CN1733129A - 治疗炎性骨病的药物组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种治疗炎性骨病的药物组合物，主要由黄连2－10份、黄柏2－10份、黄芩2－10份、蜈蚣1－5份、全蝎1－5份、壁虎1－5份制成，其可抑制炎症介质IL－1、TNF－α、IL－2及前列腺素E2，用于治疗炎性骨病，包括风湿关节炎、类风湿关节炎、关节炎、强直性脊柱炎、骨质增生以及神经痛，具有显著镇痛和消炎作用，不良反应少，标本兼治。

Description

治疗炎性骨病的药物组合物及其制备方法

技术领域

本发明属于治疗炎性骨病的药物组合物及其制备方法，尤其是源于中药的治疗关节炎、类风湿关节炎、强直性脊柱炎等的药物组合物及其可工业的制备方法。

背景技术

炎性骨病主要涉及的炎症介质有IL-1、TNF-α、IL-2、前列腺素E2，且往往伴有痛疼。例如类风湿关节炎(RA)是一种以关节滑膜慢性炎症病变为主要特征的自身免疫性疾病。该病以对称性关节疼痛、肿胀和僵硬为主要特征，并伴有免疫功能的异常。遗传、感染、环境、神经内分泌、免疫系统等多种复杂因素参与或加重类风湿关节炎的病变过程。其病理特点是滑膜细胞增生，多种炎细胞浸润，血管翳形成，继而引起软骨和骨组织的破坏，最终导致关节畸形和功能丧失。滑膜细胞增生与高水平的细胞因子产生有关，这些细胞因子通过与靶细胞上的特意性受体结合来表达其生物学功能。细胞因子是细胞间相互作用的重要介质，如被抗原-HLA复合物活化了的巨噬细胞能分泌白介素-1(IL-1，下同)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α，下同)等，它们起了活化T淋巴细胞的作用。活化了的淋巴细胞则分泌IL-2、λ干扰素等，λ干扰素又转而促进巨噬细胞的HLA-DR分子的表达，IL-2促使T淋巴细胞本身的增殖及巨噬细胞的活化。细胞因子一方面使巨噬细胞、淋巴细胞在疾病过程中持续被活化，造成RA慢性过程；另一方面它也是许多临床表现的因素。如IL-1等促使花生四稀酸的代谢造成滑膜炎症，它也激活胶原酶和破骨细胞，致使关节软骨和骨破坏，促使肝合成急性期蛋白以致血沉、C反应蛋白升高。TNF-α可刺激滑膜细胞产生IL-6以及促进滑膜成纤维细胞的增殖，还可促进中性粒细胞黏附与血管内皮和游走进入关节滑膜液中。因此IL-1、TNF-α是RA发病机理中居于中心地位的促炎症细胞因子，是关节软骨破坏的最重要的炎症介质[参见：蔡青，孟济明，IL-1和TNF与类风湿关节炎。上海免疫学杂志，1998，18(1)：62-3]。有研究表明，IL-2在RA病人的血液及关节滑液中大量增加，除了作为炎性因子损伤关节滑膜之外，也可能参与了免疫平衡紊乱的病理过程，IL-2的表达增加与疾病的严重性相关(Romas E，Bakharevski O，Hards DK，et al.Expression ofosteoclast differentiation factor at sites of bone erosion in collagen-induced arthritis.ArthritisRheum，2000；43(4)：821-6.)。前列腺素2(PGE₂，下同)既是炎症介质，又是免疫调质。在RA中滑膜细胞和中性粒细胞产生前列腺素等炎性介质，高浓度的PGE₂能使骨组织吸收破坏增加，还刺激软骨细胞和破骨细胞，减少糖蛋白合成，增加粘蛋白降解，并产生胶原酶及其它中性蛋白酶，释放骨钙，导致软骨基质崩解，软骨吸收和骨破坏。

目前治疗炎性骨病如类风湿关节炎尚未找到特异有效的治疗方法，常用药物可分为非甾体抗炎药(NSAIDs)、慢作用抗风湿药(SAARDs)、肾上腺皮质激素等；治疗的主要目的是控制炎症和关节的破坏。由于上市的药物中大多存在各种不同的缺点，一般治标不治本，且难以阻止疾病的进程，长期使用不良反应较多，临床应用受到限制。

发明内容

本发明要解决的技术问题是研究源于中药的治疗炎性骨病的药物组合物及其制备方法，尤其是治疗风湿关节炎、类风湿关节炎、关节炎、强直性脊柱炎、骨质增生、神经痛等。不仅能够具有显著镇痛和消炎作用，而且可以标本兼治，力求不良反应少，并能阻止疾病的进程。即本发明药物组合物应能够抑制涉及关节软骨破坏的最重要的炎症介质IL-1、TNF-α，应能够抑制IL-2的表达，以阻止疾病的进程，应能降低炎性肿胀足前列腺素E2的含量，以抑制骨组织吸收破坏，最终改善病变关节的病理组织结构，以有效治疗炎性骨病。

为解决上述问题，本发明提供如下技术方案。

一种治疗炎性骨病的药物组合物，其特征在于主要是由下列重量份的原料药制成：黄连2-10份、黄柏2-10份、黄芩2-10份、蜈蚣1-5份、全蝎1-5份、壁虎1-5份。

本发明药物组合物，优选原料药的用量为：黄连4-8份、黄柏4-8份、黄芩4-8份、蜈蚣2-3份、全蝎2-3份、壁虎2-3份。更优选原料药的用量为：黄连6份、黄柏6份、黄芩6份、蜈蚣3份、全蝎3份、壁虎3份。

本发明药物组合物的制备方法，包括下列步骤：

1)称取各原料药，备用；

2)将所述重量配比的原料药用水和/或乙醇提取，得提取液A；

3)将步骤2)的提取液A浓缩，得浓缩液B，与药学上可接受的辅料混合，制得口服制剂。

前述药物组合物的制备方法，其步骤2)中原料药用含0～95％乙醇的水溶液提取，得提取液A；步骤3)中浓缩液B加入乙醇至溶液含醇量达70-80％，将该含醇液放置后过滤，取滤液浓缩，得浓缩液C；将浓缩液C与药学上可接受的辅料混合，制得胶囊剂、口服液、片剂或丸剂。优选的制备方法中，原料药用水或20～50％乙醇液提取，得提取液A；向浓缩液C中，加入乙醇至溶液含醇量达80-90％；将该含醇液放置后过滤，取滤液浓缩至无醇味后，与药学上可接受的辅料混合，制得胶囊剂或丸剂。

本发明药物组合物的制备方法，包括下列步骤：

1)称取各原料药，备用；

2)将所述重量配比的原料药用水和/或乙醇提取，得提取液A；

3)将步骤2)的提取液A浓缩，得浓缩液B；

4)取步骤3)的浓缩液B加入乙醇至溶液含醇量达70-80％，将该含醇液放置后过滤，取滤液浓缩，得浓缩液C；

5)向步骤4)的浓缩液C中，加入乙醇至溶液含醇量达80-90％；将该含醇液放置后过滤，取滤液浓缩至无醇味后，加入水，放置后，过滤，滤液浓缩至浸膏D；

6)取步骤5)的浸膏D与药学上可接受的载体混合，制成各种制剂。

前述药物组合物的制备方法中，优选

1)称取各原料药，备用；

2)将所述重量配比的原料药用液含0～95％乙醇的水溶液提取，得提取液A；

3)将步骤2)的提取液A浓缩，得浓缩液B；

4)取步骤3)的浓缩液加入乙醇至溶液含醇量达75％，将该含醇液放置后过滤，取滤液浓缩，得浓缩液C；

5)向步骤4)的浓缩液C中，加入乙醇至溶液含醇量达85％；将该含醇液放置后过滤，取滤液浓缩至无醇味后，加水至溶液体积为药材重量的1.2-1.5倍，放置后过滤，滤液浓缩，得浸膏D；取浸膏D与药学上可接受的载体混合，制成各种制剂。

