CN1715415A - bec基因花器官特异表达载体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种bec基因花器官特异表达载体，它含有在花器官特异表达的启动子查尔酮合成酶基因chs启动子Pchs、吲哚双加氧酶基因bec、终止子nos、筛选标记基因NPTII(新霉素磷酸转移酶基因)和LB(左边界)、RB(右边界)序列，其特征在于将其中的bec基因置于花器官特异表达的启动子Pchs调控之下，将该载体转入花卉，可促使靛蓝色素在花器官特异生成，改变花的色泽，提高花卉观赏价值。
Description
一、技术领域
本发明涉及基因重组与表达调控，具体地说将吲哚双加氧酶基因bec与在花器官特异表达的启动子重组，构建成可在花器官特异表达吲哚双加氧酶的载体质粒。
二、背景技术
靛蓝是最早发现的天然染料之一，颜色鲜艳又耐久，它通常从含靛植物中提取出来，但提取工艺复杂，产量低，因此目前市售的靛蓝色素绝大部分通过化学合成。自1928年发现微生物可合成靛蓝色素以来，通过微生物发酵大规模生产天然靛蓝色素成为可能。靛蓝分子中的苯环可引入各种取代基(最重要的是卤素)，形成各种靛蓝类染料。此外，靛蓝分子中的氮原子可被其它原子取代，用硫来代替氮原子则形成硫靛，是一种红色染料。在生物体的色氨酸代谢途径中，色氨酸在色氨酸酶的作用下形成吲哚及其衍生物，其中吲哚酚常以β-吲哚葡萄糖苷形式存在，其在β-葡糖酶的作用下脱去一分子葡萄糖生成吲哚酚，而吲哚酚极易被氧化成靛蓝。因此在靛蓝合成途径中，吲哚氧化成吲哚酚是关键步骤，而吲哚双加氧酶是关键酶，该基因的表达就可以促使靛蓝色素的生成。
在自然界中，天然的靛蓝色花卉极为罕见。通过基因工程的方法改良花卉的颜色就是将花器官特异表达启动子或诱导表达启动子与色素合成基因构建成植物高效表达载体，转化花卉，产生的色素就会沉淀在花器官的细胞腔内呈现色彩，改变转基因花卉的色泽。这种转基因花卉的出现将以其新颖的色泽和更加优良的园艺性状而具有更为广阔的市场前景。
查尔酮合成酶基因(chs)是植物体类黄酮合成分支的第一个酶，它的表达受到植株发育状况和环境刺激等因素的影响。目前，chs启动子是花卉基因工程中研究较多的一个，尤其是花卉的花色基因工程。在目前GenBank(基因数据库)中公布的有关chs启动子序列中，以十字花科植物为主，其中作为模式植物的拟南芥更是研究最多的材料之一。另外，象赤松、豌豆和矮牵牛等也是研究较多的植物。
1996年，Ouriel Faktor等研究了法国豌豆chs15基因的启动子序列，chs15-gus(β-葡萄糖苷酸酶基因)融合表达显示该启动子与大豆中报道的chs启动子具有相似的组织特异表达模式。gus活性在花和根尖中较强，而且在花中的表达主要是限定在花器官的色素部分。而在叶片和花萼部分很难检测到gus表达。在烟草中表达时，色素集中的花药部分gus的表达活性要比花丝等部位高的多，在子房中gus的表达活性也比较低。因此查尔酮合成酶基因启动子以其在花器官和根尖特异表达的特性而成为一种较为理想的用于花卉基因工程研究中的启动子。
三、发明内容
本发明的目的是提供一种bec基因花器官特异表达载体，将该载体转入花卉，可促使靛蓝色素在花器官特异生成，改变花的色泽，提高花卉观赏价值。
本发明的技术方案是：将花器官特异表达的查尔酮合成酶基因的启动子Pchs与吲哚双加氧酶基因bec进行基因重组，构建成可在花器官细胞内特异表达吲哚双加氧酶的重组质粒。将该质粒转化花卉，转基因花卉的花器官中将含有吲哚双加氧酶，催化吲哚氧化成吲哚酚，2个吲哚酚分子自然缩合成为靛蓝色素，沉淀在花器官细胞腔内从而改变花器官的颜色。
其中，所述bec基因的表达产物为吲哚双加氧酶，是靛蓝色素合成途径中的关键酶，该基因的表达就可以促使靛蓝色素的生成。
所述查尔酮合成酶基因chs启动子为花器官特异表达，可调控结构基因在花器官中特异表达。
