KR20180078624A - 돼지 진피-유래 치과용 차폐막 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 개시 내용의 일 구체예에 따르면, 돼지 진피로부터 유래된 멤브레인 부재를 기반으로 하는 골 결손부의 재생용 차폐막 및 이의 제조방법이 개시된다.

Description

돼지 진피-유래 치과용 차폐막 및 이의 제조방법{Porcine Dermis-derived Barrier Membrane for Dental Applications and Method for Fabricating the Same}

본 개시 내용은 돼지 진피-유래 치과용 차폐막 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시 내용은 골 결손부의 재생을 위한 돼지 진피-유래 콜라겐 기반의 차폐막 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

생활수준 향상에 따른 임플란트(implant) 시술 환자가 증가함에 따라, 구강 내 매식 재료 개발에 대한 수요가 급격히 증가하고 있다. 치아 임플란트 시술은 대체적으로, 환자의 잇몸을 절개한 후, 그 속에 있는 치조골에 임플란트용 포스트를 삽입하고, 임플란트용 포스트에 인공치아(crown)를 결합함으로써 완성된다. 임플란트 시술을 하기 위하여는 픽스츄어(fixture)가 식립되는 치조골이 충분한 길이 및 폭을 가져야 하나, 뼈는 다른 조직에 흡수되거나 소실되는 경우가 많다.

임플란트 시술 시 구강 내 소실된 골의 재생 및 시술 방법으로는 주로 골 이식재(bone graft materials) 및 차폐막(barrier membrane)을 이용한 골유도 재생술(guided bone regeneration; GBR)이 시행되고 있다. 이러한 골유도 재생술은 골 결손부에 골 이식재를 주입한 후에 차폐막을 덮어 뼈가 자라도록 유도하는 시술로서 임플란트 이식 성공률을 결정하는 중요한 요소이다.

뼈는 다른 조직과 달리 신체의 구조로 완전히 회복되는 유일한 잠재력을 가지고 있다. 그러나, 뼈가 올바른 형태로 재생되기 위하여는 기계적 안정성 및 풍부한 혈액 공급이 요구된다.

골유도 재생술의 생물학적 필요조건으로서 혈류 공급, 안정화, 골아 세포, 제한된 공간, 공간 유지 등이 있는 바, 이를 위하여 여러 가지 외과적 시술이 시행된다. 이때, 골 이식재에 적절한 압력을 제공하는 경우, 밀착성이 높아지고 골 형성에 도움을 줄 수 있다.

따라서, 임플란트 시술에서 필수적으로 요구되는 매식 재료 중 하나인 차폐막은 골 결손부위에 이식된 골 이식재의 이동을 억제하고 불필요한 연조직 세포의 증식은 배제하며, 그리고 골 재생에 필요한 세포를 선택적으로 접근시킴으로써 골 결손 부위의 골 재생을 유도하는 지지체 역할을 한다.

치과용 차폐막은 골 결손부 및 임플란트 주위의 골 결손부에서 뼈의 형성을 유의성 있게 개선하고, 봉합 가능한 정도의 물성을 나타내면서 생체 내에 사용하여도 안전하도록 생체 적합성을 가져야 한다. 또한, 수술 후 상처 감염의 우려가 없고 조직 변성을 일으키지 않아야 하며, 치주 조직 내에서 이물감을 최소화하면서 치주 조직과 밀착 가능해야 하며, 그리고 우수한 세포성장 특성을 갖는 재료를 사용하는 것이 중요하다.

치과의료용 차폐막은 분해되는 특성에 따라 흡수성과 비흡수성 차폐막으로 구분된다. 흡수성 차폐막은 골 결손부에 이식된 후에 자연적으로 구강 내에서 생분해됨으로써 차폐막 제거를 위한 2차적 수술이 필요없고 조작이 비교적 용이한 장점을 갖고 있는 반면, 비흡수성 차폐막에 비하여 견고성이 낮아 공간 유지력이 저하되거나 결손부의 외형이 좋지 않고, 골 이식재 등의 도움이 없다면 조직 재생의 량이 제한될 수 있다. 또한, 구강 내 이식 후 빠른 생분해로 인하여 완전한 골 재생이 어려울 수 있고 중간 부산물이 국소적인 조직 반응을 일으킬 수 있는 한계를 갖는다.

한편, 비흡수성 차폐막은 골 회복까지 완벽히 제 기능을 수행하여 임상적 예후가 좋기 때문에 임상에서 선호되는 차폐막의 종류이다. 그러나, 비흡수성 차폐막은 흡수되지 않기 때문에 충분한 조직 재생을 유도하는 반면, 차폐막을 제거하는 2차 수술이 필요하고, 더 나아가 고가의 고어텍스 제품 소재를 사용하기 때문에 치과 치료비를 증가시킨다.

본 개시 내용의 구체예에서는 골 재생에 필요한 기간 동안 구강 내에서 원하는 형태를 유지할 수 있고, 주변 조직과의 친화성이 양호하여 주변 조직의 염증을 유발하지 않는 개선된 치과용 차폐막 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.

본 개시 내용의 제1 면에 따르면,

소정 패턴 형상을 갖도록 구성된 흡수성 또는 비흡수성 프레임 부재;

상기 프레임 부재의 상측 면 및 하측 면에 밀착하면서 둘러싸는 멤브레인 부재;

를 포함하는 치과용 차폐막으로서,

상기 멤브레인 부재는 판상형의 복수 콜라겐 층의 적층 구조를 갖고, 하기의 물성을 충족하는 치과용 차폐막이 제공된다:

(i) 적어도 0.4 g/㎤의 밀도,

(ii) ISO 13726-1에 따라 측정되는 흡수도가 100 내지 2,000%,

(iii) ASTM F2212에 따라 측정되는 효소분해저항성(8h)이 40 내지 80%, 그리고

(iv) ASTM D638에 따라 측정되는 인장강도 및 인장신장율 각각이 적어도 0.5 MPa 및 적어도 5%임.

본 개시 내용의 제2 면에 따르면,

(I) 돼지 진피로부터 유래된 콜라겐-함유 진피층을 물과 함께 분쇄 처리하는 단계;

(II) 상기 진피층 분쇄물을 감압 필터링에 의하여 성형하여 제1 멤브레인 구조물을 형성하는 단계;

(III) 상기 제1 멤브레인 구조물 상에 소정 패턴 형상을 갖도록 구성된 흡수성 또는 비흡수성 프레임 부재를 부착하는 단계;

(IV) 상기 프레임 부재가 부착된 제1 멤브레인 구조물 상에 상기 단계 (I)에서 얻어진 진피층 분쇄물을 첨가하고 감압필터링에 의하여 형성되는 제2 멤브레인 구조물이 상기 제1 멤브레인 구조물과 함께 상기 프레임 부재를 밀착하면서 둘러싸는 복합 구조물을 형성하는 단계;

(V) 상기 복합 구조물에 대하여 물리적 가교 및 화학적 가교로 이루어지는 2중 가교를 수행하는 단계;

를 포함하고,

상기 제1 및 제2 멤브레인 구조물 각각은 판상형의 복수 콜라겐 층의 적층 구조를 갖는 치과용 차폐막의 제조방법이 제공된다.

일 구체예에 따르면, 상기 복수 콜라겐 층은 가교된 콜라겐 구조를 가질 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 상기 차폐막은 프레임 부재의 벤딩에 의한 3차원적 구조에 의하여 골재생 공간을 형성할 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 상기 차폐막은 2차원적 구조에 의하여 골재생 공간을 형성할 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 상기 프레임 부재는 티타늄 또는 티타늄 합금 재질일 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 상기 프레임 부재는 결손된 치조골의 상부에 위치하게 되는 환형부 및 상기 결손된 치조골의 측부 또는 그 일부가 상부에 위치하는 다리부를 구비할 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 상기 단계 (IV)와 상기 단계 (V) 사이에 상기 복합 구조물을 동결 건조하는 단계를 더 포함할 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 상기 단계 (I)에 앞서 돈피를 탈지질 처리하여 돼지 진피를 얻는 단계; 및

상기 돼지 진피를 탈핵산화 처리하는 단계;

를 더 포함할 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 상기 탈핵산화 처리된 돼지 진피를 동결 건조시킨 다음, 상기 단계 (I)을 수행할 수 있다.

