CN1788801A - 具有生物相容性能的免拆除创面覆盖物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种具有生物相容性能的免拆除创面覆盖物及其制备方法。创面覆盖物，由胶原溶液与壳聚糖溶液混匀、经交联剂作用后倾入平皿、进行真空冷冻干燥制得。制备方法，将胶原溶液与壳聚糖溶液按胶原与壳聚糖的质量比为7～10∶1的比例混匀；同时按壳聚糖与交联剂的质量体积比g/ml为1∶0.1～2的比例注入交联剂，4℃冰箱静置消泡24～48小时；将上述混合液倾入平皿内，经预冻后进行真空冷冻干燥，第一次冻干样品，经硼氢化钠还原，浸泡，蒸馏水清洗，浸泡，沥干，置冰箱预冻；再次预冻样品，经真空冷冻干燥制得成品人工皮肤。它既可代替自体皮移植的供给不足，又可避免异体皮移植的排斥反应，是目前烧伤治疗领域较为理想的覆盖物。

Description

具有生物相容性能的免拆除创面覆盖物及其制备方法

【技术领域】：本发明涉及医用生物工程材料的制备技术领域，特别是医用生物材料人工皮肤的制备方法及其应用。

【背景技术】：目前已有许多种烧伤创面覆盖物，但除自体皮移植以外，尚没有一种覆盖物能作为永久性保留而免于拆除的创面覆盖物，如国家知识产权局2004年9月22日授权公告的02111593.1号《壳聚糖、胶原和海藻酸钙生物复合无纺布敷料》专利等。因此，开发和研究各种创面覆盖物并使之最终成为令人满意的能永久保留的人体皮肤替代物已日益引起国内外学者的关注。特别是大面积深度烧伤病人，由于供皮区相对不足，暴露的创面又容易受到脓毒症、败血症和超高代谢的威胁，因此研制一种理想具有生物相容性能且能永久保留的免拆除创面覆盖物，是目前烧伤治疗领域急待解决的问题。这种永久保留的创面覆盖物不仅应具备良好的理化性能，同时还应具备良好的生物学性能，促进伤口愈合、止血，起到保护创面，防止细菌侵袭，减少超高代谢和营养不良，降低疼痛等作用。

近年来国内研究多以胶原为主，缺点是降解过快，容易合并痂下感染。国外人工皮研究已进入组织工程化产品阶段，以胶原\硫酸软骨素\壳聚糖为主要组份制成各种人工真皮支架，并与纤维细胞/表皮细胞复合培养形成组织工程化皮肤，近年来组织工程皮肤已取得可喜的进步并初步应用于临床。所应用的组织工程皮肤移植后并不引发临床可见的排斥反应。但一般认为它将最终为受体自己的组织所取代；另一方面，目前的体外培养过程周期仍较长，难以及时满足临床需要，移植中也发现由于组织工程皮肤没有血管系统供给营养，表面的上皮容易坏死脱落。

【发明内容】：本发明的目的是解决单纯胶原制膜作为创面覆盖物，无法解决降解过快，强度过低的弱点，而壳聚糖不溶于水，在体内降解缓慢，单纯以壳聚糖制膜同样不利的问题，提供一种具有生物相容性能的免拆除创面覆盖物及其制备方法。

本发明提供的具有生物相容性能的免拆除创面覆盖物，即人工皮肤由胶原溶液与壳聚糖溶液混匀、经交联剂作用后倾入平皿、进行真空冷冻干燥制得，其中，胶原与壳聚糖的质量比为7～10∶1，壳聚糖与交联剂的质量体积比g/ml为1∶0.1～2。

壳聚糖为脱乙酰度≥85度的医用级壳聚糖，交联剂为0.25％的戊二醛。

一种上述免拆除创面覆盖物的制备方法，该方法依次包括：

——胶原溶液与壳聚糖溶液的制备：

首先将胶原配制成0.2％～1.0％的胶原溶液，壳聚糖配制成1％～2％的壳聚糖溶液；

——人工皮肤混合液的配制：

将上述胶原溶液与壳聚糖溶液按胶原与壳聚糖的质量比为7～10∶1的比例混匀；同时按壳聚糖与交联剂的质量体积比g/ml为1∶0.1～2的比例注入交联剂，4℃冰箱静置消泡24～48小时；

