CN1742018A

CN1742018A - 抗病毒的核苷衍生物

Info

Publication number: CN1742018A
Application number: CNA200380107974XA
Authority: CN
Inventors: R·T·亨德里克斯; E·R·汉弗莱斯; J·A·马丁; A·普林斯; K·萨尔马
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2002-12-10
Filing date: 2003-12-02
Publication date: 2006-03-01
Also published as: US20040121969A1; TW200417372A; AR042335A1; EP1572710A2; PA8590801A1; CA2508656A1; AU2003296601A1; GT200300275A; AU2003296601A8; JP2006510645A; WO2004052905A2; PE20040903A1; WO2004052905A3

Abstract

本发明涉及用于治疗丙型肝炎病毒感染的包括式(I)和式(II)化合物的核苷衍生物、含有这些化合物的药用组合物，以及在单独疗法或组合疗法中采用所述化合物来治疗或预防丙型肝炎病毒介导的疾病的方法。

Description

抗病毒的核苷衍生物

技术领域

本发明涉及抗病毒疗法领域，尤其涉及用于治疗丙型肝炎病毒(HCV)介导的疾病的核苷衍生物。本发明提供了新的化合物、包含这些化合物的药用组合物以及在单独疗法或组合疗法中采用所述化合物来治疗或预防HCV介导的疾病的方法。

背景技术

丙型肝炎病毒(HCV)是全世界大部分慢性肝病的原因，在工业化国家中有70％的慢性肝炎病例由丙型肝炎病毒引起。在全球估计丙型肝炎的比例为平均3％(0.1％至5.0％)；估计在全世界有1.7亿的慢性携带者。因此一直需要有有效的抗HCV治疗剂。

式I化合物(R¹＝R²＝R³＝H)左旋韦林(levovirin)(1-(3S，4R-二羟基-5S-羟甲基-四氢呋喃-2S-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺)是核苷类似物，并且是抗病毒化合物利巴韦林的对映异构体。与利巴韦林不同，左旋韦林没有可检测的抗病毒活性；然而，左旋韦林可通过增加抗病毒Th1细胞因子的表达来刺激免疫反应。与利巴韦林相同，左旋韦林在小鼠肝炎模型中降低血清丙氨酸氨基转移酶的水平。(R.Tam等人，J.Med.Chem.2000 44：1276-1283；M.Assenmacher等人，Eur.J.Immunol.1998 28：1534-1543)。左旋韦林似乎没有与利巴韦林相关的毒性。

虽然核苷衍生物常常具有高水平的生物活性，但是它们的治疗应用通常受到欠佳的物理性质和限制核苷吸收量的不佳的药代动力学和生物利用度的阻碍。口服给药后仅有约15％的左旋韦林被全身吸收。因此，需要有生物利用度改善的治疗剂。前药是吸收不好的化合物的生物可逆化学衍生物，它是优化物理性质以改善药物传送的一种途径。(W.N.Chapman和C.J.H.Porter，Adv.Drug Deliv.1996 19：149-169；D.Fleisher等人，Adv.Drug Eeliv 1996 19：115-130)。前药设计的一个途径是，制备化学衍生物以优化油/水分配系数或其它使穿过粘膜的被动转运增强的物理性质。选择这样的衍生物：该衍生物是细胞质、血液或血清中存在的非特异性酶的底物，在该化合物被吸收后能裂解修饰基团并转化为生物活性的母体分子。理想的口服前药应当对胃液和肠食糜稳定，可被有效地转运穿过肠膜，并且在被胃肠道吸收后可迅速转化为母体药物。因此，“核苷前药”可能能防止母体核苷发生如活性、生物利用度或稳定性的问题。

另一途径利用非特异性主动转运系统以使前药穿过膜。设计分子的前药部分以使之被主动转运系统识别，并在转运完成后裂解。已经提议将非特异性肽转运蛋白PepT1和PepT2用于改善吸收不好的药物的生物利用度。(P.Balimane等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.1998 250：246-251；K.Sawada等人，J.Pharmacol Exp.Ther.1999 291(2)：705-709；I.Rubio-Aliaga和H.Daniel，Trends Pharmacol.Sci.2002 23(9)：434-40)。

IIa：R′＝H；R″＝HIIb：R′＝H；R″＝Val-HHc：R′＝CH₂OH；R″＝HIId：R′＝CH₂OH；R″＝Val-H

阿昔洛韦IIa的缬氨酸酯IIb(伐昔洛韦)的吸收性质改善，这已经被提议是经肽转运蛋白摄取的结果。(Balimane，出处同上；M.E.Ganapathy等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.1998 246：470-75；P.J.Sinko和P.V.Balimane，Biopharm.Drug Dispos.1998 19：209-17；R.L.de Vrueh等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.1998 286：1166-70)。Mitsuru Sugara等人(J.Pharm.Sci.2000 89(6)：781-89)提出更昔洛韦IIc的缬氨酸酯缬更昔洛韦IId的转运改善可归因于PepT1和PepT2转运体系。WO 01/68034 A2(G.Wang等人)公开对左旋韦林的糖和三唑部分进行生物可逆性修饰以提高药物的生物利用度和治疗感染、侵染、赘生物或自身免疫性疾病。WO 00/23454(A.K.Ganguly等人)公开将利巴韦林衍生物与α干扰素共同施用于慢性丙型肝炎患者。

虽然利用有效吸收的前药提供了改善左旋韦林生物利用度的途径，但是利用这些化合物同样需要左旋韦林衍生物具有使活性成分的有效制备和配制成为可能的物理性质。左旋韦林前药应具有足够的热稳定性和光稳定性，并且是不吸湿的。与制剂化学有关的性质包括粒径、多晶型物、晶癖和盐形式。这些性质影响水溶解度、溶出性质、与制剂中其它组分的相容性、给药途径以及生物药剂学性质。因此，理想的核苷药物候选者必须具有使其有效制备和配制成为可能的物理性质、使其传送至吸收位点成为可能的药学性质，以及允许其被转运系统识别和摄取并在摄取完成后被转化为所需母体化合物的化学性质。

发明详述

现已令人惊奇地发现：左旋韦林的若干种疏水性氨基酸酯盐酸盐和一系列中性单-、二-和三-酰基衍生物具有必要的物理和化学性质，并且生物利用度改善。

本发明涉及式I的核苷化合物：

其中，R¹、R²和R³独立地选自氢、C^1-10酰基、C^1-10烷氧羰基和COR⁴，其中COR⁴是氨基酸或二肽，以及所述化合物的水合物、溶剂化物、包合物和酸加成盐；

治疗由丙型肝炎病毒(HCV)介导的疾病的方法，该方法包括给予哺乳动物治疗有效量的式I化合物；以及涉及包含治疗有效量的式I化合物和至少一种可药用载体的药用组合物，任选含有赋形剂。

本发明的一个实施方案是其中R¹、R²和R³如上定义的式I核苷化合物。

在另一实施方案中，提供了如下定义的式I化合物：其中R¹、R²和R³中之一是COR⁴，R⁴是CH(R⁵)NH₃ ⁺Cl^-或吡咯烷-2-基，R⁵是天然存在的疏水性氨基酸的侧链或是C_1-6直链或支链烷基，以及R¹、R²和R³中的其它基团独立地选自氢、C_1-10酰基和C_1-10烷氧羰基。

在另一实施方案中，提供了如下定义的式I化合物：其中R¹是COR⁴，R⁴是CH(R⁵)NH₃ ⁺Cl^-或吡咯烷-2-基，R⁵是天然存在的疏水性氨基酸的侧链或C_1-6直链或支链烷基，且R²和R³独立地选自氢、C_1-10酰基和C_1-10烷氧羰基。

在另一实施方案中，提供了如下定义的式I化合物：其中R¹是COR⁴，R⁴是CH(R₅)NH₃ ⁺Cl^-，R⁵选自CH(CH₃)₂和CH(CH₃)CH₂CH₃，且R²和R³均为氢。

在本发明的另一实施方案中，提供了如下定义的式I化合物的酸加成盐：其中R¹、R²和R³中之一是COR⁴，R⁴是CH(R⁵)NH₂，R⁵是缬氨酸的侧链，且R¹、R²和R³中的其它基团独立地选自氢。

在本发明的另一实施方案中，提供了如下定义的式I化合物的酸加成盐：其中R¹是COR⁴，R⁴是缬氨酸的侧链，且R²和R³均为氢。

在本发明的优选实施方案中，提供了如下定义的式I化合物的盐酸盐：其中R¹是COR⁴，R⁴是L-缬氨酸的侧链，且R²和R³均为氢。

本发明的化合物的优选代表是2S-氨基-3-甲基-丁酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羟基-四氢呋喃-2S-基甲酯盐酸盐。

在另一实施方案中，提供了如下定义的式I化合物：其中R¹是COR⁴，R⁴是CH(R⁵)NH₃ ⁺Cl^-，R⁵是CH₃，且R²和R³均为氢。

在另一实施方案中，提供了如下定义的式I化合物：其中R¹、R²和R³是C^1-10酰基或C^1-10烷氧羰基。

该化合物的优选代表是丙酸3S，4S-双-丙酰氧基-5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-四氢呋喃-2S-基甲酯。

在另一实施方案中，提供了如下定义的式I化合物：其中R¹是C_1-10酰基或C_1-10烷氧羰基，且R²和R³均为氢。

在另一实施方案中，提供了如下定义的式I化合物：其中R¹是氢，且R²和R³独立地是C_1-10酰基或C_1-10烷氧羰基。

在本发明的优选实施方案中，提供了下述化合物：异丁酸2S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-5S-羟甲基-4S-异丁酰氧基-四氢呋喃-3S-基酯；或2，2-二甲基丙酸4S-(2，2-二甲基丙酰氧基)-5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-2S-羟甲基-四氢呋喃-3S-基酯.