본 개시 내용의 구체예에 따른 차폐막은 돼지 진피를 특정 방식에 의하여 처리하여 제조됨으로써 인체에 무해하고, 치은결합조직의 세포 유입을 차단하여 하부에서 골조직으로부터 유래된 세포의 증식에 의하여 골 형성을 촉진시킬 수 있다. 특히, 골재생에 필요한 기간 동안 일정 형상의 골재생 공간을 유지할 수 있는 생화학적 내구성 및 기계적 물성이 우수할 뿐만 아니라, 주변 조직에 대한 친화성이 양호하여 염증과 같은 부작용이 유발되지 않는 장점을 제공한다. 따라서, 향후 광범위한 상용화가 기대된다.

도 1a 내지 도 1i는 각각 본 개시 내용의 예시적 구체예에 따라 멤브레인 부재에 다양한 형상을 갖는 프레임 부재가 부착된 치과용 차폐막을 도시하는 도면이고;
도 2는 본 개시 내용의 다른 구체예에 따라 차폐막을 제조하는 일련의 공정을 예시적으로 도시하는 공정 순서도이고;
도 3은 실시예 1에서 돼지 진피층을 탈핵산 용액으로 처리하기 전후의 핵산성분의 함량을 평가하기 위하여 H&E 염색 조직 슬라이스를 제조하여 광학 현미경(40배 및 100배)으로 관찰한 결과를 나타내는 사진이고;
도 4는 실시예 1에서 2단계 감압 필터링(적층)을 거쳐 동결 건조된 멤브레인 형상의 복합 구조물 중 멤브레인 부재의 단면에 대한 주사전자현미경 사진이고;
도 5는 실시예 1에 따라 제조된 차폐막의 멤브레인 부재에 대한 세포독성 평가 결과를 나타내는 광학 현미경 사진이고;
도 6은 실시예 1에 따라 제조된 차폐막의 멤브레인 부재 및 상용 멤브레인 제품 간의 흡수도를 대비한 결과를 나타내는 그래프이고; 그리고
도 7a 및 도 7b 각각은 실시예 1에 따라 제조된 차폐막의 멤브레인 부재 및 상용 멤브레인 제품 간의 기계적 물성(인장강도 및 인장신장율)을 대비한 결과를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 하기의 설명에 의하여 모두 달성될 수 있다. 하기의 설명은 본 발명의 바람직한 구체예를 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 첨부된 도면은 이해를 돕기 위한 것으로, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 개별 구성에 관한 세부 사항은 후술하는 관련 기재의 구체적 취지에 의하여 적절히 이해될 수 있다.

본 명세서에 있어서, 어떠한 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 별도의 언급이 없는 한, 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.

"상에" 또는 "상측에" 및 "하측에" 또는 "아래에"와 같은 용어는 구성 요소 또는 부재 간의 상대적인 위치 관계를 기술하는 것으로 이해될 수 있으며, "상측에 위치한다" 또는 "하측에 위치한다"는 용어는 특정 대상과 접촉된 상태뿐만 아니라 접촉되지 않은 상태에서 상대적인 위치 관계를 표현하는 것으로 이해될 수 있다.

"콜라겐"은 천연 생분해성 고분자로서 동물의 결합 조직(피부, 뼈, 힘줄 등)의 주된 구성 성분인 단백질을 의미하며, 이때 특정 단일 단백질의 의미하기보다는 단백질 패밀리를 의미하는 것으로 이해될 수 있다. 구체적으로, 콜라겐은 포유동물의 살 및 결합조직을 구성하는 신체의 구조적 지지체로서, 이의 기본 구성 단위는 트로포콜라겐(tropocollagen) 단백질(동일한 크기를 갖는 3종의 폴리펩티드 사슬로 구성됨)이며, 사슬들이 각각 서로 주위로 감겨서 초나선형(superhelical) 케이블 또는 삼중 나선형(triple-helix) 구조를 형성한다. 콜라겐은 크게 타입 I, 타입 II, 타입 III, 타입 V 등으로 구분될 수 있는 바, 이러한 타입의 콜라겐은 얇고 긴 섬유소 구조를 형성하여 조밀하다.

본 개시 내용의 일 구체예에 따른 차폐막은, 크게 멤브레인 부재 및 프레임 부재로 이루어질 수 있다. 이때, 프레임 부재는 결손된 치조골 주변에 원하는 골재생 공간을 형성하도록 차폐막을 지지하는 역할을 하며, 멤브레인 부재는 상기 프레임 부재와 함께 골재생 공간을 형성할 수 있다. 이때, 멤브레인 부재가 프레임 부재의 상측 면 및 하측 면에 밀착하면서 둘러싸도록 구성된다.

프레임 부재는, 특히 결손 공간 또는 임플란트 식립을 위한 적절한 잔존골을 확보에 필요한 공간을 소정 기간에 걸쳐 제공하도록 안정적인 지지 기능을 제공해야 한다. 이러한 프레임 부재는 흡수성 또는 비흡수성 재질로 이루어질 수 있는데, 이의 두께는, 예를 들면 약 0.1 내지 0.6 mm, 구체적으로 약 0.15 내지 0.5 mm, 보다 구체적으로 약 0.2 내지 0.4 mm 범위일 수 있다.

예시적으로, 흡수성 프레임 부재를 사용할 경우, 멤브레인 부재와 유사하게 구강 내 체액을 흡수할 수 있는 소재, 예를 들면 콜라겐, 히알루론산, 폴리카프로락톤, 폴리락타이드 등으로 이루어질 수 있는 바, 이러한 흡수성 재질에서 결여된 강성을 제공하기 위하여 전술한 흡수성 소재를 압축하여 강성을 높이고, 이를 소정 형상으로 절단하여 패턴화할 수 있다.

택일적 구체예에 따르면, 프레임 부재로서 비흡수성 재질을 사용할 수 있는 바, 예를 들면 티타늄 또는 티타늄 합금 소재를 사용할 수 있다. 티타늄계 소재는 공간 유지에 필요한 기계적 물성 및 양호한 골 친화성을 갖기 때문에 차폐막의 프레임 부재로 적합하다. 다만, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 전술한 요건을 충족하는 다른 금속 또는 금속 합금 재질도 사용할 수 있다.

도 1a 내지 도 1i는 각각 본 개시 내용의 예시적 구체예에 따라 멤브레인 부재에 프레임 부재가 부착된 차폐막의 예를 도시한다.

도시된 바와 같이, 차폐막 내 프레임 부재는 다양한 패턴의 형상을 가질 수 있다. 상기 도시된 프레임 부재의 형상은 본 출원인의 국내특허출원번호 제2014-0020243호에 상세히 설명되어 있는 바, 상기 특허문헌은 본 명세서의 참고자료로 포함된다.

구체적으로, 도시된 예에 있어서, 프레임 부재는 도 1a 내지 도 1h에 나타낸 바와 같이 환형부 및 다리부를 포함할 수 있다. 이때, 환형부는 골 재생 시 결손된 치조골의 상부에 위치하는 한편, 다리부는 결손된 치조골의 측부에 위치하거나 또는 그 일부가 치조골의 상부에 위치하게 된다. 특히, 환형부는 임플란트 시술 시 결손된 치조골에 식립된 픽스츄어 상에 고정될 수 있다. 또한, 다리부는 필요에 따라 벤딩 가능하는데 적합한 치수(예를 들면, 두께 및 폭)를 가질 수 있는 바, 특히 다리부의 벤딩을 통하여 3차원적 공간을 용이하게 형성할 수 있다. 즉, 다리부는 환형부에 대하여 벤딩되거나, 또는 다리부 자체의 벤딩에 의하여 원하는 골 재생 공간을 형성할 수 있다.

다른 구체예에 따르면, 프레임 부재는 도 1i에 도시된 바와 같이 원호부 및 다리부를 포함하는 형태로 구성될 수 있다. 상기 구체예에 따르면, 원호부는 결손된 치조골의 상부에 위치할 수 있고, 다리부는 전술한 바와 같이 결손된 치조골의 측부에 위치하거나 또는 그 일부가 치조골의 상부에 위치할 수 있다.

