CN1732955A - 以知母总皂苷元为活性成分的药物组合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了以知母总皂苷元为活性成分的药物组合物,以及以知母总皂苷元为活性成分的药物组合物的制备方法,本发明还提供了其在制备药物方面的用途,具体提供了其在制备治疗或预防更年期综合症、骨质疏松和血管性痴呆的药物中的应用。
Description
技术背景
本发明涉及一种以知母总皂苷元为活性成分的药物组合物及其制备方法和用途。
技术领域
知母为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根茎,知母总皂苷元由知母药材经水解提取的总皂苷元精制而成,具有清热泻火,生津润燥,止渴除烦作用。但关于以知母总皂苷元为活性成分的药物组合物及其医药用途未见报道。
发明内容
本发明提供了以知母总皂苷元为活性成分的药物组合物
本发明提供了知母总皂苷元在制备治疗或预防更年期综合征的药物中的用途。
本发明提供了知母总皂苷元在制备治疗或预防女性更年期综合征和男性更年期综合征的药物中的用途。
本发明提供了知母总皂苷元在制备治疗或预防骨质疏松的药物中的应用。
本发明提供了知母总皂苷元在制备治疗或预防血管性痴呆的药物中的应用。
本发明提供的药物组合物,知母总皂苷元中含有萨尔萨皂苷元和知母皂苷元等,总皂苷元含量在50%以上,优选在70%以上。
本发明所述的知母总皂苷元由知母总皂苷经酸水解制得,知母总皂苷与酸的比例为1∶20~100,水解反应温度为65~95℃,反应时间0.5~2小时。酸可以是盐酸、硫酸或高氯酸中的一种或几种。知母总皂苷是由知母药材加入5~10倍量的20%~80%乙醇提取后,用正丁醇萃取或大孔吸附树脂柱分离获得。
知母总皂苷元用于上述用途时的有效剂量范围为12~1200mg。
具体实施方式
制备例1:制备知母总皂苷元
取知母药材,加入5~10倍量的20%~80%乙醇,优选7~8倍量,乙醇浓度优选50%~60%,提取知母总皂苷,可提取1次,也可提取2~3次。合并提取液,浓缩,回收乙醇。残留液体用正丁醇萃取知母总皂苷,回收正丁醇后的膏状物经过干燥,获得知母总皂苷(A)。也可以用回收乙醇的残留液体加水稀释后,通过大孔吸附树脂柱,再用水洗脱至无明显成分后,用50%~95%乙醇洗脱,回收含乙醇的洗脱液,浓缩,干燥,获得知母总皂苷(A)。
取A样品,用稀盐酸或稀硫酸水溶液水解,即1份A,加20~100份的稀盐酸或稀硫酸,稀酸重量百分比浓度为1~10%。A样加热搅拌水解,加热温度控制在65~95℃,水解反应时间控制在0.5~2小时之间,滤取沉淀物,干燥,得知母总皂苷元(B)。B主要含有萨尔萨皂苷元,知母总皂苷元。经紫外分光光度法检测,B中总皂苷元含量在50%以上。
萨尔萨皂苷元
知母皂苷元
试验例1 知母总皂苷元对去卵巢大鼠内分泌功能紊乱的治疗作用
1材料
知母总皂苷元:按制备例1制备。
乙烯雌酚:上海利生制药厂生产;
动物:普通级Wistar大鼠,雌性,体重250g-280g,山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供,合格证号:鲁动质字200106005号;
血清雌二醇放免测定试剂盒:天津九鼎医学生物工程有限公司。
2方法
大鼠60只,按体重分为假手术组、模型组、乙烯雌酚组、知母总皂苷元小剂量组(2mg/kg)、知母总皂苷元中剂量组(50mg/kg)、知母总皂苷元大剂量组(100mg/kg);大鼠进行切除双侧卵巢手术,制作大鼠去卵巢模型。假手术不切除卵巢。手术7天后开始i.g.给药,1次/天,连续28天。末次给药后24h,大鼠水合氯醛麻醉,腹主动脉采血,检测血浆促肾上腺皮质激素(ACTH),血清促黄体生成素(LH),雌二醇(E2)含量。数据以
X±s表示,组间t-test检验。
3结果
如表1所示,去卵巢大鼠血浆ACTH明显高于假手术组,血清E2含量显著低于假手术组,LH明显高于假手术组;知母总皂苷元能明显抑制去卵巢大鼠ACTH、LH的升高和E2的降低。
表1知母总皂苷元对去卵巢大鼠内分泌功能紊乱的影响
组别 | 剂量(mg/kg) | ACTH(pmol/L) | LH(IU/L) | E2(pmol/L) |
假手术组模型组乙烯雌酚组知母总皂苷元大知母总皂苷元中知母总皂苷元小 | NSNS100502 | 68.2±21.3138.7±45.6**96.6±58.7△75.3±29.5△△90.5±22.6△109.4±56.1 | 0.19±0.080.70±0.15**0.41±0.12△0.33±0.18△△0.49±0.13△0.63±0.26 | 520.2±46.8218.5±29.7**476.8±43.2△△△418.2±41.3△△310.6±48.9△△266.6±42.7 |