所述载体质粒，在bec基因的5’端组装花器官特异启动元件查尔酮合成酶基因启动子Pchs。它们能使bec基因在花器官特异表达。
所述载体质粒，在bec基因的3’端组装了增强表达能力的nos终止子。
所述载体质粒组装NPTII基因，作为转基因植物的筛选标记，可以用卡那霉素进行转基因植株的筛选。
所述载体质粒组装LB和RB序列，促使组装于其间的bec基因表达框架和筛选标记基因NPTII整合至植物受体细胞染色体中。
本发明与现有技术相比，其显著优点是：本发明所述载体含有微生物靛蓝色素合成途径关键酶基因bec，并将其置于花器官特异表达的启动子Pchs调控之下，将该载体转入花卉，可促使靛蓝色素在花器官特异生成，改变花的色泽，提高花卉观赏性，具有重要的意义。
四、附图说明
附图是bec基因花器官特异表达载体质粒pBinPchs-bec的构建路线图。
将pPTL-bec上切下吲哚双加氧酶基因bec片段，经过两步中间载体pSIII和pSIV，将花器官特异启动子、bec基因和Nos终止子串联，构建成bec基因表达盒Pchs-bec-Tnos”，然后连入植物表达载体pBin19，最终得到载体pBinPchs-bec。
五、具体实施方式
下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1：拟南芥总DNA的提取。
1、取拟南芥哥伦比亚生态型种子，经无菌处理接种在培养基上，待其长出叶片。
2、称取4克新鲜叶片作为植物材料，在液氮中研成粉末，装入50ml离心管中，加入20ml冰浴的提取缓冲液，混合均匀。
3、2,700g离心20分钟，取上清加入8ml裂解缓冲液，充分涡旋混合均匀，65oC温浴20-30分钟。
4、加入10ml氯仿/异戊醇(24∶1)，颠倒混匀，12000rpm离心5分钟，取上相转入一新离心管中。如此重复数次，直至分界面澄清为止。
5、吸取上相到另一新Eppendof管中，加入2/3体积冰冷的异丙醇(约5.6ml)，室温静置20-30分钟。
6、6000rpm离心10分钟，收集沉淀物。
7、加入1ml 70％乙醇温和振荡冲洗2～3次，吹干。
8、加入500μl TE 65℃温浴10-30分钟，重悬沉淀。
9、重悬沉淀后，10,000g离心5分钟沉淀多糖。然后将上清转移到新的1.5mlEppendorf管。
10、溶解于TE的DNA可保存几周至数月。
11、紫外检测结果浓度为300ng/ul，A260/A280的比值为1.89，凝胶电泳结果DNA大于20KB。
实施例2：花器官特异启动子的克隆。
1、花器官特异启动子Pchs引物。
上游引物5’-TAG GAG TTA AGT ATG CAC GTG TAA GAA CT-3’
下游引物5’-CGC TAT AGT TAT CAC CAA CTT GG-3’。
2、PCR扩增：高保真PCR反应体系如下：10×ExBuf(Mg2+free)2μl；2mM dNTPMixer 2μl；25mM Mg2+1μl；ExTaq DNA Polymerase 0.2μl，即1u；上游引物1μl，30pmol；下游引物1μl，30pmol；模板(拟南芥总DNA约10-250ng)1μl，加无菌ddH2O补足20μl。反应程序：预变性94℃3分钟-(94℃40秒-55℃30秒-72℃40秒)×35个循环-72℃10分钟。
3、反应完成后，取10μl样品经1.0％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下用一次性刀片小心切下位于530bp左右的特异片段，用DNA片段回收试剂盒回收并纯化后溶于20μl ddH2O中，-20℃保存。
4、将扩增片段连接到pGEM-T载体上，进行序列分析。
实施例3：花器官特异启动子gus表达载体(pESII)的构建。