상기 도시된 프레임 부재의 형상 패턴은 예시적 목적을 위하여 제시되는 것으로, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

일 구체예에 따르면, 프레임 부재를 밀착하며 둘러싸는 멤브레인 부재의 특징 중 하나는 판상형의 복수 콜라겐 층의 적층 구조를 갖는다는 점이다. 이와 같이 다수의 얇은 콜라겐 층의 적층 구조를 갖는 멤브레인 부재를 형성함으로써 차폐막이 구강 내 환경에서 골 재생 공간을 장기간에 걸쳐 유지할 수 있고, 3차원의 골 재생 공간 확보를 위하여 차폐막을 벤딩하는 경우에 프레임 부재에 의하여 멤브레인 부재가 찢어지거나 손상되는 현상을 억제할 수 있는 기계적 물성(또는 내구성)을 확보할 수 있다.

특히, 멤브레인 부재의 적층 구조를 구성하는 판상형의 복수 콜라겐 층은 가교된 콜라겐 구조를 가질 수 있는 바, 이와 같이 콜라겐 내에 가교(또는 가교 네트워크) 구조를 도입함으로써 구강 내 환경에서 멤브레인 부재가 체액을 지나치게 많은 량으로 흡수하여 기계적 물성을 유지하지 못하는 현상을 억제할 수 있다. 이와 함께, 타액과 접촉 시 타액 내에 함유된 효소로 인하여 멤브레인 내 콜라겐이 분해되는 현상 역시 억제할 수 있다.

특히, 복수의 콜라겐 층의 적층 구조를 도입함으로써 외부 요인에 대한 차폐 효과를 높일 수 있고, 콜라겐 층 상호 밀착 특성을 강화함으로써 구강 내 환경 내 분해 저항성을 개선할 수 있다. 이와 관련하여, 가교 구조가 도입된 멤브레인 부재 내 콜라겐 성분의 총 아미노산 조성 중 히드록시프롤린(hydroxyproline; OH-Pro) 내 히드록시기(-OH)의 량이 가교되지 않은 경우(또는 가교 구조가 도입되기 전)에 비하여, 예를 들면 약 90% 이하, 구체적으로 약 50 내지 80%, 보다 구체적으로 약 60 내지 70% 수준일 수 있다.

이때, 적층 구조를 구성하는 개별 콜라겐 층의 두께는, 예를 들면 약 1 내지 50 ㎛, 구체적으로 약 10 내지 45 ㎛, 보다 구체적으로 약 15 내지 35 ㎛ 범위일 수 있다. 다만, 적층 구조 내에서 콜라겐 층의 대부분은 상면 및/또는 하면에 인접하는 다른 콜라겐 층과 긴밀하게 접촉된 상태로 존재할 수 있으나, 경우에 따라서는 일부 표면 부위에서는 약간 이격될 수도 있다.

예시적 구체예에 있어서, 전술한 바와 같이 멤브레인 부재와 프레임 부재를 포함하는 차폐막의 두께는, 예를 들면 약 0.4 내지 1.5 mm, 구체적으로 약 0.5 내지 1 mm, 보다 구체적으로 약 0.6 내지 0.9 mm 범위일 수 있으며, 골 재생 기간, 요구되는 기계적 및 생화학적 물성 등을 고려하여 결정할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 기계적 물성 및 생화학적 특성 면에서 개선된 치과용 차폐막은 복수의 물성 요건을 충족한다.

구체적으로, 차폐막 내 멤브레인 부재의 밀도는 적어도 약 0.4 g/㎤, 구체적으로 약 0.48 내지 0.7 g/㎤, 보다 구체적으로 약 0.5 내지 0.65 g/㎤ 범위일 수 있다. 멤브레인 부재의 밀도는 차폐막의 형상 및 기계적 물성에 영향을 미치는 인자로서, 일정 수준 미만에서는 콜라겐이 판상의 적층 구조를 갖기보다는 스폰지와 같은 성상을 갖게 된다. 반면, 밀도가 지나치게 높은 경우에는 물리적인 강도는 우수하나 사용성이 저하되며, 수화 시 유연성이 악화되는 문제점을 가질 수 있다. 따라서, 전술한 밀도 범위 내의 특성을 갖는 것이 유리할 수 있다.

한편, 멤브레인 부재는 멤브레인 부재의 흡수율은 약 100 내지 2,000%, 구체적으로 약 500 내지 1,000%, 보다 구체적으로 약 100 내지 200% 범위일 수 있다. 이때, 멤브레인 부재의 흡수율은 ISO 13726-1(Methods for the direct testing of wounds. Part 1: Aspects concerning absorption)에 의하여 측정할 수 있다. 이와 같이 멤브레인 부재의 흡수율을 특정 범위로 유지하는 것이 바람직한 이유는 구강 내 결손 공간 내에서 타액, 혈액 등에 함유된 액체 성분(수분)에 대하여 적당한 흡수율을 확보함으로써 조골세포의 분화 및 성장을 촉진하는 인자를 함유한 혈액을 흡수하고 혈액에 이러한 인자들을 이용한 빠른 재혈관화 효과를 얻기 위함이다. 다만, 흡수율이 지나치게 낮거나 높은 경우에는 혈액 등에 함유된 성장인자의 활용도 및 차폐막의 기능 면에서 문제점이 유발될 수 있기 때문에, 가급적 전술한 범위 내에서 적절히 조절하는 것이 유리하다.

이외에도, 멤브레인 부재는 효소 분해에 대한 저항성이 일정 수준 이상이어야 골 유도 재생 기간 동안 타액, 체액 내에 함유된 효소에 의하여 분해되지 않고 골 재생 공간을 유지할 수 있어야 한다. 이러한 특성을 정량화하기 위하여 ASTM F2212에 따라 효소분해저항성(8 시간)을 측정할 수 있는 바, 본 구체예에서는 약 40 내지 80%, 구체적으로 약 50 내지 70%, 보다 구체적으로 약 55 내지 65% 범위일 수 있다. 효소분해 저항성이 지나치게 낮은 경우에는 골 재생이 충분하게 되지 않은 상태에서 멤브레인 부재의 분해에 의한 노출에 의하여 주변부에 감염에 의한 염증이 유발될 수 있는 반면, 효소분해 저항성이 지나치게 높은 경우에는 잔존해 있는 멤브레인 부재를 제거하기 위한 2차적인 제거가 필요하다. 따라서 전술한 범위 내의 값을 갖는 것이 바람직하다.

멤브레인 부재의 기계적 물성은 골재생 공간을 유지하기 위한 지지 기능 및 차폐막을 벤딩할 경우에 가해지는 외력(프레임 부재에 의한 인장력 등)에 의하여 멤브레인 부재가 찢어지거나 손상되는 현상을 억제하는데 중요한 기능을 제공한다. 상기의 점을 고려하여, 본 구체예에서는 멤브레인 부재가 일정 수준 이상의 인장강도 및 인장신장율을 갖는 것이 요구될 수 있는 바, 이러한 기계적 물성은 ASTM D638에 의하여 측정될 수 있다.

일 구체예에 있어서, 멤브레인 부재의 인장강도는 적어도 약 0.5 MPa, 구체적으로 약 0.5 내지 10 MPa, 보다 구체적으로 약 1 내지 5 MPa 범위일 수 있다. 또한, 인장 신장율은 적어도 약 5%, 구체적으로 약 10 내지 40%, 보다 구체적으로 약 15 내지 30% 범위일 수 있다. 이와 같이, 인장강도 및 인장 신장율은 적정 범위로 유지할 필요가 있는 바, 이는 차폐막으로서 적절한 강도 및 유연성을 가져야 하기 때문이다.

전술한 생화학적 및 기계적 물성은 상호 보완적 특성일뿐만 아니라, 상호 상반되는(conflicting) 특성에 해당되는 만큼, 이를 동시에 충족하는 것이 요구된다. 상기의 점을 고려하여, 본 개시 내용의 다른 구체예에서는 돼지 진피로부터 유래하는 콜라겐을 이용하여 차폐막을 제조하는 방법이 제공된다. 특히, 돼지 진피를 일련의 절차를 통하여 처리하면서 지지 기능을 제공하는 프레임 부재를 흡수성 멤브레인 부재 내에 혼입시켜 치과용 차폐막을 제조할 수 있다.