前述制备方法中，优选将所述重量配比的原料药用水或20～50％乙醇提取，得提取液A；浓缩后过滤，向滤液中加乙醇至溶液含醇量达75％，静置过夜，过滤，取滤液浓缩除尽乙醇，冷藏过夜后，过滤，取滤液加乙醇至溶液含醇量达85％，再冷藏过夜，过滤，滤液回收乙醇并蒸发除尽乙醇得浓缩液，加水至溶液体积为药材重量的1.3-1.4倍，冷藏后过滤，滤液浓缩至相对密度为1.36的浸膏，按常规制成注射液或口服制剂。

本发明药物组合物在制备抑制炎症介质IL-1、TNF-α和/或抑制IL-2的表达药物中的应用，包括在制备治疗炎性骨病中药物中的应用，所述炎性骨病有风湿关节炎、类风湿关节炎、关节炎、强直性脊柱炎、骨质增生，以及与炎性骨病有关的神经痛。

本发明治疗炎性骨病的高、中、低三个剂量组药物组合物，包括治疗风湿关节炎、类风湿关节炎、关节炎、强直性脊柱炎、骨质增生、神经痛等。不仅具有显著镇痛和消炎作用，而且可以标本兼治，不良反应少，并能阻止疾病的进程。即本发明药物组合物抑制了涉及关节软骨破坏的最重要的炎症介质IL-1、TNF-α，抑制了IL-2的表达，阻止了疾病的进程，降低了炎性肿胀足前列腺素E₂的含量，抑制了骨组织吸收破坏，最终改善了病变关节的病理组织结构，达到有效治疗炎性骨病的有益效果。

实验表明：本发明药物组合物可抑制二甲苯所致小鼠耳肿胀、角叉菜胶所致的大鼠足跖肿胀、抑制大鼠棉球肉芽组织增生及氟氏完全佐剂诱导的大鼠关节炎的原发性和继发性病变；对小鼠热板、醋酸扭体致痛均有明显的镇痛作用。本发明病理切片结果显示本发明药物组合物对佐剂性关节炎大鼠病变关节的病理组织结构有明显的改善作用，而佐剂性关节炎大鼠模型组踝关节周围软组织内见大量炎细胞浸润，滑膜上皮细胞增生、肿胀，滑膜组织不完整。本发明药物组合物能降低大鼠佐剂性关节炎细胞因子的含量以及抑制淋巴细胞的分裂增殖。本发明药物组合物能降低大鼠佐剂性关节炎炎性肿胀足前列腺素E₂的含量。所有这些实验表明本发明药物组合物不是单纯的镇痛或消炎，而是标本兼治。

氟氏完全佐剂诱导的大鼠多发性关节炎类似于人的类风湿关节炎，常用来筛选抗风湿药。其病理变化一般分为三个阶段：①致炎后10天内逐渐出现早期炎症反应，尤其头三天足肿胀达高峰，以后逐渐减弱。②第10天到18天因迟发型超敏反应，可出现多发性关节炎症状。③26天以后症状逐渐减轻和消退，可能遗有永久性关节畸形(陈纪潘，赵会芳等，通痹灵对大鼠佐剂性关节炎滑膜细胞功能的影响[J]。中国中西医结合杂志，1999，19(3)：167-169)。实验数据表明本发明药物组合物对第一阶段至第三阶段均有效。

附图说明

图1、体外给药对佐剂性关节炎大鼠胸腺和脾淋巴细胞增殖及IL-2产生的影响( x±S，n＝4)

具体实施方式

原料药黄连(Coptis chinensis)、黄柏(Phellodendro)、黄芩(Radix scutellariae)、蜈蚣(Scolopendra subspinipes mutilans)、全蝎(Scorpio)、壁虎(Gekko)(又名天龙)均为市购，且符合药典相关项下标准。

实施例一

称取黄连、黄柏、黄芩各100克；蜈蚣、全蝎、壁虎各50克。

原生药450克，粉为粗末，加水煎煮三次，每次一小时，过滤，合并滤液，浓缩至近600ml，放冷，过滤，滤液加95％乙醇至溶液含醇量达75％，静置过夜，过滤，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度为1.36的浸膏，加入淀粉和微晶纤维素适量，混合均匀，制成适宜软材过22目筛制颗粒，60℃鼓风干燥，20目筛整粒，颗粒填充入2号胶囊壳成品。

实施例二

黄连、黄柏、黄芩各10克，蜈蚣、天龙、全蝎各1克，粉碎成粗末，混合，95％乙醇浸泡过夜，回流三次，合并乙醇液，过滤，浓缩至0.75g药材/ml，加入常规矫味剂，得口服液。

实施例三

黄连、黄柏、黄芩各20克，蜈蚣、天龙、全蝎各50克，粉为粗末，混合，20％乙醇浸泡过夜，回流3次，合并回流液，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.35的浸膏，加入淀粉和微晶纤维素适量，混合均匀，制成适宜软材过22目筛制颗粒，60℃鼓风干燥，20目筛整粒，颗粒填入2号胶囊壳。

实施例四

黄连、黄柏、黄芩各60克，蜈蚣、天龙、全蝎各30克，粉为粗末，混合，50％乙醇浸泡过夜，回流3次，合并回流液，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.36的浸膏，加入淀粉和微晶纤维素适量，混合均匀，制成适宜软材过22目筛制颗粒，60℃鼓风干燥，20目筛整粒，颗粒填入2号胶囊壳。

实施例五

称取黄连、黄柏、黄芩各40克，蜈蚣、天龙、全蝎各30克。

将原生药粉为粗末，加水煎煮三次，每次一小时，过滤，合并滤液，浓缩至273ml，放冷，过滤，滤液加95％乙醇至溶液含醇量达70％，静置过夜，过滤，滤液回收乙醇并浓缩至273ml，冷藏，过夜，过滤，滤液再加95％乙醇至溶液含醇量达80％，再冷藏，过夜，过滤，滤液回收乙醇并蒸发除尽乙醇得浓缩液，加蒸馏水至273ml，冷藏冰箱40小时，过滤弃去鞣质，滤液浓缩至相对密度为1.36的浸膏，加入淀粉和微晶纤维素适量，混合均匀，制成适宜软材过22目筛制颗粒，60℃鼓风干燥，20目筛整粒，颗粒填充入2号胶囊壳成品。

实施例六

称取黄连、黄柏、黄芩各80克；蜈蚣、全蝎、壁虎各30克。

原生药粉为粗末，加水煎煮三次，每次一小时，过滤，合并滤液，浓缩至约462ml，放冷，过滤，滤液加95％乙醇至溶液含醇量达80％，静置过夜，过滤，滤液回收乙醇并浓缩至近462ml，冷藏，过夜，过滤，滤液再加95％乙醇至溶液含醇量达90％，再冷藏，过夜，过滤，滤液回收乙醇并蒸发除尽乙醇得浓缩液，加蒸馏水至近462ml，冷藏冰箱40小时，过滤弃去鞣质，滤液浓缩至相对密度为1.36的浸膏，加入注射用水至0.75g药材/ml，精滤后灌装，经灭菌、灯检、质检后，得本发明药物组合物注射液。