本发明的另一实施方案是式II的核苷化合物：

其中，R¹、R²和R³独立地选自氢、C_1-10酰基、C_1-10烷氧羰基和COR⁴，其中COR⁴是氨基酸或二肽；R⁶是C_1-10酰基；以及所述化合物的水合物、溶剂化物、包合物以及酸加成盐。

以式I或式II为特征的本发明的化合物可在疗法中使用，尤其在由丙型肝炎病毒介导的疾病的疗法中使用。

以式I或式II为特征的本发明的化合物可以以治疗有效量施用于哺乳动物，通常剂量为0.1至300mg/kg患者体重/天，优选1至100mg/kg患者体重/天，更优选1至50mg/kg患者体重/天。

在本发明的另一实施方案中，以式I或式II化合物为特征的本发明的化合物可与免疫系统调节剂或抗病毒剂如干扰素、白介素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、抗炎药或逆转录酶抑制剂组合施用。

所述干扰素可以是化学衍生的干扰素，例如PEG-干扰素-α-2a(PEGASYS^)或PEG-干扰素-α-2b(PEG-INTRON^)。

蛋白质化学领域的技术人员将认识到：连接聚合物和蛋白质的新方法学在不断发展，当连接聚合物和干扰素的新方法所产生化合物与左旋韦林前药共同施用来治疗由HCV介导的疾病时，该化合物落在本发明范围内。

在本发明的另一实施方案中，提供如下的药用组合物：该组合物包含治疗有效量的式I和式II化合物和至少一种可药用载体，任选含有赋形剂。定义

如本文所用的短语“一个(种)”实体指一个(种)或多个(种)该实体；例如，一种化合物指一种或多种化合物或者至少一种化合物。照此，术语“一个(种)”、“一个(种)或多个(种)”和“至少一个(种)”在本文中可互换使用。

短语“如上定义”指在发明详述中给出的第一个定义。

如本文所用的术语“烷基”指含1至12个碳原子的直链或支链烃基。术语“低级烷基”指含1至6个碳原子的直链或支链烃基。代表性的低级烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基或戊基。

术语“酰基”指式R-C(O)-的有机基团，其在形式上是通过除去羟基由有机酸衍生；术语“C_1-12酰基”指其中R为含1-12个碳原子的烷基或芳基的酰基；如本文所用的术语“低级酰基”指其中R为C_1-6直链、支链或环状烷基的酰基。如本文所用的术语“芳酰基”指其中R是芳基的酰基。

如本文所用的术语“烷氧基”指其中“烷基”部分如上定义的式R-O-的有机基团，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基、庚氧基，包括它们的异构体。如本文所用的“低级烷氧基”指其中“低级烷基”如前定义的烷氧基。

如本文所用的术语“烷氧羰基”指式R-O-C(O)-的有机基团，其中R-O-是如本文所定义的烷氧基。

如本文所用的术语“天然存在的氨基酸”指天然存在的氨基酸的L-异构体。天然存在的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、组氨酸、天门冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、γ-羧基谷氨酸、精氨酸、鸟氨酸和赖氨酸。除非具体说明，本申请中所指的所有氨基酸均是L-型。如本文所用的术语“疏水性氨基酸”指甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和脯氨酸。

碱性式I化合物可与无机酸和有机酸形成可药用盐，其中无机酸例如是氢卤酸(例如盐酸和氢溴酸)、硫酸、硝酸和磷酸等，有机酸例如是乙酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、苹果酸、水杨酸、柠檬酸、甲磺酸和对甲苯磺酸等。

如本文所用的术语“溶剂化物”指还包括化学计量或非化学计量的溶剂的本发明的化合物或其盐，其中所述溶剂通过非共价分子间力结合。优选的溶剂是挥发性的，无毒，和/或痕量施用于人时是可接受的。

如本文所用的术语“水合物”指还包括化学计量或非化学计量的水的本发明的化合物或其盐，其中水通过非共价分子间力结合。

如本文所用的术语“包合物”指其中含有空间(如通道)的晶格形式的本发明的化合物或其盐，在空间中可捕获客分子(如溶剂或水)。

如本文所用的术语“免疫调节剂”指有助于或能够修饰或调节免疫功能的治疗剂。其能使免疫调整、调节或增强。

如本文所用的术语“干扰素”指能干扰细胞的病毒传染以及抑制正常和转化细胞的增殖、调节细胞分化和调整免疫系统的蛋白质家族。干扰素的四种主要抗原型(α、β、γ和ω)根据它们生成的细胞源来定义。I型干扰素(干扰素(α、β和ω))彼此竞争性地与I型干扰素受体细胞结合，因此共享该多亚单位细胞表面受体的至少一部分组分，而II型干扰素(干扰素γ)受体则是不同的实体。天然存在的干扰素和重组干扰素可在组合疗法中与本发明的化合物一起施用。干扰素的契合序列已经在美国专利US4,897,471(Y.Stabinsky)中有描述。

如本文所用的术语“化学衍生的干扰素”指与聚合物共价连接的干扰素分子，所述聚合物改变干扰素的物理和/或药代动力学性质。该聚合物非限制性的名单包括聚醚均聚物如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)、聚氧乙烯化多元醇、其共聚物和嵌段共聚物，其前提是可维持嵌段共聚物的水溶解度。本领域技术人员知道将聚合物与干扰素连接的众多途径(例如参见A.Kozlowski和J.M.Harris J.Control.Release 2001 72(1-3)：217-24；C.W.Gilbert和M.Park-Cho，美国专利US5,951,974)。用于本专利的化学衍生的IFNα的非限制性名单包括PEG-干扰素-α-2a(PEGASYS^)和PEG-干扰素-α-2b(PEGINTRON^TM)。

缩写

本申请中使用下列缩写，它们具有下述所列出的含义：

THF：四氢呋喃

DMF：N，N-二甲基甲酰胺

CBZ：苄氧羰基

PyBOP：六氟磷酸(苯并三唑-1-基-氧基)三吡咯烷基鏻

IPA：异丙醇

DMAP：4-N，N-二甲基氨基吡啶

DIPEA：N，N-二异丙基乙胺

TEA：三乙胺

DEAD：偶氮二甲酸二乙酯

PTLC：制备薄层色谱法

TsOH：对甲苯磺酸一水合物

命名法

一般而言，本申请所采用的命名法基于AUTONOM^TM(第4.0版)，其为生成IUPAC系统命名法的Beilstein Institute计算机化系统。

本发明的化合物的实例

给出随后的实施例和制备以使本领域技术人员更清楚地理解和实施本发明。它们不应当理解为是对本发明的范围的限制，而仅仅是其解释或示例。表1中的化合物是左旋韦林的单-、二-和三-酰基衍生物的实例。表2中的化合物举例说明N-酰基左旋韦林衍生物。表3中的化合物举例说明其中一个或多个羟基被保护的合成中间体和含有与2’，3’羟基所形成的缩酮或缩醛的酰化化合物。

表1

酰化左旋韦林衍生物

编号	R¹	R²	R³	盐	方法³	m.s.⁴	m.p.⁶
编号	R¹	R²	R³	盐	方法³	m.s.⁴	m.p.⁶	1	MeCO	MeCO	MeCO		A	371
2	EtCO	EtCO	EtCO		A	413		1	MeCO	MeCO	MeCO		A	371
2	EtCO	EtCO	EtCO		A	413		3	H	Val	Val	HCl	C	477	202-205
4	Val	H	H	Tos	B	344	110-114.5	3	H	Val	Val	HCl	C	477	202-205
4	Val	H	H	Tos	B	344	110-114.5	5	Val	H	H	HCl	B	344	154-156
6	(D)-Val	H	H	Tos	B	344		5	Val	H	H	HCl	B	344	154-156
6	(D)-Val	H	H	Tos	B	344		7	Ala	H	H	Tos	B	316	108-120
8	Phe	H	H	Tos	B	392	114-136	7	Ala	H	H	Tos	B	316	108-120
8	Phe	H	H	Tos	B	392	114-136	9	Leu	H	H	Tos	B	358	112-123
10	Ile	H	H	Tos	B	358	101.8-110.8	9	Leu	H	H	Tos	B	358	112-123
10	Ile	H	H	Tos	B	358	101.8-110.8	11	t-BuCO	H	H	-	B	329	139-141.6
12	i-PrCO	H	H	-	B	315	169-171.2	11	t-BuCO	H	H	-	B	329	139-141.6
12	i-PrCO	H	H	-	B	315	169-171.2	13	Gly	H	H	Tos	B	302	89.3-96.4
14	MeNHCH₂CO	H	H	Tos	B	316	69.4-86.3	13	Gly	H	H	Tos	B	302	89.3-96.4
14	MeNHCH₂CO	H	H	Tos	B	316	69.4-86.3	15	H	t-BuCO	t-BuCO	-	C
16	i-Pr-OCO	H	H	-	B	329	46-59	15	H	t-BuCO	t-BuCO	-	C
16	i-Pr-OCO	H	H	-	B	329	46-59	17	H	i-PrCO	i-PrCO	-	C	407⁵	179.0-179.6