도 2는 치과용 차폐막을 제조하는 일련의 공정의 예를 도시하는 바, 크게 돼지 진피의 전처리 단계, 멤브레인 형상의 복합(적층) 구조물 형성 단계, 및 2단의 가교 단계를 포함한다.

돈피의 전처리 단계(선택적)

돈피에는 혈액을 비롯하여 각종 이물질이 함유되거나 붙어 있고, 각종 지방 성분 및 핵산 성분이 함유되어 있는 상태로 얻어진다. 따라서, 돼지 진피-유래 콜라겐을 이용한 차폐막의 제조에 앞서 1 또는 그 이상의 돈피 전처리 과정을 수행한다. 이하에서는 입수된 돈피의 전처리 과정의 예를 설명하며, 상기 예시된 전처리 단계 중 적어도 하나를 수행할 수 있다.

(i) 세척/지방층 제거 단계

일 구체예에 따르면, 이러한 전처리 과정의 일 예로서 입수된 돈피를 세척하고 지방층을 제거하는 단계를 수반할 수 있다. 돈피의 세척을 위하여, 먼저 염화나트륨 등을 첨가한 수용액 내에 침지시키고, 교반 하에서 또는 교반 없이 진탕 배양하는 단계를 거칠 수 있다. 이때, 첨가 성분의 농도는, 예를 들면 약 0.5 내지 2 M, 구체적으로 약 1 내지 1.7 M 범위일 수 있고, 예를 들면 약 30 내지 45℃, 구체적으로 약 35 내지 40℃의 온도 조건 하에서 진탕 배양할 수 있다. 또한, 진탕 배양 시간은, 예를 들면 약 50 내지 100 시간, 구체적으로 약 65 내지 80 시간 범위 내에서 조절할 수 있다.

이와 같이 진탕 배양 과정을 거친 후에는 물(구체적으로 탈이온수)로 1회 이상 세척하며, 경우에 따라서는 세척 전에 돈피 주변에 존재하는 지방 부위를 절단 수단(예를 들면, 가위 등)을 사용하여 제거할 수 있다. 이와 같이, 세척이 종료되면 돈피 아래에 존재하는 지방층(피하지방층)을 제거하는 것이 요구될 수 있는 바, 돈피를 동결시킨 다음, 지방층을 제거할 수 있다.

(ii) 탈지질 처리 단계

앞선 세척/지방층 제거 단계는 주로 물리적 처리를 수반하고 있어 여전히 돈피 내에 함유된 지방(지질) 성분이 잔류하고 있다. 따라서, 가급적 콜라겐 성분만을 함유한 상태가 되도록 탈지질 처리하는 것이 바람직할 수 있다. 이를 위하여, 탈지질 용액을 사용하여 화학적으로 잔여 지질을 제거하고, 더 나아가 돈피 내에 남아 있는 외부 바이러스(또는 1차 바이러스) 등을 비활성화 처리할 수 있다.

예시적으로, 탈지질 처리를 위하여 염기 성분(예를 들면, 수산화나트륨) 및 아세톤의 혼합 용액을 제조한 다음, 약 1 내지 10℃, 구체적으로 약 2 내지 5℃에서 약 1 내지 5 시간, 구체적으로 약 2 내지 4 시간에 걸쳐 진탕 배양할 수 있고, 경우에 따라서는 교반을 수반할 수 있다. 후속적으로, 에탄올(예를 들면, 농도 약 50% 이상, 구체적으로 약 70% 이상, 보다 구체적으로 약 90% 이상) 내에서 약 10 내지 20 시간, 구체적으로 약 15 내지 18 시간 동안 추가 처리하여 잔여 지질을 제거할 수 있다. 그 다음, 살균 성분, 예를 들면 과산화수소 등으로 처리하여 외부 바이러스의 비활성화시킬 수 있다.

상술한 처리 과정을 통하여 수득된 돼지 진피 내 지질 함량(조지방 함량)을, 예를 들면 약 0.005% 이하, 구체적으로 약 0.003% 이하, 보다 구체적으로 약 0.002% 이하로 저감시킨다.

(iii) 탈핵산 처리 단계

탈지질 단계가 완료된 후에도 돼지 진피에는 핵산 성분이 함유되어 있어 이를 바로 인체의 구강 점막 등과 접촉하는 차폐막 제조에 사용할 경우, 면역 반응 및 이식거부반응을 유발할 수 있다. 따라서, 돼지 진피 내 핵산 성분(예를 들면, DNA, RNA 등)을 제거하는 탈핵산 처리를 수행할 수 있다. 탈핵산 처리에 사용 가능한 처리 용액은 완충 용액일 수 있는 바, 예를 들면 Triton-X, Trizma 베이스(또는 Tris 베이스), SDS(sodium dodecyl sulphate) 등을 함유하는 완충 용액을 사용할 수 있다. 이와 같이 탈핵산화 처리가 완료되면, 소독수를 이용하여 중성화 세척을 수행할 수 있다.

(iv) 동결 건조 단계

전술한 탈핵산 처리를 거친 후에는 멤브레인 형상의 복합 구조물 형성 과정에 필요한 돼지 진피의 분쇄물을 용이하게 형성할 수 있도록 돼지 진피층에 대한 동결 건조 단계를 수행할 수 있다. 이때, 동결 건조는, 예를 들면 약 -90 내지 -50℃, 구체적으로 약 -85 내지 -60℃, 보다 구체적으로 약 -80 내지 -70℃의 온도 조건 하에서, 예를 들면 약 10 내지 50 시간, 구체적으로 약 15 내지 40 시간, 보다 구체적으로 약 20 내지 30 시간에 걸쳐 수행할 수 있다.

멤브레인 형상의 복합(적층) 구조물 형성 단계

일 구체예에 따르면, 돼지 진피층(구체적으로 앞서 전처리된 돼지 진피층)을 물(예를 들면, 탈이온수)과 함께 물리적으로 파쇄하여 돼지 진피 분쇄물의 슬러리(또는 현탁액)를 제조한다. 이때, 분쇄 과정에서는 당업계에 공지된 분쇄 수단, 예를 들면 믹서기, 호모게나이져, 냉동 분쇄기, 초음파 분쇄기, 핸드블랜더, 플런저 밀 등을 사용할 수 있지만 이에 한정되지 않는다.

상기 돼지 진피층의 분쇄물의 사이즈는 후술하는 감압 필터링 과정에서 사용되는 필터 망의 사이즈, 멤브레인 부재의 요구 물성 등을 고려하여 조절할 수 있는 바, 예시적으로 약 0.7 내지 2 ㎛, 구체적으로 약 0.8 내지 1.5 ㎛, 보다 구체적으로 약 0.9 내지 1.2 ㎛ 범위일 수 있으나, 이는 예시적 목적으로 기술되는 것으로 필터 망의 사이즈를 고려하여 적정 범위로 조절될 수 있을 것이다.

또한, 돼지 진피의 분쇄 과정에서 첨가되는 물의 량은, 멤브레인 형상으로 성형하는데 필요한 점도, 지지력 등을 확보할 수 있는 한, 특정 량으로 한정되는 것은 아니다. 예시적으로, 진피층 100 중량부에 대하여, 예를 들면 약 500 내지 1000 중량부, 구체적으로 약 550 내지 800 중량부, 보다 구체적으로 약 600 내지 700 중량부 범위 내에서 선택될 수 있다. 다만, 물의 첨가량이 지나치게 적거나 많은 경우에는 멤브레인 구조를 형성하기 곤란하기 때문에 전술한 범위 내에서 물의 첨가량을 조절하는 것이 유리할 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 제조된 돼지 진피 분쇄물의 슬러리를 감압 필터링을 통하여 멤브레인 형상의 구조물로 성형한다. 이러한 감압 필터링을 통한 멤브레인 형성 공정은 필터 망 위에 진피 분쇄물의 슬러리를 소정 량 붓고 필터 망 하측에서 감압을 걸어줌으로서 진피층 분쇄물이 필터 망에 밀착되고, 수분이 필터 망을 빠져 나감으로써 돼지 진피층 분쇄물로 이루어진 멤브레인 형상의 구조(제1 멤브레인 구조물)가 형성될 수 있다(제1 감압 필터링 단계). 이때, 필터 망은 당업계에서 알려진 스테인레스 스틸(예를 들면, SUS 시리즈), 셀룰로오스계(예를 들면, 셀룰로오스 아세테이트), 불소계(예를 들면, PTFE, PVDF 등), 규소계(예를 들면, 글라스), 설폰계(예를 들면, 폴리에테르 설폰), 폴리아라미드계 (예를 들면, par a-Aramid, Nylon 6, Nylon 6,6) 등의 재질일 수 있다.