实施例七

称取黄连、黄柏、黄芩各100克；蜈蚣、全蝎、壁虎各50克。

原生药粉为粗末，加水煎煮三次，每次一小时，过滤，合并滤液，浓缩至近600ml，放冷，过滤，滤液加95％乙醇至溶液含醇量达75％，静置过夜，过滤，滤液回收乙醇并浓缩至近600ml，冷藏，过夜，过滤，滤液再加95％乙醇至溶液含醇量达85％，再冷藏，过夜，过滤，滤液回收乙醇并蒸发除尽乙醇得浓缩液，加蒸馏水至近600ml，冷藏冰箱40小时，过滤弃去鞣质，滤液浓缩至相对密度为1.36的浸膏，加入注射用水至0.75g药材/ml，精滤后灌装，经灭菌、灯检、质检后，得本发明药物组合物注射液。

实施例八

称取黄连、黄柏、黄芩各80克；蜈蚣、全蝎、壁虎各20克。

原生药粉为粗末，加水煎煮三次，每次一小时，过滤，合并滤液，滤液浓缩至浸膏，常规制作丸剂。

实施例九

本发明药物组合物对大鼠佐剂性关节炎的药效学研究

大鼠佐剂性关节炎是兼有体液免疫和细胞免疫变化的慢性系统性免疫性炎症，与类风湿关节炎有许多共同的组织学和免疫学特征。

实验表明：本发明药物组合物对二甲苯致小鼠耳肿胀和大鼠棉球肉芽肿的形成有明显抑制作用，它既可抑制大鼠佐剂性关节炎致炎局部的早期反应，又可抑制对侧足因迟发性超敏反应引起的肿胀。可明显抑制角叉菜胶所致大鼠足跖的炎症反应；对小鼠热板和醋酸扭体致痛有明显的镇痛作用。

复方乙酰水杨酸片，规格：25mg/片，由南京白敬宇制药厂提供，批号：030228。地塞米松(Dexamethasone)针剂，规格：5mg/ml，由金陵药业股份有限公司南京金陵制药厂提供，批号：021205。度冷丁(Dolantin，Pethidine)，规格：100mg/2ml，由湖北宜药集团有限责任公司提供，批号：010408。本发明药物组合物选用实施例一、二、三、四口服制剂灌胃，或者实施例七的注射液腹腔注射。二甲苯(Xylene)，苏州振兴化工研究所，批号：971101；角叉菜胶，美国Sigma公司，批号：073K0051；氟氏完全佐剂，规格：10ml/支，Sigma公司，由北京舒伯伟化工仪器有限责任公司提供，批号：033K8933。

昆明种小鼠，体重20±2克：SD大鼠，雄性，体重180±20克；由中国药科大学动物房提供；合格证号：SCKX(苏)，2002-0011。

1、小鼠耳二甲苯致炎试验

实验方法：取体重20±2克的昆明种小鼠60只，雌雄各半，随机分成五组，每组12只。分别为阳性对照组(阿司匹林)、阴性对照组(蒸馏水)及本发明药物组合物高、中、低(分别用H、M、L表示，下同)三个剂量组。阳性及阴性对照组连续口服给药7天，每天一次：本发明药物组合物组分别连续肌注或口服给药7天，每天一次。结果见下述各表。

表1、本发明药物组合物对二甲苯所致小鼠耳肿胀度的影响试验(n＝12， x±S)

组别	剂量(g/kg)	肿胀度(mg)	抑制率(％)	活性比
					蒸馏水阿司匹林本发明药物组合物(H)本发明药物组合物(M)本发明药物组合物(L)	0.200.780.390.195	11.7±1.28.1±2.2**9.0±1.7**10.1±1.4**11.4±1.3	030.823.113.72.6	010.750.440.08

^**P＜0.01对 蒸馏水

实施例七注射液肌注实验表明：与阴性对照组相比，阳性对照组(阿司匹林0.2g/kg/20ml)与本发明药物组合物高(0.78g/kg/20ml)、中(0.39g/kg/20ml)两个剂量组均可明显抑制二甲苯致小鼠耳肿胀(P＜0.01)；其抑制率分别为30.8％、23.1％、13.7％。

表2、本发明药物组合物对二甲苯致小鼠耳肿胀的结果或影响如下：

组别	剂量(g/kg)	肿胀度(mg)	抑制率(％)	活性比
					模型组阳性组本发明药物组合物(高)本发明药物组合物(中)本发明药物组合物(低)	0.200.780.390.195	11.2±3.26.1±2.3**6.6±2.4**7.4±3.3*8.74±3.0	045.539.333.922.3	010.860.750.49

^**P＜0.01，^*P＜0.05对 模型组

实施例一口服制剂实验表明：与对照组相比，阿司匹林(0.20g/kg)与本发明药物组合物高(0.78g/kg)、中(0.39g/kg)两个剂量组均可明显抑制二甲苯致小鼠耳肿胀(P＜0.01，P＜0.05)；其抑制率分别为45.5％、39.3％、33.9％。

表3、本发明药物组合物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响

组别	剂量(g/kg)	肿胀度(mg)	抑制率(％)	活性比
					模型组阳性组本发明药物组合物(高)本发明药物组合物(中)本发明药物组合物(低)	0.200.780.390.195	12.6±1.45.9±1.5**5.6±1.3**6.4±1.4**9.6±0.7**	048.550.343.724.4	011.040.900.50

^**P＜0.01对模犁组

实施例三口服制剂实验表明：与对照组相比，阿司匹林(0.20g/kg)与本发明药物组合物高(0.78g/kg)、中(0.39g/kg)、低(0.195g/kg)三个剂量组均可明显抑制二甲苯致小鼠耳肿胀(P＜0.01)；其抑制率分别为48.5％、50.3％、43.7％、24.4％。

表4、本发明药物组合物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响

组别	剂量(g/kg)	肿胀度(mg)	抑制率(％)	活性比
					模型组阳性组本发明药物组合物(高)本发明药物组合物(中)本发明药物组合物(低)	0.200.780.390.195	11.9±3.56.0±2.1**6.3±2.7**7.1±3.2*8.3±3.8	049.647.140.330.3	010.950.810.61

^**P＜0.01，^*P＜0.05对 模型组

实施例四口服制剂实验表明：与对照组相比，阿司匹林(0.20g/kg)与本发明药物组合物高(0.78g/kg)、中(0.39g/kg)两个剂量组均可明显抑制二甲苯致小鼠耳肿胀(P＜0.01，P＜0.05)：其抑制率分别为49.6％、47.1％、40.3％。

表5、本发明药物组合物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响

剂量

肿胀度

抑制率

活性比

组别	(g/kg)	(mg)	(％)
					模型组阳性组本发明药物组合物(高)本发明药物组合物(中)本发明药物组合物(低)	0.200.780.390.195	12.2±3.06.4±2.5**7.3±3.1**7.9±3.6*9.8±3.7	047.540.235.219.7	010.850.740.41

^**P＜0.01，^*P＜0.05对 模型组

实施例二口服制剂实验表明：与对照组相比，阿司匹林(0.20g/kg)与本发明药物组合物高(0.78g/kg)、中(0.39g/kg)两个剂量组均可明显抑制二甲苯致小鼠耳肿胀(P＜0.01，P＜0.05)；其抑制率分别为47.5％、40.2％、35.2％。

