为A₂B₁C₁D₁E₁。即渗漉溶剂(盐酸)用0.1mol/L，DA-201型大孔吸附树脂用量为每4.6g生药用1cm³树脂，洗脱大孔树脂乙醇浓度为80％，中性氧化铝用量为每6.6g生药用1g中性氧化铝，洗脱中性氧化铝柱用94％的乙醇。

(四)验证试验：

称取皖贝母2份，每份100g，应用本工艺参数对每份样品进行试验，结果见表7。

表7：

试验号	提取物重(g)	含量％	总碱得率(g)
				1	0.715	72.4	0.518
2	0.710	72.3	0.517
				平均值	0.713	72.6	0.518

(五)小结

直观分析和方差分析表明，C因素的水平变化对得率指标影响显著而对含量指标影响很小，A因素的水平变化对得率指标和含量指标都有较大影响，E因素的水平变化对含量指标有较大影响，对得率指标影响很小，而B、D因素的水平变化对含量指标和得率指标影响都很小，考虑到经济因素，综合考虑选择最佳工为A₂B₁C₁D₁E₁即渗漉溶剂(盐酸)用0.1mol/L，用量为每1g生药用11倍量的盐酸液即可渗漉完全。大孔树脂用量为每4.6g生药用1cm³树脂，洗脱大孔树脂乙醇用80％浓度，用量为每1g生药用20倍量的80％乙醇即可洗脱完全，中性氧化铝用量为每6.6g生药用1g中性氧化铝，洗脱中性氧化铝柱乙醇浓度为94％，用量为每1g生药用2.5倍量的94％乙醇即可洗脱完全。应用A₂B₁C₁D₁E₁工艺参数对皖贝母提取两次，得本发明药物组合物含量为72.6％每100g皖贝母中得率为0.518g。通过本工艺的验证实验及放大中试提取，均能获得不具吸湿性的皖贝母提取物，含量及得率均较满意。

我们对上述提取方法获得的提取物进行分析，以确认所得提取物的成分。对上述提取方法获得的提取物进行薄层色谱扫描(见图1)，根据扫描的峰面积，可以获知主要生物碱含量比例(表8)：

表8

编号	峰面积	％
			1、原点—贝母生物碱甙未知碱2、贝母素甲3、异贝母甲素4、贝母辛5、贝母素乙未知碱	17231.295427.8523573.5188394.159401.8581782.026468.88	5.71.77.729.219.6278.7

为对比皖贝母提取物和原药材皖贝母的生物碱组成，以及与特征性有效成分贝母素甲，贝母素乙的比较。应用硅胶G薄层，环乙烷—醋酸乙酯—二乙胺(6∶4∶1)为展开剂以展开生物碱。注意到同属贝母药材(如浙贝母)的生物碱是否引起混淆，我们曾将皖贝母与浙贝母，川贝母的生物碱进行对比分析，应用薄层扫描法测定主要生物碱，结果如下表9：

            表9.3种贝母生物碱的含量(％)

生物碱	皖贝	浙贝	川贝
				总碱贝母素甲异贝母甲素贝母辛贝母素乙川贝酮	0.430.04010.15230.07890.1402-	0.250.03960.02510.00800.0495-	0.092--0.069-0.0187

由于皖贝与浙贝所含生物碱成分较近似，但从薄层层析图谱(见图2)及总碱含量和主要生物碱含量的比例，是有显著差别，皖贝总碱含量高于浙贝的总碱含量，同时主要生物碱含量比例也不同，皖贝母：异贝母甲素＞贝母素乙＞贝母辛，浙贝母：贝母素乙＞贝母素甲＞异贝母甲素＞贝母辛。

本发明所述的皖贝母提取物经药效学试验证实，它对小鼠氨水引咳和猫电刺激喉上神经均有明显的镇咳作用，与可待因比较无明显差异，并无快速耐受现象；小鼠酚红法和大鼠毛细管法的药理试验表明，它有较好的祛痰作用，与必嗽平比较无明显差异；整体动物引喘实验结果证实它有平喘作用；小鼠耳二甲苯致炎和肉芽肿形成实验结果显示，它能明显减轻炎症反应及抑制炎症增殖期的作用。因此，本发明的皖贝母提取物可用于制备治疗具有镇咳祛痰平喘功效的药物。