감압 필터링 과정에서 가해지는 압력은, 예를 들면 약 600 Torr 이하, 보다 구체적으로 약 10 내지 500 Torr, 보다 구체적으로 약 200 내지 300 Torr 범위일 수 있다. 또한, 필터 망의 사이즈는, 예를 들면 약 0.2 내지 1 ㎛, 구체적으로 약 0.4 내지 0.8 ㎛, 보다 구체적으로 약 0.5 내지 0.7 ㎛ 범위일 수 있다. 다만, 돼지 진피층 분쇄물이 필터 망을 빠져 나가지 않도록 필터 망의 사이즈는 진피층 분쇄물의 사이즈에 비하여 적게 설정될 수 있다.

이와 같이 형성된 제1 멤브레인 구조물은 여전히 일정량의 수분을 함유하고 있어 점성을 나타내면서, 변형 가능한 상태에 있다. 따라서, 상기 제1 멤브레인 구조물 상에 프레임 부재를 배치(적층)함에 따라 프레임 부재의 하측 면의 적어도 일 부위가 제1 멤브레인 구조물과 밀착하는 한편, 프레임 부재의 상측 면은 외부로 노출되어 있다.

이후, 프레임 부재의 상측 면을 둘러싸기 위하여 앞서 제조된 돼지 진피 분쇄물의 슬러리(분산물)를 다시 제1 멤브레인 구조물 상에 붓고 감압 필터링(제2 감압 필터링 단계)에 의한 멤브레인 형상의 구조물을 형성한다(제2 멤브레인 구조물).

이와 같이, 제2 감압 필터링 단계가 수행되면, 제1 멤브레인 구조물과 제2 멤브레인 구조물 각각이 프레임 부재의 상측 면과 하측 면을 밀착하면서 둘러싸게 되어 복합 구조물을 형성한다.

상기와 같이 제1 멤브레인 구조물, 프레임 부재 및 제2 멤브레인 부재의 적층 구조(복합 구조물)은 여전히 수분을 함유하고 있는 만큼, 건조 과정을 거칠 수 있다. 예시적 구체예에 따르면, 상기 복합 구조물은 동결 건조 방식으로 건조될 수 있다. 동결 건조 시, 온도는, 예를 들면 약 -90 내지 -50℃, 구체적으로 약 -85 내지 -60℃, 보다 구체적으로 약 -80 내지 -70℃ 범위에서 설정될 수 있다. 이때, 복합 구조물의 건조(또는 동결 건조)는 감압 하에서 수행될 수 있는 바, 압력은 약 600 Torr 이하, 보다 구체적으로 약 1 내지 100 Torr, 보다 구체적으로 약 2 내지 10 Torr 범위일 수 있다.

선택적으로, 건조(또는 동결 건조)에 앞서 복합 구조물을 예비 동결할 수 있는 바, 예를 들면 약 -70 내지 -50℃, 보다 구체적으로 약 -65 내지 -55℃의 온도 조건 하에서 적어도 약 1 시간, 구체적으로 약 1 내지 3 시간 동안 유지할 수 있다.

상술한 감압 필터링에 의한 성형 단계 및 건조(동결 건조) 단계를 거친 후, 복합 구조물 내의 멤브레인 부재는 판상형의 콜라겐 층이 복수 층으로 적층된 형태를 갖게 된다.

2단 가교 단계

일 구체예에 따르면, 건조된 복합 구조물은 2단의 순차적 가교 단계를 통하여 콜라겐 층에 가교 구조(가교 네트워크)를 도입함으로써 필요한 골 재생 기간(예를 들면, 약 4 내지 8개월, 구체적으로 약 5 내지 7개월) 동안 분해 저항성을 개선할 수 있다. 구체적으로 가교 반응에 의하여 콜라겐 내 하이드록시기(-OH)의 량이 감소하는데, 예를 들면 가교 구조가 도입된 멤브레인 부재 내 콜라겐 성분의 총 아미노산 조성 중 히드록시프롤린(hydroxyproline; OH-Pro) 내 히드록시기(-OH)의 량이 가교되지 않은 경우(또는 가교 구조가 도입되기 전)에 비하여, 예를 들면 약 90% 이하, 구체적으로 약 50 내지 80%, 보다 구체적으로 약 60 내지 70% 수준일 수 있다.

본 구체예에 있어서, 중요한 특징 중 하나는 복수의 가교 반응, 구체적으로 열처리 가교 반응 및 화학적 가교 반응을 순차적으로 수행하는 점이다. 이와 같이, 물리적 가교-화학적 가교의 순으로 진행하는 이유는 감압필터링 후 동결건조된 복합 구조물의 경우 분쇄된 조직간의 결합력이 약하기 때문에 수화시 분쇄된 조직들이 쉽게 해리될 수 있다. 따라서, 열처리 가교를 통하여 복합 구조물의 물리적인 강도와 수화시 멤브레인 구조체의 형상을 유지시키기 위하여 열처리 가교 반응과 화학적 가교반응을 순차적으로 수행한다. 또한, 열처리 가교를 통하여 복합 구조물 내 다층 막의 구조가 더욱 치밀해지는 장점이 있다. 화학적 가교는 물리적 가교방법인 열처리가교보다 높은 가교도를 가지므로 분해저항성을 높여 이식 후 골형성 기간 동안 안정적인 차폐막의 역할을 수행할 수 있다.

예시적인 2단 가교 반응의 세부 사항은 하기와 같다.

(i) 열처리 가교 반응(탈수 가열 처리)

콜라겐의 열처리 가교 반응은 물리적 가교 반응의 일종으로서 콜라겐 내 수분을 제거함으로써 콜라겐의 수축 온도를 증가시키게 된다. 콜라겐으로부터 수분을 제거함으로써 콜라겐 내 사슬 간 가교 구조를 형성하는데, 콜라겐은, 예를 들면 약 80 내지 130℃(구체적으로 약 90 내지 125℃, 보다 구체적으로 약 100 내지 120℃)및 감압(구체적으로, 약 750 Torr 이하, 보다 구체적으로 진공) 조건 하에서, 예를 들면 약 12 내지 30 시간(구체적으로 약 15 내지 25 시간, 보다 구체적으로 약 18 내지 22 시간) 동안 건조된다. 열처리 가교 반응 메커니즘은 하기 반응식 1과 같다.

[반응식 1]

예시적 구체예에 있어서, 열처리 가교 반응에 의하여 가교도는, 예를 들면 약 5 내지 30%, 구체적으로 약 10 내지 25%, 보다 구체적으로 약 15 내지 20%로 증가된다.

(ii) 화학적 가교 반응

콜라겐의 화학적 가교 반응은 가교제의 사용을 수반할 수 있는 바, 통상적으로 2 관능성 화합물을 상이한 폴리펩티드 사슬 상의 리신 또는 하이드로리신 잔기의 아민기와 반응시키거나, 또는 글루탐산 및 아스파르트산 잔기의 카르복시기를 활성화한 후에 또 다른 폴리펩티드 사슬의 아민기와 반응시켜 아미드 결합을 형성함으로써 화학적 가교 반응을 수행할 수 있다. 예시적 구체예에 있어서, 글루타르알데히드, 에폭시 화합물, 카르보디이미드 화합물, 아실 아자이드 등을 사용할 수 있다. 특정 구체예에 따르면, 화학적 가교제로서 카르보디이미드 화합물을 사용할 수 있다. 수용성 카르보디이미드 화합물은 콜라겐 내 글루탐산 및 아스파르트산 모이티의 자유 카르복실기를 활성화시킬 수 있는 바, 카르보디이미드(예를 들면, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC))를 이용하여 카르복실기를 활성화함으로써 O-acylisourea 기를 형성한다. 이탈기(leaving group)로서 우레아를 갖는 (하이드록시)리신 잔기의 자유 아민기를 친핵성 공격에 의한 응축 반응을 통하여 아미드 가교결합을 형성한다. 이러한 화학적 가교 반응의 메커니즘은 하기 반응식 2와 같다.