1、取7μlPCR回收产物与1μlpGEM-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，测序鉴定得pGEM-T-Pchs。
2、将pGEM-T-Pchs以PstI和NcoI酶切，所得片段连接至经PstI和NcoI双酶切的pUC-T-GAFP载体片段，转化鉴定，即得中间载体pSI。
3、阳性克隆以PstI和NcoI双酶切鉴定大小，切下大小为0.54KB左右片段。
4、将中间载体pSI以HindIII、EcoRV酶切所得Pchs启动子片段连接至经HindIII、SmaI酶切的pBI121载体片段，得花器官特异启动子gus表达载体pES II。阳性克隆经PCR鉴定，可见一条0.53 kb左右条带，即Pchs启动子片段。
实施例4：花器官特异启动子调控下bec基因的植物表达载体(pBinPchs-bec)构建。
1、将pPTL-bec以EcoRI、PstI酶切所得bec片段连接至经EcoRI、PstI。酶切的pBluescriptSK载体片段得中间载体pSIII。蓝白斑筛选所得阳性克隆经EcoRI、SmaI酶切鉴定得2.4kb左右条带，为bec基因。
2、将中间载体pSIII以EcoRI、SmaI酶切所得bec片段连接至EcoRI、EcoRV酶切的pSI载体片段，获得中间载体pSIV，阳性克隆经XbaI，SacI双酶切鉴定，可见一条2.4kb左右条带，即bec基因。
3、将中间载体pSIV以EcoRI和HindIII酶切所得bec片段连接至经EcoRI和HindIII酶切pBin19所得载体片段上，获得植物表达载体pBinPchs-bec。阳性克隆经EcoRI和HindIII双酶切并以pBin19酶切产物为对照，结果pBin19双酶切产物可见1条10.0kb左右条带为gus片段；而pBinPchs-bec双酶切产生2条带，各约10.0kb和3.5kb，说明花器官特异启动元件调控下基因的基因表达盒“Pchs-bec-Tnos”已经成功插入。
Claims (7)
1、一种bec基因花器官特异表达载体，其特征在于它含有拟南芥查尔酮合成酶基因的启动子、bec基因、终止子和NPTII基因。
2、根据权利要求1所述的bec基因花器官特异表达载体，其特征在于bec基因的表达产物是吲哚双加氧酶。
3、根据权利要求1所述的bec基因花器官特异表达载体，其特征在于bec基因的5’端组装花器官特异启动元件查尔酮合成酶基因启动子。
4、根据权利要求1所述的bec基因花器官特异表达载体，其特征在于bec基因的3’端组装了增强表达能力的nos终止子。
5、根据权利要求1所述的bec基因花器官特异表达载体，其特征在于含有LB和RB序列。
6、根据权利要求1所述的bec基因花器官特异表达载体，其特征在于NPTII基因可以用卡那霉素筛选。
7、根据权利要求1所述的bec基因花器官特异表达载体，其特征在于可将bec基因整合至植物受体细胞染色体中。
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| CN200510039104.4A CN1715415A (zh) | 2005-04-26 | 2005-04-26 | bec基因花器官特异表达载体 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN102250898A (zh) * | 2011-06-17 | 2011-11-23 | 清华大学 | 一种能驱动基因在花组织中表达的启动子 |
| CN102465126A (zh) * | 2010-11-05 | 2012-05-23 | 中国中医科学院中药研究所 | 黄芩查尔酮合酶基因的启动子及其应用 |
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