CN1786034A - 猪苓多糖硫酸酯的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种多糖硫酸酯的制备方法。猪苓多糖硫酸酯的制备方法，其特征是：包括如下步骤：1).制备酯化试剂；2).按猪苓多糖粉末∶无水甲酰胺或二甲基甲酰胺的质量比＝0.4－2.0∶36－48选取，将猪苓多糖粉末悬浮于无水甲酰胺或二甲基甲酰胺中，得猪苓多糖悬浮液；3).进行酯化反应：按酯化试剂∶猪苓多糖悬浮液中的无水甲酰胺或二甲基甲酰胺的体积比＝27.5－75∶40选取酯化试剂，将猪苓多糖悬浮液缓慢加入酯化试剂中，于100℃的水浴下搅拌反应2－4小时，冷至室温，加冰水，用NaOH中和到pH值为6－8；4).沉淀：用无水乙醇沉淀，收集沉淀物；5).纯化；6).再沉淀，对沉淀物冷冻干燥，得猪苓多糖硫酸酯。本发明得到的猪苓多糖硫酸酯具有生物活性强的特点。

Description

猪苓多糖硫酸酯的制备方法

技术领域

本发明涉及一种主要用于抗乙型肝炎病毒(HBV)活性的多糖硫酸酯的制备方法，具体涉及的是对猪苓中的活性成分——水溶性猪苓多糖进行硫酸酯化修饰制备猪苓多糖硫酸酯的方法。

背景技术

乙肝是一个严重的影响公众健康问题，具有传染性强，流行面广和发病率高的特点，本病是目前已知七型肝炎中危害最大的一种。此种感染最终可发展为肝硬化、肝癌，是当前WTO公布的人类疾病死亡原因中居第9位的疾病。目前世界上有3亿多人感染慢性乙型肝炎病毒，而我国近两年据粗略估计，约有1.3亿人是慢性乙型肝炎病毒感染者，其中有2000-3000万左右患者需要抗病毒治疗。对HBV的治疗，尚没有一种特效的药物能够达到满意的治疗效果，寻找有效的抗HBV药物是当务之急。核普类似物在抗HBV方面显示了其良好的治疗作用，但由于其停药后复发率高，对HBeAg作用不明显，使其临床应用受到了极大的限制。而从中草药中可分离有效成分作为先导化合物并进行结构改造得到新型高效低毒的抗肝炎药物且具有众多优点，目前已有不少用于治疗乙型肝炎的临床观察。当前常用于治疗病毒性乙型肝炎的中药有：苦参素、白花蛇舌草、猪苓多糖、香菇多糖、冬虫夏草等等。中药作为干扰素、拉米夫定等抗病毒药物的辅助治疗，对提高疗效、减轻副作用早已有许多报道。

多糖是一种良好的中药活性成分，多糖在医药上还是一种很好的佐剂。能提高机体的免疫功能，具有防衰老、防癌、抗癌、抗肝炎等作用。猪苓多糖具有抗肿瘤和抗肝炎的生物活性，临床上已用于癌症辅助治疗以及用以治疗肝炎。

自1987年发现硫酸酯化葡聚糖可抑制艾滋病病毒(HIV)的活性以来，人们对硫酸酯化多糖(SPS)或称多糖硫酸酯(PSS)产生了极大的兴趣。有些本身不表现抗病毒活性的多糖，经人工化学修饰得到的硫酸酯化多糖也具有抗病毒活性，这类人工合成的硫酸酯化多糖包括：硫酸化右旋糖酐；硫酸化香菇多糖；硫酸化木聚糖。目前国内外尚无文献报道有关猪苓多糖硫酸酯的合成与及其对猪苓多糖生物活性影响的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生物活性强的猪苓多糖硫酸酯的制备方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：猪苓多糖硫酸酯的制备方法，其特征是：包括如下步骤：