[반응식 2]

예시적 구체예에 따르면, EDC 가교제는 용액 형태, 예를 들면 물 및 에탄올을 용매로 사용한 용액 형태로 사용할 수 있다. 이때, 용액 내 EDC 가교제의 농도는, 예를 들면 약 1 내지 5 mM, 구체적으로 약 2 내지 4 mM, 보다 구체적으로 약 2.5 내지 3.5 mM 범위일 수 있다. 상기 EDC 용액을 이용한 반응은 진탕 배양 방식으로, 예를 들면 약 1 내지 10℃, 구체적으로 약 3 내지 6℃에서, 예를 들면 약 15 내지 30시간, 구체적으로 약 20 내지 25 시간에 걸쳐 수행될 수 있다. 이때, 반응의 촉진을 위하여 교반을 수행하는 것이 유리할 수 있다. 상기 화학적 가교 반응의 경우, 전형적으로 앞선 열처리 가교 반응에 비하여 높은 가교도(예를 들면, 약 90%까지, 구체적으로 약 60 내지 80%)가 얻어질 수 있다.

전술한 2단 가교 반응이 완료되면, 가교된 복합 구조물 상에 잔류하는 가교제를 세정하는 단계를 선택적으로 수행할 수 있다. 예시적으로, 초음파 세척을 이용할 수 있는 바, 구체적으로 적어도 1회의 초음파 세척을 수행하고, 진탕 배양하여 복합 구조물에 잔류하는 가교제 성분을 제거할 수 있다.

이후, 인산염 완충 용액(Phosphate buffer saline; PBS)을 이용하여 중성화 처리할 수 있는 바, 그 이유는 체액과 유사한 조건에서의 삼투압 및 pH를 조절하기 위함이다. 이때, PBS의 pH는, 예를 들면 약 7 내지 8, 구체적으로 약 7.3 내지 7.5 범위로 조절할 수 있다. 이때, 중성화 처리는 전술한 세정 단계와 유사한 방식으로 초음파를 이용하여 적어도 1회에 걸쳐 수행할 수 있다.

후속적으로, 세정 및/또는 중성화 처리를 거친 복합 구조물을 다시 동결 건조 시켜 최종적으로 치과용 차폐막을 제조할 수 있다. 이때, 건조 조건은 앞서 기재된 범위 내에서 설정될 수 있고, 건조(또는 동결 건조)에 앞서 예비 동결 과정이 수반될 수도 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해 바람직한 실시예를 제시하지만, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

돈피의 정제 처리(전처리)

시장에서 구매한 돈피를 1.5M NaCl 수용액에 침지시켜 37℃ 및 150 rpm의 교반 조건 하에서 72시간 동안 진탕 배양시켰다. 이후, 돈피의 주변 지방부위를 제거한 후, 일정한 사이즈로 재단하여 탈이온수로 3회 세척하였다. 세척된 돈피를 -60℃에서 동결한 후 육절기를 이용하여 지방층을 제거하였다.

그 다음, 1.5M NaOH와 아세톤을 6:4(체적 기준)로 혼합한 탈지질 처리 용액을 제조하여, 이에 돈피를 투입하여 4℃ 및 150 rpm의 교반 조건 하에서 2시간 동안 진탕배양시킨 후에 99% 에탄올로 16시간 동안 진탕 배양하여 잔여 지질을 제거하였으며, 돼지 진피층을 분리하였다. 이후, 수득된 돼지 진피층의 탈색 및 이물질 제거, 그리고 1차 바이러스 비활성화를 위하여 12% 농도의 과산화수소를 첨가하고, 2시간에 걸쳐 4℃ 및 150 rpm 교반 하에서 진탕 배양하였다.

ISO 1444(1996, Meat and meat products-Determination of free fat contents) 및 속슬렛(Soxhlet) 추출법(시료 0.2g 이상, 100 mL 에테르, 8시간 추출(80℃))에 따라 상기 돼지 진피층에 대한 탈지질 평가를 수행하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

시료 번호	시료중량 (g)	시료 중량 합계 (g)	플라스크 중량 (g)	측정 후 플라스크 중량 (g)	조지방 함량 (%)
1	0.0905	0.2465	3회 측정 평균 135.8132g	4회 측정 135.8167g	0.002%
2	0.0729
3	0.0831
4	0.0623	0.2662	3회 측정 평균 129.4189g	4회 측정 평균 129.4209g	0.001%
5	0.0916
6	0.1123

상기 표에 나타낸 바와 같이, 탈지질 처리를 통하여 돼지 진피층 중 지질 성분이 실질적으로 제거되었음을 확인할 수 있다.

탈지질 처리된 돼지 진피층 내 잔여 핵산을 제거하기 위하여, 2000 mL의 증류수에 Tris 2.4g, EDTA 4g, Triton X100 2.34 mL 및 SDS 2.5g을 함유하는 탈핵산 용액을 제조하였으며, 제조된 탈핵산 용액 250 mL에 돼지 진피층을 넣고 150 rpm의 교반 조건 하에서 24시간 동안 진탕배양하였다.

탈핵산화 처리에 의한 핵산 성분의 감소 정도를 평가하기 위하여, H&E 염색(staining) 조직 슬라이스를 제조하여 탈핵산화 처리 전·후의 돼지 진피층을 광학 현미경(40배 및 100배)으로 관찰하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 상기 도면에 나타낸 바와 같이, 탈핵산 처리를 통하여 돼지 진피층 내 핵산 성분이 현저히 저감되었음을 확인할 수 있다.

상기 탈핵산화 처리가 완료된 돼지 진피층을 -84℃에서 예비 동결시켰으며, 이후 24시간 동안 동결 건조하였다.

멤브레인 형상의 복합 구조물의 제조

동결 건조된 돼지 진피층 20g을 비이커에 넣고 130 mL의 증류수를 투입하였고, 핸드믹서를 이용하여 2분 동안 돼지 진피층을 분쇄하여 진피층 분쇄물의 슬러리를 제조하였다. 뷰흐너와 2000 mL 여과 플라스크, 진공 펌프를 연결한 다음, 뷰흐너에 0.7 ㎛ 디스크 필터를 넣고 증류수를 흘려주어 뷰흐너 및 필터가 서로 밀착되도록 하였으며, 진공 펌프를 작동시켰다.

뷰흐너에 앞서 제조된 돼지 진피층의 분쇄물 슬러리 100 mL를 넣고 4시간에 걸쳐 제1 감압 필터링하였으며(460 Torr), 핀셋을 이용하여 상기 형성된 제1 멤브레인 부재 위에 도 1c에 도시된 티타늄 부재(전체 폭 11 mm, 길이 20 mm. 다리 폭 0.9 mm 및 두께 0.35 mm)를 배치하였다. 그 다음, 나머지 돼지 진피층의 분쇄물 슬러리를 넣고 제1 감압 필터링에서와 동일한 조건 하에서 16시간 동안 제2 감압 필터링하였다. 2단계 감압 필터링 완료 후에 얻어진 복합 구조물을 핀셋을 이용하여 분리하고, 동결 건조기에 넣고 -60 ℃에서 1 시간 동안 예비 동결시켰다. 이후, 예비 동결된 복합 구조물을 상부 선반에 배치하고, 상부 선반으로 연결되는 진공 밸브를 개방하여 진공 상태가 유지되는지 여부를 확인한 다음, -84℃ 및 5 Torr 조건 하에서 24시간 동안 동결 건조시켰다.

상술한 2단계 감압 필터링(적층)을 거쳐 동결 건조된 멤브레인 형상의 복합 구조물 중 멤브레인 부재의 단면에 대한 주사전자현미경(SEM) 사진을 도 4에 나타내었다. 상기 도면으로부터, 2단계 감압 필터링 및 동결 건조를 거치면서 판상형의 복수 콜라겐 층이 긴밀하게 서로 접촉하면서 적층 구조를 형성하고 있음을 확인하였다.

