CN1193764C - 中药知母中甾体总皂苷的医药新用途及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了中药知母中甾体总皂苷的医药新用途及其制备方法，提出了知母甾体总皂苷具有雌性激素样抗骨质疏松作用、抗炎活性及具有抑制中性粒细胞过氧化物产生的作用，可为知母资源的利用提供新的途径。知母药材经浸泡及煎煮，滤渣取液后再经液体浓缩，直至其重量与所述知母药材重量之比为1～3∶1止，然后再吸附洗脱、脱色、去杂质、经回收干燥后得成品。本发明的工艺路线成本低，重金属含量和农药残留量小，生产过程对环境无污染。

Description

中药知母中甾体总皂苷的医药新用途及其制备方法

本发明涉及植物甾体总皂苷的医药新用途及其制备方法，确切地说是中药知母甾体总皂苷的医药新用途及制备方法。

知母是一种常用中药，国内外各学者对其药理活性研究的比较多。主要具有抗菌、抗病毒、解热、抗血小板聚集、降血糖及清除自由基等作用。而对知母中的甾体总皂苷的研究报道较少。知母甾体总皂苷是中药知母中的主要活性成分，发明人对其进行了较全面的药理实验研究，并首次发现知母甾体总皂苷具有雌性激素样抗骨质疏松作用、抗炎活性及具有抑制中性粒细胞过氧化物产生的作用。因此，知母甾体总皂苷具有极高的应用价值及前景。骨质疏松(osteoporosis)是老年人的常见病，多发病。更年期后的妇女由于体内雌性激素的减少，易患骨质疏松症。随着人口的老龄化，骨质疏松将成为医疗和社会的重大问题。目前可供选择的治疗骨质疏松的药物种类少，疗效欠佳，一些进口药物价格昂贵，实难为大多数患者所接受。本世纪初，一种含有植物雌性激素(phytoestrogen)的蔬菜复合剂因其副作用小在美国和日本成为畅销药物。

知母是我国药典收载的常用中药，其主要成分知母皂苷与雌性激素同属于甾体类物质，推测知母皂苷也可能有抗骨质疏松的作用。为了寻找副作用小活性强的抗骨质疏松药，对知母总皂苷进行了抗骨质疏松作用研究。本发明经大量的活性筛选实验发现，从中药知母中制备的知母总皂苷具有雌性激素样抗骨质疏松作用及具有抑制中性粒细胞过氧化物产生的作用、抗炎作用。现有的甾体总皂苷提取方法成本较高，杂质含量高，同时还残留毒性溶剂正丁醇等。

本发明的目的在于明确提出了知母甾体总皂苷的新的医药用途，可利用其具有雌性激素样抗骨质疏松作用及具有抑制中性粒细胞过氧化物产生的作用、抗炎作用。使知母甾体总皂苷可望成为新的抗骨质疏松药和抗炎药，并为利用知母资源提供新的途径。同时提供一种新的知母甾体总皂苷的制备方法，使知母甾体总皂苷的提取成本低，杂质含量少，并使其生产过程对环境无污染。

本发明的目的是通过如下方案实现的，它提供了中药知母中甾体总皂苷的医药新用途，其特征在于：中药知母中甾体总皂苷作为制备治疗具有雌性激素样抗骨质疏松疾病的药物、抗炎药物和抑制中性粒细胞过氧化物产生的疾病药物的应用。中药知母中甾体总皂苷的制备方法由以下工艺步骤组成：

A：知母药材浸泡及煎煮

(a)按知母药材与自来水的重量份数比为1∶8～16向知母药材中加入自来水，常温浸泡0.5～2小时，然后，将两者的混合物加热至70℃～100℃，保温1～3小时，之后，滤渣取液；

