CN1712528A - 耐高温葡萄糖异构酶及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及葡萄糖异构酶，具体地说是一种耐高温(热)葡萄糖异构酶及其编码基因和(在生产果葡糖浆方面的)应用；其具有序列表SEQ ID NO：2中的氨基酸序列和具有序列表SEQ ID NO：1中碱基序列。本发明公开的耐高温葡萄糖异构酶基因来源于Thermotoga neapolitana，可直接生产果糖含量高的果葡糖浆。

Description

耐高温葡萄糖异构酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及葡萄糖异构酶，具体地说是一种耐高温(热)葡萄糖异构酶及其编码基因和(在生产果葡糖浆方面的)应用。

背景技术

葡萄糖异构酶，或称木糖异构酶(Xylose isomerase)是重要的工业酶。食品工业上利用葡萄糖异构酶制备果葡糖浆。利用酶法生产果葡糖浆时，反应温度越高，产品果葡糖浆中的果糖含量也越高(Hartley，BS et al.，Biochim Biophys Acta.2000，1543：294-335.)。

目前，商业上使用葡萄糖异构酶主要取自链霉菌(Streptomyces)、或密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis)等，但这些葡萄糖异构酶不耐高温，在高温(如高于60℃)下容易失活。因此，目前工业界只得在60℃下制备果葡糖浆，所得的果葡糖浆中果糖的含量也就较低，一般为42％。若欲生产含高浓度果糖(如大于42％)的果葡糖浆通常依赖层析分离方法生产，令生产含高果糖果葡糖浆的成本大大提高了。因此，从耐热菌中筛选并通过蛋白质工程的方法生产耐热高催化活性的葡萄糖异构酶工业前景良好。尽管许多国家的科学家对提高葡萄糖异构酶的耐热性有浓厚兴趣并进行了大量研究，如参见文献：Journal of GeneralMicrobiology，1993，139：1227-1234；Methods Enzymology 2001；330：215-24；Protein Engineering，2000，13：259-65，但这些研究尚难在高于现有工业条件，即在60℃以上温度条件下，生产高浓度果糖(如大于42％)的果葡糖浆。

发明内容

本发明的目的在于提供一种耐高温葡萄糖异构酶及其编码基因和应用。

一种耐高温葡萄糖异构酶，具有序列表SEQ ID NO：2中的氨基酸序列。

所述耐高温葡萄糖异构酶也可以为与序列表SEQ ID NO：2中的氨基酸序列具有同源性≥90％的氨基酸衍生物。

上述耐高温葡萄糖异构酶的编码基因，具有序列表SEQ ID NO：1中的碱基序列。也可以为与序列表SEQ ID NO：1中的碱基序列具有同源性≥75％的碱基序列。

所述耐高温葡萄糖异构酶可在制备果葡糖浆中的应用。其工程葡萄糖异构酶可以是纯酶或部分纯化的酶；

在本发明制备工程葡萄糖异构酶的方法中，所述的工程葡萄糖异构酶可以在原核细胞或真核细胞内表达，也可采用本领域已知的任何其它适当方法实现在原核细胞或真核细胞外表达(例如在胞外表达体系中表达)。

其中耐高温葡萄糖异构酶在细胞内表达可按如下过程制备：

1)耐高温葡萄糖异构酶(TN)基因扩增和质粒构建

利用引物对T1：5’AGA TTA CCT AGG TAC ATA TGG CTG AAT TCT ATCCAG AAA TCC CGA AA 3’和T2：5’ATT TCC GAT GGC GCG CCT CAC CTC AGTTCC AGA ATG GTC TTC 3’从Thermotoga neapolitana中扩增葡萄糖异构酶编码基因序列表SEQ ID NO：1的碱基序列；PCR扩增反应程序为：95℃ 3分钟，40圈循环：95℃ 50秒、50℃ 40秒和72℃ 1分钟，最后72℃ 10分钟；扩增的基因按常规方法连接至载体pGEMT-Easy(Promega，USA)上，产生质粒pGMT-TN；

在本发明制备工程葡萄糖异构酶的方法中，所述的载体包括(但不限于)原核表达载体pRSET、pGEMT-Easy、和pET21；包括(但不限于)真核表达载体pYD1和pYES2/GS；包括(但不限于)克隆载体pUC18/19和pBluscript-SK。在生产本发明提供的耐高温葡萄糖异构酶时，可以将耐高温葡萄糖异构酶基因序列与表达调控序列相连，进而形成耐高温葡萄糖异构酶表达载体。表达载体含有复制起始点和表达调控序列、启动子、或/和增强子、或/和必要的加工信息位点、或/和信号肽编码序列。表达载体还必须含有可供选择的标记基因，如氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因。这些表达载体可以用本领域公知的重组DNA技术制备，可参考Sambrook，et al.，Molecular cloning：A laboratory manual.New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)。