**P<0.01VS假手术组;△P<0.05,△△P<0.01,VS△△△P<0.01模型对照组
试验例2知母总皂苷元对去卵巢小鼠中枢神经系统的保护作用
1材料
知母总皂苷元:由山东省天然药物工程技术研究中心提供。
动物:清洁级级昆明种小鼠,雌性,体重22g~25g,由山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供,动物合格证:鲁动质字200106003号;
更年安:天津乐仁堂制药厂生产;
小鼠自主活动记录仪:中国医学科学院生产。
2方法与结果
2.1知母总皂苷元对去卵巢小鼠睡眠时间的影响
60只小鼠,按体重随机分为假手术组、模型组、更年安组、知母总皂苷元小剂量组(4mg/kg)、知母总皂苷元中剂量组(100mg/kg)、知母总皂苷元大剂量组(200mg/kg);对小鼠进行切除双侧卵巢手术,制作小鼠去卵巢模型。假手术不切除卵巢。手术7天后开始i.g.给药,1次/天,连续28天。末次给药后24h,各组小鼠分别i.p 35mg/kg戊巴比妥钠,以翻正反射消失为评价标准,观察其催眠入睡时间及睡眠持续时间。数据以
X±s表示,组间t-test检验。
结果如表2所示,知母总皂苷元明显延长小鼠经戊巴比妥钠催眠的睡眠时间。
表2知母总皂苷元对去卵巢小鼠睡眠时间的影响
组别 | 剂量(mg/kg) | 催眠后入睡时间(min) | 催眠后睡眠持续时间(min) |
假手术组模型组更年安组知母总皂苷元大知母总皂苷元中知母总皂苷元小 | NSNS15002001004 | 6.5±1.35.8±1.26.0±0.96.3±1.16.4±1.26.6±1.3 | 49.3±2.928.9±2.7**42.3±4.5△△44.5±4.1△△39.6±3.4△30.6±3.5 |
**P<0.01VS假手术组;△P<0.05,△△P<0.01,VS△△△P<0.01模型对照组
2.2知母总皂苷元对苯丙胺引起去卵巢小鼠自主活动增加的影响
60只小鼠,按体重随机分为假手术组、模型组、更年安组、知母总皂苷元小剂量组(4mg/kg)、知母总皂苷元中剂量组(100mg/kg)、知母总皂苷元大剂量组(200mg/kg);对小鼠进行切除双侧卵巢手术,制作小鼠去卵巢模型。假手术不切除卵巢。手术7天后开始i.g.给药,1次/天,连续28天。末次给药后24h,各组小鼠分别i.p苯丙胺3mg/kg,20min后在自主活动记录仪中记录其5min内自主活动次数。数据以
X±s表示,组间t-test检验。结果如表3所示,知母总皂苷元能抑制苯丙胺引起的去卵巢小鼠自主活动的增加。
表3知母总皂苷元对苯丙胺所致去卵巢小鼠自主活动的影响
组别 | 剂量(mg/kg) | 自主活动次数(5min) |
假手术组模型组更年安组知母总皂苷元大知母总皂苷元中知母总皂苷元小 | NSNS15002001004 | 25.2±2.446.9±2.3**39.6±2.1△32.1±1.8△△36.7±1.6△43.2±3.6 |
**P<0.01VS假手术组;△P<0.05,△△P<0.01,VS△△△P<0.01模型对照组
2.3知母总皂苷元对4-氨基吡啶诱发去卵巢小鼠激怒发生率的影响
120只小鼠,按体重随机均分为假手术组、模型组、更年安组、知母总皂苷元小剂量组(4mg/kg)、知母总皂苷元中剂量组(100mg/kg)、知母总皂苷元大剂量组(200mg/kg);对小鼠进行切除双侧卵巢手术,制作小鼠去卵巢模型。假手术不切除卵巢。手术7天后开始i.g.给药,1次/天,连续28天。末次给药后24h,各组小鼠分别i.p 6mg/kg 4-氨基吡啶,放入8×8×6cm3的木盒内,观察10min内小鼠激怒(活动增多、竖耳对峙、相互追逐、抓打撕咬)发生率。
结果如表4显示,知母皂苷元剂量依赖性减少去卵巢小鼠因4-氨基吡啶诱发激怒的发生率。
表4知母总皂苷元对4-氨基吡啶所致去卵巢小鼠激怒发生率的影响
组别 | 剂量(mg/kg) | 激怒发生只数 | 激怒发生率(%) |
假手术组模型组更年安组知母总皂苷元大知母总皂苷元中知母总皂苷元小 | NSNS15002001004 | 516971013 | 2580**45△35△△50△65 |
**P<0.01VS假手术组;△P<0.05,△△P<0.01,VS△△△P<0.01模型对照组
2.4知母总皂苷元对去卵巢小鼠跳台试验的影响