2、大鼠足跖角叉菜胶致肿法

取健康雄性SD大鼠，体重160-180克，50只，按体重随机分成5组，即阳性对照组(地塞米松)、阴性对照组(生理盐水)以及本发明药物组合物高、中、低三个剂量组；各组分别给予地塞米松、生理盐水以及本发明药物组合物肌注，连续七天，每天一次(表中如未特别注明mg/kg，均表示剂量单位为g/kg，下同)。末次给药后30分钟，分别在每鼠右后足跖皮下注射1％角叉菜胶0.1ml致炎，测量致炎前及致炎后1、2、4、6小时右后足跖关节下的容积，以致炎前体积为基数，计算致炎后各时段点的肿胀度和肿胀度抑制率。所有数据均用 x±SD表示，采用t检验比较给药组与模型对照组差异情况。结果见下。

表6、本发明药物组合物对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀度的影响试验(n＝10， x±S)

组别	剂量(g/kg)	肿胀度(ml)
						1h	2h	4h	6h
		生理盐水地塞米松本发明药物组合物(H)本发明药物组合物(M)本发明药物组合物(L)	0.4mg/kg0.540.270.135	21.0±2.06.6±4.2**11.1±3.0**15.2±2.9**16.2±4.6**	34.4±4.113.8±2.5**17.0±2.3**20.1±4.3**22.0±3.7**					53.1±3.819.7±2.4**24.3±2.8**24.8±4.8u30.9±4.0**	45.5±5.014.9±3.8**21.6±3.7**21.2±5.1**26.7±4.7**

^**P＜0.01对 生理盐水

表7、本发明药物组合物大鼠足跖角叉菜胶致肿法4小时点的抑制率和活性比(n＝10， x±S)

剂量

肿胀度

抑制率

活性比

组别	(g/kg)	(ml)	(％)
					生理盐水地塞米松本发明药物组合物(H)本发明药物组合物(M)本发明约物组合物(L)	0.4mg/kg0.540.270.135	53.1±3.819.7±2.4**24.3±2.8**24.8±4.8**30.9±4.0**	062.954.253.341.8	010.860.850.66

^**P＜0.01对 生理盐水

实验表明：与阴性对照组相比，阳性对照组(地塞米松0.4mg/kg/2ml)与本发明药物组合物高(0.54g/kg/2ml)、中(0.27g/kg/2ml)、低(0.135g/kg/2ml)三个剂量组1、2、4、6小时点均明显抑制角叉菜胶所致大鼠关节肿胀：其中在4小时点的抑制率和活性比最大(P＜0.01)；在4小时点的抑制率分别为62.9％、54.2％、53.3％、41.8％，活性比分别为0.86、0.85、0.66。

3、大鼠棉球肉芽肿法

实验方法：取健康雄性SD大鼠，体重160-180克，50只，在乙醚浅麻醉、无菌条件下作一胸部切口，将20±1mg无菌棉球植入两侧腋窝下，切口缝合后以青霉素及链霉素防止感染。手术后将大鼠随机分成5组，每组10只，分别为阳性对照组、阴性对照组及本发明药物组合物高、中、低三个剂量组。手术当天手术前1小时给药，肌肉注射连续7天，每天一次物。

表8、本发明药物组合物对大鼠棉球肉芽肿形成的影响试验(n＝10， x±S)

组别	剂量(g/kg)	肉芽重量(mg)	抑制率(％)	活性比
					生理盐水地塞米松本发明药物组合物(H)本发明药物组合物(M)本发明药物组合物(L)	0.4mg/kg0.540.270.135	95.9±18.823.0±3.2**71.3±8.6**84.4±10.290.3±13.0	076.025.712.05.8	010.340.160.08

^**P＜0.01对 生理盐水

实验表明：与阴性对照组相比，阳性对照组(地塞米松0.4mg/kg/2ml)与本发明药物组合物高剂量组(0.54g/kg/2ml)能明显抑制大鼠棉球肉芽肿的形成(P＜0.01)；其抑制率分别为76.0％、25.7％。

4、氟氏完全佐剂诱导的大鼠关节炎试验

按文献方法(陈奇中药药理研究方法学[M]。北京：人民卫生出版社，1993，369)先用强力碘消毒大鼠左后足跖，再将0.1ml氟氏完全佐剂(FCA)皮内注入大鼠足跖。

取健康雄性SD大鼠，体重160-200克，50只，按体重平均分为5组，每组10只，即：阳性对照组、阴性对照组及本发明药物组合物高、中、低三个剂量组，以Freund’s完全佐剂致炎(即在大鼠左后脚足跖部皮内注射0.1mlFCA，注射前先用强力碘消毒)，从致炎前两天开始给药，给药途径为肌注。采用容积法测量给药前及致炎后的足容积；然后按文献方法(郑高利，赖氨匹林的解热、镇痛和抗炎作用。新药与临床，1997，1(3)：32)计算肿胀度及肿胀度抑制率。

[Vn为致炎前足容积；Vt为致炎后足容积]

[Et为给药组平均肿胀度；Ec为对照组平均肿胀度]

表9、本发明药物组合物对大鼠佐剂性关节炎原发性病变影响的试验(n＝10， x±S)

组别	剂量(g/kg)	注射侧足跖肿胀度(ml)
						2d	7d	14d	21d
		生理盐水地塞米松本发明药物组合物(H)本发明药物组合物(M)本发明药物组合物(L)	0.4mg/kg0.540.270.135	54.0±7.022.0±7.0**29.0±5.0**30.0±5.0**36.0±5.0**	68.0±12.011.0±6.0**23.0±5.0**22.0±5.0**31.0±4.0**					63.0±11.04.0±4.0**16.0±5.0**18.0±5.0**25.0±4.0**	53.0±9.00.0±0.0**12.0±5.0**13.0±7.0**23.0±4.0**

^**P＜0.01对 生理盐水

表10、各组对大鼠佐剂性关节炎原发性病变第七天的抑制率和活性比(n＝10， x±S)

组别

剂量(g/kg)

肿胀度(ml)

抑制率(％)

活性比

生理盐水地塞米松本发明药物组合物(H)本发明药物组合物(M)本发明药物组合物(L)

0.4mg/kg0.540.270.135

68.0±12.011.0±6.0**23.0±5.0**22.0±5.0**31.0±4.0**

083.866.267.654.4

010.790.810.65

^**P＜0.01对 生理盐水

表11、本发明药物组合物对大鼠佐剂性关节炎继发性病变影响的试验(n＝10， x±S)

组别	剂量(g/kg)	非注射侧足跖肿胀度(ml)
						8d	12d	15d	18d
		生理盐水地塞米松本发明药物组合物(H)本发明药物组合物(M)本发明药物组合物(L)	0.4mg/kg0.540.270.135	30.2±7.19.4±2.6**22.2±5.0**24.7±5.025.1±3.2	30.7±8.55.8±3.1**16.8±4.3**18.0±4.2**21.1±3.0**					26.3±7.31.3±2.4**11.0±4.1**11.4±4.2**14.7±3.4**	19.1±6.8-1.7±2.9**4.8±3.7**4.7±4.0**7.5±3.9**

^**P＜0.01对 生理盐水

表12、本发明药物组合物对大鼠佐剂性关节炎继发性病变第15天的抑制率和活性比(n＝10， x±S)

组别	剂量(g/kg)	肿胀度(ml)	抑制率(％)	活性比
					生理盐水地塞米松本发明药物组合物(H)本发明药物组合物(M)本发明药物组合物(L)	0.4mg/kg0.540.270.135	26.3±7.31.3±2.4**11.0±4.1**11.4±4.2**14.7±3.4**	095.158.256.744.1	010.610.600.46