(b)按所述知母药材与自来水的重量份数比为1∶6～10向工步a滤出的渣中加入自来水，并将两者混合物加热至70℃～100℃，保温1～2.5小时，之后，滤渣取液；

(c)按所述知母药材与自来水的重量份数比为1∶6～8向工步b滤出的渣中加入自来水，并将两者混合物加热至70℃～100℃，保温1～1.5小时，之后，滤渣取液；

B：液体浓缩

将分别通过所述各工步a、b、c制取的液体混合一起后减压浓缩，直至其重量与所述知母药材重量之比为1～3∶1止；

C：吸附洗脱

使浓缩后的液体通过经活化处理后的大孔吸附树脂柱，使液体中的皂苷被树脂柱吸附，并弃去流出液，再按蒸馏水与浓缩后液体的体积之比为0.1～1∶1的比例取用蒸馏水冲洗树脂柱，弃去流出液，继用浓度为50～80％的乙醇清洗树脂柱，使吸附于其上的皂苷被完全洗脱止，并收集洗脱液；

D：脱色

按药用氧化镁与所述知母药材的重量份数比为2～6∶100的比例取用药用氧化镁并加入所述洗脱液中，加热回流20～60分钟，然后，使该混合物通过澄渣板过滤，并收集滤液；

E：去杂

使所述滤液自彼此串联的阳离子交换树脂和阴离子交换树脂中通过，使其中的离子与重金属被滤除，并收集滤液；

F：成品回收、干燥

回收工序E制得滤液中的乙醇，余留物质干燥后，即可得到知母甾体总皂苷成品。

本发明的优点是：通过利用知母甾体总皂苷具有的雌性激素样抗骨质疏松作用、抗炎活性及具有抑制中性粒细胞过氧化物产生的作用，使知母甾体总皂苷可望成为新的抗骨质疏松药和抗炎药，为老年骨质疏松病，更年期后妇女骨质疏松症提供一种有效廉价的药物。本发明的工艺路线，成本低，每公斤成品为600元人民币，成品中重金属含量小于5ppm，农药残留量小于10ppm，因而其杂质含量低，消除了毒性溶剂正丁醇的残留，生产过程对环境无污染。

下面结合附图、实验数据和实施例对本发明作进一步详细的描述。

图1为知母总皂苷对去势雌性小鼠动情周期的影响结果表。

图2为知母总皂苷对去势雌性小鼠子宫重和左股骨重的影响表。

图3为知母总皂苷对去势小鼠血钙、血磷和降钙素含量的影响表。

图4为知母总皂苷和氢化泼尼松对中性粒细胞过氧化物产生作用的影响实验结果图。

图5、图6、图7、图8、图9、图10均为知母总皂苷和部分单体化合物对中性粒细胞过氧化物产生作用的影响实验结果图。

图中8为知母总皂苷E1、9为知母总皂苷E2。

(1)知母总皂苷抗骨质疏松作用的研究

动物：昆明种雌性小鼠，体重20.0±2.0g(沈阳药科大学动物室提供)。

实验方法：在乙醚麻醉下取出小鼠双侧卵巢，术后5天开始作阴道涂片，每天1次，连续6天。将无动情周期的小鼠随机分组，每组20只。伪去势对照组的小鼠在乙醚麻醉下，于第十二肋骨下缘与脊柱交骨处外侧做两个纵行切口，长约1厘米，不去除卵巢。以灌胃方式给药。在经药过程中每天做小鼠阴道涂片观察动情期出现情况。连续给药49天，于末次给药24小时后眼眶取血，分离血清，测血钙、血磷和降钙素的含量，记录小鼠体重、副性器官子宫重和左侧股骨重，计算脏器系数。

知母总皂苷对去势雌性小鼠动性周期的影响，结果见附图1

实验结果表明，知母总皂苷可使去势小鼠重新出现动性周期，表明知母总皂苷具有雌性激素样作用。

知母总皂苷对去势雌性小鼠子宫重和左股骨重的影响，结果见附图2。与伪去势组比较^#p＜0.05 ^##p＜0.01；与去势模型组比较^*p＜0.05^**p＜0.01。