本发明的皖贝母提取物还可以作为活性成分与药学上可接受的载体制备成具有治疗镇咳祛痰平喘功效的药物。该药物可以是各种剂型如片剂、颗粒剂、口服液、胶囊剂、丸剂、注射液等。

具体的实施方式

实施例1

将165kg皖贝母用每1g生药用11倍量的0.1mol/L的盐酸浸渍24小时后，渗漉，得到渗漉液，渗漉液的体积与生药重量之比为11ml∶1g，将其上到预处理过的每4.6g生药用1cm³树脂装有DA-201大孔树脂的大孔树脂柱上，用去离子水洗至pH为5，再用1g生药用20倍量的80％乙醇洗脱，将洗脱液减压浓缩回收乙醇，将浓缩液上到每6.6g生药用1g中性氧化铝的中性氧化铝柱上脱色，上样量为30g中性氧化铝可上相当皖贝母总碱1g的量，用每1g生药用2.5倍量的94％乙醇洗脱至无生物碱反应为止，将洗脱液减压浓缩回收乙醇，浓缩液在70℃真空干燥，得到本发明的皖贝母提取物1000g。

实施例2

先用乙醇温浸100kg皖贝母，乙醇挥干后的浓缩液以酸水溶解生物碱，酸水液碱化后的游离生物碱用氯仿多次萃取，氯仿萃取液水洗后脱水浓缩即得465g，得率为95％。

实施例3

用0.05mol/L盐酸溶液作溶剂，对150kg皖贝母进行渗漉，渗漉液通过氢型732苯乙烯磺酸型阳离子交换树脂，树脂碱化后在索氏提取器中用乙醇回流洗脱，洗脱液减压浓缩即得667g，通过薄层层析与药材对比，生物碱无变化，定量测定，得率可达到89％，

试验例1、皖贝母提取物的镇咳作用

1、对小鼠氨水引咳实验

(1)材料

动物：小白鼠为昆明种。普通级动物，由本所动物室提供，雌雄各半，体重20±2g。

药物：皖贝母提取物(5mg/ml总生物碱)由我植化室提供。磷酸可待因，系青海制药厂出品，批号：870919

(2)方法与结果

实验按小鼠氨水引咳法进行，取小鼠100只，随机分成5组，用25％氨水在恒定压力下喷雾，使气雾通入盛有小白鼠的容器内，当小鼠接受一定时间的气雾刺激后，立即取出小鼠，观察1分钟内出现3次以上典型咳嗽者为阳性反应。实验设计采用“上下法”，以引起一半小白鼠咳嗽的喷雾时间(EDT₅₀)为指标，结果见表10。

表10本发明皖贝母提取物对小鼠氨水引咳的作用

^*与可待因比较P＞0.05

从表10可看出本发明皖贝母提取物3个剂量组和可待因组给小鼠灌药后半小时，对氨水引起半数小鼠咳嗽所需的时间(EDT₅₀)比对照组(生理盐水)明显延长，经统计学处理，给药组与对照组比较，有非常显著性差异(P＜0.001，本发明皖贝母提取物组与可待因组比较P＞0.05，无显著性差异。说明本发明皖贝母提取物对氨水引咳有明显止咳作用。

2.对猫喉上神经引咳的影响

(1)材料

动物：猫，购自猫市场，在本所动物室饲养，剔除不健康者，体重2.5±0.5kg，雌雄兼有。

药物：皖贝母提取物，磷酸可待因。

(2)方法与结果：

猫39只，随机分成6组，2组十二指肠给药，4组静脉给药。用苯巴比妥钠75mg/kg和戊巴比妥钠15mg/kg混合腹腔麻醉，使猫保持在较浅的麻醉状态下，按Domeyoz等氏方法，分离一侧喉上神经，电刺激时按置一付灵活的电导子于神经干上引起咳嗽反应。记录咳嗽反应，用自制玻璃罩管置咽喉于声带之上，罩管的出口端通过T型管与马利氏气鼓相连，使猫的正常呼吸运动与咳嗽反应由气鼓的杠杆系统直接描出，刺激器用YSD-4药理、生理实验多用仪，刺激参数在给药前后不变，给药前两次电刺激喉上神经，引出猫典型而稳定的咳嗽反应后，十二指肠(或静脉)给药，每隔20min或10min)，按原条件刺激，发现咳嗽次数(见表11)和强度(见图3)均受到不同程度抑制，十二指肠给药组的动物咳嗽被抑制时间约维持2-3小时，最明显受抑制约在药后60min左右；静脉给药组的动物咳嗽被抑制时间约维持1-2小时，最明显受抑制约在药后30min左右。计算受抑制最明显时的咳嗽减少次数，求t值，作自身及组间比较。