——人工皮肤的制备：

①将上述人工皮肤混合液按20ml/皿，倾入平皿内，于-20℃预冻24～48小时；②预冻的人工皮肤样品进行真空冷冻干燥-40~-60℃，24小时；③第一次冻干样品，经0.1～1.0％硼氢化钠还原，浸泡4小时，蒸馏水清洗2～5次，浸泡8小时，沥干，置-20℃冰箱预冻；④将再次预冻样品，经真空冷冻干燥-40～-60℃，8小时，制得成品人工皮肤。

上述方法中的胶原溶液可采用如下工艺制成：

①称取新鲜牛蹄筋10g，切成厚0.5～1.0mm的薄片；

②将上述筋片，经蒸馏水冲洗2～3遍沥干；5～10％ NaCl溶液100ml浸泡筋片2小时，室温25℃，盐析除去杂蛋白；

③经蒸馏水冲洗沥干，加入0.125～0.25g/100g无花果酶，加18ml蒸馏水和0.5mol/LEDTA 2～4ml，恒温培养箱36～37℃酶解22～30小时；

④将酶解后的筋片，蒸馏水冲洗净沥干，加入15～30％H₂O₂ 20ml，室温24℃作用1～4小时；

⑤蒸馏水洗净沥干，用0.1～1.0％丙二酸250～300mL缓慢低速搅拌8～16小时，溶胀提取胶原溶液。

上述方法的壳聚糖溶液中的壳聚糖采用如下工艺制成：

①虾皮冲洗干净，净壳晾晒干燥；

②过量浓度(4～20)波美度(10～20％)盐酸溶液，室温浸泡24小时，以除无机盐，水洗至中性；

③过量浓度(8～28)波美度(10～20％)氢氧化钠溶液，室温浸泡24小时，以消化蛋白，倾出碱液，水洗至中性；

④过量浓度(2～14)波美度(2～6％)盐酸溶液，室温浸泡24小时，以除无机盐，倾出酸液，水洗至中性；

⑤过量浓度(8～28)波美度(10～20％)氢氧化钠溶液，室温浸泡7～8小时，进一步消化蛋白，倾出碱液，水洗至中性，晒干即得白色片状物质即甲壳质；

⑥将所得甲壳质100g浸泡在(30～60％)氢氧化钠溶液3000mL中，在(90～120℃)反应1小时，脱去乙酰基，水洗至中性，晒干即得白色片状物质即壳聚糖。

本发明的优点及效果：本发明将胶原和壳聚糖按照一定的比例混合，复合制备出具有三维结构和可生物降解吸收的人工皮，祢补了单纯胶原或壳聚糖制膜的缺点。由于三维结构使人工皮具有更好的柔性、弹性，透气性、透湿性和较好的机械强度，既可抵抗胶原酶的降解作用，控制其降解速率，又可防止感染，促进细胞生长和新生血管长入的特点。这种人工皮以其优良的生物相容性能，不易被机体所排斥，防止创面收缩，引导组织细胞长入，并可降解吸收，它即可代替自体皮移植的供给不足，又可避免异体皮移植的排斥反应，是目前烧伤治疗领域较为理想的覆盖物。

经对“人工皮”进行毒理学和组织相容性评价研究，结果显示“人工皮”的各项生物学性能指标，全部符合国家标准要求，具有良好的生物相容性，为临床使用提供了可靠的技术数据。其疗效学评价研究结果显示，但临床应用试验研究的效果颇佳。理化性能和稳定性试验研究显示“人工皮”的理化性能，符合国家标准要求，稳定性良好。另外，经超微结构观察显示，这种三维结构海绵状人工皮具有很好的孔隙率，利于细胞的生长，透气、透湿性能良好。该人工皮以其来源丰富，贮存方便，疗效可靠的优势，在未来生物高科技的21世纪，将迅速进入临床市场，有着广泛的应用前景和不可忽视的临床意义。

