CN1816336A - 治疗缺血相关疾病的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过施用缩氨基硫脲化合物给需要的病人来治疗缺血相关疾病的方法。本发明优选的实施方案涉及治疗特定的缺血相关疾病的方法，所述疾病包括但不限于阿尔兹海默病、帕金森氏综合症、冠状动脉侧枝架桥手术、心搏停止导致的弥漫性脑缺血、病灶性脑梗塞、脑出血、出血性梗塞、高血压性出血、由颅内血管畸形破裂造成的脑出血、颅内动脉瘤破裂造成的蛛网膜下腔出血、高血压性脑病、颈动脉狭窄或阻塞造成的脑缺血、心源性血栓栓塞、脊髓卒中及脊髓损伤、脑血管疾病：例如，动脉粥样硬化、脉管炎、斑变性、心肌梗塞、心肌缺血及室上性心动过速。

Description

治疗缺血相关疾病的方法

发明领域

本发明涉及治疗缺血相关的疾病及紊乱的方法，包括由于突然丧失氧气导致的神经及心脏疾病，以及像阿尔兹海默病这样的变性疾病。

背景技术

中枢神经系统(CNS)由脊髓、脑及视网膜构成，含有上千亿个神经细胞(神经元)，由此形成胜任复杂功能的网络。CNS神经元的存在及生理功能的实现需要能量支持。中枢神经细胞能量的唯一来源通常认为来自血液的葡萄糖及氧气。如果全部或任何部分中枢神经系统的血液供应被关闭，那么受累的神经元会缺氧及低糖(又称缺血)，以至迅速变性。临床上，通常将神经系统缺乏血液供应的情况称为“脑卒中”。仅仅是氧气供应的中断，则称为“缺氧”，这发生在昏厥、窒息或溺水。单独是葡萄糖的供应中断，则称为“低糖”，比如出现在糖尿病患者服用了过量的胰岛素。上述所有情况，都涉及到能量短缺，在临床上被认为是脑损伤的潜在原因。下文中，“能量短缺”和“缺血”会交替使用，但都意指使中枢神经系统所需能量短缺的任意状况。

几年来，神经科学家在理解能量短缺导致的神经变性的机理方面有了长足的进展。已经认识到，谷氨酸盐在中枢神经系统正常和健康的情况下是一种重要的兴奋神经递质，但在缺血时则起着神经毒性作用，称为“兴奋毒性(excitotoxicity)”。通常，谷氨酸盐存在于细胞内，仅仅在突触连接处微量释放，作用到毗邻含有谷氨酸盐受体的神经元以传递神经信号。在正常情况下，释放到细胞外液的谷氨酸盐在数毫秒时间内会以一种高效的转运过程被转运回神经元内。

只要这种转运过程工作正常，谷氨酸盐的兴奋毒性潜能就会被遏制。然而，这种转运过程是需要能量的，所以在缺血(能量短缺)的情况下，谷氨酸盐转运失能，已经释放作为递质的谷氨酸盐分子则会在细胞外的突触液中蓄积。这使得谷氨酸盐持续与兴奋受体接触，让这些受体处于过度刺激状态，这种情况下神经元过度兴奋导致死亡。两个额外的因素使情况更加复杂和恶化：(1)受刺激过度的神经元在另外的突触连接处释放过量的谷氨酸盐，使更多的神经元处于过度刺激状态，神经毒积累范围超过初始的缺血区；和(2)与正常的神经元相比，受过度刺激的神经元更迅速消耗葡萄糖或氧气，这加速了有限能源的消耗，并进一步损害谷氨酸盐的转运过程。因此，象在脑卒中、心跳停止、昏厥的缺氧或低糖这样能量不足情况下导致的脑损伤是由一种复合的机制造成的；初始的原因是缺血本身，但由此导致的谷氨酸盐转运系统失灵及谷氨酸盐介导的兴奋毒性事件级联反应很大程度上为随后的脑损伤负责。

除上述情况外，最近已经注意到神经元使用能量基质(葡萄糖及氧气)来维持其能量水平的能力的各种缺陷还可以激发导致神经元死亡的兴奋毒性过程。据推定，这是出现在象阿尔兹海默病、帕金森氏综合症、杭廷顿氏舞蹈病及肌萎缩性脊髓侧索硬化这样的神经疾病中的神经变性的机制。例如，在患阿尔兹海默病病人脑活检组织中，已发现细胞内能量代谢缺陷的证据，并被建议引发谷氨酸盐兴奋毒性潜能释放导致阿尔兹海默病中神经元的死亡，从而通过与能量关联的兴奋毒性过程来解释。也有报道，在帕金森氏综合症及杭廷顿氏舞蹈病中细胞内存在能量代谢的内在缺陷的证据。因此，防范这些疾病中神经变性的合理治疗策略，将包括纠正能量缺陷或防止兴奋毒性神经变性的方法。

神经变性疾病为特征在于正常神经元功能改变，大多数情况下导致神经死亡的一组疾病(大多数这些疾病，尤其在晚期与严重的神经损伤有关)。在大多数情况下，致病原因未知而且疾病是进行性发展的。神经变性疾病的结果会毫无例外地出现严重的情感、身体及财政方面压力，不仅影响个体，也造成社会负担。

发展成神经变性紊乱(特别是阿尔兹海默病或帕金森氏综合症)的最一致的危险因素是年龄的增长。一个世纪以来，在工业化国家中，65岁及以上人口的增长率已经远远超过人口整体的增长率。这样，可以预料再过几代人，老年人口的比例将加倍；与之相伴的是可能患神经变性疾病人群的比例亦会加倍。这种预测是医学界及法律制定者担忧加剧的中心点，因为很容易预料与伤残性疾病有关的，给病人、福利事业(caregivers)及社会的情感、身体及财政带来的负担会大幅度增加。事实上，要解决这种问题，目前已有数种已获批的药物在某种程度上可以减轻数种神经变性疾病的症状，这些药物的长期使用经常有一定程度的副作用，似乎无一可以终止变性进程。与此有关的是，我们对于神经变性疾病中神经元死亡的原因及机制的了解有限阻碍着开发有效的预防或保护性治疗。尽管前景黯淡，数个神经生物学的突破已经使我们比以往更趋近揭开数种神经变性疾病的秘密及获得有效治疗战略的那一天。

在开发保护及减少CNS缺血相关的神经元损伤的方法方面，已取得了重要的进展。该领域中最活跃的研究涉及使用受体特异性的拮抗药物(药理学术语，为一种占据和封闭细胞表面上的某种受体而不引发该受体的活性的药物，称为该受体的拮抗剂)在谷氨酸盐受体处抑制兴奋活性的方法。能够介导兴奋毒性神经变性的谷氨酸盐受体，广义分为NMDA及非NMDA受体两大类。NMDA受体是以N-甲基-D-天冬氨酸盐命名，这类药物在自然情况下不存在于脑内，但发现可以很强地结合到谷氨酸盐受体上，因此与之结合的受体称为NMDA受体。近来非NMDA类谷氨酸盐受体又分为两种不同类型，一种是KA(红藻氨酸)受体，另一种是AMPA受体(曾称为QUIS受体)。

NMDA受体拮抗剂在体外实验及在许多体内动物模型中，一再表明可以保护CNS免受缺血性神经变性的危害；然而，近来也有各种证据表明，NMDA受体拮抗剂对于一种主要类型的缺血-“弥漫性缺血”可能是无效的，而对另一种主要的缺血“病灶性(focal)”缺血仅仅提供部分保护。进而，NMDA拮抗剂必须在缺血发作后立即给药，才能提供显著的保护。有关非NMDA拮抗剂的实验数据更有限，但少数体内动物实验研究表明，这些拮抗剂即使是在缺血事件发生后给药仍可对缺血性神经变性提供显著的保护。

尽管单独使用NMDA或非NMDA拮抗剂，宣称能够对CNS缺血提供实质性的保护，但越来越多的证据表明，它们单独使用的保护程度是相对有限的。

谷氨酸盐受体拮抗剂作为神经保护剂抵抗缺血性神经变性的突出限制是，它们仅暂时使神经元与变性隔离；它们既没有更正能量短缺，也没有更正随着能量短缺继发而来的其它错乱。因此，尽管这些拮抗剂的确在动物模型中对缺血性神经变性提供了某种程度的保护，但如上所述，其保护是不完全的，在某种情况下仅延缓了变性的始发时间。但是，重要的是注意，如果在这延缓的期间中有其它药物或方法能够提供额外和/或持续的保护，那么使变性的始发时间延缓也许是很有价值的。