           表11本发明皖贝母提取物的镇咳作用

组别	猫(只)	剂量(mg/kg)	给药途径	X±S	P值
						本发明皖贝母提取物组本发明皖贝母提取物组可待因组本发明皖贝母提取物组本发明皖贝母提取物组本发明皖贝母提取物组	666777	5.010.02.52.55.010.0	十二指肠十二指肠i.vi.vi.vi.v	1.33±0.412.75±0.443.33±0.332.14±0.123.14±0.504.36±0.37	＜0.05＜0.01＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

结果表明，十二指肠给药二个剂量组的咳嗽次数均较给药前显著减少；静脉给药三个剂量组的咳嗽次数也均较给药前显著减少，且呈量效关系趋势(见表11)。

3.皖贝母提取物镇咳作用的耐受性实验

(1)材料：同前

(2)方法与结果

镇咳方法同前。猫4只，麻醉后无菌手术分离左侧喉上神经，给药前引起典型而稳定的咳嗽反应后，腹腔注射本发明药物组合物5mg/kg，给药后30分钟按原条件电刺激，见咳嗽反应减弱，次数减少，45分钟时更弱，后渐恢复。缝合切口，喂养。每天按实验时的剂量给猫腹腔注射一次，连续7天，第8天重复第1天实验，见皖贝母提取物对猫的镇咳情形同第一次结果，说明皖贝母提取物镇咳无耐受性。

通过上述实验，证明皖贝母提取物有明显的镇咳作用。与可待因比较无明显差异，并无快速耐受现象。

试验例2、皖贝母提取物的祛痰作用

1、改良的小鼠酚红法

(1)材料

动物：昆明种小白鼠，雌雄均有，体重20±2g。

药物：皖贝母提取物，盐酸溴己胺片(必嗽片)：上海第十一制药厂，沪卫药准字(1981)第0259号。

(2)方法与结果

在我国药理工作者建立的酚红法基础上，Engler等又进行了方法学上的研究和补充，证明祛痰剂以剂量依赖性的方式增加气管内酚红的分泌，我们用此改良的酚红法进行实验。

小鼠50只，随机分成5组，灌胃给药半小时后，给小鼠腹腔注射500mg/kg用生理盐水配制的2.5％酚红浓度，待30分钟，将小鼠颈椎脱臼处死，取其气管放入2ml生理盐水中浸洗30分钟，取出气管后，在试管中加入0.2ml INNaOH，以稳定洗出液的PH。用岛津UV-240紫外可见分光光度计在558nm处测定酚红浓度。结果见表12。

      表12本发明皖贝母提取物对气管洗出液中酚红浓度的影响

组别	剂量(mg/kg)	给药途径	X±S	醱红浓度的改变％	P值
						生理盐水组必嗽平组本发明皖贝母提取物	等容量205	i.gi.gi.g	0.8±0.291.18±0.321.06±0.34	47.132.9	＜0.05＞0.05

本发明皖贝母提取物本发明皖贝母提取物

1015

i.gi.g

1.20±0.42**1.28±0.20**

49.959.6

＜0.05＜0.001

^*酚红浓度(μg/ml)   ^**与必嗽平比较P＞0.05

实验结果提示，本发明皖贝母提取物5mg/kg有祛痰作用的趋势；本发明皖贝母提取物两组(10mg/kg、15mg/kg)与必嗽平均能促进气管内酚红的分泌，有祛痰作用，与生理盐水组比较，均有显著性差异，P＜0.05，但与阳性对照药必嗽平组间比较无显著性差异，P＞0.05。

2、气管洗出液中己糖含量的测定

(1)材料：同改良的小鼠酚红法。

(2)方法与结果

分组同上，灌服各药后，30分钟处死小鼠，按上法取气管，用0.3ml生理盐水浸洗30分钟，在浸出液中加入终浓度60％的浓硫酸，80℃水解10分钟，待水解液冷至室温后加入1％苔黑酚显色，用岛津UV-240紫外—可见分光光度计在480nm处，测定己糖的浓度，见表13。