2)载体的转化

在本发明制备工程葡萄糖异构酶的方法中，所述的微生物宿主细胞为原核细胞或真核细胞；所述原核微生物包括(但不限于)大肠杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草杆菌和链霉菌；所述真核微生物包括(但不限于)酿酒酵母和毕赤巴斯德酵母。

3)葡萄糖异构酶的制备与纯化：接种单个含质粒pGMT-TN的菌种克隆于种子菌培养基中，得种子液；将上述种子液发酵培养，收集菌体，粉碎裂解细菌细胞，收集纯化获得葡萄糖异构酶。本发明具有如下优点：

1.葡萄糖异构酶耐热性好。本发明利用来源于Thermotoga neapolitana的耐热葡萄糖异构酶，在高温(如：60℃以上)下反应，生产果糖含量高于43％的果葡糖浆。

2.可直接生产果糖含量高的果葡糖浆。使用本发明的耐热葡萄糖异构酶直接生产果糖含量高于42％的果葡糖浆；甚至可生产果糖含量低于55％(包括55％)的果葡糖浆。

附图说明

下列附图表用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1为葡萄糖异构酶TN在80℃反应条件下生产的果葡糖浆中果糖含量随反应时间延长的变化。

具体实施方式

下列实施实例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。实施实例中未注明具体条件的实验方法，按常规条件或制造商建议的条件进行。

葡萄糖异构酶TN的核苷酸序列如下：

1 atggctgaat tctttccaga aatcccgaaa gtgcagttcg aaggcaaaga aagcacaaat

61 ccacttgcgt tcaagttcta cgatccagaa gagatcatcg acggcaaacc cctcaaggac

121 catctgaagt tctccgttgc cttctggcac accttcgtga acgagggaag ggaacccttc

181 ggagacccaa cggccgatcg tccctggaac aggtacaccg atcccatgga caaggctttt

241 gcaagggtgg acgccctttt tgaattctgc gaaaaactca acatcgagta cttctgcttc

301 cacgacagag acatcgctcc cgagggaaaa acgctgaggg agacaaacaa aattttggac

361 aaagtagtgg agagaatcaa agagagaatg aaagacagca acgtgaagct cctctggggt

421 actgcaaacc tcttttccca cccaaggtac atgcatggtg cagcgacaac ctgcagtgct

481 gatgtttttg cgtacgcggc cgcccaggtg aaaaaagccc ttgagatcac caaagaactt

541 ggaggagaag ggtacacatt ctggggtgga agagaaggat acgaaacact cctcaacacg

601 gaccttggat tcgaacttga aaacctcgcc cgcttcctca gaatggctgt ggattatgca

661 aaaaggatcg gtttcaccgg acagttcctc atcgaaccaa aaccgaaaga acccaccaaa

721 caccagtacg acttcgacgt tgcaaccgcc tatgccttcc tgaagagcca cggtctcgat

781 gaatacttca aattcaacat cgaggcaaac cacgccacac tcgccggtca caccttccag

841 cacgaactga gaatggcaag gatccttgga aaactcggaa gcatcgatgc aaaccaagga

901 gaccttcttc ttggatggga caccgatcag ttcccaacaa acgtctacga tacaaccctt

961 gcaatgtacg aagtgataaa agcgggaggc ttcacaaaag gtgggctcaa cttcgatgcg

102l aaggtgagga gggcttctta caaagtggag gacctcttca tagggcacat agcgggaatg

108l gacacctttg cactcggttt caaggtggca tacaaactcg tgaaggatgg tgttctggac

1141 aaattcatcg aagaaaagta cagaagtttc agggagggca ttggaaggga catcgtcgaa

1201 ggtaaagtgg attttgaaaa acttgaagag tatataatag acaaagaaac gatagaactt

1261 ccatctggaa agcaagaata cctggaaagc ctcatcaaca gttacatagt gaagaccatt

1321 ctggaactga ggtga

(1)SEQ ID NO 1：的信息(参见序列表)

(a)序列特征：

*长度：1335碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：Thermotoga neapolitana。