编号	R¹	R²	R³	盐	方法³	m.s.⁴	m.p.⁶
编号	R¹	R²	R³	盐	方法³	m.s.⁴	m.p.⁶	18	H-Val-Pro	H	H	HCl	B	441	146-149
19	H	EtCO	EtCO	-	C	357	154.2-155.6	18	H-Val-Pro	H	H	HCl	B	441	146-149
19	H	EtCO	EtCO	-	C	357	154.2-155.6	20	n-PrCO	n-PrCO	n-PrCO	-	A	455
21	Val	EtCO	EtCO	Tos	D	456	60.0-63.5	20	n-PrCO	n-PrCO	n-PrCO	-	A	455
21	Val	EtCO	EtCO	Tos	D	456	60.0-63.5	22	Val	i-PrCO	i-PrCO	Tos	D	506⁵	72.0-76.0
23	H-Pro-Val1	H	H	Tos	B	441	76-92	22	Val	i-PrCO	i-PrCO	Tos	D	506⁵	72.0-76.0
23	H-Pro-Val1	H	H	Tos	B	441	76-92	24	EtOCO	EtOCO	EtOCO	-	A	461
25	PhCO	PhCO	PhCO	-	A	579		24	EtOCO	EtOCO	EtOCO	-	A	461
25	PhCO	PhCO	PhCO	-	A	579		26	i-PrCO	i-PrCO	i-PrCO	-	A	477⁵
27	t-BuCO	t-BuCO	t-BuCO	-	A	519⁵		26	i-PrCO	i-PrCO	i-PrCO	-	A	477⁵
27	t-BuCO	t-BuCO	t-BuCO	-	A	519⁵		28	H	PhCO	PhCO	-	C	453
29	t-BuCO	H	t-BuCO	-	C	413		28	H	PhCO	PhCO	-	C	453
29	t-BuCO	H	t-BuCO	-	C	413		30	H	n-PrCO	n-PrCO	-	C	407	135.3-135.9
31	n-C₆H₁₃CO	H	H	-	B	357	151.2-152.8	30	H	n-PrCO	n-PrCO	-	C	407	135.3-135.9
31	n-C₆H₁₃CO	H	H	-	B	357	151.2-152.8	32	n-PrOCO	n-PrOCO	n-PrOCO	-	A	503	51.7-56.6
33	H-Pro-Val²	H	H	Tos	B	441	120-136	32	n-PrOCO	n-PrOCO	n-PrOCO	-	A	503	51.7-56.6
33	H-Pro-Val²	H	H	Tos	B	441	120-136	34	C₇H₁₅CO	H	H	-	B	371	154.4-155.8
35	C₈H₁₇CO	H	H	-	B	385	155-157.1	34	C₇H₁₅CO	H	H	-	B	371	154.4-155.8
35	C₈H₁₇CO	H	H	-	B	385	155-157.1	36	EtCO	H	H	-	B	301	178-181.8
47	H	H	EtCO	-	C	301		36	EtCO	H	H	-	B	301	178-181.8
47	H	H	EtCO	-	C	301		48	H	H	t-BuCO	-	C	329
49	H	H	i-PrCO	-	C	315		48	H	H	t-BuCO	-	C	329
49	H	H	i-PrCO	-	C	315		51	H	n-BuCO	n-BuCO	-	C	435⁵	115.0-118.1
52	H	n-C₅H₁₁CO	n-C₅H₁₁CO	-	C	463⁵	114.8-115.3	51	H	n-BuCO	n-BuCO	-	C	435⁵	115.0-118.1
52	H	n-C₅H₁₁CO	n-C₅H₁₁CO	-	C	463⁵	114.8-115.3	53	H	n-PrOCO	n-PrOCO	-	C	417	101.0-103.0
54	H	c-C₆H₁₁CO	c-C₆H₁₁CO	-	C	487	195.6-197.5	53	H	n-PrOCO	n-PrOCO	-	C	417	101.0-103.0
54	H	c-C₆H₁₁CO	c-C₆H₁₁CO	-	C	487	195.6-197.5	55	(n-Pr)₂CHCO	H	H	-	B	393	179.0-179.9
56	c-C₆H₁₁CO	H	H	-	B	355	168.5-171.9	55	(n-Pr)₂CHCO	H	H	-	B	393	179.0-179.9
56	c-C₆H₁₁CO	H	H	-	B	355	168.5-171.9	57	n-C₇H₁₅OCO	H	H	-	B	387	111.1-114.5
58	H	(Et)₂CHCO	(Et)₂CHCO	-	C	463⁵	154.9-160.3	57	n-C₇H₁₅OCO	H	H	-	B	387	111.1-114.5
58	H	(Et)₂CHCO	(Et)₂CHCO	-	C	463⁵	154.9-160.3	59	n-C₈H₁₇OCO	H	H	-	B	401	126.3-129.1

表2

酰化N-酰基左旋韦林衍生物

编号	R¹	R²	R³	R⁶	m.s.	方法
编号	R¹	R²	R³	R⁶	m.s.	方法	37	EtCO	EtCO	EtCO	EtCO	469	E
38	H	n-PrCO	n-PrCO	n-PrCO	477(M+Na)⁺	E	37	EtCO	EtCO	EtCO	EtCO	469	E
38	H	n-PrCO	n-PrCO	n-PrCO	477(M+Na)⁺	E	39	n-PrCO	n-PrCO	n-PrCO	n-PrCO	547(M+Na)⁺	E
40	H	H	H	n-PrCO	315	E	39	n-PrCO	n-PrCO	n-PrCO	n-PrCO	547(M+Na)⁺	E
40	H	H	H	n-PrCO	315	E	50	n-PrCO	H	H	n-PrGO	477(M+Na)⁺	E

表3

被保护的合成中间体

	R1	R2	R3	m.s.¹	m.p.³
	R1	R2	R3	m.s.¹	m.p.³	41	H	C(CH₃)₂	285	95.1-98
42	H	CHPh		333	150-153	41	H	C(CH₃)₂	285	95.1-98
42	H	CHPh		333	150-153	43		Si(i-Pr)₂OSi(i-Pr)₂
44	(i-Pr)₃Si	H	H	423²	174.6-175.7	43		Si(i-Pr)₂OSi(i-Pr)₂
44	(i-Pr)₃Si	H	H	423²	174.6-175.7	45	Val	C(CH₂)₄
46	t-BuCO	C(CH₃)₂				45	Val	C(CH₂)₄

¹质谱(M+H)⁺

²(M+Na)⁺

³熔点(℃)

化合物的制备

式I化合物可通过有机化学领域已知的多种概括方法和核苷类似物合成的具体方法来制备。合成原料可容易地自商业获得，或者是已知的，或者本身可通过本领域已知的技术来制备。给出随后的实施例(见下文)以使本领域技术人员更清楚地理解和实施本发明。它们不应当理解为是对本发明的范围的限制，而仅仅是其解释和示例。制备核苷类似物的综述见下列出版物：

A M Michelson“核苷化学与核苷”(The Chemistry of Nucleosides andNucleotides)，Academic出版社，纽约1963；

L Goodman“核酸化学中的基本原则”(Basic Principles in NucleicAcid Chemistry)Ed P O P Ts’O，Academic出版社，纽约1974，第1卷，第2章；

“核酸化学中的合成方法”(Synthetic Procedures in Nucleic acidChemistry)Ed W W Zorbach和R S Tipson，Wiley，纽约，1973，第1和2卷；

H.Vorbrüggen和C.Ruh-Pohlenz(eds)“核苷合成手册”(Handbook ofNucleoside Synthesis)Wiley，纽约，2001。

已经努力确保所用数字(如量、温度)的准确性，但是应当考虑允许有实验误差和偏差，包括校准差异和数字的四舍五入等。

配制和施用

式I化合物的制剂可采用制剂领域已知的方法制备。给出随后的实施例(见下文)以使本领域技术人员更清楚地理解和实施本发明。它们不应当理解为是对本发明的范围的限制，而仅仅是其解释和示例。

虽然本发明的核苷衍生物对于穿过胃肠粘膜递送是最佳的，但是当通过其它给药途径施用时这些化合物也是有效的，所述其它给药途径包括持续(静脉滴注)、局部、胃肠道外、肌内、静脉内、皮下、透皮(其可含有渗透促进剂)、口腔、经鼻和栓剂施用的途径。口服施用可以是片剂、包衣片剂、糖衣丸、硬和软明胶胶囊、溶液剂、乳剂、糖浆剂或悬浮剂的形式。