2단 가교(물리적 가교-화학적 가교) 단계

동결 건조된 멤브레인 형상의 복합 구조물을 꺼내어 핀셋을 이용하여 진공 오븐 내로 이동시킨 후에 진공 밸브를 개방하고 외부 공기 유입구를 폐쇄시킨 후에 18시간 동안 진공 오븐(110℃) 내에서 열처리 가교, 즉 탈수가열(DHT) 가교를 수행하였다. 열처리 가교 완료 후 온도를 낮추고 진공 상태를 해제하였다.

그 다음, 2.5 mM EDC 가교 용액(물 : 에탄올(99%)= 1 : 1) 600 mL에 열처리 가교된 복합 구조물을 넣고, 4℃ 및 150 rpm 조건 하에서 16시간 동안 진탕배양시켰다. 진탕배양에 의한 화학적 가교 반응이 종료되면, 가교 용액을 제거하고 증류수 2000 mL를 넣은 후에 5분 간격으로 초음파 세척을 3회 실시하였다.

이후, 세척된 복합 구조물을 PBS(pH 7.4) 내에서 교반 조건 하에서 24시간 동안 중성화 처리하였다. 중성화 처리 용액을 버리고 증류수로 가교된 복합 구조물을 세척하고, -60℃에서 1 시간 동안 예비동결시켰다. 그 다음, -86℃ 및 5 Torr 조건 하에서 24 시간동안 동결 건조시켜 차폐막을 수득하였다.

실시예 2

차폐막의 성능 테스트

수득된 차폐막으로부터 멤브레인 부재를 분리하여 하기와 같이 성능 테스트를 수행하였다.

(1) 세포 독성 평가 테스트

가. 사용 물질

- 세포주: L929 cell (CCL-1, ATCC, USA)

- 양성대조군: 0.1%의 아연 디에틸디티오카바메이트(ZDEC)를 함유하는 폴리우레탄 필름(RM-A, Hatano Research Institute, Japan)

- 음성대조군: 고밀도 폴리에틸렌 필름(RM-C, Hatano Research Institute, Japan)

나. 절차

(i) 검액 제조: 시료 당 2 mL의 비율로 10% FBS(fetal bovine serum)가 첨가되지 않은 알파-MEM 배양액에 넣고 48시간 동안 용출하였다.

(ii) 배양 대조액 제조: 테스트 물질을 포함하지 않은 상태로 10% FBS가 첨가되지 않은 알파-MEM 배양액에 넣고 48시간 동안 용출하였다

(iii) 음성대조액 제조: 음성 대조 성분인 고밀도 폴리에틸렌 필름을 6 ㎠/mL의 비율로 10% FBS가 첨가되지 않은 알파-MEM 배양액에 넣고 48시간 동안 용출하였다.

(iv) 양성대조액 제조: ZDEC 폴리우레탄 필름을 0.1g/mL의 비율로 10% FBS가 첨가되지 않은 알파-MEM 배양액이 담긴 15 mL 튜브에 넣고 37℃에서 48시간 동안 용출하였다.

다. 평가방법 및 기준

(i) ISO 10993-5와 의료기기의 생물학적 안전에 관한 공통기준규격(식품의약품안전청고시 제2006-3호)에 의거하여 시험 및 평가를 수행하였다.

(ii) 평가 방법: 세포를 현미경으로 관찰하여 형태 변화에 따라 판단하였는 바, 살아있는 세포는 긴 가지 형상으로 바닥에 붙어있는 반면, 죽은 세포는 모양이 둥글고 배양액에 떠있으며 세포막이 파괴되어 세포핵 및 세포질을 구별할 수 없었다.

(iii) 다음날, 플레이트 바닥 면적의 80% 정도까지 세포가 증식하면 플레이트에서 배양액을 걷어내었고, 검액 및 대조액을 넣고 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다.

(iv) 24시간이 경과한 후, 양성대조 및 음성대조가 정확할 때, 세포를 현미경으로 관찰하고 측정하여 검액에 나타난 반응이 1등급 이하이면 세포독성이 없는 것으로 판정하였다. 세부 판단 기준은 하기 표 2와 같다.

상술한 세포 독성 평가 결과(배양액 대조군, 음성 대조군, 양성 대조군 및 시료)를 도 5에 나타내었다.

상기 도면에 따르면, 본 실시예에서 수득된 차폐막의 멤브레인 부재의 경우, 긴 가지 형상의 살아있는 다수의 세포가 바닥에 붙어있었다. 이는 상기 멤브레인 부재가 실질적으로 세포 독성을 갖고 있지 않음을 의미한다. 반면, 배양액 대조군 및 음성 대조군의 경우, 살아있는 세포에 대한 죽은 세포의 비율이 높았으며, 특히 양성 대조군에서는 죽은 세포의 비율이 현저히 높았다.

(2) 생화학적 및 기계적 물성 테스트

실시예 1에서 수득된 차폐막의 멤브레인 부재를 시판 중인 5종의 콜라겐 멤브레인(비교예)과 생화학적 및 기계적 물성과 관련하여 비교 실험을 수행하였다. 그 결과를 하기 표 3, 그리고 도 6 및 도 7에 나타내었다.

시험 방법			실시예 1	비교예 1 내지 5
시편 정보		가교방법	2단 가교 (DHT/EDC)	화학가교 (EDC/NHS)	열처리 가교		비가교	비가교
		분해기간	6개월 이상	6개월 이상	3~5개월		3~4개월	3~5개월
No.	시험 평가 항목	원자재	돈피	소 힘줄	돈피			소 심막
1	두께 (mm)	-	0.50	0.45	0.24	0.48	-	0.45
2	밀도 (g/cm3)	-	0.51	0.34	0.66	0.08	-	0.26
3	흡수도 (%)	ISO 13726-1	165.1	169	567	1689.04	-	-
4	효소분해저항성 (%) (Collagenase 50U, 8h)	ASTM F2212	82.73 (10h) 67.79 (8h)	43.05 (10h)	8.00 (8h)	-	0.00 (8h)	6.00 (8h)
5	인장강도 (MPa)	ASTM D638	5.63	3.27	4.69	0.74	-	-
6	인장신장율 (%)		33.12	14.4	14.8	14.1	-	-

상기 표 및 도면에 따르면, 실시예 1에 따라 제조된 차폐막의 멤브레인 부재는 복수의 평가지표에 걸쳐 모두 양호한 특성을 갖는다.

화학 가교만을 수행한 비교예 1의 경우, 흡수도에서는 실시예 1과 유사한 값을 나타내었으나, 인장강도 및 인장신장율 면에서는 실시예 1에 비하여 현저히 낮은 수준이었다. 또한, 열처리 가교를 거친 비교예 2 및 3의 경우, 흡수도, 효소분해저항성, 인장 강도 및 인장신장율에 있어서 실시예 1에 비하여 낮은 물성을 나타내었다.

이외에도, 가교 반응을 수반하지 않은 비교예 4 및 5의 경우, 모든 평가지표 면에서 실시예 1에 비하여 열악한 물성을 나타내었다.

(3) 멤브레인 부재 내 히드록시기 함량 평가

2단 가교 단계를 거친 실시예 1과 가교 단계를 거치지 않은 비교예 4에 있어서 아미노산 조성을 측정하였다. 구체적으로, PITC 라벨링된 시료를 400 uL의 완충용액에 용해시키고 10 배 희석한 후, 이중 10 uL를 취하여 HPLC 에 로딩하는 방식으로 측정하였다. 이때, 사용된 분석기기는 하기와 같다.

- 시스템: Waters 510 HPLC 펌프 2대, Waters 구배(Gradient) 컨트롤러 및 Waters 717 자동 샘플러

- 컬럼: Waters Pico-tag 컬럼(3.9 ㅧ 300 mm, 4 mm)

- 검출기(Detector): Waters 2487 UV 검출기(254 nm)

- 데이터 분석: empower 2 software

분석 결과, 실시예 1의 OH-Pro 함량은 1054.276 pmol인 반면, 비교예 4의 OH-Pro 함량은 1186.949 pmol이었다. 이처럼, 실시예 1은 멤브레인 부재를 구성하는 콜라겐 단백질 내 -OH기의 함량이 비교예 4에 비하여 낮은 수준인 바, 이는 구강 내 환경에서 분해저항성이 높음을 지시한다.