1).制备酯化试剂：按吡啶∶氯磺酸的体积份数比＝10∶1-3选取吡啶和氯磺酸，将附有冷凝装置和搅拌装置的容器置于盐水-冰浴中加入吡啶，搅拌下缓慢加入氯磺酸，继续搅拌20-40分钟，得酯化试剂，密封后置冰箱中备用；

2).猪苓多糖悬浮液的制备：按猪苓多糖粉末∶无水甲酰胺或二甲基甲酰胺的质量比＝(0.4-2.0)∶(36-48)选取猪苓多糖粉末，无水甲酰胺或二甲基甲酰胺，将猪苓多糖粉末悬浮于无水甲酰胺或二甲基甲酰胺中，得猪苓多糖悬浮液；

3).进行酯化反应：按酯化试剂∶猪苓多糖悬浮液中的无水甲酰胺或二甲基甲酰胺的体积比＝27.5-75∶40选取酯化试剂，将猪苓多糖悬浮液缓慢加入酯化试剂中，于100℃的水浴下搅拌反应2-4小时，冷至室温，加反应液体积的0.3-0.5倍的冰水，用浓度为2.0-3.0mol/L NaOH中和到PH值为6-8；

4).沉淀：中和后加入无水乙醇使无水乙醇的体积浓度为75-80％，搅拌析出沉淀，液固离心分离，收集沉淀物A；

5).纯化：将沉淀物A溶于水，流水透析48-72小时，蒸馏水透析22-26小时，得到除去小分子杂质后的水溶液B；

6).对水溶液B采用无水乙醇沉淀：水溶液B中加入无水乙醇使无水乙醇的体积浓度为75-80％，搅拌析出沉淀，静置12-24小时，液固离心分离，收集沉淀物C，对沉淀物C冷冻干燥，得猪苓多糖硫酸酯。

由图1-3可知，通过猪苓多糖硫酸酯和猪苓多糖的红外光谱对照分析表明，猪苓多糖硫酸酯除了多糖母体特征吸收峰得以保留外，还增加了1240cm^-1左右的吸收，表明为OSO₃ ^-的S＝O伸缩振动，810cm^-1左右的吸收表明为C-O-S的拉伸振动，这些是硫酸键的特征吸收峰；同时，还可以看出猪苓多糖硫酸酯在3400cm^-1附近的羟基吸收峰有所降低，表明部分羟基已被酯化，以上充分说明猪苓多糖已形成猪苓多糖硫酸酯。

本发明对猪苓多糖进行硫酸酯化后，显著增强其生物活性，产生了原多糖所不具有的生物活性。研究表明猪苓多糖硫酸酯具有可以减轻肝组织的病理损伤，促进肝细胞再生和肝功能恢复，还可以促进乙型肝炎表现抗体的产生。另外还能刺激机体的免疫细胞，释放淋巴因子，提高机体的体液免疫及细胞免疫，具有抗肿瘤的作用，与化疗药物合用具有增效减毒的作用。本发明得到的猪苓多糖硫酸酯能增强治疗乙型肝炎疗效而减小毒副作用，能更好的用于乙型肝炎及化疗的辅助治疗。

附图说明

图1为猪苓多糖的红外光谱图

图2为猪苓多糖硫酸酯的红外光谱图

图3为猪苓多糖与猪苓多糖硫酸酯的红外光谱对照图

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实例1：

1.仪器：

不锈钢锅、电炉、玻璃棒、烧杯(1000ml)、量筒(1000ml)、分析天平、纽力天平、锥形瓶、温度计、透析袋、移液管(10ml，5ml)、三颈烧瓶、球形冷凝管、分液漏斗、滴液漏斗、搅拌器、TDL-5台式离心机(上海安亭科学仪器厂)、RE-52AA型旋转蒸发仪(上海嘉朋科技有限公司)、KQ-100B型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)、766-2型远红外快速干燥箱(沪粤科学仪器厂)、SZ-93自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)、WQF-200傅立叶变换红外光谱仪(北京第二光学仪器厂)。