在大多数缺血研究中尚未给予足够解决的一个关键因素是涉及损伤(缺血)事件的给药时间。这是一个非常重要的考量；尽管某些缺血事件可以预测(如心脏打开手术)，但绝大多数的缺血事件是不能预计的，而且在大多数情况下，治疗仅仅在缺血事件发生的过程中或之后开始。因为缺血发生后CNS细胞开始非常迅速地变性，所以很明确尚需要新的神经保护方法，以在CNS变性开始之后给药仍能奏效。

另一个重要的考虑是，缺血仅仅是短暂的(如在心动停止的发作期)，还是持续的(如CNS血管的血栓性或栓子性阻塞之后)。如果缺血是短暂的，在事件后立即恢复携带氧气及葡萄糖的血液对CNS的供给，防止神经变性或促进缺血侵害恢复的药物经血液循环可以达到缺血组织。

如果脑区的血液供应被凝血块永久阻断，那么现有方法不可能阻止缺血区中心的神经变性，因为缺血组织永久性丧失氧气及葡萄糖，而药物无法经阻断的血管到达缺血组织。然而，在环绕着缺血区边缘存在着一个大的组织区域，称作半影(penumbra)，这里可以得到毗邻CNS区域的血液，这一组织区域是药物治疗的潜在靶。同样，现在正检测和研发用于治疗心脏病发作的溶解凝血块药物(溶栓剂，如链激酶及组织纤维蛋白溶酶原激活剂)，以恢复脑卒中后给CNS的血液供应。当这些药物广泛用于人体的CNS时，利用这些药物可使血管再通，这样缺血的CNS组织不仅可以获得氧气及葡萄糖，同时亦可得到这里公开的神经变性保护或促进缺血侵害后恢复的药物。

最后，在特殊情况下，如给眼睛视网膜供血的主要动脉出现血栓阻塞，这里公开的药物会有帮助。当这种血管阻塞时，直接注射本发明药物于眼睛的玻璃体(即眼球内的清亮液体)以投药于缺血的视网膜是可能的。药物可以迅速地由玻璃体扩散进入视网膜。

开发能够预防或治疗不管是急性还是慢性缺血事件的疾病/紊乱后果的治疗剂，将是极受欢迎的。

发明概述

本发明涉及以通式I化合物或其药物前体投药给所需病人以治疗缺血相关疾病的方法：

通式I

其中：

E是氧、硫、NH或N-C1-6烷基；

R₁、R₂、R₃和R₄独立地选自氢，任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的环烷基、任选取代的卤代烷基、任选取代的芳香基、任选取代的氨基烷基、任选取代的羟烷基、任选取代的烷氧基烷基及任选取代的烷酰基，或者

NR₁R₂合起来形成3到7元环，该环可包含0、1或2个另外选自氮、氧及硫的杂环原子；并且

HET为任选取代的5到7元杂芳香基残基，该杂芳香基残基含有1到4个选自氮、氧或硫的杂原子。

优选实施方案涉及用于本发明方法的组合物，其中HET是下列通式的残基：

其中：

m是0或1；

当m为0时，Z₁、Z₂及Z₃独立地选自N、O、S或CR，或

当m为1时，Z₁、Z₂及Z₃独立地选自N或CR；

R每次出现时，独立地选自氢、卤化物、羟基、巯基(thiol)、氨基、羟氨基、单-C_1-8烷基氨基、二(C_1-8烷基)氨基、C_1-8烷氧基、C_1-8烷基、C_2-8烯基及C_2-8炔基；并且

x为由0到4的整数。

更优选的实施方案包括组合物的应用，其中HET残基独立地选自吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、咪唑基、三唑基、噁唑基及噻噁唑基；并且

R₁、R₂、R₃和R₄独立地选自氢、C_1-8烷基、C_2-8烯基、C_2-8炔基、C_3-8环烷基、C_1-8卤代烷基、C_6-10芳香基、氨基C_1-8烷基、羟基C_1-8烷基、C_1-8烷氧基C_1-8烷基及C_1-8烷酰基，或者

NR₁R₂合起来形成3到7元环，该环可包含0、1或2个额外选自氮、氧及硫的杂环原子。

本发明的另一实施方案涉及通过对需要的病人给药下列通式II的化合物或其药物前体以治疗缺血相关疾病的方法：

通式II

其中：

R、R₁、R₂、R₃及R₄独立地选自氢，任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的环烷基、任选取代的卤代烷基、任选取代的芳香基、任选取代的氨基烷基、任选取代的羟烷基、任选取代的烷氧基烷基及任选取代的烷酰基，或者

NR₁R₂组合形成3到7元环，该环可包含0、1或2个额外选自氮、氧及硫的杂环原子，并且

x为由0到5的整数。

并且，此处更具体其中：

x为0、1、2或3

R、R₁、R₂、R₃及R₄独立地选自氢、C_1-8烷基、C_2-8烯基、C_2-8炔基、C_3-8环烷基、C_1-8卤代烷基、C_6-10芳香基、氨基C_1-8烷基、羟基C_1-8烷基、C_1-8烷氧基C_1-8烷基及C_1-8烷酰基，或者

NR₁R₂合起来形成3到7元环，该环可包含0、1或2个额外选自氮、氧及硫的杂环原子。

本发明另一实施方案涉及通过对需要的病人给药下列通式III的化合物或其药物前体以治疗缺血相关疾病的方法：

通式III

其中：

R、R₁、R₂、R₃及R₄独立地选自氢、C_1-8烷基、C_2-8烯基、C_2-8炔基、C_3-8环烷基、C_1-8卤代烷基、C_6-10芳香基、氨基C_1-8烷基、羟基C_1-8烷基、C_1-8烷氧基C_1-8烷基及C_1-8烷酰基，或者

NR₁R₂合起来形成3到7元环，该环可包含0、1或2个额外选自氮、氧及硫的杂环原子；

R₆为氢、羟基、氨基或C_1-8烷基；

R₅及R₇独立地选自氢、卤化物、羟基、巯基、氨基、羟氨基、单-C_1-8烷基氨基、二(C_1-8烷基)氨基、C_1-8烷氧基、C_1-8烷基、C_2-8烯基及C_2-8炔基。

本发明最优选的实施方案涉及通过对需要的病人给药具有下列通式的PAN811(3-氨基吡啶-2-羧醛缩氨基硫脲)以治疗缺血相关疾病的方法：

本发明的优选实施方案涉及治疗特定的缺血相关疾病的方法，这些疾病包括但不限于阿尔兹海默病、帕金森氏综合症、冠状动脉侧枝架桥手术、心搏停止导致的弥漫性脑缺血、病灶性脑梗塞、脑出血、出血性梗塞、高血压性出血、由颅内血管异常破裂造成的脑出血、颅内动脉瘤破裂造成的蛛网膜下腔出血、高血压性脑病、颈动脉狭窄或阻塞造成的脑缺血、心源性血栓栓塞、脊髓卒中及脊髓损伤、脑血管疾病：例如，动脉粥样硬化、脉管炎、斑变性，心肌梗塞、心肌缺血及室上性心动过速。

附图简述

图1为用PAN-811(A)或已知的神经保护剂维生素E(B)、硫辛酸(C)或银杏(Ginkgo Biloba)(D)预处理，随后用过氧化氢处理的细胞存活率(左版面)及神经保护能力(右版面)的代表性图示。

图2为PAN-811对神经细胞中产生ROS的影响的代表性图示。(A)PAN-811对神经细胞中产生过氧化氢诱导的ROS的影响。(B)PAN-811对神经细胞中产生基础水平的ROS的影响。

图3为在缺氧情况下神经毒性对葡萄糖浓度的依赖性的代表性图示。

图4为细胞在缺氧情况下有或没有神经保护剂MK-801及PAN-811的代表性组织学影像。

图5为在常氧情况下及缺氧情况下PAN-811的神经保护作用的代表性图示。

图6为在缺氧/低糖情况下PAN-811毒性的代表性图示。

图7为轻度缺氧/低糖情况下PAN-811对神经细胞死亡的保护作用的代表性图示。

图8为脑皮质神经元被PAN-811处理24小时时，PAN-811神经毒性的代表性图示。

图9为PAN-811对缺血产生毒性的保护作用的代表性图示。

图10为在用PAN-811或溶剂预处理，然后用过氧化氢处理后的细胞存活率的代表性图示。

图11为在用PAN-811或溶剂预处理，然后用过氧化氢处理后的细胞存活率的代表性图示。

发明详述

本发明的特点及其它细节，现在将给予更具体的描述，并将在权利要求书中指出。应当理解，本发明的具体实施方案由说明方式展示的而非对本发明的限制。本发明的主要特点可被用于不同的实施方案而不偏离本发明的范围。