对于药用制剂的制备，核苷衍生物及其可药用盐可采用无治疗活性的无机或有机赋形剂配制成片剂、包衣片剂、糖衣丸、硬和软明胶胶囊、溶液剂、乳剂或悬浮剂。式I化合物可与可药用载体混和配制。例如，本发明的化合物可以以药理学可接受的盐的形式经口服施用。因为本发明的化合物大多数是水溶性的，因此它们可以在生理盐水溶液(如缓冲至pH为约7.2-7.5)中经静脉内施用。常规的缓冲剂如磷酸盐、碳酸氢盐或柠檬酸盐可用于该组合物。适于片剂、包衣片剂、糖衣丸和硬明胶胶囊的赋形剂例如是乳糖、玉米淀粉及其衍生物、滑石粉以及硬脂酸或其盐。如果需要的话，片剂或胶囊可采用标准技术包肠溶衣或制成缓释。适于软明胶胶囊的赋形剂例如是植物油、蜡、脂肪、半固态和液态多元醇。适于注射溶液的赋形剂例如是水、盐水、醇、多元醇、甘油或植物油。适于栓剂的赋形剂例如是天然和硬化油、蜡、脂肪、半液态或液态多元醇。适于肠内使用的溶液和糖浆剂的赋形剂例如是水、多元醇、蔗糖、转化糖和葡萄糖。药用制剂还可含有防腐剂、增溶剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、矫味剂、用于调整渗透压的盐、缓冲剂、掩蔽剂或抗氧化剂。药用制剂还可含有本领域已知的其它治疗活性药物。适宜的药用载体、赋形剂以及它们的配制在Remington的“药学科学与实践”(The Science and Practice ofPharmacy，1995，E.W.Martin编辑，Mack出版公司，第19版，伊斯顿，宾夕凡尼亚州)一书中有描述。在实施例13-15中描述了含有本发明的化合物的代表性药用制剂。

制剂领域的普通技术人员还可利用前药形式的有利的物理和药代动力学参数，其中前药形式将本发明的化合物递送至宿主生物体或患者的靶向位点，以使化合物的预期效力最大。熟练的制剂科学家可在说明书的教导范围内改变制剂，以提供众多用于特定给药途径的制剂，而不会使本发明的组合物不稳定或减弱它们的治疗活性。

具体而言，通过本领域普通技术中所熟知的较小改变(形成盐、酯化等)，可容易地对该化合物进行修饰，以使它们在水或其它溶媒中的溶解度更大。在本领域的普通技术中同样熟知的是：改变具体化合物的给药途径和剂量方案，以控制该化合物的药代动力学，从而在患者中达到最大有益作用。

剂量可以在较宽范围内变化，并且在每一具体病例中当然可根据个体需求进行调节。对于口服施用，约0.01至约100mg/kg体重/天的日剂量在单独疗法和/或组合疗法中应当是适宜的。优选的日剂量为约0.1至约300mg/kg体重，更优选为1至约100mg/kg体重，最优选为1.0至约50mg/kg体重/天。典型的制剂可含有约5％至约95％的活性化合物(w/w)。日剂量可作为单剂量或者以分开的剂量、通常是每天1至5个剂量的形式施用。

药用制剂优选是单位剂量形式。在该形式中，制剂被细分为含适宜量活性组分的单位剂量。单位剂量形式可以是包装制剂，在该包装中含有分开的大量制剂，如小包的片剂、胶囊以及装入小瓶或安瓿中的粉末。同样，单位剂量形式本身可以是胶囊、片剂、扁囊剂或锭剂，或者也可以是包装形式的适宜数量的任何这些剂型。

核苷衍生物或其药物可用于单独疗法或组合疗法中，即治疗可与一种或多种其它治疗活性物质组合，所述活性物质例如是免疫系统调节剂如干扰素、白介素、肿瘤坏死因子或集落刺激因子、抗炎药和/或抗病毒剂。当治疗为组合疗法时，所述活性物质可与核苷衍生物共同或依次施用。如此，如本文所用的共同施用包括在同一时间或不同时间施用药物。

本文所指的治疗包括预防丙型肝炎介导的疾病和治疗已患有的病症，本文所指的治疗动物包括治疗人及其它哺乳动物。此外，如本文所用的治疗丙型肝炎病毒(HCV)感染还包括治疗或预防与丙型肝炎病毒(HCV)感染相关或由其介导的疾病或病症，或者它们的临床症状。

实施例1

1-(6S-羟甲基-2，2-二甲基-四氢-3αS，6αS-呋喃并[3，4-d][1，3]间二氧杂环戊烯 -4S-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺(3，R’＝R”＝CH₃ )。

将左旋韦林(1，1.0g，4.1mmol，Roche Carolina)悬浮在32mL无水丙酮∶2，2-二甲氧基丙烷的2∶1混和物中。将溶液在N₂和冰浴下搅拌，滴加7滴浓高氯酸。将反应物于室温搅拌4小时以上。加入1M氢氧化钠溶液中和混合物，蒸发得残余物。残余物经色谱法(硅胶；5％-10％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到0.72g(62％)1-(6S-羟甲基-2，2-二甲基-四氢-3αS，6αS-呋喃并[3，4-d][1，3]间二氧杂环戊烯-4S-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺(化合物41(3，R’＝R”＝CH₃)；(M+H)⁺＝285；mp＝95.1-98℃)。

实施例2

1-(6S-羟甲基-2-苯基-四氢-3αS，6αS-呋喃并[3，4-d][1，3]间二氧杂环戊烯-4S- 基)-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺(3；R’＝H，R”＝Ph)。

将左旋韦林(6.00g，24.5mmol，Roche Carolina)悬浮在60mL苯甲醛中。将氯化锌(5.70g，41.8mmol，Aldrich Chemical)加入搅拌的混合物中。4小时后，将反应混合物滴加至1升快速搅拌的乙醚中。将所形成的沉淀过滤，用乙醚冲洗，然后溶解在350mL乙酸乙酯和650mL冷的2M氢氧化钠溶液中。分层，水层用乙酸乙酯另外萃取两次。所合并的乙酸乙酯层用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，并蒸发至固体。将固体用乙醚研磨，经硅胶色谱法(2％-7％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到4.4g(54％)1-(6S-羟甲基-2-苯基-四氢-3αS，6αS-呋喃并[3，4-d][1，3]间二氧杂环戊烯-4S-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺(化合物42(3，R’＝Ph，R”＝H)；(M+H)⁺＝333；mp＝150-153℃)。

实施例3

1-(3R-羟基-5，5，7，7-四异丙基-四氢-1，4，6，8-四氧杂-5，7-二硅杂-3αS，9αS-环戊二烯并环辛烯-2S-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺。

于0℃向左旋韦林(3.75g，15.4mmol)在30mL DMF中的搅拌浆状物中加入30mL吡啶、TEA(5.35mL，38.4mmol)和1，3-二氯-1，1，3，3-四异丙基-二硅氧烷(6.15mL，19.2mmol)。使反应物反应以温热至室温，并搅拌24小时。所得溶液在1N HCl和乙酸乙酯之间分配。有机层用盐水洗涤，经MgSO₄干燥，并真空浓缩。残余物经色谱法(25％丙酮/氯仿)纯化，得到3.96g(53％)1-(3R-羟基-5，5，7，7-四异丙基-四氢-1，4，6，8-四氧杂-5，7-二硅杂-3αS，9αS-环戊二烯并环辛烯-2S-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺(化合物43)。

实施例4

1-(3S，4R-二羟基-5S-三异丙基硅烷氧基甲基-四氢呋喃-2S-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺

在室温下，向左旋韦林(1，9.22g，37.8mmol)在75mL DMF中的搅拌浆状物中加入咪唑(2.80g，41.1mmol)和三异丙基甲硅烷基氯(8.1mL，38mmol)。将悬浮液加热至50℃溶解固体，并维持该温度6小时。将溶液转移至分液漏斗中，在400mL乙酸乙酯和500mL水之间分配。有机层(浆状)用200mL水洗涤三次，滤除沉淀。有机层滤液经MgSO₄干燥并真空浓缩。滤渣在150mL甲醇中重结晶；母液与有机浓缩液合并并进一步重结晶。收集四批结晶，得到10.47g(69％)1-(3S，4R-二羟基-5S-三异丙基硅烷氧基甲基-四氢呋喃-2S-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺，为白色结晶固体(化合物44；(M+Na)⁺＝423；mp＝174.6-175.7℃)。

方法A——三取代类似物的制备

实施例5

异丁酸3S，4S-双-异丁酰氧基-5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)四氢呋喃 -2S-基甲酯(2；R ¹ ＝CH(CH₃)₂ )

在氮气下，向左旋韦林(0.46g，1.88mmol)在8mL THF中的搅拌浆状物中加入TEA(1.31mL，9.40mmol)和异丁酸酐(1.41mL，8.48mmol)。反应容器装有指形冷凝管(cold finger attachment)，于65℃加热24小时。反应物在乙酸乙酯和饱和NaHCO₃水溶液之间分配。有机层用盐水洗涤，经MgSO₄干燥，浓缩。残余物经硅胶色谱法(3％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到0.278g(33％)异丁酸3S，4S-双-异丁酰氧基-5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)四氢呋喃-2S-基甲酯，为粘性固体。MS：(化合物26(2，R＝CH(CH₃)₂；(M+Na)⁺＝477)。

采用适宜酸酐，按照类似方式，制备下述化合物：2，2-二甲基丙酸3S，4S-双-(2，2-二甲基丙酰氧基)-5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-四氢呋喃-2S-基甲酯(化合物27；18％)；苯甲酸3S，4S-双-苯甲酰氧基-5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-四氢呋喃-2S-基甲酯(化合物25；66％)；乙酸3S，4S-双-乙酰氧基-5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-四氢呋喃-2S-基甲酯(化合物1；65％；(M+H)⁺＝371)；澄清油状的丙酸3S，4S-双-丙酰氧基-5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-四氢呋喃-2S-基甲酯(化合物2；52％；(M+H)⁺＝413)；澄清油状的丁酸3S，4S-双-丁酰氧基-5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-四氢呋喃-2S-基甲酯(化合物20；20％；(M+H)⁺＝455)。