2.试剂：

吡啶、氯磺酸、无水乙醇、2.5mol·L^-1NaOH(以上试剂均为分析纯)

3.猪苓多糖的鉴定：

α-萘酚-浓硫酸反应(Molisch反应)于猪苓多糖的水解溶液中加入10％α-萘酚乙醇溶液混合后，沿着器壁滴加浓硫酸，使酸层集于下层。多糖类在此条件下水解产生单糖，则于两液层交界处呈现紫色环，推测该反应的机制可能是由于糖先转变为糖醛或其衍生物，在与醛缩合并经氧化而产生有色物质。

本实验鉴定了猪苓中提取的多糖成分。呈正反应。

4.猪苓多糖硫酸酯的制备：

氯磺酸-吡啶法：将附有冷凝管和搅拌装置的三颈烧瓶置盐水-冰浴中，加入吡啶25ml，搅拌，使之充分冷却，用滴液漏斗慢慢加入氯磺酸2.5ml，约30-40min滴加完毕，烧瓶中出现大量淡黄色固体，得酯化试剂；将多糖粉末0.4g悬浮于二甲基甲酰胺40ml，得猪苓多糖悬浮液；缓慢地将猪苓多糖悬浮液加入到酯化试剂中，迅速将三颈烧瓶移入沸水浴中，恒温搅拌1.8-2.2小时，冷至室温，将反应液倾入反应液0.3-0.5倍的冰水中，用浓度为2.5mol/L NaOH中和到PH值为6-8；中和后加入无水乙醇使无水乙醇的体积浓度为75-80％，搅拌析出沉淀，液固离心分离，收集沉淀物A；将沉淀物A溶于水，透析48h，蒸馏水透析24h，得到除去小分子杂质后的水溶液B；对水溶液B再次采用无水乙醇沉淀：水溶液B中加入无水乙醇使无水乙醇的体积浓度为75-80％，搅拌析出沉淀，静置12-24小时，液固离心分离，收集沉淀物C，对沉淀物C冷冻干燥；得猪苓多糖硫酸酯。

5.猪苓多糖硫酸酯的红外光谱分析：

将猪苓多糖与猪苓多糖硫酸酯粉末用溴化钾压片后，运用WQF-200傅立叶变换红外光谱仪进行红外分析。

6.分析：

通过猪苓多糖硫酸酯和猪苓多糖的红外光谱对照分析(图3)表明，猪苓多糖硫酸酯除了多糖母体特征吸收峰得以保留外，还增加了1240cm^-1左右的吸收，表明为OSO₃ ^-的S＝O伸缩振动，810cm^-1左右的吸收表明为C-O-S的拉伸振动，这些是硫酸键的特征吸收峰；同时，还可以看出猪苓多糖硫酸酯在3400cm^-1附近的羟基吸收峰有所降低，表明部分羟基已被酯化，以上充分说明猪苓多糖已形成猪苓多糖硫酸酯。猪苓多糖经过硫酸酯化化学修饰后能显著增强其生物活性，或产生原多糖所不具有的生物活性。

实例2：

将附有冷凝管和搅拌装置的三颈烧瓶置于盐水-冰浴中，加入吡啶40ml，剧烈搅拌，使之充分冷却，用滴液漏斗慢慢加入氯磺酸5ml，30min滴加完毕，烧瓶中出现大量淡黄色固体，得酯化试剂；将猪苓多糖粉末0.5g悬浮于无水甲酰胺40ml，得猪苓多糖悬浮液；缓慢地将猪苓多糖悬浮液加入到酯化试剂中，迅速将三颈瓶移入沸水浴中(100℃)，恒温搅拌1.8-2.2小时，冷至室温，将反应液倾入反应液0.3-0.5倍的冰水中，用浓度为2.5mol/L NaOH中和到PH值为6-8；中和后加入无水乙醇使无水乙醇的体积浓度为75-80％，搅拌析出沉淀，液固离心分离，收集沉淀物A；将沉淀物A溶于水，透析48h，蒸馏水透析24h，得到除去小分子杂质后的水溶液B；对水溶液B再次采用无水乙醇沉淀：水溶液B中加入无水乙醇使无水乙醇的体积浓度为75-80％，搅拌析出沉淀，静置12-24小时，液固离心分离，收集沉淀物C，对沉淀物C冷冻干燥；得猪苓多糖硫酸酯。