60只小鼠,按体重随机分为假手术组、模型组、更年安组、知母总皂苷元小剂量组(4mg/kg)、知母总皂苷元中剂量组(100mg/kg)、知母总皂苷元大剂量组(200mg/kg);对小鼠进行切除双侧卵巢手术,制作小鼠去卵巢模型。假手术不切除卵巢。手术7天后开始i.g.给药,1次/天,连续28天。末次给药后24h,进行小鼠跳台试验测定,计录平台停留期(T)及错误次数(N)。数据以
X±s表示,组间t-test检验。
结果如表5显示,模型组小鼠较正常对照组小鼠平台停留期明显缩短,错误次数明显增加,知母总皂苷元两个剂量组可显著延长小鼠平台停留期,减少错误次数。
表5知母总皂苷元对去卵巢小鼠跳台试验的影响
分组 | 剂量(mg/kg) | 学习训练N | 记忆测试 | |
T | N | |||
假手术组模型对照组更年安组知母总皂苷元大知母总皂苷元中知母总皂苷元小 | NSNS0.072001004 | 4.12±1.1213.52±7.59***8.75±3.91△△6.72±3.58△△9.78±6.12△10.66±5.19 | 251.3±90.585.6±66.5***166.7±108.6△△187.6±121.5△△152.6±114.9△△108.6±100.4 | 0.69±0.318.77±4.10***3.01±1.02△△3.03±0.95△△3.43±1.76△5.12±2.34 |
***P<0.01VS假手术组;△P<0.05,△△P<0.01VS模型对照组
试验例3知母总皂苷元对雄性去势大鼠内分泌功能紊乱的治疗作用
1材料
知母总皂苷元:由山东省天然药物工程技术研究中心提供。
动物:普通级Wistar大鼠,雌性,体重250g-280g,山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供,合格证号:鲁动质字200106005号。
血清睾酮放免测定试剂盒:天津九鼎医学生物工程有限公司。
2方法
大鼠50只,按体重分为假手术组、模型组、知母总皂苷元小剂量组(2mg/kg)、知母总皂苷元中剂量组(50mg/kg)、知母总皂苷元大剂量组(100mg/kg);对大鼠进行去势手术,制作大鼠去势模型手术7天后开始i.g.给药,1次/天,连续28天。末次给药后24h,大鼠水合氯醛麻醉,腹主动脉采血,检测血清促黄体生成素,睾酮含量。数据以
X±s表示,组间t-test检验。
3结果
结果如表6所示,知母总皂苷元能明显抑制去势大鼠促黄体生成素和睾酮的降低。
表6知母总皂苷元对雄性去势大鼠内分泌功能紊乱
组别 | 剂量(mg/kg) | 睾酮 | 促黄体生成素 |
正常对照组模型组知母总皂苷元大知母总皂苷元中知母总皂苷元小 | NSNS100502 | 157.6±88.7102.2±53.4**148.3±41.2△△126.4±24.7△113.8±39.4 | 3.2±1.52.8±1.3*3.6±1.6△3.7±1.5△3.2±1.8△ |
*P<0.05,**P<0.01VS正常对照组;△P<0.05,△△P<0.01VS模型对照组试验例4知母总皂苷元对氢化可的松所致阳虚小鼠中枢神经系统及抗应激能力的影响
1材料
知母总皂苷元:由山东省天然药物工程技术研究中心提供。
动物:清洁级级昆明种小鼠,雌性,体重22g~25g,由山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供,动物合格证:鲁动质字200106003号。
小鼠自主活动记录仪:中国医学科学院生产
2方法与结果
2.1知母总皂苷元对氢化可的松所致阳虚小鼠睡眠时间的影响
50只小鼠,按体重随机分为正常对照组、模型组、知母总皂苷元小剂量组(4mg/kg)、知母总皂苷元中剂量组(100mg/kg)、知母总皂苷元大剂量组(200mg/kg);小鼠肌注氢化可的松1mg/只/天,连续10天,制作小鼠阳虚模型。正常对照组注射等容量生理盐水。同时动物i.g.给药,1次/天,连续28天。末次给药后24h,各组小鼠分别i.p 35mg/kg戊巴比妥钠,以翻正反射消失为评价标准,观察其催眠入睡时间及睡眠持续时间。数据以
X±s表示,组间t-test检验。
结果如表7所示,知母总皂苷元明显延长阳虚小鼠经戊巴比妥钠催眠的睡眠时间。
表7知母总皂苷元对氢化可的松所致阳虚小鼠睡眠时间的影响
组别 | 剂量(mg/kg) | 催眠后入睡时间(min) | 催眠后睡眠持续时间(min) |
正常对照组模型组知母总皂苷元大知母总皂苷元中知母总皂苷元小 | NSNS2001004 | 6.7±1.45.7±1.26.4±1.16.2±1.16.7±1.3 | 48.3±2.926.9±2.7**44.6±4.4△△39.7±3.1△30.8±3.2 |
**P<0.01VS正常对照组;△P<0.05,△△P<0.01,VS△△△P<0.01模型对照组
2.2知母总皂苷元对氢化可的松所致阳虚小鼠抗应激能力的影响