实验结果表明，去势模型组子宫系数和左股骨系数与伪去势组间均有显著性差异；乙烯雌酚组和知母总皂苷高低剂量组子宫系数和左股骨系数与去势模型组之间均有显著性差异。说明知母总皂苷有雌性激素样促进子宫增生和使骨质钙化加重的作用。

知母总皂苷对去势小鼠血钙、血磷和降钙素含量的影响，结果见附图3。与伪去势组比较^#p＜0.05；与去势模型组比较^*p＜0.05。

以血钙为指标，去势模型组与伪去势组间有显著性差异：知母总皂苷高低剂量组与去势模型组间有显著性差异，说明知母总皂苷可以降低血钙，使骨质钙化。

以血磷为指标，伪去势组和给药组与去势模型组之间没有显著性差异。

以降钙素为指标，与伪去势组比较，去势模型组小鼠血清降钙素下降，知母皂苷组与去势模型组比较血清降钙素呈上升趋势，但没有显著差异。

(2)知母总皂苷和部分单体化合物对中性粒细胞过氧化物产生作用的影响。

中性粒细胞在人体的防御系统中起着很重要的作用，它可以通过呼吸爆发产生过氧化物，过氧化物与细胞内的其它酶一起杀死侵入机体内的病原微生物。当由于某种原因机体内的过氧化物产生过多或过少时，就会导致各种疾病，如：慢性肉芽肿和脯氨酰酶缺乏症。其中，脯氨酰酶缺乏症病人的主要症状是长期溃疡性炎症，用氢化泼尼松(prednisolone)等抗炎性药物治疗可以缓解症状。有学者研究发现，炎症的出现与体内过氧化物的数量之间有着密切的关系，氢化泼尼松可以抑制中性粒细胞过氧化物的产生。

发明人测试了知母总皂苷和8种甾体皂苷类单体化合物对中性粒细胞过氧化物产生的影响，并与抗炎药物氢化泼尼松的活性进行了对照。

实验采用健康人的静脉血液，与3.8％枸橼酸钠混匀，加入分离剂，离心后取出粒细胞层。在缓冲盐溶液中依次加入粒细胞、细胞色素c、知母皂苷溶液和过氧化物产生的一种诱导剂(AA、fMLP或PMA)，在550～540nm下测吸光度。实验结果如附图4～10所示。

由附图4可知，知母总皂苷与氢化泼尼松对过氧化物产生的影响作用相似，轻微促进PMA诱导的过氧化物产生，而对fMLP诱导的过氧化物产生有很好的抑制作用，只是知母总皂苷的作用在这个浓度范围内比氢化泼尼松弱一些。由此可以推测知母总皂苷也具有类似氢化泼尼松的抗炎作用。

由附图5和附图6可知，对fMLP诱导的过氧化物产生，知母皂苷I、Ia、BII、BIII、E1和E2表现出抑制作用，其中知母皂苷Ia的抑制作用最强，而知母皂苷BI和AIII则表现出促进作用。

由附图7和附图8可知，对于PMA诱导的过氧化物产生，知母皂苷BI即没表现出抑制作用，也没表现出促进作用，其它7种化合物均具有一定的促进作用。

根据附图9，知母皂苷I、Ia、BII和AIII具有抑制AA诱导的过氧化物产生作用，而知母皂苷BI和BIII却对过氧化物产生具有促进作用。

知母皂苷E1和E2对AA诱导的过氧化物产生即没有抑制作用，也没有促进作用，具体数据在此没有列出。

从所测试的知母皂苷对中性粒细胞过氧化物产生的抑制作用结果可知，An-I、An-Ia、TB-III对fMLP和AA诱导的过氧化物产生有抑制作用；TB-II、E1和E2仅对fMLP诱导的过氧化物产生有抑制作用；TA-III对AA诱导的过氧化物产生有抑制作用；而TB-I对三种诱导剂诱导的过氧化物产生均没有抑制作用；所有知母皂苷趋向于促进PMA诱导的过氧化物产生。