【附图说明】：

图1是制备人工皮肤的工艺流程图。

【具体实施方式】：

实施例1

1、胶原溶液的制备：

①称取新鲜牛蹄筋10g，切成厚0.5mm的薄片；

②将上述筋片，经蒸馏水冲洗3遍沥干；8％ NaCl溶液100ml浸泡筋片2小时，室温25℃，盐析除去杂蛋白；

③经蒸馏水冲洗沥干，加入0.20g/100g无花果酶，加18ml蒸馏水和0.5mol/L EDTA 4ml，恒温培养箱37℃酶解24小时；

④将酶解后的筋片，蒸馏水冲洗净沥干，加入20％H₂O₂ 20ml，室温24℃作用4小时；

⑤蒸馏水洗净沥干，用0.6％丙二酸300mL缓慢低速搅拌16小时，溶胀提取胶原溶液。

2、壳聚糖溶液中的壳聚糖的制备：

①虾皮冲洗干净，净壳晾晒干燥；

②过量浓度10波美度盐酸溶液，室温浸泡24小时，以除无机盐，水洗至中性；

③过量浓度15波美度氢氧化钠溶液，室温浸泡24小时，以消化蛋白，倾出碱液，水洗至中性；

④过量浓度5波美度盐酸溶液，室温浸泡24小时，以除无机盐，倾出酸液，水洗至中性；

⑤过量浓度15波美度氢氧化钠溶液，室温浸泡8小时，进一步消化蛋白，倾出碱液，水洗至中性，晒干即得白色片状物质即甲壳质；

⑥将所得甲壳质100g浸泡在40％氢氧化钠溶液3000mL中，在118℃反应1小时，脱去乙酰基，水洗至中性，晒干即得白色片状物质即壳聚糖。

3、胶原溶液与壳聚糖溶液的制备：

将胶原配制成0.5％的胶原溶液，壳聚糖配制成1％的壳聚糖溶液；

4、人工皮肤混合液的配制：

将上述胶原溶液与壳聚糖溶液按胶原与壳聚糖的质量比为10∶1的比例混匀；同时按壳聚糖与交联剂的质量体积比g/ml为1∶0.1的比例注入交联剂，4℃冰箱静置消泡24小时；

5、人工皮肤的制备：

①将上述人工皮肤混合液按20ml/皿，倾入平皿内，于-20℃预冻24小时；②预冻的人工皮肤样品进行真空冷冻干燥-60℃，24小时；③第一次冻干样品，经0.5％硼氢化钠还原，浸泡4小时，蒸馏水清洗3次，浸泡8小时，沥干，置-20℃冰箱预冻；④将再次预冻样品，经真空冷冻干燥-60℃，8小时，制得成品人工皮肤。