按2.1所述方法给药、造模,末次给药后24h,每只小鼠尾部负重为体重10%的铅块,放入水深25cm,水温(36±0.5)℃的水糟中,从入水开始至鼻孔沉下水面所需时间(min)计为小鼠游泳时间。数据以
X±s表示,组间t-test检验。
按2.1所述方法给药、造模,末次给药后24h,将小鼠放入盛有钠石灰的25ml密闭玻璃瓶内,每瓶放小鼠一只,瓶盖周围涂凡士林,小鼠缺氧死亡时间表示为常压耐缺氧时间。数据以
X±s表示,组间t-test检验。
结果如表8所示,知母总皂苷元明显延长阳虚小鼠游泳时间和存活时间
表8知母总皂苷元对氢化可的松所致阳虚小鼠抗应激能力的影响
组别 | 剂量(mg/kg) | 游泳时间(min) | 存活时间(min) |
正常对照组模型组知母总皂苷元大知母总皂苷元中知母总皂苷元小 | NSNS2001004 | 56.8±11.224.6±10.3**49.8±12.4△△36.5±13.5△△30.3±10.8 | 28.4±10.115.8±9.7**25.6±11.4△△20.8±6.3△18.6±9.4 |
**P<0.01VS正常对照组;△P<0.05,△△P<0.01,VS△△△P<0.01模型对照组
试验例5:知母总皂苷元对维甲酸所致雌性大鼠骨质疏松症的治疗作用
1.材料:
知母总皂苷元:由山东省天然药物工程技术研究中心提供。
维甲酸胶囊,重庆华邦制药公司生产,批号990701;低钙饲料,中国医学科学院动物所生产。
普通级Wistar大鼠,雌性,3~4月龄,体重150~210g,由山东省天然药物工程技术研究中心动物实验中心提供。合格证号:鲁动质字200106005号。
SX-2.5-10型马福炉(天津市中环实验电炉有限公司生产);
BP210S型电子分析天平(德国sartorius公司生产);
QDR-4000型双能线骨密度测定仪(美国HOLOGIC公司生产);
CSS-1101C电子万能试验机(长春试验机研究所生产)。
2.方法
2.1大鼠骨质疏松模型的制备、动物分组及用药
取健康3~4月龄雌性大鼠,随机分为6组:正常对照组,骨质疏松模型组,知母总皂苷元小剂量组(2mg/kg)、知母总皂苷元中剂量组(50mg/kg)、知母总皂苷元大剂量组(100mg/kg),每组10只。除正常对照组外,各组大鼠均以维甲酸70mg/kg剂量灌胃给药,1次/日,连续三周。造模三周后,停服维甲酸,各组动物分别按上述药物剂量灌胃给药。1次/日,连续给药一个月。正常对照组和骨质疏松模型组给予与给药组等容量的生理盐水(10ml/kg)。饲养室温度22℃~25℃,湿度50%~70%,喂以低钙饲料(含钙量<0.3%),自由饮水。
2.2大鼠活动能力的测定
末次给药24h后,取大鼠置于实验盒中,记录5min内大鼠自主活动次数。
2.3大鼠骨密度测定
末次给药24h后,以10%水合氯醛(350mg/kg,i.p.)麻醉大鼠,置于QDR-4000型双能线骨密度测定仪探头下,仰位固定于检测台上,头与身体呈直线,线球管对准身体纵轴中点,选择大鼠骨质疏松敏感区域单侧(左侧)股骨中点(F50)的皮质骨和第三腰椎骨测定骨密度。
2.4大鼠骨指数、骨矿成分(骨Ca、P)的测定
末次给药24h后,取大鼠右侧股骨于120℃烘箱中干燥2h,电子天平测定骨重量(W)、游标卡尺测定骨长(L)、骨直径(D),计算表观线密度(W/L),表观面密度(W/LD)。将上述股骨置于800℃马福炉中灰化8h,使骨呈白色粉末状,称灰重(Wash),其灰重即为无机物质重量。用等离子光量计测定骨灰中钙、磷等元素的含量,并计算骨灰分的灰分表观线密度(Wash/L)及灰分表观面密度(Wash/LD)。
2.5大鼠骨生物力学的测定
末次给药24h后,左侧股骨、胫骨剔除肌肉和周围组织,放入液体石蜡中7天之内测定其生物力学特征,用电子万能试验机做三点折断试验,参数为标定1/50,加载速度6mm/min,最大负荷200牛顿(N),跨距20mm,描记负荷—变形曲线,计算最大负荷及结构强度(引起1mm变形需要的负荷,相当于曲线上的斜率)。
2.6数据统计数据以
X±s表示,组间t-test检验。
3结果
3.1知母总皂苷元对骨质疏松大鼠自主活动次数的影响
由表9可见,与正常组相比,模型组大鼠自主活动次数显著下降;知母总皂苷元各剂量组均能显著提高骨质疏松大鼠自主活动次数。
表9知母总皂苷元对骨质疏松大鼠自主活动次数的影响
组别 | 剂量(mg/kg) | 自主活动次数 |
正常组模型组知母总皂苷元大知母总皂苷元中知母总皂苷元小 | NSNS100502 | 214.8±36.7115.4±29.3**191.6±21.8△△180.8±32.4△161.2±34.1△ |