^**P＜0.01对 生理盐水

实验表明：与阴性对照组相比，本发明药物组合物高(0.54g/kg/2ml)、中(0.27g/kg/2ml)、低(0.135g/kg/2ml)三个剂量组均能够显著抑制氟氏完全佐剂诱导的大鼠足跖各时段点的肿胀度(P＜0.01)；且随着时间的延长，效果越显著。对与原发性病变其在第7天的抑制率分别为66.2％、67.6％、54.4％，对与继发性病变其在第15天的抑制率分别为58.2％、56.7％、44.1％。

5、小鼠热板法镇痛试验

实验方法：选取55℃热板痛阈值＞5秒＜30秒的雌性未孕昆明种小鼠60只，体重18-22克。按疼痛时间分成5组，每组12只：分别为阳性对照组、阴性对照组及本发明药物组合物高、中、低三个剂量组，连续给药7天，每天一次肌肉注射给药，阳性对照组淤第七天给药一次，末次给药后0.5，1，2，3h测定疼痛阈值。

表13、本发明药物组合物对小鼠热板法痛阈值的影响试验(n＝12， x±S)

组别	剂量(g/kg)	末次给药后不同时间的痛阈值(s)
						0.5h	1h	2h	3h
		生理盐水度冷丁本发明药物组合物(H)本发明药物组合物(M)本发明药物组合物(L)	0.0130.780.390.195	19.3±4.437.2±5.5**34.5±3.4**34.5±4.9**31.8±2.4**	19.34±3.937.4±3.1**37.3±7.6**36.5±5.2**32.2±3.1**					19.5±4.037.6±4.5**36.8±3.4**36.4±7.0**33.84±4.9**	19.2±4337.5±4.0**36.2±3.8**36.1±3.9**33.0±3.6**

^**P＜0.01对 生理盐水

表14、小鼠热板法镇痛试验60分钟点增加的痛阈值和增加痛阈值的百分比(n＝12， x±S)

组别	剂量(g/kg)	基础痛阈值(s)	增加的痛阈值(s)	增加痛阈值的百分比(％)
					生理盐水度冷丁本发明药物组合物(H)本发明药物组合物(M)本发明药物组合物(L)	0.0130.780.390.195	19.3±4.519.4±4.420.6±4.320.8±4.820.0±3.8	018.0**16.7**15.7**12.2**	092.881.175.561.0

^**P＜0.01对 生理盐水

实验表明：本发明药物组合物高(0.78g/kg/2ml)、中(0.39g/kg/2ml)、低(0.195g/kg/2ml)三个剂量组均可提高小鼠热板法痛阈值，有明显的镇痛作用：其在60分钟点提高的痛阈值分别为16.7s、15.7s、12.2s，镇痛抑制率分别为81.1％、75.5％、61.0％：与阴性对照组相比有显著性意义(P＜0.01)。

6、小鼠醋酸扭体法镇痛试验

实验方法：取体重18-22克的昆明种雄性小鼠60只，按体重随机分为5组，每组12只：分别为阳性对照组、阴性对照组及本发明药物组合物高(0.78g/kg)、中(0.39g/kg)、低(0.195g/kg)三个剂量组，除阳性对照组外，其余各组肌注给药，连续7天，每天一次；阳性对照组第七天给药一次；末次给药后30分钟，每鼠分别腹腔注射0.6％醋酸生理盐水0.2ml。

表15、本发明药物组合物对小鼠醋酸扭体的影响试验(n＝12， x±S)

组别	剂量(g/kg)	扭体次数	抑制率(％)	活性比
					生理盐水度冷丁本发明药物组合物(H)本发明药物组合物(M)本发明药物组合物(L)	13mg0.780.390.195	24.0+3.72.6±1.5**6.0±1.6**9.8±1.3**16.5±2.5**	089.275.059.231.2	010.840.660.35

^**P＜0.01对 生理盐水

实施例七注射液肌注实验表明：本发明药物组合物高(0.78g/kg/2ml)、中(0.39g/kg/2ml)、低(0.195g/kg/2ml)三个剂量组均可减少0.6％醋酸溶液所致小鼠扭体反应次数，表明其对0.6％醋酸溶液致小鼠疼痛反应有明显的镇痛作用；其镇痛抑制率分别为75.0％、59.2％、31.2％；与阴性对照组相比，有显著性差异(P＜0.01)。

下述实验方法同前，阳性对照组淤第七天给予度冷丁口服一次，其它各组分别给予等量生理盐水及本发明药物组合物口服，连续给药7天，每天一次，未次给药后30分钟，每鼠分别腹腔注射0.6％醋酸生理盐水0.2ml。

表16、本发明药物组合物对小鼠醋酸扭体的影响试验

组别	剂量(g/kg)	扭体均数(次)	抑制率(％)	活性比
					模型组度冷丁本发明药物组合物(高)本发明药物组合物(中)	13mg0.780.39	22.04±3.73.6±2.4**7.5±3.3**10.8±3.1**	083.665.950.9	010.790.61

本发明药物组合物(低)

0.195

13.5±2.5**

38.6

0.54

**P＜0.01对 模型组

实施例一口服制剂实验结果从上表可见，度冷丁(0.013g/kg)与本发明药物组合物高(0.78g/kg)、中(0.39g/kg)、低(0.195g/kg)三个剂量组均可减少0.6％醋酸溶液所致小鼠扭体反应次数，表明其对0.6％醋酸溶液致小鼠疼痛反应有明显的镇痛作用；其镇痛抑制率分别为83.6％、65.9％、50.9％、38.6％；与对照组相比，有显著性差异(P＜0.01)。

17、本发明药物组合物对醋酸致小鼠疼痛的影响(n＝12， x±S)

组别	剂量(g/kg)	扭体均数(次)	抑制率(％)	活性比
					模型组度冷丁本发明药物组合物(高)本发明药物组合物(中)本发明药物组合物(低)	13mg0.780.390.195	21.0±3.92.0±1.4**8.7±3.1**11.7±3.8**13.9±2.2**	090.558.644.333.8	010.650.490.37

**P＜0.01对模型组

从上表实施例三口服制剂实验结果可见，度冷丁(0.013g/kg)与本发明药物组合物高(0.78g/kg)、中(0.39g/kg)、低(0.195g/kg)三个剂量组均可减少0.6％醋酸溶液所致小鼠扭体反应次数，表明其对0.6％醋酸溶液致小鼠疼痛反应有明显的镇痛作用；其镇痛抑制率分别为90.5％、58.6％、44.3％、33.8％；与对照组相比，有显著性差异(P＜0.01)。

表18、本发明药物组合物对醋酸致小鼠疼痛的影响(n＝12， x±S)

组别	剂量(g/kg)	扭体均数(次)	抑制率(％)	活性比
					模型组度冷丁本发明药物组合物(高)本发明药物组合物(中)本发明药物组合物(低)	13mg0.780.390.195	23.0±5.72.9±4.2**4.8±1.5**6.7±2.6**9.5±3.4**	087.479.170.958.7	010.910.810.67

**P＜0.01对 模型组

从上表实施例四口服制剂实验结果可见，度冷丁(0.013g/kg)与本发明药物组合物高(0.78g/kg)、中(0.39g/kg)、低(0.195g/kg)三个剂量组均可减少0.6％醋酸溶液所致小鼠扭体反应次数，表明其对0.6％醋酸溶液致小鼠疼痛反应有明显的镇痛作用；其镇痛抑制率分别为87.4％、79.1％、70.9％、58.7％；与对照组相比，有显著性差异(P＜0.01)。

表19、本发明药物组合物对醋酸致小鼠疼痛的影响(n＝12， x±S)