实施例2

1、胶原溶液的制备：

①称取新鲜牛蹄筋10g，切成厚1.0mm的薄片；

②将上述筋片，经蒸馏水冲洗2遍沥干；10％ NaCl溶液100ml浸泡筋片2小时，室温25℃，盐析除去杂蛋白；

③经蒸馏水冲洗沥干，加入0.25g/100g无花果酶，加18ml蒸馏水和0.5mol/L EDTA 4ml，恒温培养箱37℃酶解30小时；

④将酶解后的筋片，蒸馏水冲洗净沥干，加入30％H₂O₂ 20ml，室温24℃作用3小时；

⑤蒸馏水洗净沥干，用1.0％丙二酸250mL缓慢低速搅拌14小时，溶胀提取胶原溶液。

2、壳聚糖溶液中的壳聚糖的制备：

①虾皮冲洗干净，净壳晾晒干燥；

②过量浓度20波美度盐酸溶液，室温浸泡24小时，以除无机盐，水洗至中性；

③过量浓度20波美度氢氧化钠溶液，室温浸泡24小时，以消化蛋白，倾出碱液，水洗至中性；

④过量浓度10波美度盐酸溶液，室温浸泡24小时，以除无机盐，倾出酸液，水洗至中性；

⑤过量浓度20波美度氢氧化钠溶液，室温浸泡8小时，进一步消化蛋白，倾出碱液，水洗至中性，晒干即得白色片状物质即甲壳质；

⑥将所得甲壳质100g浸泡在50％氢氧化钠溶液3000mL中，在110℃反应1小时，脱去乙酰基，水洗至中性，晒干即得白色片状物质即壳聚糖。

3、胶原溶液与壳聚糖溶液的制备：

将胶原配制成1.0％的胶原溶液，壳聚糖配制成2％的壳聚糖溶液；

4、人工皮肤混合液的配制：

将上述胶原溶液与壳聚糖溶液按胶原与壳聚糖的质量比为7∶1的比例混匀；同时按壳聚糖与交联剂的质量体积比g/ml为1∶0.5的比例注入交联剂，4℃冰箱静置消泡48小时；

5、人工皮肤的制备：

①将上述人工皮肤混合液按20ml/皿，倾入平皿内，于-20℃预冻48小时；②预冻的人工皮肤样品进行真空冷冻干燥-50℃，24小时；③第一次冻干样品，经1.0％硼氢化钠还原，浸泡4小时，蒸馏水清洗5次，浸泡8小时，沥干，置-20℃冰箱预冻；④将再次预冻样品，经真空冷冻干燥-50℃，8小时，制得成品人工皮肤。

细胞毒性试验

依据国家标准GB/T 16886.5-1997方法进行。

采用琼脂覆盖法对材料中存在的可滤取的每性物质直接进行试验，使用L929细胞株，试验用细胞为传代48～72小时生长旺盛的细胞。

人工皮细胞毒性试验结果见表1。

          表1  人工皮细胞毒性试验结果

组别	样品数	区域内情况(Z)	细胞溶解(L)	R＝Z/L
					阴性样品检测样品阳性样品	6126	样品下细胞形态及着色良好样品下细胞形态及着色良好样品下及周边平均3.3mm处细胞全部脱色、圆缩	未见未见25％	0/00/02/2

——结论

结果显示，人工皮的细胞毒性为0级，无细胞毒性，符合GB/T 16886.5-1997标准规定。

皮肤致敏试验

依据国家标准GB/T14233.2-1993方法进行。

本试验系将一定量的材料浸提液与豚鼠皮肤接触，以检测材料是否具有引起接触性皮肤变态反应的可能性。

——结果

各组试验动物贴敷处红斑、水肿记分见表2，致敏率见表3。

       表2  各组试验动物红斑、水肿记分汇总

组别	动物数(只)	1h(分)	24h(分)	48h(分)
					阴性对照组阳性对照组人工皮组	8108	0200	0200	0200

             表3  人工皮致敏率

组别	致敏数	致敏率(％)	分度
				阴性对照组阳性对照组人工皮组	0/1616/160/16	01000	IVI

试验结果表明，人工皮贴敷物取下后1h、24h、48h观察，未见红斑、水肿现象，与0.9％生理盐水(阴性对照组)无明显差异，致敏率为0％。而5％甲醛溶液(阳性对照组)组出现红斑、水肿，甚至出现硬结和焦痂的现象，致敏率为100％。

结论

人工皮无皮肤致敏反应，符合GB/T14233.2-1993的规定。

原发性皮肤刺激试验

依据国家标准GB/T 16175.1996方法进行。

本试验是将材料浸提液与动物皮肤在规定时间内接触，通过动物皮肤的局部反应情况来评价材料对皮肤的原发性刺激作用。

——结果

除去贴敷物后1h、24h、48h、72h对照组和人工皮组试验局部及周围皮肤组织均无红斑、水肿反应，原发性刺激指数为0。结果见表4、表5。

           表4  人工皮原发性皮肤刺激反应记分结果

组别	24h		48h		72h		记分
								红斑	水肿	红斑	水肿	红斑	水肿
	生理盐水组人工皮组	-*-	--	--	--	--								--	00