缺血相关紊乱或疾病的病理学，涉及通常由于血管狭窄或阻塞导致的体内器官、组织或机体的部分血液供应减少，例如视网膜病、急性肾衰竭、心肌梗塞及脑卒中。这可以是急性发作(如心脏病发作)或慢性过程(如神经变性疾病)的结果。

本发明涉及将通式I化合物或其药物前体给药到所需病人以治疗缺血相关疾病的方法：

通式I

其中：

E是氧、硫、NH或N-C1-6烷基；

R₁、R₂、R₃和R₄独立地选自氢，任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的环烷基、任选取代的卤代烷基、任选取代的芳香基、任选取代的氨基烷基、任选取代的羟烷基、任选取代的烷氧基烷基及任选取代的烷酰基，或者

NR₁R₂合起来形成3到7元环，该环可包含0、1或2个额外选自氮、氧及硫的杂环原子；并且

HET为可任选取得的5到7元杂芳香基残基，该杂芳香基残基含有1到4个选自氮、氧或硫的杂环原子。

优选的实施方案涉及用于本发明方法中的组合物，其中HET是下列通式的残基：

其中：

m是0或1；

当m为0时，Z₁、Z₂及Z₃独立地选自N、O、S或CR或

当m为1时，Z₁、Z₂及Z₃独立地选自N或CR；

R每次出现时，独立地选自氢、卤化物、羟基、巯基、氨基、羟氨基、单-C_1-8烷基氨基、二(C_1-8烷基)氨基、C_1-8烷氧基、C_1-8烷基、C_2-8烯基及C_2-8炔基；并且

x为由0到4的整数。

更优选的实施方案包括使用组合物，其中HET残基独立地选自吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、咪唑基、三唑基、噁唑基及噻噁唑基；并且

R₁、R₂、R₃和R₄独立地选自氢、C_1-8烷基、C_2-8烯基、C_2-8炔基、C_3-8环烷基、C_1-8卤代烷基、C_6-10芳香基、氨基C_1-8烷基、羟基C_1-8烷基、C_1-8烷氧基C_1-8烷基及C_1-8烷酰基，或者

NR₁R₂合起来形成3到7元环，该环可包含0、1或2个额外选自氮、氧及硫的杂环原子。

本发明的另一实施方案涉及通过给药通式II化合物或其药物前体到所需病人以治疗缺血相关疾病的方法：

通式II

其中：

R、R₁、R₂、R₃及R₄独立地选自氢，任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的环烷基、任选取代的卤代烷基、任选取代的芳香基、任选取代的氨基烷基、任选取代的羟烷基、任选取代的烷氧基烷基及任选取代的烷酰基，或者

NR₁R₂合起来形成3到7元环，该环可包含0、1或2个额外选自氮、氧及硫的杂环原子，并且

x为由0到5的整数。

并且，更具体的其中：

x为0、1、2或3，

R、R₁、R₂、R₃及R₄独立地选自氢、C_1-8烷基、C_2-8烯基、C_2-8炔基、C_3-8环烷基、C_1-8卤代烷基、C_6-10芳香基、氨基C_1-8烷基、羟基C_1-8烷基、C_1-8烷氧基C_1-8烷基及C_1-8烷酰基，或者

NR₁R₂合起来形成3到7元环，该环可包含0、1或2个额外选自氮、氧及硫的杂环原子。

本发明的另一实施方案涉及通过给药通式III的化合物或其药物前体给所需病人来治疗缺血相关疾病的方法：

通式III

其中：

R、R₁、R₂、R₃及R₄独立地选自氢、C_1-8烷基、C_2-8烯基、C_2-8炔基、C_3-8成环烷基、C_1-8卤代烷基、C_6-10芳香基、氨基C_1-8烷基、羟基C_1-8烷基、C_1-8烷氧基C_1-8烷基及C_1-8烷酰基，或者

NR₁R₂合起来形成3到7元环，该环可包含0、1或2个额外选自氮、氧及硫的杂环原子；

R₆为氢、羟基、氨基或C_1-8烷基；

R₅及R₇选自氢、卤化物、羟基、巯基、氨基、羟氨基、单-C_1-8烷基氨基、二(C_1-8烷基)氨基、C_1-8烷氧基、C_1-8烷基、C_2-8烯基及C_2-8炔基。

本发明最优选的实施方案涉及通过给药具有下列通式的PAN811(3-氨基吡啶-2-羧醛缩氨基硫脲)给所需病人以治疗缺血相关疾病的方法：

本发明的优选实施方式涉及治疗特定缺血相关疾病的方法，所述疾病包括但不限于阿尔兹海默病、帕金森氏综合症、冠状动脉侧枝架桥手术、心博停止导致的弥漫性脑缺血、病灶性脑梗塞、脑出血、出血性梗塞、高血压性出血、由颅内血管异常破裂造成的脑出血、颅内动脉瘤破裂造成的蛛网膜下腔出血、高血压性脑病、颈动脉狭窄或阻塞造成的脑缺血、心源性血栓栓塞、脊髓卒中及脊髓损伤、脑血管疾病：例如，粥样硬化、脉管炎、斑变性、心肌梗塞、心肌缺血及室上性心动过速。

用于本发明方法中的化合物的合成方法在本领域是众所周知的。这样的合成方案在美国数个专利中给予描述：5,281,715、5,767,134、4,447,427、5,869,676及5,721,259。在此，它们以全文引为参考。

药物组合物本发明的另一个方面，涉及用于本发明方法中的缩氨基硫脲的药物组合物。本发明的药物组合物通常包含用于本发明方法中的化合物及药学上可接受的载体。在此，“药学上可接受的载体”包括任一和所有的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌及抗真菌剂、等渗剂及延缓吸收剂和生理相容的类似物。载体的类型可根据打算的给药途径选择。在不同的实施方案中，载体适合于静脉内、腹膜内、皮下、肌内、局部、经皮或口服给药。药学上可接受的载体，包括无菌水溶液或分散系及适用于临时制备无菌注射溶液或分散系的无菌粉剂。这些介质及试剂用作药学活性物质是本领域众所周知的。除与活性化合物不相容以外，任何常规的介质或试剂都可考虑在本发明中的药物化合物中的使用。补充的活性化合物也能被添加到这种组合物中。

治疗用药物组合物通常在制造及储存情况下必须是无菌及稳定的。这种组合物能够配制成溶液、微乳状液、脂质体或其它适合于高浓度药的有序结构。载体可以是含有，例如水、乙醇、多羟基化合物(如丙三醇、丙二醇、液状聚乙二醇及类似物)及其它适合的其混合物的溶剂或分散介质。例如，适合的流动性，可以通过使用象卵磷脂这样的涂层，在分散系中保持所需颗粒的尺寸及使用表面活化剂来维持。在许多情况下，更优选在组合物中包含等渗剂，如糖类，象甘露醇及山梨(糖)醇这样的多醇或氯化钠。可注射成份的延迟吸收可以通过在组合物中包含一种延缓吸收剂，如单硬脂酸盐或明胶来实现。此外，化合物能以随时间而释放的剂型给药，例如在包含缓释聚合物的组合物中。活性化合物可与载体一起制备，以防化合物迅速释放，诸如这种控制释放的剂型，包括植入物及微胶囊化投递系统。生物可降解、生物相容的聚合物可用于此，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、聚乳酸、聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLG)。制备这些剂型的许多方法是本领域众所周知的。

可注射的无菌溶液，可用所需的量将活性化合物与上述列举的成分之一或其组合(视需要)掺入在合适溶剂中，之后过滤除菌而制备。通常，将活性化合物掺入到含有基本分散介质及其它所需的上述列举成分的无菌媒介物中来制备分散系。在无菌粉剂用于制备可注射无菌溶液的情况下，优选的制备方法是真空干燥及冰冻干燥，这生成活性成分加上来自其前述无菌过滤溶液的任何额外所需成分的粉剂。

取决于给药途径，化合物可用材料涂布以保护其免受酶、酸及其它可以失活该试剂的自然条件作用的材料。例如，可将化合物以适当载体或稀释剂与酶抑制剂共同给药或以合适的载体例如脂质体给药于对象。药用稀释液包括盐和水性缓冲液。酶抑制剂包括胰腺的胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟代磷酸盐(DEP)和抑肽酶(trasylol)。脂质体包括油包水-水包油乳状液(water-in-oil-in-water)及常规的脂质体(Strejan，etal.，(1984)J.Neuroimmunol 7：27)。分散系也可用丙三醇、液状聚乙二醇及其混合物和油来制备。在通常的储存及使用条件下，这些制备物中可含防腐剂，以防止微生物的生长。