实施例6

碳酸2S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-4S-乙氧羰基氧基-5S-乙氧羰基氧基甲基-四氢呋喃-3S-基酯乙酯

将左旋韦林(1，0.5g，2.04mmol，Roche Carolina)悬浮在3mL DMF和1.5mL吡啶中。冰浴下搅拌混合物，将氯甲酸乙酯(0.78mL，8.19mmol)分三批历经15分钟缓慢加入。反应物于室温搅拌2小时以上。加入甲醇并将反应物搅拌10分钟。蒸发后，将残余物加入乙酸乙酯和饱和氯化铵溶液中。分层，水层用乙酸乙酯萃取一次。所合并的乙酸乙酯层用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，并浓缩。将泡沫状残余物的甲醇/水溶液经色谱法(3-4％甲醇/二氯甲烷)和冷冻干燥而纯化，得到固态的碳酸2S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-4S-乙氧羰基氧基-5S-乙氧羰基氧基甲基-四氢呋喃-3S-基酯乙酯(化合物24，74％，(M+H)⁺＝461)。

采用适宜的氯甲酸烷基酯，按照类似方式，制备下述化合物：碳酸2S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-4S-丙氧羰基氧基-5S-丙氧羰基氧基甲基-四氢呋喃-3S-基酯丙酯(化合物32，47，(M+H)⁺＝503)。

方法B——5’-单酰基衍生物的制备

实施例7

2S-氨基-3-甲基-丁酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羟基-四氢呋喃-2S-基甲酯；该化合物含有甲苯-4-磺酸(4：R ¹ ＝CH(NH₂)CH(CH₃)₂ )。

将1-(6S-羟甲基-2-苯基-四氢-3αS，6αS-呋喃并[3，4-d][1，3]间二氧杂环戊烯-4S-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺(0.49g，1.47mmol)溶于5mL无水DMF中。依次加入N-CBZ-L-缬氨酸(0.44g，1.77mmol，Aldrich Chemical)、PyBOP(0.84g，1.62mmol，Nova Biochem)和DIPEA(0.51mL，2.94mmol)。搅拌18小时后，加入乙酸乙酯和饱和氯化铵溶液。分层，水层用乙酸乙酯萃取一次。所合并的乙酸乙酯层用水、饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤，经硫酸钠干燥。蒸发溶剂，残余物经色谱法(硅胶；梯度为2％-5％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到520mg(62％)泡沫状的2S-苄氧羰基氨基-3-甲基-丁酸6S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)2-苯基-四氢-3αS，6αS-呋喃并[3，4-d][1，3]间二氧杂环戊烯-4S-基甲酯(M+H)⁺＝566。

将2S-苄氧羰基氨基-3-甲基-丁酸6S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-2-苯基-四氢-3αS，6αS-呋喃并[3，4-d][1，3]间二氧杂环戊烯-4S-基甲酯(0.49g，0.87mmol)溶于5mL甲醇中，该甲醇中含有0.36g 20％在碳上的氢氧化钯(50wt％水)。加入TsOH(0.165g，0.87mmol)，将反应容器与充有氢气的气囊连接。容器通入H2气体并于35℃搅拌4.5小时。然后将混合物经CELITE床过滤，并用更多甲醇冲洗。溶剂蒸发后，将残余物溶于水中并冷冻干燥，得到0.44g(98％)2S-氨基-3-甲基-丁酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羟基-四氢呋喃-2S-基甲酯，该化合物含有甲苯-4-磺酸(化合物4；(M+H)⁺＝344；m.p.＝110-114.5℃)；

采用适宜的羧酸，按照上述两步序列，获得下述化合物：2S-氨基-丙酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羟基-四氢呋喃-2S-基甲酯，该化合物含有甲苯-4-磺酸(化合物7；98％；(M+H)⁺＝316；m.p.＝108-120℃)；2S-氨基-3-苯基-丙酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羟基-四氢呋喃-2S-基甲酯，该化合物含有甲苯-4-磺酸(化合物8；91％；(M+H)⁺＝392；m.p.＝114-136℃)；2S-氨基-4-甲基-戊酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羟基-四氢呋喃-2S-基甲酯，该化合物含有甲苯-4-磺酸(化合物9；95％；(M+H)⁺＝358；m.p.＝112-123℃)；2S-氨基-3S-甲基-戊酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羟基-四氢呋喃-2S-基甲酯，该化合物含有甲苯-4-磺酸(化合物10；91％；(M+H)⁺＝358；m.p.＝101.8-110.8℃)；2-甲基-丙酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羟基-四氢呋喃-2S-基甲酯(化合物12；94％；(M+H)⁺＝315；m.p.＝169-171.2℃)；2-氨基-乙酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羟基-四氢呋喃-2S-基甲酯，该化合物含有甲苯-4-磺酸(化合物13；91％；(M+H)⁺＝302；m.p.＝89.3-96.4℃)；2-甲基-氨基-乙酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羟基-四氢呋喃-2S-基甲酯，该化合物含有甲苯-4-磺酸(化合物14；83％；(M+H)⁺＝316；m.p.＝69.4-86.3℃)。

实施例8

2S-氨基-3-甲基-丁酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羟基-四氢呋喃-2S-基甲酯，盐酸盐(4：R ¹ ＝CH(NH₂)CH(CH₃)₂ )。

将左旋韦林(1，350mg，1.43mmol)在9.5mL THF中的悬浮液用L-Val-CBZ(360mg，1.43mmol)和三苯膦(600mg，2.29mmol)处理。反应物于室温搅拌，并滴加DEAD(0.28mL，1.8mmol)。反应物于室温搅拌过夜，并将所得悬浮液浓缩，进行色谱法(PTLC，7％MeOH/CH₂CL₂)，得到白色固态的2S-苄氧羰基氨基-3-甲基-丁酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羟基-四氢呋喃-2S-基甲酯(16％)。MS：MH⁺＝478(其它核苷的Mitsunobu偶联参见：Wei，Y.；Pei，D.Bioorg.Med.Chem.Lett.2000，10(10)，1073)。

向2S-苄氧羰基氨基-3-甲基-丁酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羟基-四氢呋喃-2S-基甲酯(170mg，0.35mmol)与50mg 10％Pd/碳的混合物中加入甲醇(10mL)和1M HCl(0.7mL)。在氢气氛(约1atm，气囊)下将所得悬浮液搅拌30分钟，并将反应物经CELITE垫过滤。浓缩滤液，用水稀释并冷冻干燥，得到2S-氨基-3-甲基-丁酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羟基-四氢呋喃-2S-基甲酯盐酸盐，为灰黄色吸湿性固体(化合物5，75％，(M+H)⁺＝344)。从稀HCl/IPA中重结晶，得到白色结晶固体；mp：154-156℃)。

采用适宜的羧酸，按照上述两步序列，获得下述化合物：2R-氨基-3-甲基-丁酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羟基-四氢呋喃-2S-基甲酯，该化合物含有甲苯-4-磺酸(化合物6；90％；(M+H)⁺＝344)。

实施例9

2，2-二甲基-丙酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羟基-四氢呋喃-2S-基甲酯(4：R ¹ ＝C(CH₃)₃ )。

向1-(6S-羟甲基-2-苯基-四氢-3αS，6αS-呋喃并[3，4-d][1，3]间二氧杂环戊烯-4S-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺(0.24g，0.72mmol)在3mL 1∶1 DMF/吡啶的溶液中加入2，2-二甲基丙酸酐(0.36mL，1.8mmol)和DMAP(0.04g，0.36mmol)。所得溶液于室温搅拌过夜，在50mL乙酸乙酯和饱和NH₄Cl溶液之间分配。水层用第二份乙酸乙酯萃取，所合并的有机层用盐水洗涤，经MgSO₄干燥，并浓缩。残余物进行色谱法(PTLC，5％MeOH/CH₂CL₂)，获得澄清油状的2，2-二甲基-丙酸6S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-2-苯基-四氢-3αS，6αS-呋喃并[3，4-d][1，3]-间二氧杂环戊烯-4S-基甲酯(95％)。

向2，2-二甲基-丙酸6S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-2-苯基-四氢-3αS，6αS-呋喃并[3，4-d][1，3]-间二氧杂环戊烯-4S-基甲酯(0.37g，0.88mmol)与50％湿的10％Pd(OH)₂/C(300mg)的混合物中加入甲醇(6mL)。将所得悬浮液于40℃和氢气氛(约1atm，气囊)下搅拌6小时，反应物经CELITE垫过滤。浓缩滤液，将所得油溶于1.5mL MeOH和10mLCH₂Cl₂中，然后加入3mL己烷至溶液刚开始变浑浊。过滤所沉淀的白色固体，得到2，2-二甲基-丙酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羟基-四氢呋喃-2S-基甲酯(化合物11；70％；(M+H)⁺＝329；m.p：139-141.6℃)。

采用适宜的羧酸酐，按照上述两步序列，获得下述化合物：庚酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羟基-四氢呋喃-2S-基甲酯(化合物31；70％)；丙酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羟基-四氢呋喃-2S-基甲酯(化合物36；70％)。

实施例10

辛酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羟基-四氢呋喃-2S-基甲酯(4：R ¹ ＝C₇H₁₅ )。