^*无红斑、水肿现象。

     表5各  组原发性刺激指数(PII)

组别	原发性刺激指数(PII)
		生理盐水组人工皮组	00

——结论

人工皮原发性皮肤刺激试验合格，符合GB/T 16175.1996的规定。

疗效评研究

我们选择体外抑菌试验研究和体内动物疗效试验研究，以及临床应用研究，对“人工皮”进行了疗效学评价研究。

——试验性动物疗效研究

通过对家兔烧伤模型的试验性治疗，观察人工皮对创面愈合疗效和疤痕的组织病理学变化。试验观察指标为愈合时间和疤痕组织病理学变化。

——材料

①试验样品：人工皮

①对照样品：凡士林油纱布，(医药白凡士林，天津石油化工公司第三石油化工厂出品，(81)津卫药准字第1691号，批号940516)。

③试验动物：

健康成年家兔20只，雌雄不限，体重2.5～3kg，由天津市万众养殖场提供。

——方法：

本试验采用组间对照，随机将家兔分为对照和人工皮两组，每组10只。将动物背部脊柱两侧剪毛，范围为10×6cm²。以复方氯胺酮0.15ml/kg肌肉注射麻醉。将麻醉的动物置于手术台上固定，用烧灼赤红的烙铁于背部脊柱一侧直接烧灼10秒钟，烧灼面积为10cm²，形成II°烧伤模型，已经病理组织学证实。待动物苏醒后，回笼饲养，并注意观察全身状况。于烧伤模型建立二天后行切痂术，麻醉动物，常规消毒，切除焦痴，即全层皮肤面积为10cm²，切后创面面积为12～15cm²，人工皮组以人工皮敷盖创面，对照组以凡士林油纱布敷盖创面，最后以纱布和胶布包扎固定。于术后48小时，对照组创面用生理盐水棉球擦拭清洁，隔日换药一次，人工皮组不换药，仔细观察创面愈合情况。

——结论

结果显示，从愈合时间来观察，人工皮组与对照组相比P＞0.05，无显著性差异。但从愈合方式来观察，人工皮组是以干性愈合为主，贴敷好，吸附作用明显避免了痂下感染，在愈合过程中人工皮随着新生皮肤的生长而不断降解。对照组是以湿性愈合为主，不降解。容易合并痂下感染。病理结果显示，人工皮组和对照组条形疤痕创面愈合点的表皮及真皮层，组织形态学基本相同。对照及人工皮组少数动物均见表皮不完整，由坏死的炎细胞及其分泌物覆盖。但两侧表皮正趋于向中心点生长，可能系取材时间点略早的缘故。说明人工皮与对照疗效几乎相同。但由于对照组需要每天进行清理伤口、换药处理，造成时间浪费和换药带来痛苦。而人工皮只需一次性敷盖，免去了换药的痛苦和时间的浪费。因此，从某种意义上讲，人工皮的疗效还是优于对照组的疗效。

临床疗效研究

——试验目的

①观察人工皮对烧伤创面愈合修复的作用。

②观察创面局部反应：疼痛、刺激、过敏和炎症等。

③观察创面局部降解、吸收和贴敷情况。

④观察全身毒副反应。

——入选病例标准：

①受试病例年龄：16～65岁，性别不限。

②中、小面积烧伤，无伴发全身性感染者。

③伤前体健，无心、肺、肝、肾和血液系统合并症者。

④供皮区皮肤健康，无局部过敏及炎症。

⑤中厚层取皮供皮区创面，厚度为0.3～0.45mm，面积＞5×5cm²。

——方去：

应用自体对照方法：供皮区手术前处理按常规进行，在无菌操作下用鼓式取皮机，调节刻度0.3～0.45mm之间，切取中厚层皮片，经加压止血后，在供皮区创面上分区应用。试验组无菌人工皮和对照组无菌凡士林油纱布贴敷于创面上，再用无菌纱布加压，达到止血及防止感染的目的。术后24～48小时更换外层敷料，并观察创面愈合情况。观察项目和指标如下：