**P<0.01VS正常组;△P<0.05,△△P<0.01VS模型组
3.2知母总皂苷元对骨质疏松大鼠骨密度的影响
由表10可见,与正常组相比模型组大鼠股骨密度和椎骨密度显著下降,知母总皂苷元各剂量组均能显著提高骨质疏松大鼠股骨密度和椎骨密度。
表10知母总皂苷元对骨质疏松大鼠骨密度的影响
组别 | 剂量(mg/kg) | 股骨密度(g/cm2) | 椎骨密度(g/cm2) |
正常组模型组知母总皂苷元大知母总皂苷元中知母总皂苷元小 | NSNS100502 | 0.77±0.080.52±0.06**0.73±0.02△△0.72±0.03△△0.63±0.07△ | 0.75±0.030.50±0.05**0.71±0.02△△0.69±0.02△△0.64±0.06△ |
**P<0.01VS正常组;△P<0.05,△△P<0.01VS模型组
3.3知母总皂苷元对骨质疏松大鼠骨指数的影响
由表11可见,与正常组相比模型组大鼠股骨重量、长度、表观线密度、表观面密度均明显下降,知母总皂苷元各剂量组均能显著提高骨质疏松大鼠股骨密度和椎骨密度。
表11知母总皂苷元对骨质疏松大鼠股骨灰分指数的影响
组别 | 剂量(mg/kg) | 骨灰重量(g) | 灰分表观线密度(g/cm) | 灰分表观面密度(g/cm2) |
正常组模型组知母总皂苷元大知母总皂苷元中知母总皂苷元小 | NSNS100502 | 0.36±0.030.22±0.02**0.35±0.03△△0.34±0.05△△0.27±0.03△ | 0.10±0.000.06±0.00**0.09±0.01△△0.08±0.01△△0.07±0.01△ | 0.26±0.010.20±0.01**0.5±0.01△△0.24±0.01△△0.23±0.02△ |
**P<0.01VS正常组;△P<0.05,△△P<0.01VS模型组
3.4知母总皂苷元对骨质疏松大鼠骨矿成分含量的影响
由表12可见,与正常组相比模型组大鼠股骨Ca、P含量显著降低,知母总皂苷元各剂量组均能显著提高骨质疏松大鼠股骨Ca、P含量。
表12知母总皂苷元对骨质疏松大鼠股骨灰分指数的影响
组别 | 剂量(mg/kg) | 钙(mg/g) | 磷(mg/g) |
正常组模型组知母总皂苷元大知母总皂苷元中知母总皂苷元小 | NSNS100502 | 34.39±2.1321.41±2.51**32.36±3.52△△31.33±3.64△△27.69±3.58△ | 15.44±0.759.62±0.56**14.28±1.54△△13.62±1.10△△12.36±1.38△ |
**P<0.01VS正常组;△P<0.05,△△P<0.01VS模型组
3.5知母总皂苷元对骨质疏松大鼠股骨、胫骨生物力学的测定
由表13可见,与正常组相比模型组大鼠股骨和胫骨的最大负荷、结构强度显著降低,知母总皂苷元各剂量组均能显著提高骨质疏松大鼠股骨和胫骨的最大负荷、结构强度。
表13知母总皂苷元对骨质疏松大鼠股骨、胫骨生物力学的影响
组别 | 剂量(mg/kg) | 股骨最大负荷(N) | 股骨结构强度(N/mm) | 胫骨最大负荷(N) | 胫骨结构强度(N/mm) |
正常组模型组知母总皂苷元大知母总皂苷元中知母总皂苷元小 | NSNS100502 | 108.5±5.771.6±8.7**105.7±6.4△△101.5±6.2△△85.6±9.1△ | 357.6±22.2250.7±18.9**345.4±26.9△△318.6±33.4△△281.7±35.9△ | 71.8±12.848.2±13.1**70.2±10.4△△68.6±15.3△△62.8±14.9△ | 511.3±134.9369.6±86.5**494.8±65.3△△473.6±101.9△△452.9±80.5△ |
**P<0.01VS正常组;△P<0.05,△△P<0.01VS模型组
试验例6:知母总皂苷元对切除睾丸所致大鼠肾虚骨质疏松症的治疗作用
1.材料:
知母总皂苷元:按制备例制备。
维甲酸胶囊,重庆华邦制药公司生产,批号990701;
低钙饲料,中国医学科学院动物所生产。
普通级Wistar大鼠,雄性,3~4月龄,体重150~210g,由山东省天然药物工程技术研究中心动物实验中心提供。合格证号:鲁动质字200106005号。
SX-2.5-10型马福炉(天津市中环实验电炉有限公司生产);BP210S型电子分析天平(德国sartorius公司生产);QDR-4000型双能线骨密度测定仪(美国HOLOGIC公司生产);CSS-1101C电子万能试验机(长春试验机研究所生产)。
2.方法
2.1大鼠骨质疏松模型的制备、动物分组及用药