组合物中的活性剂(即一或多种缩氨基硫脲)，优选以治疗有效量配制在组合物中。“治疗有效量”意指在剂量及所需时间段获得期望的治疗结果，从而影响特定疾病状态的疗程的有效量。活性剂的治疗有效量可根据个体的疾病状态、年龄、性别、体重及该活性剂在个体引起期望反应的能力的不同而异。剂量方案可被调整以提供最佳的治疗反应。治疗有效量也指治疗上有益效果超过其毒性或有害性作用的量。在另一个实施方案中，活性剂以预防有效量被配制在组合物中。“预防有效量”意指在剂量及所需时间段获得期望的疾病预防结果的有效量。通常，预防剂量低于治疗有效量，这是因为该剂量用于对象发病之前或疾病的早期。

组合物中活性化合物的量可根据个体的疾病状态、年龄、性别及体重等因素的不同而异。剂量方案可被调整，以提供最佳的治疗反应。例如：给药可以是单次团注(bolus)、一段时间内数次分剂量给药，或根据治疗紧急状况成比例地加减剂量。特别有利的是，以容易给药和均一剂量的单位剂量形式配制胃肠外给药组合物。这里使用的单位剂量形式，意指对待治疗的哺乳动物对象而言适合作为单位剂量的物理上分散的单元；每单元含有与所需的药物载体联用计算产生所需治疗效果的预定量活性化合物。本发明的剂量单位形式规格由以下指定并直接依赖于(a)活性化合物的独特性质及想获得的具体疗效；(b)对个体治疗敏感度方面，在组合这种活性化合物时技术上的内在局限。

本发明的化合物，可以配制成该化合物是其中唯一活性剂的药物组合物。或者，药物组合物可含有额外的活性剂。例如，本发明的两种或更多种化合物可以组合使用。

本发明可通过下列的实施例进一步阐明，这些实施例不应解释为局限性。本申请中所有参考文献、专利及公布的专利申请、以及图示的内容，在此引作参考。

实施例

实施例1

PAN-811与其它神经保护剂的神经保护效能比较

目的

本研究的目的是在阿尔兹海默病相关的氧化应激细胞模型中，比较PAN-811(3-氨基吡啶-2-羧醛缩氨基硫脲；C7H9N5S；MW＝195)与已知的神经保护剂，如维生素E，硫辛酸及银杏的神经保护能力。

1.材料及方法

1.1研究设计

1.1.1.细胞的分离及培养

初生皮层神经元从17日龄大鼠胚脑分离，以每孔5万个细胞接种到96孔板，在常规的神经基础培养基(neurobasal medium)中培养2-3周。以不含抗氧化剂的新鲜神经基础培养基半量换液两次。

1.1.2.用PAN-811、其它神经保护剂及过氧化氢处理

PAN-811以1mg/ml(～5mM)溶解于乙醇，并进一步以培养基稀释到0.1μM、1μM及10μM的终浓度。其它已知的神经保护剂被溶解到合适的溶剂中，并稀释到指示的终浓度。神经元用PAN-811、已知的神经保护剂或媒介物预处理24小时，然后进行过氧化氢(终浓度150μM)诱导的氧化应激。对照包括未处理的细胞(没有化合物及过氧化氢处理)、仅仅用化合物处理的细胞、暴露于过氧化氢但无化合物的细胞。未处理的细胞被用作对照来评价毒性及改进的存活率。每个分析重复三次。

1.1.3.细胞功能的评价

24小时后，使用标准的MTS分析(Promega)评价存活率及线粒体功能。遵循制造商的操作规程。

1.2材料

-神经基础培养基(Invitrogen)

-B27-AO(Invitrogen)

-PAN-811(Vion Pharmaceuticals，Inc.)

-过氧化氢(Calbiochem)

-乙醇(Sigma)

-维生素E(Sigma)

-硫辛酸(Sigma)

-银杏(CVS)

-MTS分析试剂盒(Promega)

1.3设备

-天平(Mettler-Toledo，Inc.)

-可调加样器(Finnpipette)

-细胞培养橱(Thermo Forma)

-细胞培养箱(Thermo Forma)

-读板机(Bio-Rad Model 550)

2.结果

2.1实验

实验以上述“研究设计”中描述的方法进行。PAN-811以1mg/ml(～5mM)溶解于乙醇，并进一步以神经基础培养基稀释到0.1μM、1μM及10μM的终浓度。硫辛酸以240mM溶解于乙醇，并进一步以神经基础培养基稀释到10μM、25μM及100μM的终浓度。维生素E以100mM溶解于乙醇，并进一步以神经基础培养基稀释到50μM、100μM、200μM及400μM的终浓度。银杏以6mg/ml溶解于去离子水，并进一步以神经基础培养基稀释到2.5μg/ml、5μg/ml、25μg/ml及250μg/ml的终浓度。在处理结束时，用100μl新鲜的预热神经基础培养基加上B27(-AO)更换培养基。培养板放回到细胞培养箱(37℃，5％CO₂)一小时。之后，每孔中加入20μl的MTS试剂，培养板再放回到细胞培养箱(37℃，5％CO₂)两小时。以BioRad读板机(型号550)记录每孔在490nm的吸收。仅含培养基的孔作为空白对照。每个数据点为3个单独分析孔的平均值。未处理的细胞被用作计算细胞存活率及神经保护能力的对照。两周龄原代培养物用于这一研究。结果参见图1。

结论

PAN-811在1-10μM浓度时，显示良好的神经保护能力，甚至是在苛刻的过氧化氢处理之下。维生素E及硫辛酸在苛刻处理之下，有最小的神经保护能力。银杏在苛刻处理之下，显示某种程度的神经保护。

PAN-811在1-10μM终浓度时，显示显著的神经保护，甚至是在苛刻的过氧化氢处理之下。PAN-811的神经保护效能明显超出其它已知神经保护剂，维生素E、硫辛酸及银杏。

实施例2

PAN-811对神经细胞中产生活性氧(ROS)的影响

目的

本研究的目的是评价PAN-811在阿尔兹海默病相关的氧化应激细胞模型中减少ROS产生的能力

1.材料及方法

1.1研究设计

1.1.1细胞的分离及培养

初生皮层神经元从17日龄大鼠胚脑分离，以每孔5万个细胞接种到96孔板，在常规的神经基础培养基中培养2-3周。以不含抗氧化剂的新鲜神经基础培养基半量换液两次。

1.1.2.以CM-H₂DCFDA染料预装载细胞和用PAN-811及过氧化氢处理细胞

初生皮层神经元由HBSS缓冲液冲洗一次，用10μM 5-(及6-)氯甲基-2’，7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯，乙酰酯(CM-H₂DCFDA)孵育以预装载染料。之后细胞用HBSS缓冲液冲洗，用终浓度为0.1、1、5及10μM的PAN-811处理一小时，并进一步进行由300μM过氧化氢诱导的氧化应激两小时。

1.1.3.神经细胞中产生ROS的评价

每孔在485/520nm(Ex/Em)的c-DCF荧光以BMG极星(polar star)读板机记录，并用于评价细胞内ROS的生成。装载了染料但未处理的细胞用作计算c-DCF荧光改变的对照。每一分析重复三次。

1.2材料

-神经基础培养基(Invitrogen)

-B27-AO(Invitrogen)

-HBSS缓冲液(Invitrogen)

-CM-H₂DCFDA(Molecular Probes)

-PAN-811(Vion Pharmaceuticals，Inc.)

-过氧化氢(Calbiochem)

-乙醇(Sigma)

-PEG-300(Sigma)

1.3设备

-天平(Mettler-Toledo，Inc.)

-可调加样器(Finnpipette)

-细胞培养橱(Thermo Forma)

-细胞培养箱(Thermo Forma)

-极星(Polarstar)荧光读板机(BMG)

2.0结果

2.1实验

实验以上述“研究设计”中描述的方法进行。每孔在485/520nm(Ex/Em)的c-DCF荧光以BMG极星读板机记录。含有细胞但无染料的孔作为空白对照。每个数据点是三个单独分析孔的均值。加了染料但未处理的细胞用作计算c-DCF荧光改变的对照。两周龄的原代培养物被用于本研究。

3.0讨论

CM-H₂DCFDA是一种细胞渗透性的ROS指示剂，直到乙酸酯基团被细胞内酯酶去除并在细胞中出现氧化，CM-H₂DCFDA方显示出荧光。它被广泛用于检测细胞内及动物体内活性氧(ROS)的生成。在此，按照研究设计中描述的方法，它被用作评价PAN-811对神经细胞内ROS生成影响的工具。如图2所示，PAN-811在降低过氧化氢诱导的ROS生成和神经细胞内基础水平的ROS生成上，展示了良好的能力。使用缓冲液及PGE-300/EtOH替代PAN-811的平行对照实验，显示对细胞内的ROS生成无影响。实验以不同批次细胞重复4次，获得类似的结果。代表性的实验参见图2。

4.0结论

PAN-811在原代神经细胞内明显减低基础水平的ROS生成(～50％；在10μM)及过氧化氢诱导的ROS生成(～30％；在10μM)。

参考文献

(1).Gibson GE，Zhang H，Xu H，Park LC，Jeitner TM.(2001).Oxidative stress increases internal calcium stores and reduces a keymitochondrial enzyme(氧化应激增加内部钙储量和减少关键的线粒体酶).Biochim Biophys Acta.Mar16；1586(2)：177-89.