①全身情况：T、P、R、血、尿、生化和肝肾功能。

②供皮区创面观察：出血、疼痛、刺激、过敏、分泌物及感染情况。

③人工皮覆盖物观察：降解吸收、分泌物引流、感染是否可控制，有否出血，占位性，创面贴敷情况，对创面愈合影响有无促进作用或创面加深情况。

④医学摄影：治疗前、后拍照。

⑤细菌培养：根据情况选择。

——试验结果

①23例全部住院患者，男性20例、女性3例，年龄16～45岁(30.30±9.27)，烧伤供皮区取皮时间接受人工皮时间：1～14天(8.95±9.66)。

应用人工皮面积：5×5cm² 20例、10×10cm 3例。

供皮区创面面积：0.5％～3％平均1％，面积(8×10cm²)。

观察天数：10～14天(12.10±1.76天)

②疗效：

人工皮对供皮区创面疗效观察经SPSS软件包统计，结果见表6。

              表6  人工皮对供皮区创面疗效观察

分组	例数	愈合	末愈	恶化	愈合天数(天)
						人工皮凡士林纱布(无菌)	2323	2321	01	01	8-14(9.826±1.922)*10-16(14.130±1.938)

*人工皮组与凡士林组相较P＜0.01

供皮区人工皮组23例全部一期愈合，愈合天数8～14天(平均9.8天)比凡士林纱布愈合天数14.1天快4.2天，P值＜0.01。而二组疗效比较，人工皮组23例全部愈合，凡士林组21例愈合，其中未愈1例，恶化1例，P值＞0.05，无统计学意义。人工皮组的愈合时间提前4.2天，有非常显著性差异，说明有明显促进愈合作用。

③23例覆盖物对创面作用的观察：

人工皮覆盖物对创面作用的观察见表7。

                 表7  23例人工皮覆盖物对创面作用的观察

分组	例数	降解吸收		分泌物引流		创面贴敷情况
								人工皮组凡士林组	2323	好	不好	好	不好	好	不好
230	023	2310	013	232	021

人工皮应用供皮区创面全部均为降解吸收，分泌物引流好、贴敷好。该人工皮具有易降解，无刺激，可引流，三维覆盖的性能。

④安全性毒副作用：全部23例均无局部及全身毒副反应，局部无刺激、不疼痛、无过敏，对血、尿常规及生化肝肾功能均无异常。

——小结

①临床试验选择供皮区创面是为科学的观察皮肤组织，在不同覆盖物作用条件下对皮肤组织损伤后修复的过程。

a)烧伤供皮区皮肤是健康皮肤组织，而本课题限定在中、小面积烧伤并无伴发全身感染者。

b)供皮区取皮操作用鼓式取皮机刻度调节在0.3～0.45mm之间，是确保皮肤损伤深度一致，即将皮肤表皮全层及真皮1/2～1/3层切取残留2/3～1/2真皮层，这样可准确皮肤损伤的程度。

c)供皮区为无菌创面，无菌操作。确保创面修复是在无感染情况下进行。

d)符合本课题目的是研制永久性人工皮，能取代异体皮为大面积烧伤切痂提供复合组织人工皮的要求。

而烧伤创面则不具备上述条件：

a)感染因素无去排除。

b)烧伤创面深度均为肉眼判断不准确。

c)受全身状况及治疗干扰因素多。故本试验不选择烧伤创面是为排除局部创面及全身干扰因素；其次供皮区创面能提供人体皮肤损伤修复观察最佳的模型，而是在不增加病人痛苦，进行植皮治疗过程，同时获得对皮肤组织修复科学的观察。