组别	剂量(g/kg)	扭体均数(次)	抑制率(％)	活性比
					模型组度冷丁本发明药物组合物(高)本发明药物组合物(中)本发明药物组合物(低)	13mg0.780.390.195	20.0±5.24.6±1.4**8.7±2.0**12.3±3.0**14.5±4.6**	077.056.538.527.5	010.730.500.36

**P＜0.01对 模型组

从上表实施例二口服制剂实验结果可见，度冷丁(0.013g/kg)与本发明药物组合物高(0.78g/kg)、中(0.39g/kg)、低(0.195g/kg)三个剂量组均可减少0.6％醋酸溶液所致小鼠扭体反应次数，表明其对0.6％醋酸溶液致小鼠疼痛反应有明显的镇痛作用；其镇痛抑制率分别为77.0％、56.5％、38.5％、27.5％；与对照组相比，有显著性差异(P＜0.01)。

实施例十

本发明药物组合物对大鼠关节病理形态学的影响

大鼠佐剂性关节炎模型的制备及给药(同氟氏完全佐剂诱导的大鼠关节炎试验)

各组动物于末次给药后1小时，在乙醚麻醉下处死，取两足(含跗骨关节)。10％甲醛固定，脱钙，常规脱水，石蜡包埋，5μm切片，HE染色后镜下观察大鼠炎性肿胀足的病理变化。

实验结果：(一)正常对照组关节囊滑膜组织完好，滑膜上皮细胞被覆完整，纤维膜清晰可见，囊腔内未见渗出物，滑膜、滑膜下组织未见炎细胞浸润。骨小梁排列呈网状，大小基本一致，骨板和骨细胞无异常。组织病变评分0级。

(二)模型对照组关节囊滑膜组织不完整，滑膜上皮细胞增生肥大(++-+++)，纤维膜清晰可见，囊腔内未可见渗出物，滑膜、滑膜下组织见大量炎细胞浸润(+++)。骨小梁排列呈网状，大小基本一致，部分骨板破坏，骨细胞无异常。组织病变评分3级。

(三)低剂量组关节囊滑膜组织不完整，滑膜上皮细胞坏死脱落(++-+++)，纤维膜清晰可见，囊腔内未可见渗出物，滑膜、滑膜下组织见炎细胞浸润(++)。骨小梁排列呈网状，大小基本一致，骨板和骨细胞无异常。较模型组比较，形态学有所改善。组织病变评分2级。

(四)中剂量组关节囊滑膜组织不完整，滑膜上皮细胞坏死脱落(++)，纤维膜清晰可见，囊腔内未可见渗出物，滑膜、滑膜下组织见炎细胞浸润(+)。骨小梁排列呈网状，大小基本一致，骨板和骨细胞无异常。较模型组比较，形态学介与大剂量组和小剂量组之间。组织病变评分2级。

(五)高剂量组关节囊滑膜组织较完整，滑膜上皮细胞坏死脱落(+)，纤维膜清晰可见，囊腔内未可见渗出物，滑膜、滑膜下组织见炎细胞浸润(+)。骨小梁排列呈网状，大小基本一致，骨板和骨细胞无异常。较模型组比较，形态学好与中剂量组。组织病变评分1级。

(六)阳性对照组关节囊滑膜组织较完整，滑膜上皮细胞坏死脱落(+)，纤维膜清晰可见，囊腔内未可见渗出物，滑膜、滑膜下组织见炎细胞浸润(+)。骨小梁排列呈网状，大小基本一致，骨板和骨细胞无异常。形态学与高剂量组接近。组织病变评分1级。

实施例十一

本发明药物组合物对大鼠佐剂性关节炎淋巴细胞功能和细胞因子的影响

地塞米松针剂，规格：5mg/mL，由金陵药业股份有限公司南京金陵制药厂提供，批号：021205；本发明药物组合物为自制制剂，试验时用无菌注射用水稀释至所需浓度；氟氏完全佐剂，规格为10ml/支，Sigma公司生产，由北京舒伯伟化工仪器有限责任公司提供，批号为033k8933；刀豆蛋白A、脂多糖，美国Sigma公司产品，用完全RPMI1640培养液配成1g/L母液，经内径0.2μm的微孔滤膜过滤除菌，置-20℃冰箱保存备用；RPMI1640培养粉，美国Gibco公司，RPMI1640培养液加25mM/LHepes，1mM/L丙酮酸钠，2mM/L谷胺酰胺，50μM/L二巯基乙醇，10万IU/L青霉素，100mg/L链霉素，10％小牛血清(NBS)，pH7.4。Hepes，美国Sigma公司产品。MTT，美国Sigma公司产品，临用前用含0.5％GS的磷酸盐缓冲液(pH7.2)配成5g/L使用液，4℃冰箱避光保存。异丙醇(AR)由本校化学试剂库提供，酸化异丙醇的配制即含0.04mM/L盐酸的异丙醇。大鼠IL-1β、TNF-α定量酶联检测试剂盒，购于上海森雄科技实业有限公司。

健康成年SD大鼠，♂，体重(180±20)g，由中国药科大学动物房提供，合格证号：sckx(苏)2002-0011。

Napco-6100型CO₂培养箱，美国杜邦公司产品。EL301Strip reader(酶标仪)，美国Bio-Tek公司产品。

按文献方法(陈奇，中药药理研究方法学[M]。北京：人民卫生出版社，1993，369)，先用强力碘消毒大鼠左后足跖，再将0.1ml氟氏完全佐剂(FCA)皮内注入大鼠足跖。

将SD大鼠按体重随机分为6组，即正常组，地塞米松组，生理盐水组，本发明药物组合物高、中、低三个剂量组。给药方案：阳性对照组与阴性对照组分别注射地塞米松16mg/Kg与生理盐水，隔5天一次，给药组按成人体表面积与大鼠体表面积之比例换算，每日一次，给药途径肌注。

胸腺、脾淋巴细胞悬液的制备(魏伟，沈玉先，徐叔云，免疫细胞培养技术。见：徐叔云、陈修主编药理实验方法学(第三版)，北京：人民卫生出版社，2002：1421-22)

将大鼠放血致死，取胸腺或脾，放入盛有冷的10mlHBSS瓶皿中的不锈钢丝网100目上，剔除脂肪和结缔组织。将胸腺或脾剪成两段，用结核菌素注射器的针芯轻轻捻碎组织，使单个细胞经网进入溶液中，再经不锈钢网过滤至离心管中，离心(250g，5min)后弃上清。经低渗处理除去红细胞，用冷HBSS液洗涤细胞3次，最后用含10％NBS的完全1640培养液1-2ml悬浮细胞，作细胞计数及测定细胞的存活率，并调整细胞为1×10¹⁰.L^-1。

淋巴细胞功能的测定(魏伟，沈玉先，徐叔云，淋巴细胞功能的测定。见：徐叔云、卞如濂、陈修主编药理实验方法学(第三版)，北京：人民卫生出版社，2002：1426-28)

T淋巴细胞功能的测定：无菌取胸腺，制备胸腺淋巴细胞悬液，用完全1640培养液调至1×10¹⁰.L^-1，于96孔无菌细胞培养板中每孔加入细胞悬液100μL，ConA100μL(终浓度5mg.L^-1)体外实验加细胞悬液100μL，ConA50μL，不同浓度的本发明药物组合物50μL，每个样品设3个复孔。在37℃、5％CO₂的二氧化碳培养箱中培养48h，在培养结束前2h每孔加入MTT溶液(5g.L^-1)10μL，于震荡器上振荡1min，再放入37℃、5％CO₂的培养箱中培养2h。培养结束后以760g，离心10min，吸弃上清后每孔加入120μL的0.04M酸化异丙醇，于震荡器上振荡30s，在酶标仪于570nm波长处读取每孔A值，结果以A的均值表示。