(2).Chignell CF，Sik RH.(2003).A photochemical study of cellsloaded with 2’，7’-dichlorofuorescin：implications for the detection ofreactive oxygen species generated during UVA irradiation(装载有2’，7’二氯荧光素的细胞的光化学研究：在UVA照射中检测产生的活性氧的提示).Free Radic Biol Med.Apr 15；34(8)：1029-34.

实施例3

PAN-811对缺氧或缺氧/低血糖症诱发的神经毒性是一种潜在的神经保护剂

1.0导言

在脑卒中后的头几分钟减少神经元损伤是获得有效治疗的重要策略。在脑卒中期间，血栓栓子封闭了动脉，中断了局部脑区的氧及葡萄糖供给，从而导致梗死中心核中神经元的丧失。中心核中的细胞通过坏死性机制非常迅速地死亡。环绕着缺血梗死区的脑区，结构尚存，但(电传导)功能终止，称作半影。半影是一种暂时的区域，它演变成梗死是一种相对进行性现象(Touzani et al.，2001)。这一区域为挽救某些脑功能提供了可能性，处理半影的治疗窗口大大长于处理梗死区。半影也可描述为供血受限的区域，其中能量代谢仍然保留。因此，半影是神经保护治疗及重新激活静止神经元的因子如高压氧的靶区。由此，中枢神经受损后立即的损伤也许不是可逆的，但加重脑损伤，主要是弥漫性脑缺氧/缺血事件链的进行，可以由有效的神经保护策略加以阻止。例如，在冠状动脉侧枝架桥手术(CABG)之前及期间给予神经保护剂，能够有效地保护手术过程中由脑短期的血流改变(引起轻度缺氧/低糖状态)造成的神经变性。如此，能够显著地保护神经并能在神经损伤后挽救神经元的化合物具有非常的重要性。

2.0目的

本研究的目的是理解PAN-811是否能够在体外保护由缺氧或缺氧/低糖(H/H)导致的神经毒性。在相关的工作中，PAN-811对过氧化氢处理的原代神经元已显示明显的神经保护作用。

3.0材料及方法

3.1材料

-神经基础培养基(Invitrogen)

-B27-AO(Invitrogen)

-PAN-811(Vion Pharmaceuticals)

-乙醇(Sigma)

-DMSO(Sigma)

-PEG-300(Sigma)

-MTS分析试剂盒(Promega)

-LDH分析试剂盒(Sigma)

3.2设备

-天平(Mettler-Toledo，Inc.)

-可调加样器(Finnpipette)

-细胞培养橱(Thermo Forma)

-细胞培养箱(Thermo Forma)

-读板机(Bio-Rad Model 550)

-FYRITE气体分析器(Bacharach，Inc)

-模块培养室(Modular Incubator Chamber)-101TM(Billups-Rothenberg，Inc.)

3.3缩写

BSS＝平衡盐溶液

CABG  ＝冠状动脉侧枝架桥手术

d.i.v.＝体外天数

EtOH ＝乙醇

H/H   ＝缺氧/低血糖症

LDH   ＝乳酸脱氢酶

MCAO  ＝中脑动脉闭塞

NB    ＝神经基础培养基

NMDA  ＝N-甲基-D-天冬氨酸盐

PEG   ＝聚乙二醇

3.4研究设计

3.4.1神经元培养

96孔培养板用于本实验。皮质神经元以每孔5万个细胞密度接种在聚-D-赖氨酸涂布的表面，培养在无血清培养基中(NB加上B27补充剂)以获得高富集神经元的培养物。培养神经元14d.i.v.以上，以增加细胞对兴奋氨基酸的易感性(Jiang et al.，2001)。6个重复孔作为一组处理以利于分析定量。

3.4.2在体外模型中诱导神经毒性

如下表所示，脑中葡萄糖浓度通常超过2.2mM。在缺血时，其浓度在中心核及半影分别下降到0.2mM及1.4mM。恢复循环后一至两小时，葡萄糖浓度回复到正常水平(Folbergrováet al.，1995)。

表1.葡萄糖浓度(mmol/kg)

为理解葡萄糖浓度对缺氧诱导的神经毒性的影响，我们已经检测了不同剂量的葡萄糖。如图3所示，与正常情况下葡萄糖浓度为25mM相比，葡萄糖浓度下降到2.9mM没有导致神经细胞死亡。当葡萄糖浓度下降到0.4mM时，MTS分析显示有强烈的细胞死亡出现。

为模拟脑卒中的脑环境，我们建立了三种体外模型系统。极度H/H模型(0.4mM葡萄糖)是梗死中心核环境的模拟；轻度H/H模型(1.63mM葡萄糖)为MCAO期间半影区环境的模拟；而以单纯缺氧模型(正常神经元下，体外葡萄糖的浓度为25mM)来模拟重新灌流后半影区的环境，这是因为在重新灌流后缺氧而不是能量衰竭是造成可能的细胞死亡的主要原因。

对于极度H/H及轻度H/H而言，通过将葡萄糖的浓度分别降低到0.4mM及1.63mM获得缺氧/低血糖症。在使用前，将BSS(116.0mMNaCl，5.4mM KCl，0.8mM MgSO4·7H2O，1.0mM NaH2PO4，1.8mMCaCl2·2H2O，26.2mM NaHCO3及0.01mM甘氨酸)或含有25mM葡萄糖的BBS脱气5分钟。缺氧下培养板中的培养基用BBS或含有葡萄糖的BBS置换。同时，常氧下培养板中的培养基由未脱气的BBS或含有葡萄糖的BBS置换。为造成细胞缺氧，将培养板置于密封的容器(模块培养室-101TM，Billups-Rothenberg，Inc.)，施加真空20分钟以从培养基中去除氧及其它气体，然后以30psi的压力向容器内充填5％二氧化碳及95％氮气1分钟。以O₂指示器(FYRITE气体分析器，Bacharach，Inc)测定容器内氧气的含量为0。培养板置于室内6小时。作为实验对照，重复的培养板维持在正常培养条件下(5％二氧化碳及95％环境气体)同样长的时间。6小时后从容器内取出处理的培养板，以含有25mM葡萄糖的终止液[添加1×丙酮酸钠，10.0mM HEPES及1×N2补充的DMEM]，置换缺氧及常氧条件下培养物中的培养基，并培养在5％二氧化碳及95％环境气体的条件中。用不同浓度的PAN-811及媒介物作为阴性对照处理神经元。以MK801作为阳性对照。在H/H侵害后的24或48小时，以MTS及LDH分析(见下文)来评价线粒体功能及细胞死亡。

在单纯缺氧模型中，以溶剂或PAN-811预处理神经元24或48小时。药物处理在缺氧24小时期间及之后仍在持续。在缺氧侵害之后的24或48小时，评价细胞形态及功能(MTS及LDH分析)。

3.4.3.形态学监控

在图4中，可见形态评估的神经细胞死亡。在缺氧之前，神经元是健康的，具有相亮(phase-brilliant)的体细胞(箭头头部)及完整的神经突起(空心箭头)。背景上，这些突起及其分枝形成致密的网络。缺氧导致细胞体的皱缩及神经突起与网络的崩溃。5μM剂量的PAN-811及谷氨酸盐NMDA受体拮抗剂MK801有效地避免了神经细胞的死亡，并部分保存了神经突起。

3.4.4.MTS分析

MTS分析是一种测定代谢活性细胞中线粒体功能的比色分析。该检测间接反映细胞存活率。MTS四唑化合物在代谢活性细胞的线粒体中，被还原为有色的可溶于组织培养基的甲月替(formazan)产物，其在490nm的吸收可被检测。将20μl的MTS试剂(Promega)加到含有样品的100μl培养基的96孔培养板的孔中。在增湿、5％二氧化碳、37℃条件下，孵育培养板1到2小时，直至充分呈现颜色。以Bio-Rad96孔读板机记录在490nm处的吸收。

3.4.5.LDH分析

乳酸脱氢酶(LDH)分析是基于乳酸脱氢酶作用使NAD还原。得到的还原NAD(NADH)用于四唑盐染料的化学计量转换。如果分析从不同处理培养物取出的无细胞培养基等份，则活性可用作相关细胞死亡以及细胞膜完整性的指示。将50μl等份的培养基由每孔测试的96孔培养板的孔中转移到未用过的培养板中的孔，并补入25μl等量混合的底物、酶及染料(Sigma)。在室温下孵育20到30分钟，之后于490nm波长处进行分光光度测定。