将1-(6S-羟甲基-2-苯基-四氢-3αS，6αS-呋喃并[3，4-d][1，3]-间二氧杂环戊烯-4S-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺(0.25g，0.75mmol)溶于1mL DMF和0.5mL吡啶中。在冰浴下搅拌反应溶液并滴加辛酰氯(0.16mL，0.94mmol)。然后将反应物于室温搅拌24小时。浓缩后，将残余物在乙酸乙酯和饱和氯化铵溶液之间分配。分层，水层用乙酸乙酯萃取一次。所合并的乙酸乙酯层用盐水洗涤，并经硫酸钠干燥。蒸发溶剂后，残余物在硅胶上经色谱法纯化，以5％甲醇/二氯甲烷为洗脱剂，获得0.2g(58％)辛酸6S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-2-苯基-四氢-3αS，6αS-呋喃并[3，4-d][1，3]-间二氧杂环戊烯-4S-基甲酯；(M+H)⁺＝459。如上所述，在化合物4的制备(见上文)中不加入TsOH，使苯亚甲基氢解，获得102mg(64％)辛酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羟基-四氢呋喃-2S-基甲酯，为结晶固体(乙酸乙酯-甲醇)(化合物34；(M+H)⁺＝371；m.p.＝154.4-155.8℃)。

采用适宜酰基氯，按照上述方法，制备下述化合物：壬酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羟基-四氢呋喃-2S-基甲酯(化合物35；82％；(M+H)⁺＝385；m.p.＝155-157.1℃)。

实施例11

碳酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羟基-四氢呋喃-2S-基甲酯异丙酯(4：R ¹ ＝O-i-C₃H₇ )。

将1-(6S-羟甲基-2-苯基-四氢-3αS，6αS-呋喃并[3，4-d][1，3]-间二氧杂环戊烯-4S-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺(0.3g，0.90mmol)溶于2.4mL无水DMF∶吡啶的1∶1混合物中。反应物置于冰/盐浴上并搅拌，同时历经20分钟缓慢加入氯甲酸异丙酯(Aldrich，1M甲苯溶液)。移去冰/盐浴并将反应物搅拌5小时，之后加入1mL甲醇并将反应物搅拌5分钟以上。蒸发反应物，残余物加入乙酸乙酯和饱和氯化铵溶液中。分层，水层用乙酸乙酯萃取。所合并的乙酸乙酯层用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，并蒸发得残余物。残余物在硅胶上经色谱法纯化，以5％甲醇/二氯甲烷洗脱，获得150mg(40％)碳酸6S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-2-苯基-四氢-3αS，6αS-呋喃并[3，4-d][1，3]-间二氧杂环戊烯-4S-基甲酯异丙酯(M+H)⁺＝419。如化合物4中所述，在没有TsOH的存在下，使碳酸6S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-2-苯基-四氢-3αS，6αS-呋喃并[3，4-d][1，3]间二氧杂环戊烯-4S-基甲酯异丙酯去保护，获得碳酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羟基-四氢呋喃-2S-基甲酯异丙酯(化合物16；92％；(M+H)⁺＝329；m.p.＝46-59℃)。

实施例12

1-(2S-氨基-3-甲基-丁酰基)-吡略烷-2S-甲酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑 -1-基)-3R，4S-二羟基-四氢呋喃-2S-基甲酯，盐酸盐(4：R ¹ ＝Pro-Val-H)。

将1-(6S-羟甲基-2-苯基-四氢-3αS，6αS-呋喃并[3，4-d][1，3]-间二氧杂环戊烯-4S-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺(0.35g，1.05mmol)溶于3.5mL无水DMF中。依次加入CBZ-NH-Val-Pro-OH(0.45g，1.32mmol，Bachem)、PyBOP(0.68g，1.32mmol，Nova Biochem)和DIPEA(0.27mL，1.58mmol)。于35℃搅拌18小时后，加入乙酸乙酯和饱和氯化铵溶液。分层，水层用乙酸乙酯萃取一次。所合并的乙酸乙酯层用水、饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤，经硫酸钠干燥。蒸发溶剂，残余物用2％甲醇/二氯甲烷经硅胶色谱法纯化。浓缩纯化的级分，得到370mg(53％)玻璃状的1-(2S-苄氧羰基氨基-3-甲基-丁酰基)-吡咯烷-2S-甲酸6S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-2-苯基-四氢-3αS，6αS-呋喃并[3，4-d][1，3]-间二氧杂环戊烯-4S-基甲酯(M+H)⁺＝663。

如化合物4(见上文)中所述，用HCl/乙醚(Aldrich，1M溶液)替换对甲苯磺酸，使苯亚甲基保护基团氢解，得到1-(2S-氨基-3-甲基-丁酰基)-吡咯烷-2S-甲酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羟基-四氢呋喃-2S-基甲酯盐酸盐(化合物18；79％；(M+H)⁺＝441；m.p.＝146-149℃)。

按照类似方法制备下述化合物的两种异构体：2-(吡咯烷-2S-甲酰氨基)-3-甲基-丁酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羟基-四氢呋喃-2S-基甲酯，该化合物含有甲苯-4-磺酸(化合物23，异构体1；88％；(M+H)⁺＝441；m.p.＝76-92℃；化合物33，异构体2；92％；(M+H)⁺＝441；m.p.＝120-136℃)。

方法C——二酰基衍生物的制备

实施例13

丁酸4S-丁酰氧基-5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-2S-羟甲基-四氢呋喃 -3S-基酯(7：R ¹ ＝C₃H₇ )。

向1-(3S，4R-二羟基-5S-三异丙基硅烷氧基甲基-四氢呋喃-2S-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺(0.40g，1.00mmol)在3.3mL THF中的搅拌浆状物中加入TEA(0.48mL，3.46mmol)和正丁酸酐(0.49mL，2.97mmol)。反应容器装有指形冷凝管，在氮气下于65℃加热17小时。反应物在乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠水溶液之间分配。有机层用盐水洗涤，经MgSO₄干燥，并浓缩。残余物经硅胶色谱法(20％丙酮/氯仿)纯化，得到47g(88％)澄清油状的丁酸4S-丁酰氧基-5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-2S-三异丙基硅烷氧基甲基-四氢呋喃-3S-基酯。

在室温下，向丁酸4S-丁酰氧基-5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-2S-三异丙基硅烷氧基甲基-四氢呋喃-3S-基酯(0.47g，0.88mmol)在5mL乙腈中的搅拌溶液中加入2.5mL的1N H₂SO₄。16小时后，加入30mL饱和NaHCO₃水溶液，产物用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，经MgSO₄干燥，并浓缩。将所得残余物溶于甲醇中，用乙醚沉淀出产物，得到18g(53％)丁酸4S-丁酰氧基-5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-2S-羟甲基-四氢呋喃-3S-基酯，为白色结晶固体。(化合物30；(M+Na)⁺＝407；m.p.＝135.3-135.9℃)。

按照上述方法，但使用适宜酸酐，获得下述化合物：异丁酸2S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-5S-羟甲基-4S-异丁酰氧基-四氢呋喃-3S-基酯(化合物17；38％；(M+Na)⁺＝407；m.p.＝179.0-179.6℃)；丙酸4S-丙酰氧基-5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-2S-羟甲基-四氢呋喃-3S-基酯(化合物19；27％；(M+H)⁺＝357；m.p.＝154.2-155.6℃)；2，2-二甲基丙酸4S-(2，2-二甲基丙酰氧基)-5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-2S-羟甲基-四氢呋喃-3S-基酯(化合物15；57％)；苯甲酸4S-苯甲酰氧基-5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-2S-羟甲基-四氢呋喃-3S-基酯(化合物28；67％)。

实施例14

2S-氨基-3-甲基-丁酸4S-(2S-氨基-3-甲基-丁酰氧基)-5S-(3-氨基甲酰基 -[1，2，4]三唑-1-基)-2S-羟甲基-四氢呋喃-3S-基酯二盐酸盐(7：R ¹ ＝CH(NH₂)-i-C₃H₇ )。

在室温下，向1-(3S，4R-二羟基-5S-三异丙基硅烷氧基甲基-四氢呋喃-2S-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺(0.47g，1.16mmol)在6mL THF中的搅拌浆状物中加入4S-异丙基-2，5-二氧代噁唑烷-3-甲酸苄酯(0.77g，2.79mmol)和8滴TEA。使反应物搅拌16小时，加入100mL饱和NaHCO₃水溶液使之淬灭，并用三份100mL乙酸乙酯萃取。合并有机层，用盐水洗涤，经MgSO₄干燥，并浓缩。所得薄层经硅胶色谱法(15％丙酮/氯仿)纯化，得到0.53g(53％)澄清油状的2S-苄氧羰基氨基-3-甲基-丁酸4S-(2S-苄氧羰基氨基-3-甲基-丁酰氧基)-5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-2S-三异丙基硅烷氧基甲基-四氢呋喃-3S-基酯。

向通入氩气的2-苄氧羰基氨基-3-甲基-丁酸4-(2-苄氧羰基氨基-3-甲基-丁酰氧基)-5-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-2-羟甲基-四氢呋喃-3-基酯(0.32g，0.46mmol)在10mL乙醇中的搅拌溶液中加入盐酸(.6mL，1.81mmol)和0.20g 10％Pd/C。将反应容器抽成真空并充入氢气(～1atm)三次，搅拌6小时。悬浮液经CELITE过滤，滤液浓缩。将残余物溶于甲醇/二氯甲烷(1∶10)溶液中，用己烷沉淀出产物，得到0.09g(38％)2S-氨基-3-甲基-丁酸4S-(2S-氨基-3-甲基-丁酰氧基)-5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-2S-羟甲基-四氢呋喃-3S-基酯二盐酸盐，为白色结晶固体(化合物3；(M+Cl)^-＝477；m.p.＝202.0-205.0℃)。