动物随机分为假手术组,骨质疏松模型组,知母总皂苷元小剂量组(2mg/kg)、知母总皂苷元中剂量组(50mg/kg)、知母总皂苷元大剂量组(100mg/kg),每组10只。大鼠水合氯醛(350mg/kg,i.p.)麻醉,仰位固定,碘酒消毒阴囊部,沿阴囊正中纵行切开一小口,分开切口,卵圆形睾丸即露出,丝线结扎,在结扎线与睾丸之间剪下睾丸,缝合切口,用75%酒精棉球消毒。假手术组动物用同法剥离出睾丸,但不摘除,放回缝合。手术三周后各组动物分别按上述药物剂量灌胃给药。1次/日,连续给药一个月。正常对照组和骨质疏松模型组给予与给药组等容量的生理盐水(10ml/kg)。饲养室温度22℃~25℃,湿度50%~70%,喂以低钙饲料(含钙量<0.3%),自由饮水。
2.2大鼠活动能力的测定
末次给药24h后,取大鼠置于实验盒中,记录5min内大鼠自主活动次数。
2.3大鼠骨密度测定
末次给药24h后以10%水合氯醛(350mg/kg,i.p.)麻醉大鼠,置于QDR-4000型双能线骨密度测定仪探头下,仰位固定于检测台上,头与身体呈直线,线球管对准身体纵轴中点,选择大鼠骨质疏松敏感区域单侧(左侧)股骨中点(F50)的皮质骨和第三腰椎骨测定骨密度。
2.4大鼠骨指数、骨矿成分(骨Ca、P)的测定
末次给药24h后,取大鼠右侧股骨于120℃烘箱中干燥2h,电子天平测定骨重量(W)、游标卡尺测定骨长(L)、骨直径(D),计算表观线密度(W/L),表观面密度(W/LD)。将上述股骨置于800℃马福炉中灰化8h,使骨呈白色粉末状,称灰重(Wash),其灰重即为无机物质重量。用等离子光量计测定骨灰中钙、磷等元素的含量,并计算骨灰分的灰分表观线密度(Wash/L)及灰分表观面密度(Wash/LD)。
2.5大鼠骨生物力学的测定
末次给药24h后,左侧股骨、胫骨剔除肌肉和周围组织,放入液体石蜡中7天之内测定其生物力学特征,用电子万能试验机做三点折断试验,参数为标定1/50,加载速度6mm/min,最大负荷200牛顿(N),跨距20mm,描记负荷—变形曲线,计算最大负荷及结构强度(引起1mm变形需要的负荷,相当于曲线上的斜率)。
2.6数据统计数据以
X±s表示,组间t-test检验。
3.结果
3.1知母总皂苷元对骨质疏松大鼠自主活动次数的影响
由表14可见,与正常组相比,模型组大鼠自主活动次数显著下降;知母总皂苷元各剂量组均能显著提高骨质疏松大鼠自主活动次数。
表14知母总皂苷元对骨质疏松大鼠自主活动次数的影响
组别 | 剂量(mg/kg) | 自主活动次数 |
正常组模型组知母总皂苷元大知母总皂苷元中知母总皂苷元小 | NSNS100502 | 232.5±32.7126.1±35.4**225.0±34.6△△215.8±32.6△△168.2±38.1△ |
**P<0.01VS正常组;△P<0.05,△△P<0.01VS模型组
3.2知母总皂苷元对骨质疏松大鼠骨密度的影响
由表15可见,与正常组相比模型组大鼠股骨密度和椎骨密度显著下降,知母总皂苷元各剂量组均能显著提高骨质疏松大鼠股骨密度和椎骨密度。
表15知母总皂苷元对骨质疏松大鼠骨密度的影响
组别 | 剂量(mg/kg) | 股骨密度(g/cm2) | 椎骨密度(g/cm2) |
正常组模型组知母总皂苷元大知母总皂苷元中知母总皂苷元小 | NSNS100502 | 0.78±0.020.53±0.07**0.77±0.03△△0.75±0.03△△0.63±0.07△ | 0.75±0.020.49±0.05**0.69±0.02△△0.68±0.02△△0.61±0.05△ |
**P<0.01VS正常组;△P<0.05,△△P<0.01VS模型组
3.3知母总皂苷元对骨质疏松大鼠骨指数的影响
由表16可见,与正常组相比模型组大鼠股骨重量、长度、表观线密度、表观面密度均明显下降,知母总皂苷元各剂量组均能显著提高骨质疏松大鼠股骨密度和椎骨密度。
表16知母总皂苷元对骨质疏松大鼠股骨灰分指数的影响
组别 | 剂量(mg/kg) | 骨灰重量(g) | 灰分表观线密度(g/cm) | 灰分表观面密度(g/cm2) |
正常组模型组知母总皂苷元大知母总皂苷元中知母总皂苷元小 | NSNS100502 | 0.36±0.020.24±0.02**0.35±0.03△△0.34±0.05△△0.28±0.03△ | 0.14±0.000.08±0.01**0.13±0.01△△0.11±0.03△△0.09±0.01△ | 0.25±0.010.21±0.01**0.24±0.01△△0.24±0.01△△0.23±0.02△ |
**P<0.01VS正常组;△P<0.05,△△P<0.01VS模型组
3.4知母总皂苷元对骨质疏松大鼠骨矿成分含量的影响