根据上述结果，活性最强的是知母皂苷Ia对fMLP诱导的过氧化物产生的抑制作用。抗炎药物氢化泼尼松能较好地抑制fMLP诱导的的过氧化物产生，因此把两者的作用强度进行了对比。如附图10所示。

由附图10可以看出，氢化泼尼松只对fMLP诱导的过氧化物产生表现出抑制作用，而知母皂苷Ia对AA和fMLP诱导的过氧化物产生都具有抑制作用，并且知母皂苷Ia比氢化泼尼松的抑制作用更强。推测知母皂苷Ia具有很好的抗炎作用。此外，曾有报导，在临床上作胆囊切除术和结肠切除术之前，给病人大剂量的氢化泼尼松和神经阻断剂，可以减轻病人的疼痛感和术后的疲劳感。因此，对知母皂苷Ia的进一步研究很有意义，有可能发现甾体皂苷在临床上的新应用。

分析所测试的8种单体化合物的结构，可以把它们分成3组。知母皂苷I和知母皂苷Ia为第一组，这两个化合物的C-22位上连有异戊烷基。知母皂苷BI、BII、BIII、E1和E2构成第二组，此组化合物的C-22位上连有O-β-吡喃葡萄糖异戊烷基。知母皂苷AIII是第三组，其C-22位上连有一个甲基吡喃环。根据fMLP诱导的过氧化物产生实验结果，第一组中，具有22-OCH₃结构的知母皂苷Ia对过氧化物产生的抑制作用强于具有22-OH结构的知母皂苷I。而在第二组中，具有22-OCH₃结构的知母皂苷B1对过氧化物的产生起促进作用，具有22-OH结构的知母皂苷BII起抑制作用；与之相似的是，知母皂苷E2(22-OCH₃)的抑制作用要弱于知母皂苷E1(22-OH)。从构效关系的角度看，22-OH或22-OCH₃以及C-22上别的取代基团对整个分子的活性都有着不可忽视的贡献，是它们的协同作用决定化合物对过氧化物的产生是抑制还是促进。

知母甾体总皂苷具有广泛的医药用途、极高的应用价值及前景。因此包括我国在内的许多国家的专家、学者都对从知母中提取知母甾体总皂苷的方法进行了广泛而深入的研究，取得可喜的成就。但归纳起来最常用的方法是将知母药材的醇提取物或水提取物悬浮于水中，依次用不同极性的溶剂萃取，常用的溶剂有氯仿、乙酸乙酯和水饱和正丁醇。知母甾体总皂苷多集中于正丁醇层。减压回收正丁醇；浸膏用浓度为95％的乙醇溶解，并使其通过三氧化二铝层析柱及活性碳柱；收集流出液并减压回收乙醇，制得成品。利用这种方法制取知母甾体总皂苷存在的主要问题是：(1)产品成本较高，每公斤成品造价高达1200元人民币；(2)产品中的杂质，特别是有害物质的含量较高，其中重金属含量超过5ppm，农药残留量大于10ppb，超过规定限度，同时还不可避免地残留毒性溶剂正丁醇等。

实施例：

A：知母药材浸泡及煎煮

(A)取知母药材1kg放入容器内，再向容器中加入自来水8升，常温浸泡1小时，然后，将两者的混合物加热至70℃～80℃，保温3小时，之后，滤渣取液；

(B)向工步(A)滤出的渣中加入自来水6升，并将两者混合物加热至70℃～80℃，保温2小时，之后，滤渣取液；

(C)向工步(B)滤出的渣中加入自来水6升，并将两者混合物加热至70℃～80℃，保温1.5小时，之后，滤渣取液；

B：液体浓缩

将分别通过所述各工步(A)、(B)、(C)制取的液体混合一起后减压浓缩，直至其浓缩到约3升为止；

C：吸附、洗脱

使浓缩后的液体通过经活化处理后的大孔吸附树脂柱，使液体中的皂苷被树脂柱吸附，并弃去流出液，再用3升蒸馏水冲洗树脂柱，弃去流出液，继用浓度为75％的乙醇清洗树脂柱，使吸附于其上的皂苷被完全洗脱止，并收集洗脱液；