3结果

4.1.单纯缺氧模型

3.1.1.PAN-811的效力及毒性

以PAN-811在缺氧前预处理皮质神经元48小时。PAN-811于24小时缺氧期间及缺氧之后的48小时保留存在。如图5所示，2μM剂量的PAN-811完全阻止了细胞死亡，但在50μM出现细胞毒性。

3.1.2.与其它神经保护剂的比较

用2μM PAN-811、1∶80绿茶或5μM MK801于缺氧24小时之前、期间和之后处理皮层24小时。在检测的试剂中，PAN-811显示了最高的效力，完全阻止神经细胞死亡及线粒体机能障碍。

轻度H/H模型

3.1.3在受侵害之前及期间，PAN-811保护神经元免受轻度H/H诱导的神经毒性

培养胚胎(E17)大鼠皮质神经元15天，以PAN-811及媒介物在缺氧/低血糖症之前24小时和缺氧/低血糖症期间(6小时)处理。在接受侵害后17小时，通过MTS及LDH分析评价结果。PAN-811在浓度为5μM时，完全保护了缺氧/低血糖症诱导的线粒体机能障碍及神经细胞死亡，而1∶1520倍稀释的PEG∶EtOH(相当于媒介物在5μM PAN-811中的量)，没有形成这种保护。

代表性数据见图6。下面的表2总结了6次实验的结果，浓度范围覆盖2-50μM。

表2

4.2.2.PAN-811在受侵害期间，特别是侵害之后，保护细胞免受轻度H/H诱导的神经毒性

神经元培养15天后，用PAN-811或媒介物PEG∶EtOH(7∶3)于6小时H/H之前处理24小时(之前组)。或者，神经元培养16天后，用上述试剂在6小时H/H期间处理(期间组)，在6小时H/H期间及H/H之后的48小时阶段处理(期间及之后组)，或在H/H之后的48小时阶段处理(之后组)。在H/H阶段之后48小时，进行LDH分析。图7中的结果表明，在H/H期间，特别是H/H之后处理神经元，PAN-811保护神经细胞死亡，但在H/H之前处理神经元，保护作用微不足道。

3.2极度H/H模型

PAN-811在浓度≤50μM，未见神经保护作用(未示资料)。

4结论

4.1.PAN-811在2μM时，对单纯缺氧及轻度H/H诱导的神经毒性有完全的保护作用。PAN-811在100μM时，对极度H/H诱导的神经细胞死亡仅有部分阻止作用。因此，PAN-811不太可能与能量代谢有关。

4.2.当缺氧或局部缺血侵害期间或之后给药，PAN-811显著保护神经细胞免于死亡。

4.3.PAN-811的效力明显高于MK801和/或绿茶。

4.4.在长时间暴露(120小时)的情况下，50μM的PAN-811是神经毒性的。

5.0参考文献

1.Jiang，Z.-G.，Piggee，C.A.，Heyes，M.P.，Murphy，C.M.，Quearry，B.，Zheng，J.，Gendelman，H.E.，and Markey，S.P.Glutamate is a principalmediator of HIV-1-infected immune competent human macrophageneurotoxicity(谷氨酸盐是HIV-1感染的免疫活性人巨噬细胞神经毒性主要介质).J.Neuroimmunology 117(12)：97-107，2001.

2.Folbergrová，J.，Zhao，Q.，Katsura，K.，and Siesj，B.K.N-tert-butyl-phenylnitrone improves recovery of brain energy state in ratsfollowing transient focal ischemia(N-叔丁基苯基硝酮改善大鼠在短暂的局部缺血后脑能量状态的恢复).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：5057-5061，1995.

3.Touzani，O.，Roussel，S.，and MacKenzie，E.T.The ischemicpenumbra.(局部缺血半影)Curr.Opin.Neurol.14：83-88，2001.

实施例4

在短暂的局部脑缺血的体内模型中，PAN-811显示显著的神经保护作用

1.导言

在脑卒中后的头几分钟减少神经损伤，是获得有效治疗的重要策略。在脑卒中期间，血栓栓子封闭了动脉，中断了局部脑区的氧及葡萄糖供给，从而导致梗死中心核的神经元的丧失。中心核中的细胞经坏死性机制，非常迅速地死亡。环绕着缺血梗死区的脑区，结构尚存，但(电传导)功能终止，称作半影。半影是一种暂时的区域，它演变成梗死是一种相对进行性现象(Touzani et al.，2001)。这一区域提供了挽救某些脑功能的可能性，处理半影的治疗窗口大大长于处理梗死区。半影也可描述为供血受限的区域，能量代谢仍然保留。因此，半影区是神经保护治疗及重新激活静止神经元的因子如高压氧的靶区。由此，中枢神经受损后立即的损伤也许不是可逆的，但加重脑损伤，主要是迷漫性脑缺氧/缺血事件链的进行，可以由有效的神经保护战略加以防止。例如，在冠状动脉侧枝架桥手术(CABG)之前及期间给予神经保护剂，能够有效地保护由脑血流短期改变(引起轻度缺氧/低糖状态)造成的神经变性。如此，能够显著地保护神经并在神经损伤后挽救神经元的化合物具有非常的重要性。

2.目的

在氧化应激及缺血的体外模型中，PAN-811已显示显著的神经保护作用。对该化合物的现有工作与已知的毒性谱及药代动力学数据，强烈表明PAN-811用于治疗脑卒中的潜力。

3.0材料及方法

3.1材料

-PAN-811(Vion Pharmaceuticals)

-乙醇(Sigma)

-PEG-300(Sigma)

-MTS分析试剂盒(Promega)

3.2缩写

CABG ＝冠状动脉侧枝架桥手术

EtOH＝乙醇

H/H  ＝缺氧/低血糖症

MCAO ＝中脑动脉闭塞

PEG  ＝聚乙二醇

3.3研究设计

3.3.1体外研究在着手体内研究前，在数种神经变性的细胞模型中检测PAN-811。

3.3.1.1.神经元培养由胚龄为15日龄的Sprague-Dawley大鼠胚胎制备富集的神经元培养物。以无菌技术，从子宫中取出鼠胚，置于无菌神经元培养基中。在解剖镜下，从各胚胎中取出脑组织，小心去除脑膜及血管。在显微镜下通过大致解剖分离小脑，仅小脑组织用于培养。研碎组织，游离细胞，以每孔5×10⁵细胞的密度接种到聚-L-赖氨酸预涂布的48孔培养板上。培养物在含有等量Eagle氏基础培养基(无谷氨酰胺)和Ham氏F-12k培养基的溶液中维持，该溶液补充有10％热灭活的马血清、10％胎牛血清、600μl/ml葡萄糖、100μg/ml谷氨酰胺、50U/ml青霉素及50μg/ml链霉素。48小时后，加入10μM阿糖胞苷，以抑制非神经细胞的分裂。培养7天的细胞，用于实验。

3.3.1.2.PAN-811的神经毒性用不同浓度(0-100μM)的PAN-811处理细胞24小时。以MTT分析确定细胞存活率。

3.1.3.3.体外模型中神经毒性的诱导对4种兴奋毒性的体外模型进行研究。暴露细胞于H/H条件3小时，或以100μM谷氨酸盐、1μM staurosporine、10μM藜芦定(veratridine)处理45分钟。所有细胞与或不与10μM PAN-811的Locke氏溶液共同处理。在各兴奋毒性暴露结束时，更换条件培养基(原始培养基)。将细胞孵育在无外加葡萄糖的Locke氏溶液，5％二氧化碳及95％氮气饱和的增湿密闭容器中3小时来诱导H/H。

3.1.3.4.MTS分析兴奋毒性侵害24小时后，评价细胞存活率。应用以3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑盐(MTT，SigmaChemical Co.Ltd.，St.Louis，Mo)为基础的四唑盐比色分析，定量评价细胞损伤。简言之，将染料添加到各孔(终浓度1.5mg/ml)，细胞用MTT酸化的异丙醇(0.1N HCl的异丙醇)孵育细胞，然后用96孔读板机测定各样品在540nm的吸收强度。值表示为维持在各板上的媒介物处理的对照细胞的百分比，并计算细胞存活率百分数的变化。