由表17可见,与正常组相比模型组大鼠股骨Ca、P含量显著降低,知母总皂苷元各剂量组均能显著提高骨质疏松大鼠股骨Ca、P含量。
表17知母总皂苷元对骨质疏松大鼠股骨灰分指数的影响
组别 | 剂量(mg/kg) | 钙(mg/g) | 磷(mg/g) |
正常组模型组知母总皂苷元大知母总皂苷元中知母总皂苷元小 | NSNS100502 | 34.66±3.5122.37±2.63**33.38±3.58△△32.36±3.73△△28.65±3.22△ | 14.64±1.359.31±0.87**14.16±1.45△△13.39±1.13△△12.64±1.32△ |
**P<0.01VS正常组;△P<0.05,△△P<0.01VS模型组
3.5知母总皂苷元对骨质疏松大鼠股骨、胫骨生物力学的测定
由表18可见,与正常组相比模型组大鼠股骨和胫骨的最大负荷、结构强度显著降低,知母总皂苷元各剂量组均能显著提高骨质疏松大鼠股骨和胫骨的最大负荷、结构强度。
表18知母总皂苷元对骨质疏松大鼠股骨、胫骨生物力学的影响
组别 | 剂量(mg/kg) | 股骨最大负荷(N) | 股骨结构强度(N/mm) | 胫骨最大负荷(N) | 胫骨结构强度(N/mm) |
正常组模型组知母总皂苷元大知母总皂苷元中知母总皂苷元小 | NSNS100502 | 118.8±7.587.4±19.6**108.2±9.3△△102.3±7.9△△97.6±9.1△ | 367.6±22.8255.8±16.3**351.2±25.4△△317.2±34.5△△283.3±34.8△ | 79.2±8.953.2±13.2**77.6±10.5△△75.2±15.4△△66.5±14.1△ | 648.9±138.8468±108.2**628.4±84.7△△582.6±123.9△△512.9±91.2△ |
**P<0.01VS正常组;△P<0.05,△△P<0.01VS模型组
试验例7:知母总皂苷元对东莨菪碱所致小鼠记忆获得性障碍的影响
1材料:
知母总皂苷元:按制备例制备。
氢溴酸东莨菪碱:上海禾丰制药有限公司产品,批号为0005017。
哈伯因(石杉碱甲,Huperzine A),河南竹林众生制药股份有限公司豫中制药厂产品,批号为0008036。
YYE50小鼠跳台仪,北京医科大学仪器厂生产。
Y型水迷宫装置,中国医学科学院药物所生产。
动物:清洁级昆明种小鼠,雌雄各半,体重22g~25g,由山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供,动物合格证:鲁动质字200106003号。
2方法与结果
2.1知母总皂苷元对东莨菪碱所致记忆获得性障碍小鼠跳台试验的影响
取小鼠60只,随机分为正常对照组,模型对照组,知母总皂苷元小剂量组(4mg/kg)、知母总皂苷元中剂量组(100mg/kg)、知母总皂苷元大剂量组(200mg/kg),哈伯因组(0.2mg·kg-1),分别灌胃相应药物,每天1次,连续30天。末次给药后1h,小鼠腹腔注射东莨菪碱2mg/kg,正常对照组注射等容量生理盐水。20min后按文献【潘思源,韩怡凡,徐秋萍,等.莨菪类生物碱对18、28及38日龄小鼠的行为和记忆障碍作用.中国药理学报,1998,19(2):112~6】所述小鼠跳台试验方法进行测定,记录平台停留期(T)及错误次数(N)。数据以
X±s表示,组间t-test检验。
结果如表19所示,模型组小鼠较正常对照组小鼠平台停留期明显缩短,错误次数明显增加,知母总皂苷元可显著延长小鼠平台停留期,减少错误次数。
表19知母总皂苷元对东莨菪碱所致记忆获得性障碍小鼠跳台试验的影响
分组 | 剂量(mg/kg) | 学习训练N | 记忆测试 | |
T | N | |||
正常对照组模型对照组哈伯因组知母总皂苷元大知母总皂苷元中知母总皂苷元小 | NSNS0.22001004 | 4.12±1.1215.52±7.59**8.75±3.91△△6.72±3.58△△9.78±6.12△10.66±5.19△ | 251.3±90.585.6±66.5**166.7±108.6△△187.6±121.5△△152.6±114.9△△108.6±100.4△ | 0.69±0.318.77±4.10**3.01±1.02△△3.03±0.95△△3.43±1.76△5.12±2.34△ |
**P<0.01vs正常对照组;△P<0.05,△△P<0.01vs模型对照组
试验例8:知母总皂苷元对血管性痴呆大鼠学习记忆的影响
1材料
知母总皂苷元:按制备例1制备。