        表13本发明皖贝母提取物对气管洗出液中己糖含量的影响

组别	小鼠(只)	剂量(mg/kg)	给药途径	X±S	己糖浓度的改变％	P值
							生理盐水组必嗽平组本发明皖贝母提取物	101010	等容量2010	i.gi.gi.g	67.51±21.6265.82±15.9942.12±13.58	-2.50-37.61	＞0.05＜0.01

                       ^*己糖含量(μg/ml)

由表可看出，促进气管内酚红分泌的本发明皖贝母提取物和必嗽平，只有本发明皖贝母提取物使气管洗出液中己糖的浓度显著下降，P＜0.001。

3、大白鼠毛细管法

(1)材料

动物：大白鼠，Wistar封闭群，雌雄兼有，体重180±20g，由本所动物室供应，是普通级动物。

药物：本发明皖贝母提取物，盐酸溴己胺片。

(2)方法与结果

大白鼠实验前禁食不禁水24小时，以25％乌拉坦1mg/kg腹腔麻醉，在甲状腺下缘气管正中，两软骨环之间，用6号针头刺一小孔，然后插入毛细管(长4cm，内径8mm)一根，深度和位置要恰当，以使气管内的分泌液通过毛细管缓缓虹吸上升。当毛细管被分泌液充满时，立即再换1根。计算每小时毛细管内液柱的长度(cm)。记录给药前2小时的正常分泌量，给药后再继续观察5小时，比较给药前后平均每小时的分泌量，以此判断其祛痰作用的强弱。

实验用大白鼠40只，随机分成5组(生理盐水、必嗽平、本发明药物组合物设三个剂量组)，灌胃给药，以此来观察皖贝母提取物的祛痰作用及量效关系。

结果：本发明皖贝母提取物三个剂量组，给药前后分泌量自身比较，与对照组比较，均表现显著增加，且呈量效关系趋势。表14及附图4。

           表14本发明皖贝母提取物的祛痰作用

^*增加的痰分泌量(cm/h)   ^**与必嗽平比较，P＞0.05

试验例3、本发明皖贝母提取物的平喘作用

1、整体动物药物引喘法

(1)材料

动物：取幼年豚鼠，体重在200g以下，雌雄均有。由本所动物室供应。

药物：本发明皖贝母提取物，氨茶碱：北京第三制药厂，批号901115；磷酸组织胺：卫生部药品生物制品检定所，批号510-9010。

(2)方法与结果：将豚鼠随机分为4组：对照组，氨茶碱组(100mg/kg)，本发明药物组合物二个剂量组(10、20mg/kg)。每日灌胃给药一次，连续3天，第三天各组给药60分钟后，放入喷雾装置容器内，将组织胺(2mg/ml)等压力匀速喷雾15秒。记录自喷雾开始至豚鼠发生抽搐、翻滚的时间(潜伏期)，并进行统计学处理。结果见表15。

              表15本发明皖贝母提取物的平喘作用

组别	剂量(mg/kg)	动物(只)	潜伏期(秒)( X±S)	P值
					对照组(水)氨茶碱组本发明皖贝母提取物组本发明皖贝母提取物组	同容量1001020	6666	127.17±42.07480.00±0.0177.50±34.89234.50±76.14	＜0.001＜0.05＜0.02

显示本发明皖贝母提取物二个剂量组有抑制哮喘反应，潜伏期延长，与对照组比较有显著性差异，且20mg/kg组的平喘作用较10mg/kg组强。但其平喘作用较弱于氨茶碱。

2、离体气管法

(1)材料

动物：豚鼠400-600g，雌雄皆有。由本所动物室供应。

药物：皖贝母提取物、磷酸组织胺：卫生部药品生物制品检定所，批号510-9010。

(2)方法与结果：取豚鼠6只，每次1只，击毙，细心分离出气管，制成离体气管片标本，放入盛有克-享氏液的离体器管恒温浴槽中(37℃)，供氧稳定20-30分钟后进行描记(负重约2g)，气管平滑肌无自动收缩，待基线稳定后即可给药，观察药物反应。