3.1.2体内研究

3.1.2.1.MCAO 36只雄性Sprague-Dawley大鼠(270-330克，Charles River Labs，Raleigh，VA)用于本项研究。以5％氟烷诱导麻醉，和在2％氟烷的氧气中维持。以恒温加热系统(Harvard Apparatus，SouthNatick，MA)，使体温在整个手术过程中保持在正常温度(37±1℃)。食物及水于手术前后随意摄取，动物在12小时明暗周期环境中，分笼饲养。麻醉后，使用中脑动脉闭塞(MACO)的丝阻方法(filament method)来实现短暂局部缺血并重灌流。简言之，分离右侧外颈动脉并凝结其分支。以3-0未涂布的圆头单丝尼龙缝合线，经外颈动脉插入内颈动脉，并向前推进(由颈动脉分叉算起约22mm)直至遇到轻微阻抗，这样封闭了MCA的起端。血管内缝合线留在原处2小时，然后收回以允许血液重新灌流到MCA。MCAO手术后，动物放到维持22℃室温的恢复笼中。在2小时缺血阶段及缺血后最初6小时，也用75瓦加热灯直接放在每个笼子的顶部，以保证整个试验中动物的体温恒定在正常体温。

3.1.2.2.用PAN-811处理在MCAO之前，经静脉内注射，以每公斤体重1毫克PAN-811处理大鼠10分钟。制备PAN-811的70％PEG300，30％EtOH的储液。在注射前，用无菌盐水将该储液稀释5倍(终浓度为1mg/ml)。

3.1.2.3.梗死体积的测定对每只大鼠脑而言，缺血性脑损伤的分析被测量为总的梗死体积的函数。这从氯化2，3，5-三苯基四氮唑(TTC)染色7个冠状切片(2毫米厚)获得。脑切片采集区由额极1毫米处开始，终止于皮质小脑接合处的嘴端。使用计算机辅助影像分析计算梗死体积。简言之，每一TTC染色的前脑切片的后表面被数字化成像(Loats Associates，Westminster，MD)，并定量缺血损伤的面积(以平方毫米计)。

4结果

4.1.体外研究

4.1.1PAN-811的神经毒性结果见图1。实际上，PAN-811在浓度最高为100μM时，仅有轻微的毒性。在检测的最高浓度，最大毒性仅为8.7％(见图8)。

4.1.2PAN-811的神经保护PAN-811显示明显地保护神经元免受不同兴奋毒的侵害(图2)。以10μM PAN-811预处理神经元保护缺氧/低糖(保护约92％)，100μM谷氨酸盐(保护约75％)，1μM staurosporine蛋白激酶C抑制剂及细胞凋亡诱导剂(保护约47％)及10μM藜芦定钠通道阻断剂(保护约39％)处理3小时诱导的损害(见图9)。

4.2体内研究

本实验的结果见表3。36只大鼠用于本试验，而11只大鼠因以下原因被排除在外：4只在无出血并发症下死于严重卒中，4只出现亚急性出血(SAH)(24小时内有3只死亡)、1只由于手术中突发火灾演习、1只鼠由于统计定为无关项、另1只死于过量的氟烷。在这7只死亡的大鼠(4只无SAH，和3只有SAH下死于严重卒中)中，6只是未处理(媒介物)的大鼠，仅1只是PAN-811处理的。媒介物处理的大鼠的平均梗死体积为292.96mm³，范围在198.75-355.81。PAN-811处理的大鼠的平均梗死体积为225.85mm³，范围在42.36-387.08。这显示23％的神经保护(p＜0.05)。由于原因未知，在对照组观察到比正常测量更严重的损伤。因此，PAN-811处理动物的梗死尺寸也比预计的神经保护要显著得多。尽管如此，在两组中的差异性是极好的(SEM为10％或更少)，差异性结果与先前发表的研究一样好，如果不是更好的话。

5结论

11.1在体外及体内模型系统中，PAN-811的耐受良好，并且相对无毒。

11.2以10μM PAN-811预处理神经元，明显保护神经元免受导致神经变性的兴奋毒性的侵害。

11.3在短暂局部脑缺血前10分钟以单剂量(1mg/ml)的PAN-811预处理大鼠，可减小23％的平均梗死体积。

6参考文献

6.1文献

5.1.1Williams AJ，Dave JR，Phillips JB，Lin Y，McCabe RT，andTortella FC.(2000)Neuroprotective efficacy and therapeutic window of thehigh-affinity N-methyl-D-aspartate antagonist conantokin-G：invitro(primary cerebellar neurons)and in vivo(rat model of transient focalbrain ischemia)studies(高亲和性N-甲基-D-天冬氨酸盐拮抗剂conantokin-G的神经保护功效和治疗窗口：体外(原代小脑神经元)和体内(短暂局部脑缺血大鼠模型)研究).J Pharmacol Exp Ther.294(1)：378-86.

7.表3

媒介物处理		PAN-811处理
				大鼠编号	梗死体积	大鼠编号	梗死体积
R28	198.75	R21	42.36
				R17	208.03	R1	126.42
R2	267.38	R30	143.74
				R11	270.89	R24	158.83
R34	282.51	R3	196.18
				R19	308.19	R26	200.08
R27	308.45	R23	218.54
				R36	334.81	R20	221.46
R10	339.85	R25	224.32
				R4	347.89	R31	255.36
R32	355.81	R5	267.40
						R13	344.47
		R16	375.59
						R8	387.08
均值	292.96	均值	225.85
				标准差	53.60	标准差	96.67
标准误	16.16	标准误	25.84
				数量	11	数量	14
P值：保护：		0.05％23％

表I：媒介物和PAN-811处理的大鼠的梗死体积。大鼠在MACO前用1mg/ml PAN-811处理10分钟，手术之后24小时测定梗死体积。

实施例5

PAN-811保护神经元免受过氧化氢诱导的氧化应激

1.0目的

本研究的目的是在阿尔兹海默病相关的氧化应激细胞模型中，评价PAN-811作为神经保护剂的功效。神经保护及细胞毒性被测定。不同的溶剂被检测，以确定是否合适作为投递PAN-811的媒介体。

2.0材料及方法

2.1材料

-神经基础培养基(Invitrogen)

-B27-AO(Invitrogen)

-PAN-811(Vion Pharmaceuticals，Inc.)

-过氧化氢(Calbiochem)

-乙醇(Sigma)

-DMSO(Sigma)

-PEG-300(Sigma)

-MTS分析试剂盒(Promega)

2.2设备

-天平(Mettler-Toledo，Inc.)

-可调加样器(Finnpipette)

-细胞培养橱(Thermo Forma)

-细胞培养箱(Thermo Forma)

-读板机(Bio-Rad Model 550)

2.3研究设计

2.3.1细胞的分离及培养

初生皮层神经元从17日龄大鼠的胚脑分离，并以每孔5万个细胞接种到96孔板，在常规的神经基础培养基中培养2-3周。以不含抗氧化剂的新鲜神经基础培养基半量换液两次。

2.3.2用PAN-811及过氧化氢处理

PAN-811以1mg/ml(～5mM)溶解于乙醇或DMSO中，以5mg/ml(～25mM)溶解于PEG-300/乙醇(70％/30％)中，并进一步以培养基稀释到1μM、5μM、20μM及50μM的终浓度。神经元用PAN-811或媒介物处理24小时，之后进行由过氧化氢(终浓度60-70μM)诱导的氧化应激。对照包括未处理的细胞(没有PAN-811及过氧化氢处理)、仅仅用PAN-811处理的细胞和暴露于过氧化氢但没有PAN-811的细胞。未处理的细胞用作对照以评价神经元毒性及改进的存活率。每个分析重复3次。等体积的溶剂(乙醇、DMSO与PEG-300/乙醇)被加到细胞中以测定溶剂对分析的影响。

2.3.3.细胞功能的评价

24小时后，使用标准的MTS分析(Promega)评价培养物的存活率及线粒体功能。遵循制造商的操作规程。

3.结果

3.1实验1

实验以上述研究设计中描述的方法进行。在处理结束时，用100μl新鲜的预热神经基础培养基加上B27(-AO)更换所有的处理和培养基。培养板被放回到37℃，5％CO₂的细胞培养箱一小时，然后每孔中加入20μl的MTS试剂，培养板继续在37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养两小时。以BioRad读板机(型号550)记录每孔在490nm的吸收。仅含培养基的孔作为空白对照。每个资料点是三个单独分析孔的平均。未处理的细胞被用作计算细胞存活率及神经保护能力的对照。三周龄的原代培养物用于这一研究。结果请见图10。

3.2实验2

实验以实验1的相同方法进行。两周龄的原代培养用于这一研究。结果请见图11。

4.讨论

所有三种溶剂在相当于PAN-811终浓度1-10μM的稀释度时，对本分析系统有最小的影响。DMSO在相当于PAN-811终浓度20μM或以上的稀释度时，显示一定水平的神经保护。乙醇和PEG-300/乙醇在相当于PAN-811终浓度50μM的稀释度时，显示一定水平的神经保护能力。PAN-811在1-10μM时，显示好的神经保护。与单独乙醇比较，PAN-811在PEG-300/乙醇中有较好的溶解性。