实施例15

2，2-二甲基-丙酸2S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-5S-(2，2-二甲基-丙酰氧基甲基)-4S-羟基-四氢呋喃-3S-基酯(9：R ¹ ＝C(CH₃)₃ )。

向1-(3R-羟基-5，5，7，7-四异丙基-四氢-1，4，6，8-四氧杂-5，7-二硅杂-3αS，9αS-环戊二烯并环辛烯-2S-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺(0.92g，1.88mmol)在7mL 1∶1 DMF/吡啶中的搅拌浆状物中加入DMAP(0.12g，0.94mmol)和2，2-二甲基丙酸酐(0.95mL，4.69mmol)，反应物搅拌24小时。将反应混合物在乙酸乙酯和饱和氯化铵水溶液之间分配。有机层用盐水洗涤，经MgSO₄干燥，并浓缩，得到澄清油状的2，2-甲基-丙酸2S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-5，5，7，7-四异丙基-四氢-3αS，9αS-1，4，6，8-四氧杂-5，7-二硅杂-环戊二烯并环辛烯-3S-基酯(99％)。

在室温下，向2，2-甲基-丙酸2S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-5，5，7，7-四异丙基-四氢-3αS，9αS-1，4，6，8-四氧杂-5，7-二硅杂-环戊二烯并环辛烯-3S-基酯(0.48g，0.92mmol)在5mL乙腈中的搅拌溶液中加入2.5mL 1N H₂SO₄。2小时后，加入30mL饱和NaHCO₃水溶液，产物用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，经MgSO₄干燥，并浓缩，得到2，2-二甲基-丙酸2S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-4S-(3-羟基-1，1，3，3-四异丙基二硅氧烷基氧基)-5S-羟甲基-四氢呋喃-3S-基酯(71％)。

向2，2-二甲基-丙酸2S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-4S-(3-羟基-1，1，3，3-四异丙基二硅氧烷基氧基)-5S-羟甲基-四氢呋喃-3S-基酯(0.38g，0.65mmol)在2.6mL 1∶1 DMF/吡啶中的搅拌浆状物中加入DMAP(0.40g，33mmol)和2，2-二甲基丙酸酐(0.33mL，1.63mmol)，反应物搅拌24小时。将反应物在乙酸乙酯和饱和氯化铵水溶液之间分配。有机层用盐水洗涤，经MgSO₄干燥，并浓缩，所得残余物经色谱法(15％丙酮/氯仿)纯化，得到2，2-二甲基-丙酸2S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-4S-(3-羟基-1，1，3，3-四异丙基-1，3-二硅氧烷基氧基)-5S-(2，2-二甲基-丙酰氧基甲基)-四氢呋喃-3S-基酯(54％)。

在室温下，向2，2-二甲基-丙酸2S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-4S-(3-羟基-1，1，3，3-四异丙基-1，3-二硅氧烷基氧基)-5S-(2，2-二甲基-丙酰氧基甲基)-四氢呋喃-3S-基酯(0.24g，0.35mmol)在5mL乙腈中的搅拌溶液中加入2.5mL 1N H₂SO₄。72小时后，加入30mL饱和NaHCO₃水溶液，产物用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，经MgSO₄干燥，并浓缩，残余物经制备HPLC纯化，得到2，2-二甲基-丙酸2S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-5S-(2，2-二甲基-丙酰氧基甲基)-4S-羟基-四氢呋喃-3S-基酯(化合物29，15％，(M+H)⁺＝413)。

方法D——混和酰基衍生物

实施例16

2S-氨基-3-甲基-丁酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3S，4S-双-异丁酰氧基-四氢呋喃-2S-基甲酯；该化合物含有甲苯-4-磺酸(8：R ¹ ＝i-Pr，R ² ＝CH(NH₂)CH(CH₃)CH₃ )。

在室温下，向异丁酸2S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-5S-羟甲基-4S-异丁酰氧基-四氢呋喃-3S-基酯(见上文实施例13，化合物17，0.50g，1.29mmol)在6mL THF中的搅拌浆状物中加入4S-异丙基-2，5-二氧代-噁唑烷-3-甲酸苄酯(0.43g，1.55mmol)和0.3mL TEA。使反应物搅拌12小时，用100mL饱和NaHCO₃水溶液使之淬灭，并用三份100mL乙酸乙酯萃取。所合并的萃取液用盐水洗涤，经MgSO₄干燥，并浓缩。残余物经色谱法(硅胶；35％乙酸乙酯/己烷)纯化，获得0.52g(65％)2S-苄氧羰基氨基-3-甲基-丁酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3S，4S-双-异丁酰氧基-四氢呋喃-2S-基甲酯；(M+H)⁺＝484。

向通入氩气的2S-苄氧羰基氨基-3-甲基-丁酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3S，4S-双-异丁酰氧基-四氢呋喃-2S-基甲酯(0.52g，0.84mmol)在10mL甲醇中的搅拌溶液中加入对甲苯磺酸(0.16g，0.84mmol)和0.15g 10％Pd/C。将反应容器抽成真空并通入氢气(约1atm)三次，搅拌3小时。然后浆状物经CELITE过滤，所得滤液浓缩，溶于甲醇/二氯甲烷(1∶10)溶液中，并用己烷沉淀，得到0.18g(33％)含甲苯-4-磺酸的2S-氨基-3-甲基-丁酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3S，4S-双-异丁酰氧基-四氢呋喃-2S-基甲酯化合物，为黄色固体(化合物22；(M+Na)⁺＝506；m.p.＝72.0-76.0℃)。

按照上述方法，采用丙酸4S-丙酰氧基-5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-2S-羟甲基-四氢呋喃-3S-基酯，得到2S-苄氧羰基氨基-3-甲基-丁酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3S，4S-双丙酰氧基-四氢呋喃-2S-基甲酯(77％；(M+H)⁺＝456)，使其去保护，得到2S-氨基-3-甲基-丁酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3S，4S-双-丙酰氧基-四氢呋喃-2S-基甲酯，该化合物含有甲苯-4-磺酸(化合物21；46％)。

方法E——N-酰基类似物的制备

实施例17

丁酸5S-(3-丁酰基氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-4S-丁酰氧基-2S-丁酰氧基甲基-四氢呋喃-3S-基酯

向左旋韦林(1，0.48g，2.0mmol)在7mL THF中的搅拌浆状物中加入TEA(1.65mL，11.8mmol)、正丁酸酐(1.97mL，10.8mmol)和DMAP(0.24g，2.0mmol)。反应容器于60℃加热24小时。将溶液在乙酸乙酯和饱和NaCO₃水溶液之间分配，有机层用盐水洗涤，经MgSO₄干燥，并浓缩。残余物经色谱法(35％乙酸乙酯/己烷)纯化，得到丁酸5S-(3-丁酰基氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-4S-丁酰氧基-2S-丁酰氧基甲基-四氢呋喃-3S-基酯(化合物39；71％，(M+Na)⁺＝547)。

按照上述方法还可制备：丙酸5S-(3-丙酰基氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-4S-丙酰氧基-2S-丙酰氧基甲基-四氢呋喃-3S-基酯(化合物37；95％，(M+H)⁺＝469)。

按照上述方法，采用适宜被保护的中间体，制备下述化合物：丁酸5S-(3-丁酰基氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-4S-丁酰氧基-2S-羟甲基-四氢呋喃-3S-基酯(化合物38；35％，(M+Na)⁺＝477)和1-(3S，4R-二羟基-5S-羟甲基-四氢呋喃-2S-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酸丁酰基酰胺(化合物40，58％，(M+H)⁺＝315)。

实施例18

Caco分析法

有关Caco分析法的概述参见：S.Yee的“体外穿过Caco-2细胞(结肠)的渗透性可预测在人体内(小肠)的吸收——是事实还是神话”(Pharm.Res.14(6)：763-766(1997))和Yamashita等人的“药物穿过Caco-2单层渗透的分析：与预测药物体内吸收的联系”(Pharm.Res.14(4)：486-491(1997))。对于具体的技术方面可参见：Grass，G.M.和Sweetana，S.A.的“采用新的扩散池来体外测定胃肠组织的渗透性”(Pharm.Res.5(6)：372-376(1988))；Rubas等人的“人结肠上皮(Caco-2)细胞系与家兔、猴和犬的结肠的渗透性质的比较以及人的药物吸收”(Pharm.Res.10(1)：113-117(1993))。

孵育培养基和培养条件：

将多次传代(108-120)的Caco-2细胞在含有高葡萄糖和L-谷酰胺的Dulbecco’s改良的Eagle培养基(DMEM)(Gibco/生命技术公司，目录号11965-084)中培养，该培养基补充有10％胎牛血清、1X L-谷酰胺(Gibco/生命技术公司，目录号25030-081)、1X青霉素-链霉素(Gibco/生命技术公司，目录号15140-122)和1X非必需氨基酸(Gibco/生命技术公司，目录号11140-019)。于37℃和5％CO₂下，将细胞维持在T225cm²的处理组织培养的细胞培养瓶(Cell Culture Flask Tissue Culture Treated)(Costar，目录号3001)中。对于转运实验，将细胞以7.1×10⁴个细胞/孔铺在带有插入物(inserts)的12孔覆盖胶原的PTFE膜聚苯乙烯板(Costar，目录号3493，直径为12mm，孔径为0.4um，无菌，处理组织培养)上。每3天喂养细胞，于37℃和5％CO₂下维持21天，以使紧密连接的极化单层形成完全。