B淋巴细胞功能的测定：无菌取脾，，制备脾淋巴细胞悬液，用完全1640培养液调至1×1010.L-1，于96孔无菌细胞培养板中每孔加入细胞悬液100μL，LPS100μL(终浓度4mg.L-1)体外实验加细胞悬液100μL，LPS 50μL，不同浓度的本发明药物组合物50μL，每个样品设3个复孔。在37℃、5％CO₂的培养箱中培养48h，在培养结束前2h每孔加入MTT溶液(5g.L^-1)10μL，于震荡器上振荡1min，再放入37℃、5％CO₂的培养箱中培养2h。培养结束后以760g，离心10min，吸弃上清后每孔加入120μL的0.04M酸化异丙醇，于震荡器上振荡30s，在酶标仪于570nm波长处读取每孔A值，结果以A的均值表示。

IL-2的诱生与检测(沈玉先，魏伟，徐叔云，细胞因子的测定。见：徐叔云、卞如濂、陈修主编药理实验方法学(第三版)，北京：人民卫生出版社，2002：1438-42)

常规制备胸腺淋巴细胞悬液，用含10％NBS的完全1640培养液调成5×10¹⁰.L^-1。在无菌24孔培养板中，加入100μL细胞悬液，100μL ConA(终浓度5mg.L^-1)，800μL完全1640培养液，总体积1ml，体外实验加细胞悬液500μL，ConA250μL，不同浓度的本发明药物组合物250μL，混合后置37℃、5％CO₂的培养箱中培养48h后离心(500g，10min)，收集上清，于-20℃保存待测。

采用活化的小鼠脾细胞MTT比色法检测。常规制备脾细胞悬液2×10⁹.L^-1，加入5mg.L^-1ConA，置37℃、5％CO₂培养箱，培养4d，用5％NBS-Hank’s液洗涤细胞3次，用完全1640培养液调成1×10⁹.L^-1活化的小鼠脾细胞悬液。于96孔无菌细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液，100μL含IL-2的上清，同时设相应浓度的ConA和培养液对照。置37℃、5％CO₂培养箱中培养24h，在培养结束前2h每孔加入MTT溶液(5g.L^-1)10μL，于震荡器上振荡1min，再放入37℃、5％CO₂ 培养箱中培养2h。培养结束后以760g，离心10min，吸弃上清后每孔加入120μL的0.04M酸化异丙醇，于震荡器上振荡30s，在酶标仪于570nm波长处读取每孔A值，结果以A的均值表示。

血清IL-1β、TNF-α含量的测定：采用双抗体夹心法，严格按试剂盒说明书进行操作。

将标准品与待测样品100μL加入经抗大鼠细胞因子抗体包被的酶标板内，37℃120分钟，用洗涤液洗板4-6次，向滤纸上印干，加入生物素化的第一抗体工作液50μL，37℃60分钟，洗板同前，加入酶标抗体工作液100μL，37℃60分钟，洗板同前，加入酶底物OPD工作液100μL，37℃暗反应5-10分钟，加入一滴终止液，于492nm处测吸光度值。

以标准品1000、500、250、125、62.5、32、16、0pg/ml之OD值绘制标准曲线，根据样品的OD值，在标准曲线上查出相应细胞因子的含量。

所有数据均以 x±S形式表示，采用t检验进行统计学分析。

表20、本发明药物组合物治疗给药对佐剂性关节炎大鼠胸腺和脾淋巴细胞增殖及IL-2产生的影响

                       ( x±S，n＝10)

组别	剂量(g/kg)	ConA-诱导的(A)	LPS-诱导的(A)	IL-2(A)
					正常组模型组本发明药物组合物(L)本发明药物组合物(M)本发明药物组合物(H)地塞米松	--0.1350.270.540.4mg/kg	0.647±0.2250.972±0.201**0.705±0.2240.671±0.236*0.660±0.218*0.093±0.010**	0.498±0.1570.577±0.2210.518±0.1300.506±0.1240.522±0.1430.421±0.090	0.520±0.0610.726±0.085**0.710±0.0790.624±0.080*0.599±0.035*0.520±0.046**

^**P＜0.01对 正常组；^*P＜0.05，^**P＜0.01对 模型组

实验表明：佐剂性关节炎大鼠ConA诱导的T淋巴细胞增殖反应和IL-2的生成明显高于正常组，本发明药物组合物高(0.54g/kg/2ml)、中(0.27g/kg/2ml)两个剂量组可明显抑制ConA诱导的T淋巴细胞增殖反应和IL-2的生成，其对T淋巴细胞增殖反应的抑制率分别为32.1％、31.0％，对IL-2生成的抑制率分别为17.5％、14.0％；与模型组比较，有显著性差异(P＜0.05)。LPS诱导的B淋巴细胞增殖无明显变化。

各组体外给药对佐剂性关节炎大鼠胸腺和脾淋巴细胞增殖及IL-2产生的影响(见图1)

图1中：^**P＜0.01对 正常组；^*P＜0.05，^**P＜0.01对 模型组

实验表明：佐剂性关节炎大鼠诱导的T淋巴细胞增殖反应和IL-2的生成明显高于正常组，本发明药物组合物高(0.54g/kg/2ml)、中(0.27g/kg/2ml)两个剂量组均可明显抑制T淋巴细胞增殖反应和IL-2的生成，其对T淋巴细胞增殖反应的抑制率分别为39.0％、22.1％，对IL-2生成的抑制率分别为27.3％、18.2％；与模型组比较，有显著性差异。LPS诱导的B淋巴细胞增殖无明显变化。

各组治疗给药对佐剂性关节炎大鼠血清中IL-1β、TNF-α的影响见下表13：

表21、本发明药物组合物治疗给药对佐剂性关节炎大鼠血清中IL-1β、TNF-α的影响

                            ( x±S，n＝10)

组别	剂量(g/kg)	IL-1β(pg/ml)	TNF-α(pg/ml)
				正常组模型组本发明药物组合物(L)本发明药物组合物(M)本发明药物组合物(H)地塞米松	--0.1350.270.540.4mg/kg	14.8±2.319.3±3.6**17.9±4.516.2±2.7*16.0±2.6*15.3±2.4*	20.5±2.426.2±3.0**24.3±2.023.0±3.5*22.7±2.2*21.6±1.8**

^**P＜0.01对 正常组；^*P＜0.05，^**P＜0.01对 模型组

实验表明：佐剂性关节炎大鼠诱导的血清中IL-1β、TNF-α的量明显高于正常组，阳性对照组(0.4mg/kg/2ml)及本发明药物组合物高(0.54g/kg/2ml)、中(0.27g/kg/2ml)两个剂量组均可明显降低血清中IL-1β、TNF-α的含量，其降低IL-1β的量分别为4.0pg/ml、3.3pg/ml、3.1pg/ml，降低TNF-α的量分别为4.6pg/ml、3.5pg/ml、3.2pg/ml。与阴性对照组相比有显著性差异。

实验显示FCA大鼠ConA诱导的淋巴细胞增殖反应明显升高，而LPS诱导的淋巴细胞增殖反应不明显，这可能是FCA大鼠以T细胞免疫功能改变为主。实验结果显示体内外给药可明显抑制ConA诱导的T淋巴细胞增殖反应和IL-2的生成；提示本发明药物组合物可能通过抑制T淋巴细胞的激活致细胞因子的释放和抑制T淋巴细胞的激活增殖两条途径减少IL-2的释放来改善异常的免疫功能状态，可能是其抑制关节炎形成的机制之一。