5.结论

PAN-811在1-10μM的终浓度时，显示良好的神经保护能力。PEG-300/乙醇在相当于PAN-811 1-20μM的稀释度时，对分析系统有最小的干扰，因此是被检3种溶剂中最好的PAN-811溶剂。

本领域技术人员很容易得知本发明非常适合于实现目标，并获得最终结果和所述优点以及其中内在的东西。对本领域技术人员显而易见的是，在实施本发明时，可有不同的修饰及变更而无需背离本发明的精神及范围。对本领域技术人员而言可以在包含权利要求书中限定的本发明实质的范围内进行这里所述的修改和其他的应用。

Claims (20)

1.治疗缺血相关疾病的方法，包括对病人给药通式I的化合物或其药物前体：

其中：

E是氧、硫、NH或N-C_1-6烷基；

R₁、R₂、R₃和R₄独立地选自：氢，任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的环烷基、任选取代的卤代烷基、任选取代的芳香基、任选取代的氨基烷基、任选取代的羟烷基、任选取代的烷氧基烷基及任选取代的烷酰基，或者

NR₁R₂合起来形成3到7元环，该环可包含0、1或2个另外选自氮、氧及硫的杂环原子；并且

HET为任选取代的5到7元杂芳香基残基，该杂芳香基残基含有1到4个选自氮、氧或硫的杂环原子。

2.权利要求1的方法，其中E是硫。

3.权利要求1的方法，其中HET是下列通式的残基：

其中：

m是0或1；

当m为0时，Z₁、Z₂及Z₃独立地选自N、O、S或CR；或

当m为1时，Z₁、Z₂及Z₃独立地选自N或CR；

R每次出现时，独立地选自氢、卤化物、羟基、巯基、氨基、羟氨基、单-C_1-8烷基氨基、二(C_1-8烷基)氨基、C_1-8烷氧基、C_1-8烷基、C_2-8烯基及C_2-8炔基；并且

x为由0到4的整数。

4.权利要求3的方法，其中当Z₁、Z₂或Z₃中的0或1个为N时，剩余的为CR。

5.权利要求1的方法，其中HET残基选自任选取代的吡啶基、任选取代的吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、咪唑基、三唑基、噁唑基及噻噁唑基。

6.权利要求1的方法，其中HET是任选取代的吡啶基。

7.权利要求1的方法，其中

E为硫；

HET残基是选自任选取代的吡啶基、任选取代的吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、咪唑基、三唑基、噁唑基及噻噁唑基；并且

R₁、R₂、R₃和R₄独立地选自氢、C_1-8烷基、C_2-8烯基、C_2-8炔基、C_3-8环烷基、C_1-8卤代烷基、C_6-10芳香基、氨基C_1-8烷基、羟基C_1-8烷基、C_1-8烷氧基C_1-8烷基及C_1-8烷酰基，或者

NR₁R₂合起来形成3到7元环，该环可包含0、1或2个另外选自氮、氧及硫的杂环原子。

8.治疗缺血相关疾病的方法，包括对病人给药通式II的化合物或其药物前体：

其中：

R、R₁、R₂、R₃及R₄独立地选自氢，任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的环烷基、任选取代的卤代烷基、任选取代的芳香基、任选取代的氨基烷基、任选取代的羟烷基、任选取代的烷氧基烷基及任选取代的烷酰基，或者

NR₁R₂组合形成3到7元环，该环可包含0、1或2个另外选自氮、氧及硫的杂环原子；并且

x为0到5的整数。

9.权利要求8的方法，其中

x是0、1、2或3，

R、R₁、R₂、R₃及R₄独立地选自氢、C_1-8烷基、C_2-8烯基、C_2-8炔基、C_3-8环烷基、C_1-8卤代烷基、C_6-10芳香基、氨基C_1-8烷基、羟基C_1-8烷基、C_1-8烷氧基C_1-8烷基及C_1-8烷酰基，或者

NR₁R₂合起来形成3到7元环，该环可包含0、1或2个另外选自氮、氧及硫的杂环原子。

10.权利要求9的方法，其中

R、R₁、R₂和R₃独立地选自氢、C_1-4烷基、C_1-2卤代烷基、苯基、氨基C_1-4烷基、羟基C_1-4烷基、C_1-4烷氧基C₁₄₈烷基及C_1-4烷酰基，或者

NR₁R₂合起来形成3到7元环，该环可包含0、1或2个另外选自氮、氧及硫的杂环原子。

11.权利要求8的方法，其中给药的化合物或其药物前体是下列通式III的化合物

其中：

R、R₁、R₂、R₃及R₄独立地选自氢、C_1-8烷基、C_2-8烯基、C_2-8炔基、C_3-8环烷基、C_1-8卤代烷基、C_6-10芳香基、氨基C_1-8烷基、羟基C_1-8烷基、C_1-8烷氧基C_1-8烷基及C_1-8烷酰基，或者

NR₁R₂组合形成3到7元环，该环可包含0、1或2个另外选自氮、氧及硫的杂环原子；

R₆为氢、羟基、氨基或C_1-8烷基；

R₅及R₇独立地选自氢、卤化物、羟基、巯基、氨基、羟氨基、单-C_1-8烷基氨基、二(C_1-8烷基)氨基、C_1-8烷氧基、C_1-8烷基、C_2-8烯基及C_2-8炔基。

12.权利要求8的方法，其中R₄是氢或C_1-6烷基。

13.权利要求12的方法，其中R₄是氢、甲基、乙基、正丙基或异丙基。

14.权利要求11的方法，其中R₅选自氢或任选取代的氨基；

R₆为氢或C_1-4烷基；并且

R₇为氢，任选取代的氨基或羟基，其中R₅中至少一个是氨基、N-羟基氨基、单-或二-(C_1-4烷基)氨基或N-(C_1-4烷基)-N-(羟基)氨基，并且

R₅选自氢、羟基氨基、单-及二-(C_1-8烷基)氨基、羟基及C_1-8烷氧基；

R₆选自氢、羟基氨基、单-及二-(C_1-8烷基)氨基；并且

R₅不同于R₆，并且R₅及R₆之一为氢。

15.权利要求11的方法，其中R₄是氢或C_1-6烷基；并且，

R₁、R₂及R₃独立地选自氢、C_1-4烷基、C_1-2卤代烷基、苯基、氨基C_1-4烷基、羟基C_1-4烷基、C_1-4烷氧基C₁₄₈烷基及C_1-4烷酰基，或者

NR₁R₂合起来形成3到7元环，该环可包含0或1个另外选自氮、氧及硫的杂环原子。

16.权利要求11的方法，其中R₄为氢、甲基、乙基、正丙基或异丙基；并且

R₁、R₂及R₃独立地选自氢、甲基、乙基、乙酰基、甲酰基，或者

NR₁R₂合起来形成哌啶基、吡咯烷基、吗啉基、硫代吗啉基或哌嗪基。

17.权利要求11的方法，其中R₄为氢、甲基或乙基；并且

R₁、R₂及R₃独立地选自氢、甲基、乙基及乙酰基。

18.权利要求1到17中任一项的方法，其中缺血相关疾病选自：阿尔兹海默病、帕金森氏综合症、冠状动脉侧枝架桥手术、心博停止导致的弥漫性脑缺血、病灶性脑梗塞、脑出血、出血性梗塞、高血压性出血、由颅内血管异常破裂造成的出血、颅内动脉瘤破裂造成的蛛网膜下腔出血、高血压性脑病、造成脑缺血的颈动脉狭窄或阻塞、心源性血栓栓塞、脊髓卒中及脊髓损伤、脑血管疾病：例如，动脉粥样硬化、脉管炎、斑变性，心肌梗塞、心肌缺血及室上性心动过速。

19.治疗缺血相关疾病的方法，包含对病人给药具有下列通式的化合物：

20.权利要求19的方法，其中缺血相关疾病选自：阿尔兹海默病、帕金森氏综合症、冠状动脉侧枝架桥手术、心博停止导致的弥漫性脑缺血、病灶性脑梗塞、脑出血、出血性梗塞、高血压性出血、由颅内血管异常破裂造成的脑出血、颅内动脉瘤破裂造成的蛛网膜下腔出血、高血压性脑病、造成脑缺血的颈动脉狭窄或阻塞、心源性血栓栓塞、脊髓卒中及脊髓损伤、脑血管疾病：例如，动脉粥样硬化、脉管炎、斑变性、心肌梗塞、心肌缺血及室上性心动过速。

Images