储备液和工作溶液：

Kreb’s-Henseleit碳酸氢盐缓冲液，PH6.5和7.4

试剂：

蒸馏水(玻璃蒸馏或Nanopure)

Kreb’s-Henseleit碳酸氢盐缓冲混和物(粉末，SIGMA#K-3753)

二水氯化钙(MW＝147.0)

碳酸氢钠(MW＝84.01)

将Kreb’s-Henseleit碳酸氢盐缓冲混和物溶于约900mL水中。待缓冲混和物溶解后，加入0.373g二水氯化钙。待二水氯化钙溶解后，加入2.1g碳酸氢钠，在碳酸氢钠溶解后，加入适量水至1000mL，然后经0.2μm滤器除菌过滤，储存在冰箱中。

测试/标准化合物溶液

制备测试化合物在DMSO中的5mg/ml储备液，于4℃储存。用Kreb’s-Henseleit碳酸氢盐缓冲液(pH6.5)将所需量的5mg/ml储备液稀释至10mL，使浓度为100μM。然后将1mL的100μM溶液进一步稀释至5mL，使浓度为20μM。使用该20μM测试溶液作为初始剂量供给溶液(D0)。临用前将药物溶液温热至37℃。

分析步骤：

1.预温热缓冲液、工作溶液和三块含有缓冲液的12孔板，每块板有12个插入物。使用装有“筷式”电极的millicell^-ERS(Millipore，贝德福德，MA)检测TEER。由于TEER受温度影响，因此该操作应在细胞为约37℃时进行。仅使用那些TEER高于300欧姆的插入物。

2.倒出培养基，并用温热Kreb’s-Henseleit碳酸氢盐缓冲液洗涤每个插入物一次。

3.向细胞单层的顶侧加0.5mL Kreb’s-Henseleit缓冲液(pH6.5)，向底外侧室加1.25mL Kreb’s-Henseleit缓冲液(pH7.4)。细胞在37℃和5％CO₂的孵育箱内平衡至少30分钟。

4.除去顶侧的缓冲液，替换以0.5mL的20μM测试溶液。

5.然后将细胞在37℃和5％CO₂下孵育。

6.在30、60和90分钟的时间点，将插入物移至新的平板，该板接收侧含有1.25mL温热新鲜的Kreb’s-Henseleit缓冲液(pH7.4)。

7.收集所有板的培养基作为接收样品。

8.在60分钟转运研究后，在孔的顶侧加入荧光黄(0.05mL×1000μM)。在转运研究结束时(90分钟)，测量接收侧样品的荧光。

在实验结束时，收集供给侧的样品溶液作为D90样品。

由30(假设为0ng/mL)和60分钟时的样品数据计算测试物质的dC/dt。根据下述公式计算表观渗透系数(P_app)：

P_{app} - \frac{dQ}{dt} \times \frac{1}{A \times C_{0}} = \frac{dC}{dt} \times \frac{V}{A \times C_{0}}

其中dQ表示接收侧化合物含量的变化，dC表示接收侧化合物浓度的变化，V表示接受溶液的体积(cm³)，A表示插入物的表面积(cm²)，C₀表示药物的初始浓度，dC/dt表示接受侧溶液在90分钟的孵育期内药物浓度的变化，即，接受溶液中药物浓度对时间的斜率(μg/cm³/秒)。

表4.所选择化合物的Caco-2细胞分析渗透率

化合物编号	Caco-2渗透率(×10⁶cm/秒)
化合物编号	Caco-2渗透率(×10⁶cm/秒)	2	7.8
3	8.6	2	7.8
3	8.6	5	5.6
7	1.2	5	5.6
7	1.2	9	0.9
10	1.5	9	0.9
10	1.5	17	4.8
18	3.4	17	4.8

28	26.6
28	26.6	34	6.5

实施例19

口服施用组合物

成分％wt./wt.

活性成分 20.0％

乳糖 79.5％

硬脂酸镁 0.5％

将成分混和，分装入胶囊，每粒胶囊含有约100mg；一粒胶囊近似于一个全天剂量。

实施例20

口服施用组合物

成分％wt./wt.

活性成分 20.0％

硬脂酸镁 0.5％

交联羧甲纤维素钠 2.0％

乳糖 76.5％

PVP(聚乙烯吡咯烷酮) 1.0％

将成分混和，并采用溶剂如甲醇制粒。然后将制剂干燥，并采用适宜压片机制成片剂(含有约20mg活性化合物)。

实施例21

口服施用组合物

成分量

活性化合物 1.0g

富马酸 0.5g

氯化钠 2.0g

尼泊金甲酯 0.15g

尼泊金丙酯 0.05g

粒状糖 25.5g

山梨醇(70％溶液) 12.85g

Veegum K(Vanderbilt Co.) 1.0g

矫味剂 0.035mL

着色剂 0.5mg

蒸馏水适量至100mL

将成分混合，形成口服施用悬浮液。

如果适当的话，在上述说明书、随后的权利要求书或附图中所公开的以具体形式或者实施所公开的功能或者方法或操作(所述方法或操作实现所公开的结果)的方式表示的特征可分别或任意组合，用于以多种形式实现本发明。

为了清楚和便于理解，已经通过举例说明和示例的方法详细描述了上述发明。对本领域技术人员而言显而易见的是，可在所附权利要求的范围内进行改变和变通。因此，应当理解，上述说明书用于举例说明而非用于限制本发明。因此，本发明的范围不应当参考上述说明书来确定，而应当参考所附的权利要求以及这些权利要求所表述的等同物的全部范围来确定。

本申请所引用的所有专利、专利申请和出版物在此处为所有目的而全文引入作为参考，如同每个专利、专利申请或出版物逐一列出一样。

Claims

1.式I化合物，

其中，R¹、R²和R³独立地选自氢、C_1-10酰基、C_1-10烷氧羰基和COR⁴，其中COR⁴是氨基酸或二肽，

以及所述化合物的水合物、溶剂化物、包合物和酸加成盐。

2.权利要求1所述的化合物，其中R¹、R²和R³中之一是COR⁴，R⁴是CH(R⁵)NH₃ ⁺Cl^-或吡咯烷-2-基，R⁵是天然存在的疏水性氨基酸的侧链或者是C_1-6直链或支链烷基，以及R¹、R²和R³中的其它基团独立地选自氢、C_1-10酰基和C_1-10烷氧羰基。

3.权利要求1或2所述的化合物，其中R¹是COR⁴，R⁴是CH(R⁵)NH₃ ⁺Cl^-或吡咯烷-2-基，且R²和R³独立地选自氢、C_1-10酰基和C_1-10烷氧羰基。

4.权利要求1至3所述的化合物，其中R¹是COR⁴，R⁴是CH(R⁵)NH₃ ⁺Cl^-，R⁵选自CH(CH₃)₂和CH(CH₃)CH₂CH₃，且R²和R³均为氢。

5.权利要求1至4所述的化合物，其中R¹是COR⁴，R⁴是CH(R⁵)NH₃ ⁺Cl^-，R⁵是CH(CH₃)₂，且R²和R³均为氢。

6.权利要求1至5所述的化合物，其中该化合物是2S-氨基-3-甲基-丁酸5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-3R，4S-二羟基-四氢呋喃-2S-基甲酯盐酸盐。

7.权利要求1的化合物，其中R¹、R²和R³独立地是C_1-10酰基或C_1-10烷氧羰基。

8.权利要求1或7所述的化合物，其中该化合物是：丙酸3S，4S-双-丙酰氧基-5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-四氢呋喃-2S-基甲酯。

9.权利要求1或7所述的化合物，其中R¹是C_1-10酰基或C_1-10烷氧羰基氢，且R²和R³均为氢。

10.权利要求1或7所述的化合物，其中R¹是氢，且R²和R³独立地是C_1-10酰基或C_1-10烷氧羰基。

11.权利要求1或7所述的化合物，其中该化合物是：异丁酸2S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-5S-羟甲基-4S-异丁酰氧基-四氢呋喃-3S-基酯；或2，2-二甲基丙酸4S-(2，2-二甲基丙酰氧基)-5S-(3-氨基甲酰基-[1，2，4]三唑-1-基)-2S-羟甲基-四氢呋喃-3S-基酯。

12.式II化合物，

其中，R¹、R²和R³独立地选自氢、C_1-10酰基、C_1-10烷氧羰基和COR⁴，其中COR⁴是氨基酸或二肽；R⁶是C_1-10酰基，

以及所述化合物的水合物、溶剂化物、包合物和酸加成盐。

13.权利要求1至12所述的化合物，用于在疗法中使用。

14.权利要求1至12所述的化合物，用于在由丙型肝炎病毒介导的疾病的疗法中使用。

15.权利要求1至12的化合物在制备用于在疗法使用的药物中的用途。

16.权利要求1至12的化合物在制备用于在由丙型肝炎病毒介导的疾病的疗法中使用的药物中的用途。

17.药用组合物，该组合物包含治疗有效量的权利要求1至12的化合物和至少一种可药用载体，以及任选含有赋形剂。