实例3：

将附有冷凝管和搅拌装置于的三颈烧瓶置冰盐浴中，加入吡啶60ml，剧烈搅拌，使之充分冷却，用滴液漏斗慢慢加入氯磺酸15ml，40min滴加完毕，烧瓶中出现大量淡黄色固体，得酯化试剂；将猪苓多糖粉末2.0g悬浮于无水甲酰胺40ml，得猪苓多糖悬浮液；缓慢地将猪苓多糖悬浮液加入到酯化试剂中，迅速将三颈瓶移入沸水浴中(100℃)，恒温搅拌2.8-3.2小时，冷至室温，将反应液倾入反应液0.3-0.5倍的冰水中，用浓度为2.5mol/L NaOH中和到PH值为6-8；中和后加入无水乙醇使无水乙醇的体积浓度为75-80％，搅拌析出沉淀，液固离心分离，收集沉淀物A；将沉淀物A溶于水，透析48h，蒸馏水透析24h，得到除去小分子杂质后的水溶液B；对水溶液B再次采用无水乙醇沉淀：水溶液B中加入无水乙醇使无水乙醇的体积浓度为75-80％，搅拌析出沉淀，静置12-24小时，液固离心分离，收集沉淀物C，对沉淀物C冷冻干燥；得猪苓多糖硫酸酯。

本发明的吡啶、氯磺酸、猪苓多糖粉末、无水甲酰胺或二甲基甲酰胺各原料的上限、下限及区间值都能实现本发明，在此就不一一举例。

Claims (1)

1.猪苓多糖硫酸酯的制备方法，其特征是：包括如下步骤：

1).制备酯化试剂：按吡啶∶氯磺酸的体积份数比＝10∶1-3选取吡啶和氯磺酸，将附有冷凝装置和搅拌装置的容器置于盐水-冰浴中加入吡啶，搅拌下缓慢加入氯磺酸，继续搅拌20-40分钟，得酯化试剂，密封后置冰箱中备用；

2).猪苓多糖悬浮液的制备：按猪苓多糖粉末∶无水甲酰胺或二甲基甲酰胺的质量比＝0.4-2.0∶36-48选取猪苓多糖粉末，无水甲酰胺或二甲基甲酰胺，将猪苓多糖粉末悬浮于无水甲酰胺或二甲基甲酰胺中，得猪苓多糖悬浮液；

3).进行酯化反应：按酯化试剂∶猪苓多糖悬浮液中的无水甲酰胺或二甲基甲酰胺的体积比＝27.5-75∶40选取酯化试剂，将猪苓多糖悬浮液缓慢加入酯化试剂中，于100℃的水浴下搅拌反应2-4小时，冷至室温，加反应液体积的0.3-0.5倍的冰水，用浓度为2.0-3.0mol/L NaOH中和到PH值为6-8；

4).沉淀：中和后加入无水乙醇使无水乙醇的体积浓度为75-80％，搅拌析出沉淀，液固离心分离，收集沉淀物A；

5).纯化：将沉淀物A溶于水，流水透析48-72小时，蒸馏水透析22-26小时，得到除去小分子杂质后的水溶液B；

6).对水溶液B采用无水乙醇沉淀：水溶液B中加入无水乙醇使无水乙醇的体积浓度为75-80％，搅拌析出沉淀，静置12-24小时，液固离心分离，收集沉淀物C，对沉淀物C冷冻干燥，得猪苓多糖硫酸酯。

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