(4) 가교 밀도의 평가

열처리 가교 및 화학적 가교 각각을 거친 후의 가교 밀도를 확인하기 위하여 닌하이드린(nynhydrin)분석 방법으로 가교된 콜라겐들의 가교도를 확인하였다. 먼저 닌하이드린 용액을 하기와 같이 준비하였다:

닌하이드린(0.5g) 및 프록토스(0.3g)을 100 mL 요오드산칼륨(Potossium iodate) 용액을 제조한 후, 여기에 200 mL의 95%(v/v) 에탄올을 첨가하여 500 ml의 용액을 제조하였다. 4 mL의 포스페이트-버퍼 살린PBS, pH=6.8) 내의 약 1 mg의 시료 및 닌하이드린 용액 1 mL를 25 mL 표준 비색관(Colorimetric Tube)에 넣고, 열탕 수조로 20분 동안 가열한 다음, 차가운 물 수조 내에서 냉각시켰다. 이후 5 mL의 요오드산칼륨 용액을 상기 표준 비색관에 첨가하고 추가적으로 탈이온수를 보충하여 25mL의 용액을 유지하였다. 상기 용액의 흡광도를 568 nm에서 분광도계(Mecasys, Optizen-α, UV/vis Spectrophotometer)로 측정하였다. 기준으로는 글리신(0, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 2, 4 및 6 mg/L)을 이용하였다.

가교 밀도는 하기의 수학식으로 결정하였다:

[수학식 1]

(가교 밀도(%)=(NH₂(전)-NH₂(후)/NH₂(전)×100).

이와 같이, 열처리 가교 반응에 의하여 가교도는 약 17% 수준으로 증가되었고, 화학적 가교에 의하여 가교도는 약 80%까지 증가하였다.

본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 모두 본 발명의 영역에 속하는 것으로, 본 발명의 구체적인 보호범위는 첨부된 특허청구범위에 의하여 명확해질 것이다.

Claims (22)

1. 소정 패턴 형상을 갖도록 구성된 흡수성 또는 비흡수성 프레임 부재;
   상기 프레임 부재의 상측 면 및 하측 면에 밀착하면서 둘러싸는 멤브레인 부재;
   를 포함하는 치과용 차폐막으로서,
   상기 멤브레인 부재는 판상형의 복수 콜라겐 층의 적층 구조를 갖고, 하기의 물성을 충족하는 치과용 차폐막:
   (i) 적어도 0.4 g/㎤의 밀도,
   (ii) ISO 13726-1에 따라 측정되는 흡수도가 100 내지 2,000%,
   (iii) ASTM F2212에 따라 측정되는 효소분해저항성(8h)이 40 내지 80%, 그리고
   (iv) ASTM D638에 따라 측정되는 인장강도 및 인장신장율 각각이 적어도 0.5 MPa 및 적어도 5%임.
2. 제1항에 있어서, 상기 복수 콜라겐 층은 가교된 콜라겐 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 치과용 차폐막.
3. 제1항에 있어서, 상기 차폐막은 프레임 부재의 벤딩에 의한 3차원적 구조에 의하여 골재생 공간을 형성하는 것을 특징으로 하는 치과용 차폐막.
4. 제1항에 있어서, 상기 차폐막은 2차원적 구조에 의하여 골재생 공간을 형성하는 것을 특징으로 하는 치과용 차폐막.
5. 제1항에 있어서, 상기 프레임 부재는 티타늄 또는 티타늄 합금 재질인 것을 특징으로 하는 치과용 차폐막.
6. 제1항에 있어서, 상기 프레임 부재는 결손된 치조골의 상부에 위치하게 되는 환형부 및 상기 결손된 치조골의 측부 또는 그 일부가 상부에 위치하는 다리부를 구비하는 것을 특징으로 하는 치과용 차폐막.
7. 제1항에 있어서, 상기 판상형의 복수 콜라겐 층 각각의 두께는 1 내지 50 ㎛ 범위인 것을 특징으로 하는 치과용 차폐막.
8. 제2항에 있어서, 상기 가교 구조를 갖는 복수 콜라겐 층의 총 아미노산 조성 중 히드록시프롤린(hydroxyproline) 내 히드록시기(-OH)의 량이 가교되지 않은 경우에 비하여 90% 이하인 것을 특징으로 하는 치과용 차폐막.
9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 차폐막의 두께는 0.4 내지 1.5 mm 범위인 것을 특징으로 하는 치과용 차폐막.
10. (I) 돼지 진피로부터 유래된 콜라겐-함유 진피층을 물과 함께 분쇄 처리하는 단계;
    (II) 상기 진피층 분쇄물을 감압 필터링에 의하여 성형하여 제1 멤브레인 구조물을 형성하는 단계;
    (III) 상기 제1 멤브레인 구조물 상에 소정 패턴 형상을 갖도록 구성된 흡수성 또는 비흡수성 프레임 부재를 부착하는 단계;
    (IV) 상기 프레임 부재가 부착된 제1 멤브레인 구조물 상에 상기 단계 (I)에서 얻어진 진피층 분쇄물을 첨가하고 감압필터링에 의하여 형성되는 제2 멤브레인 구조물이 상기 제1 멤브레인 구조물과 함께 상기 프레임 부재를 밀착하면서 둘러싸는 복합 구조물을 형성하는 단계;
    (V) 상기 복합 구조물에 대하여 물리적 가교 및 화학적 가교로 이루어지는 2중 가교를 수행하는 단계;
    를 포함하고,
    상기 제1 및 제2 멤브레인 구조물 각각은 판상형의 복수 콜라겐 층의 적층 구조를 갖는 치과용 차폐막의 제조방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 단계 (IV)와 상기 단계 (V) 사이에 상기 복합 구조물을 동결 건조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 치과용 차폐막의 제조방법.
12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 단계 (I)에 앞서 돈피를 탈지질 처리하여 돼지 진피를 얻는 단계; 및
    상기 돼지 진피를 탈핵산화 처리하는 단계;
    를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 치과용 차폐막의 제조방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 탈핵산화 처리된 돼지 진피를 동결 건조시킨 다음, 상기 단계 (I)을 수행하는 것을 특징으로 하는 치과용 차폐막의 제조방법.
14. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 진피층 분쇄물의 입자 사이즈는 0.7 내지 2 ㎛ 범위인 것을 특징으로 하는 치과용 차폐막의 제조방법.
15. 제10항에 있어서, 상기 단계 (I)에서 물의 량은 상기 진피층 100 중량부에 대하여 500 내지 1000 중량부 범위인 것을 특징으로 하는 치과용 차폐막의 제조방법.
16. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 감압 필터링을 위하여 가해지는 압력은 600 Torr 이하인 것을 특징으로 하는 치과용 차폐막의 제조방법.
17. 제11항에 있어서, 상기 복합 구조물을 동결 건조하는 단계는 -90 내지 -50℃ 범위의 온도 및 600 Torr 이하의 압력 조건 하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 치과용 차폐막의 제조방법.
18. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 물리적 가교는 열처리 가교로서 80 내지 130℃ 및 감압 조건 하에서 12 내지 30 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 치과용 차폐막의 제조방법.
19. 제18항에 있어서, 상기 열처리 가교 반응에 의하여 가교도가 5 내지 30%로 증가하는 것을 특징으로 하는 치과용 차폐막의 제조방법.
20. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 화학적 가교는 카르보디이미드 화합물을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 치과용 차폐막의 제조방법.
21. 제20항에 있어서, 항기 화학적 가교 반응에 의하여 가교도가 90%까지 증가하는 것을 특징으로 하는 치과용 차폐막의 제조방법.
22. 제10항에 있어서, 상기 제1 및 제2 멤브레인 구조물 각각은 하기의 물성을 갖는 것을 특징으로 하는 치과용 차폐막의 제조방법:
    (i) 적어도 0.4 g/㎤의 밀도,
    (ii) ISO 13726-1에 따라 측정되는 흡수도가 100 내지 2,000%,
    (iii) ASTM F2212에 따라 측정되는 효소분해저항성(8h)이 40 내지 80%, 그리고
    (iv) ASTM D638에 따라 측정되는 인장강도 및 인장신장율 각각이 적어도 0.5 MPa 및 적어도 5%임.

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