国内外研究表明有效抑制IL-1、TNF-α的产生，阻止滑膜成纤维的高度增殖是RA治疗的重要途径。本实验采用大鼠IL-1β、TNF-α定量酶联检测试剂盒测定大鼠血清中IL-1β、TNF-α的含量，结果表明本发明药物组合物能够降低大鼠血清中IL-1β、TNF-α的量；证明本发明药物组合物通过抑制细胞因子的过度分泌治疗RA。

实施例十二

本发明药物组合物对关节炎大鼠炎性肿胀足前列腺素E₂(PGE₂)含量的影响

地塞米松针剂，规格：5mg/mL，由金陵药业股份有限公司南京金陵制药厂提供，批号：021205；本发明药物组合物为自制制剂，试验时用无菌注射用水稀释至所需浓度；甲醇、氢氧化钾由中国药科大学化学试剂库提供；氟氏完全佐剂，规格为10ml/支，Sigma公司生产，由北京舒伯伟化工仪器有限责任公司提供，批号为033k8933。

健康成年SD大鼠，♂，体重(180±20)g，由中国药科大学动物房提供，合格证号：sckx(苏)2002-0011。

按文献方法(陈奇，中药药理研究方法学[M]。北京：人民卫生出版社，1993，369)，先用强力碘消毒大鼠左后足跖，再将0.1ml氟氏完全佐剂(FCA)皮内注入大鼠足跖。

将SD大鼠按体重随机分为5组，即地塞米松组，生理盐水组，本发明药物组合物高、中、低三个剂量组。给药方案：阳性对照组与阴性对照组分别注射地塞米松16mg/Kg与生理盐水，隔5天一次，给药组按成人体表面积与大鼠体表面积之比例换算，每日一次，给药途径肌注。

末次给药后1h在每只大鼠的左后踝关节上0.5cm处剪下炎性肿胀足，称重、去皮、剪碎，生理盐水5ml浸泡1h，取出鼠爪，离心浸泡液，吸取上清夜0.1ml。加0.5M/L的氢氧化钾-甲醇溶液2ml，在50℃水浴中异构化20分钟，用甲醇稀释至20ml，于波长270nm处测定光密度值(OD)，以每克组织相当的吸收光密度值表示PGE₂的含量^[30-31]。

所有数据均以 x±S形式表示，采用t检验进行统计学分析。

各组对佐剂性关节炎大鼠关节及软组织PGE₂含量的影响见下表14：

表22、本发明药物组合物对佐剂性关节炎大鼠关节及软组织PGE₂含量的影响( x±S，n＝10)

组别	剂量(g/kg)	PGE2(OD×1000)
			地塞米松模型组本发明药物组合物(L)本发明药物组合物(M)本发明药物组合物(H)	0.4mg/kg-0.1350.270.54	21.2±6.6**52.0±47.042.0±2.7**35.9±4.1**26.4±3.0**

^**P＜0.01对 模型组。

实验表明：佐剂性关节炎大鼠模型组PGE₂含量明显高于其它各给药组，本发明药物组合物高(0.54g/kg/2ml)、中(0.27g/kg/2ml)、低(0.135g/kg/2ml)三个剂量组均可降低炎性肿胀足PGE₂的含量，其降低的量分别为25.6、16.1、10.0(OD×1000)；与阴性对照组相比，有显著性意义(P＜0.01)。

Claims (10)

1、一种治疗炎性骨病的药物组合物，其特征在于主要是由下列重量份的原料药制成：

黄连2-10份、黄柏2-10份、黄芩2-10份、蜈蚣1-5份、全蝎1-5份、壁虎1-5份。

2、权利要求1的药物组合物，其中原料药的用量为：

黄连4-8份、黄柏4-8份、黄芩4-8份、蜈蚣2-3份、全蝎2-3份、壁虎2-3份。

3、权利要求2的药物组合物，其中原料药的用量为：

黄连6份、黄柏6份、黄芩6份、蜈蚣3份、全蝎3份、壁虎3份。

4、权利要求1-3任一项药物组合物的制备方法，包括下列步骤：

1)称取各原料药，备用；

2)将所述重量配比的原料药用水和/或乙醇提取，得提取液A；

3)将步骤2)的提取液A浓缩，得浓缩液B，与药学上可接受的辅料混合，制得口服制剂。

5、权利要求4药物组合物的制备方法，其特征在于步骤2)中原料药用含0～95％乙醇的水溶液提取，得提取液A；步骤3)中浓缩液B加入乙醇至溶液含醇量达70-80％，将该含醇液放置后过滤，取滤液浓缩，得浓缩液C；将浓缩液C与药学上可接受的辅料混合，制得胶囊剂、口服液、片剂或丸剂。

6、权利要求4药物组合物的制备方法，其特征在于原料药用水或20～50％乙醇液提取，得提取液A；向浓缩液C中，加入乙醇至溶液含醇量达80-90％；将该含醇液放置后过滤，取滤液浓缩至无醇味后，与药学上可接受的辅料混合，制得胶囊剂或丸剂。

7、权利要求1-3任一项药物组合物的制备方法，包括下列步骤：

1)称取各原料药，备用；

2)将所述重量配比的原料药用水和/或乙醇提取，得提取液A；

3)将步骤2)的提取液A浓缩，得浓缩液B；

4)取步骤3)的浓缩液B加入乙醇至溶液含醇量达70-80％，将该含醇液放置后过滤，取滤液浓缩，得浓缩液C；

5)向步骤4)的浓缩液C中，加入乙醇至溶液含醇量达80-90％；将该含醇液放置后过滤，取滤液浓缩至无醇味后，加入水，放置后，过滤，滤液浓缩至浸膏D；

6)取步骤5)的浸膏D与药学上可接受的载体混合，制成各种制剂。

8、权利要求7药物组合物的制备方法，其中

1)称取各原料药，备用；

2)将所述重量配比的原料药用液含0～95％乙醇的水溶液提取，得提取液A；

3)将步骤2)的提取液A浓缩，得浓缩液B；

4)取步骤3)的浓缩液加入乙醇至溶液含醇量达75％，将该含醇液放置后过滤，取滤液浓缩，得浓缩液C；

5)向步骤4)的浓缩液C中，加入乙醇至溶液含醇量达85％；将该含醇液放置后过滤，取滤液浓缩至无醇味后，加水至溶液体积为药材重量的1.2-1.5倍，放置后过滤，滤液浓缩，得浸膏D；取浸膏D与药学上可接受的载体混合，制成各种制剂。

9、权利要求8药物组合物的制备方法，其中将所述重量配比的原料药用水或20～50％乙醇提取，得提取液A；浓缩后过滤，向滤液中加乙醇至溶液含醇量达75％，静置过夜，过滤，取滤液浓缩除尽乙醇，冷藏过夜后，过滤，取滤液加乙醇至溶液含醇量达85％，再冷藏过夜，过滤，滤液回收乙醇并蒸发除尽乙醇得浓缩液，加水至溶液体积为药材重量的1.3-1.4倍，冷藏后过滤，滤液浓缩至相对密度为1.36的浸膏，按常规制成注射液或口服制剂。

10、权利要求1-3任一药物组合物在制备抑制炎症介质IL-1、TNF-α和/或抑制IL-2的表达药物中的应用，包括在制备治疗炎性骨病中药物中的应用，所述炎性骨病有风湿关节炎、类风湿关节炎、关节炎、强直性脊柱炎、骨质增生，以及与炎性骨病有关的神经痛。