尼莫地平片:由正大青春宝药业有限公司生产,批号:000605,每片20mg。
硝普钠:由北京双鹤现代医药技术有限责任公司生产,批号:005071。
大鼠跳台装置,北京医科大学仪器厂生产。
Y型水迷宫装置,中国医学科学院药物所产品。
动物:普通级Wistar大鼠,雌雄各半,体重250g-280g,山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供,合格证号:鲁动质字200106005号。
2方法与结果
2.1知母总皂苷元对血管性痴呆大鼠跳台试验的影响
取大鼠60只,随机分为假手术组,模型组,尼莫地平组(10mg/kg),知母总皂苷元小剂量组(2mg/kg)、知母总皂苷元中剂量组(50mg/kg)、知母总皂苷元大剂量组(100mg/kg),分别灌胃相应药物,每天1次,3天后按文献【周小青,刘旺华,李花,等.丹龙醒脑片对血管性痴呆大鼠学习记忆及脑组织兴奋性氨基酸影响的实验研究.湖南中医学院学报,2002,22(2):4-7】所述血管性痴呆大鼠模型建立方法,将水合氯醛麻醉的大鼠腹腔注射0.05%硝普钠(5ml/kg),常规消毒,分离双侧颈总动脉,用无创动脉夹夹闭,10min后,再通10min,再夹闭10min。再通后,伤口严格消毒,缝合,回笼室温(27±0.5)℃饲养并灌胃相应药物,每天1次,连续30天。假手术组麻醉及手术过程同模型组,但不阻断双侧颈总动脉,不注射硝普钠。
造模后第11天开始按文献【周小青,刘旺华,李花,等.丹龙醒脑片对血管性痴呆大鼠学习记忆及脑组织脂质过氧化和钙超载的影响.湖南中医学院学报,2002,22(3):1-5】所述方法进行学习训练。训练前先将动物放入箱中自由活动3min,熟悉环境,然后将动物置于圆台上,接通铜栅电源,记录动物3min内错误次数(动物跳下圆台次数)及受电击总时间,作为学习训练成绩。24h后直接将动物置于圆台上,记录其放入至第1次下台受到电击的时间(潜伏期)、3min内错误次数及受电击总时间,作为记忆测试成绩。
数据以
X±s表示,组间t-test检验。
结果如表20显示,模型组大鼠的学习成绩、记忆成绩与假手术组相比,错误次数及受电击时间显著增多,潜伏期(记忆成绩)明显缩短。中、大剂量知母总皂苷元组、尼莫地平组与模型组比较,错误次数、受电击时间均明显减少;潜伏期(记忆成绩)明显延长。
表20知母总皂苷元对血管性痴呆大鼠跳台试验的影响
分组 | 剂量mg/kg | 学习训练成绩 | 记忆测试成绩 | |||
错误次数(次/3min) | 受电击时间(s) | 潜伏期(s) | 错误次数(次/3min) | 受电击时间(s) | ||
假手术组模型组尼莫地平知母总皂苷元大知母总皂苷元中知母总皂苷元小 | NSNS10100502 | 4.4±2.114.3±3.6**7.8±2.4△5.9±2.0△△7.2±2.6△6.7±3.8△ | 28.3±11.269.2±14.8**42.7±15.1△36.4±12.4△△46.3±10.7△51.2±11.6△ | 138.6±35.148.6±21.1**89.7±25.8△△106.3±36.2△△91.2±35.2△△71.6±31.4△ | 1.5±1.15.9±1.3**2.8±1.1△2.1±1.1△△2.5±1.7△3.1±1.6△ | 11.52±3.641.2±9.6**20.1±8.8△18.8±6.4△△22.1±7.5△25.6±6.3△ |
**P<0.01vs假手术组;△P<0.05,△△P<0.01vs模型对照组
Claims (10)
1.以知母总皂苷元为活性成分的药物组合物。
2.根据权利要求1所述的药物组合物,知母总皂苷元中含有萨尔萨皂苷元,知母皂苷元,总皂苷元含量在50%以上。
3.根据权利要求2所述的药物组合物,总皂苷元含量在70%以上。
4.根据权利要求1-3任一所述的药物组合物,知母总皂苷元由知母总皂苷经酸水解制得,知母总皂苷与酸的比例为1∶20~100,水解反应温度为65~95℃,反应时间0.5~2小时。
5.根据权利要求4所述的药物组合物,酸可以是盐酸、硫酸或高氯酸中的一种或几种。
6.根据权利要求4所述的药物组合物,知母总皂苷是由知母药材加入5~10倍量的20%~80%乙醇提取后,用正丁醇萃取或大孔吸附树脂柱分离获得。
7.知母总皂苷元在制备治疗或预防更年期综合症的药物中的应用。
8.知母总皂苷元在制备治疗或预防骨质疏松的药物中的应用。
9.知母总皂苷元在制备治疗或预防血管性痴呆的药物中的应用。
10.根据权利要求7-9任一所述的应用,知母总皂苷元的有效剂量范围为12~1200mg。
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