结果表明，本发明皖贝母提取物在不同浓度(1ug/ml、10ug/ml、100ug/ml)下，对离体气管片无明显影响。

试验例4、本发明皖贝母提取物的抗炎作用

1、小鼠耳二甲苯致炎法

(1)材料

动物：体重25-30g雄性小白鼠，昆明种。

药物：本发明皖贝母提取物，阿斯匹林片：西北第二合成厂，批号〔82〕00503；二甲苯，天津市化学试剂二厂，批号830508。

(2)方法与结果：

将动物随机分成4组：对照组、阿斯匹林组(100mg/kg)，本发明皖贝母提取物二个剂量组(10、15mg/kg)，每日灌胃给药一次，连续5天。第5天药后1小时用100％二甲苯0.02ml/只，涂于小鼠左耳前后两面，4小时后将小白鼠颈椎脱臼致死，用9mm直径打孔嚣分别在同一部位打下园耳片，分析天平称重，每鼠左耳重量减去右耳片重即为肿胀度。将对照组与给药组的肿胀程度进行统计学处理，见表16

         表16本发明皖贝母提取物对小鼠耳二甲苯炎症的影响

组别	剂量(mg/kg)	动物(只)	肿胀度( X±S)	P值
					对照组(水)阿斯匹林组本发明皖贝母提取物本发明皖贝母提取物	同容量1001015	10101010	11.22±4.535.78±4.876.20±4.313.82±1.62	＜0.02＜0.01＜0.001

结果证实，本发明皖贝母提取物的两个剂量组能明显减轻炎症反应，尢以15mg/kg组作用明显，与对照组比较，均有显著性差异。与阿斯匹林抗炎作用相似。

2、肉芽肿形成实验法(棉球法)

(1)材料：

动物：Wistar大白鼠，120±150g，雄性。

药物：本发明皖贝母提取物，阿斯匹林(同前)

(2)方法与结果：

动物随机分成4组：对照组、阿斯匹林组(100mg/kg)，本发明皖贝母提取物二个剂量组(10、20mg/kg).。每日灌胃给药1次。第3天在浅麻下，腹部切口，将两个灭菌棉球(每个重20mg，加青、链霉素各0.1mg，，以防感染)，分别植入大鼠两侧腹股沟皮下，共连续7天给药。第8天颈椎脱臼处死，剥出周围已包裹肉牙组织的棉球，在60℃烘箱放置12小时称重，减去原棉球重量即为肉芽肿净重，结果见表17。

          表17本发明皖贝母提取物对大鼠棉球肉芽肿的影响

组别	剂量(mg/kg)	动物(只)	每100克体重肉芽肿重( X±S)	P值
					对照组(水)阿斯匹林组本发明皖贝母提取物本发明皖贝母提取物	同容量1001020	10101010	74.56±14.6163.05±7.6167.49±9.3748.69±12.24	＜0.05＞0.05＜0.001

结果证实，本发明皖贝母提取物10mg/kg有抑制炎症的趋势，随剂量增大20mg/kg，有明显的抑制炎症的作用。与对照组比较，有非常显著性差异(P＜0.001。与阿斯匹林抗炎作用相似。

Claims (8)

1.一种皖贝母提取物，它可以用下列方法获得：用0.05mol/L盐酸溶液作溶剂，对皖贝母进行渗漉，渗漉液通过氢型732苯乙烯磺酸型阳离子交换树脂，树脂碱化后用乙醇回流洗脱，洗脱液减压浓缩即得。

2.按照权利要求1所述的皖贝母提取物，其特征在于它包括总生物碱，总生物碱以贝母素乙计，不得少于50％。

3.按照权利要求2所述的皖贝母提取物，其中的总生物碱包括贝母素甲、贝母素乙、异贝母甲素、贝母辛和贝母生物碱甙。

4.按照权利要求3所述的皖贝母提取物，其中异贝母甲素∶贝母素乙∶贝母辛∶贝母素甲∶贝母生物碱甙的重量比为3-5∶2-4∶1-3∶0.8-1.5∶0.5-1。

5.按照权利要求4所述的皖贝母提取物，其中异贝母甲素∶贝母素乙∶贝母辛∶贝母素甲∶贝母生物碱甙的重量比为3.8∶3.5∶2.5∶1∶0.74。

6.一种制备皖贝母提取物的方法，它包括用0.05mol/L盐酸溶液作溶剂，对皖贝母进行渗漉，渗漉液通过氢型732苯乙烯磺酸型阳离子交换树脂，树脂碱化后用乙醇回流洗脱，洗脱液减压浓缩即得。

7.权利要求1-5中任何一项所述的皖贝母提取物在制备具有镇咳祛痰平喘功效药物的用途。

8.含有权利要求1-5中任何一项所述皖贝母提取物的药物。

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