②临床疗效显著：全部23例均达到愈合，愈合天数较凡士林组缩短4.2天，这对烧伤治疗是极其有利，而且人工皮可降解吸收、引流好、贴敷好，应用方便。

③安全性好，无局部及全身毒副反应。

Claims (5)

1、一种具有生物相容性能的免拆除创面覆盖物，即人工皮肤，其特征是该人工皮肤：由胶原溶液与壳聚糖溶液混匀、经交联剂作用后倾入平皿、进行真空冷冻干燥制得的成品人工皮肤，其中，胶原与壳聚糖的质量比为7～10∶1，壳聚糖与交联剂的质量体积比g/ml为1∶0.1～2。

2、根据权利要求1所述的免拆除创面覆盖物，其特征是壳聚糖为脱乙酰度≥85度的医用级壳聚糖，交联剂为0.25％的戊二醛。

3、一种权利要求1所述的免拆除创面覆盖物的制备方法，其特征是该方法依次包括：

——胶原溶液与壳聚糖溶液的制备：

首先将胶原配制成0.2％～1.0％的胶原溶液，壳聚糖配制成1％～2％的壳聚糖溶液；

——人工皮肤混合液的配制：

将上述胶原溶液与壳聚糖溶液按胶原与壳聚糖的质量比为7～10∶1的比例混匀；同时按壳聚糖与交联剂的质量体积比g/ml为1∶0.1～2的比例注入交联剂，4℃冰箱静置消泡24～48小时；

——人工皮肤的制备：

①将上述人工皮肤混合液按20ml/皿，倾入平皿内，于-20℃预冻24～48小时；②预冻的人工皮肤样品进行真空冷冻干燥-40～-60℃，24小时；③第一次冻干样品，经0.1～1.0％硼氢化钠还原，浸泡4小时，蒸馏水清洗2～5次，浸泡8小时，沥干，置-20℃冰箱预冻；④将再次预冻样品，经真空冷冻干燥-40～-60℃，8小时，制得成品人工皮肤。

4、根据权利要求3所述的免拆除创面覆盖物的制备方法，其特征是所述的胶原溶液采用如下工艺制成：

①称取新鲜牛蹄筋10g，切成厚0.5～1.0mm的薄片；

②将上述筋片，经蒸馏水冲洗2～3遍沥干；5～10％ NaCl溶液100ml浸泡筋片2小时，室温25℃，盐析除去杂蛋白；

③经蒸馏水冲洗沥干，加入0.125～0.25g/100g无花果酶，加18ml蒸馏水和0.5mol/L EDTA 2～4ml，恒温培养箱36～37℃酶解22～30小时；

④将酶解后的筋片，蒸馏水冲洗净沥干，加入15～30％H₂O₂ 20ml，室温24℃作用1～4小时；

⑤蒸馏水洗净沥干，用0.1～1.0％丙二酸250～300mL缓慢低速搅拌8～16小时，溶胀提取胶原溶液。

5、根据权利要求3所述的免拆除创面覆盖物的制备方法，其特征是所述的壳聚糖溶液中的壳聚糖采用如下工艺制成：

①虾皮冲洗干净，净壳晾晒干燥；

②过量浓度(4～20)波美度(10～20％)盐酸溶液，室温浸泡24小时，以除无机盐，水洗至中性；

③过量浓度(8～28)波美度(10～20％)氢氧化钠溶液，室温浸泡24小时，以消化蛋白，倾出碱液，水洗至中性；

④过量浓度(2～14)波美度(2～6％)盐酸溶液，室温浸泡24小时，以除无机盐，倾出酸液，水洗至中性；

⑤过量浓度(8～28)波美度(10～20％)氢氧化钠溶液，室温浸泡7～8小时，进一步消化蛋白，倾出碱液，水洗至中性，晒干即得白色片状物质即甲壳质；

⑥将所得甲壳质100g浸泡在(30～60％)氢氧化钠溶液3000mL中，在(90～120℃)反应1小时，脱去乙酰基，水洗至中性，晒干即得白色片状物质即壳聚糖。