D：脱色

将含量不小于97％的符合中国药典(II部)规定标准的药用轻质氧化镁0.03kg加入所述洗脱液中，加热至70℃～80℃，并在此温度条件使两者的混合物回流45分钟，然后，使该混合物通过澄渣板过滤，并收集滤液；

E：去杂

使所述滤液自彼此串联的732型阳离子交换树脂和717型阴离子交换树脂中通过，使其中的离子与重金属被滤除，并收集滤液；

F：成品回收、干燥

回收工序E制得滤液中的乙醇，余留物质干燥后，即可得到知母甾体总皂苷成品。

按本实施例方法制取的知母甾体总皂苷产品：

1、收率(重量百分比)：为4.0～4.5％。

2、按薄层扫描法检测：该产品含知母皂苷AIII≥15％。

3、按HPLC法检测：该产品所含知母皂苷AIII、知母皂苷BII含量之和≥30％。

4、成分：分离鉴定了共18种皂苷及苷元，分别为：知母皂苷AI、知母皂苷AIII、知母皂苷F、知母皂苷G、知母皂苷I、知母皂苷Ia、知母皂苷BI、知母皂苷BII、知母皂苷BIII、知母皂苷D、知母皂苷E1、知母皂苷E2、知母皂苷H1、知母皂苷I1、知母皂苷I2、黄精皂苷A、萨尔萨皂苷元、马尔可皂苷元。

5、杂质含量：重金属≤5ppm、农药残留量，既“666”、“DDT”、“5 氯硝基苯”的残留量均≤10ppb。

Claims (2)

1、中药知母中甾体总皂苷的制备方法，其特征在于：它由以下工艺步骤组成：

A：知母药材浸泡及煎煮

(a)按知母药材与自来水的重量份数比为1∶8～16向知母药材中加入自来水，常温浸泡0.5～2小时，然后，将两者的混合物加热至70℃～100℃，保温1～3小时，之后，滤渣取液；

(b)按所述知母药材与自来水的重量份数比为1∶6～10向工步a滤出的渣中加入自来水，并将两者混合物加热至70℃～100℃，保温1～2.5小时，之后，滤渣取液；

(c)按所述知母药材与自来水的重量份数比为1∶6～8向工步b滤出的渣中加入自来水，并将两者混合物加热至70℃～100℃，保温1～1.5小时，之后，滤渣取液；

B：液体浓缩

将分别通过所述各工步a、b、c制取的液体混合一起后减压浓缩，直至其重量与所述知母药材重量之比为1～3∶1止；

C：吸附洗脱

使浓缩后的液体通过经活化处理后的大孔吸附树脂柱，使液体中的皂苷被树脂柱吸附，并弃去流出液，再按蒸馏水与浓缩后液体的体积之比为0.1～1∶1的比例取用蒸馏水冲洗树脂柱，弃去流出液，继用浓度为50～80％的乙醇清洗树脂柱，使吸附于其上的皂苷被完全洗脱止，并收集洗脱液；

D：脱色

按药用氧化镁与所述知母药材的重量份数比为2～6∶100的比例取用药用氧化镁并加入所述洗脱液中，加热回流20～60分钟，然后，使该混合物通过澄渣板过滤，并收集滤液；

E：去杂

使所述滤液自彼此串联的阳离子交换树脂和阴离子交换树脂中通过，使其中的离子与重金属被滤除，并收集滤液；

F：成品回收、干燥

回收工序E制得滤液中的乙醇，余留物质干燥后，即可得到知母甾体总皂苷成品。

2、中药知母中甾体总皂苷的医药用途，其特征在于：中药知母中甾体总皂苷作为制备治具有雌性激素样抗骨质疏松疾病药物的应用。