上述有核苷酸序列基因编码的(葡萄糖异构酶TN的)氨基酸序列为：

MAEFFPEIPKVQFEGKESTNPLAFKFYDPEEIIDGKPLKDHLKFSVAFWHTFVNEGREPF

GDPTADRPWNRYTDPMDKAFARVDALFEFCEKLNIEYFCFHDRDIAPEGKTLRETNKILD

KVVERIKERMKDSNVKLLWGTANLFSHPRYMHGAATTCSADVFAYAAAQVKKALEITKEL

GGEGYTFWGGREGYETLLNTDLGFELENLARFLRMAVDYAKRIGFTGQFLIEPKPKEPTK

HQYDFDVATAYAFLKSHGLDEYFKFNIEANHATLAGHTFQHELRMARILGKLGSIDANQG

DLLLGWDTDQFPTNVYDTTLAMYEVIKAGGFTKGGLNFDAKVRRASYKVEDLFIGHIAGM

DTFALGFKVAYKLVKDGVLDKFIEEKYRSFREGIGRDIVEGKVDFEKLEEYIIDKETIEL

PSGKQEYLESLINSYIVKTILELR*

(1)SEQ ID N0 2：的信息(参见序列表)

(a)序列特征：

*长度：444氨基酸残基

*类型：蛋白

(b)分子类型：蛋白质

(c)假设：否

(e)最初来源：Thermotoga neapolitana。

实施例：

1)基因扩增和质粒构建

根据基因库(L38994)基因序列设计引物T1：5’AGA TTA CCT AGG TACATA TGG CTG AAT TCT ATC CAG AAA TCC CGA AA 3’和T2：5’ATT TCC GATGGC GCG CCT CAC CTC AGT TCC AGA ATG GTC TTC 3’；利用引物对T1和T2从Thermotoga neapolitana中扩增葡萄糖异构酶编码基因(TN)。

扩增反应条件为：5微升10×缓冲液(Promega，USA)，4微升2.5毫摩尔dNTP(Promega，USA)，2微升10微摩尔引物T1，2微升10微摩尔引物T2，0.5微升5U/微升Tag DNA聚合酶(Promega，USA)，用接种环挑取少许Thermotoga neapolitana菌体，再用无菌水调反应体积至50微升。

PCR扩增反应程序为：95℃ 3分钟，40圈循环：95℃ 50秒、50℃ 30秒和72℃ 1分钟，最后72℃ 10分钟。扩增的基因连接至载体pGEMT-Easy上，连接条件如载体制造商所建议方案，产生质粒pGMT-TN。

2)质粒转化

按常规方法制备DH5α的感受态细胞(参考Sambrook，e艺al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.New York：Cold Spring HarborLaboratory press，1989)。将40纳克质粒pGMT-TN加入100微升DH5α感受态细胞中，于42℃热击2分钟，迅速于冰上冷却，加入400微升LB培养基(参考Sambrook，et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.New York：Cold Spring Harbor Laboratory press，1989)，于37℃振动培养2小时，涂10微升培养物于1％的MacConkey(DIFCO，USA)平板(含1％D-木糖和50mg/L氨苄青霉素)上，置板于37℃培养，从中筛选出具葡萄糖异构酶活性的克隆。

3)葡萄糖异构酶的制备与纯化

接种单个含质粒pGMT-TN的菌种(大肠杆菌DH5α)克隆于50毫升种子菌培养基(玉米浆：0.2克；酵母膏：0.25克，调整pH至7.0；加卡那霉素至50毫克/升)中，于37℃培养过夜。将4毫升转入5000毫升种子菌培养基(玉米浆：20克；酵母膏：25克，调整pH至7.0；加卡那霉素至50毫克/升)中，于30℃培养过夜(约12小时)，此时细菌OD₆₀₀应达到3-4。将上述5升种子菌培养液转入预先消毒好的含100升起始培养基(玉米浆：4000克；酵母膏：400克；葡萄糖：250克；硫酸铵：152克；磷；氢二钠：304克；磷酸二氢钾：80克；氯化钠：152克；含7个结晶水的硫酸镁：252克；氢氧化钠：100克；卡那霉素：5克，调pH至7.0)的发酵罐(自动控温、调节酸碱度、补氧、补料)中，于35℃培养。随着葡萄糖的逐渐消耗，pH会下降，此时用固体氢氧化钾调pH至7.0-7.4。当葡萄糖消耗完毕，pH会逐渐上升(大约5-7小时后)，此时缓慢加入60升补料培养基(玉米浆：10500克；酵母膏：500克；甘油：1升；葡萄糖：300克；硫酸铵：38克；磷酸氢二钠：76克；磷酸二氢钾：20克；氯化钠：38克；含7个结晶水的硫酸镁：63克；氢氧化钠：100克；卡那霉素：3克，调整pH至7.0)，令pH维持在7.0-7.4，约12-19小时后补料结束，之后再培养2小时左右，终止发酵。于4000转/分钟离心20分钟收集菌体，并离心约20分钟收集菌体，离心转速为4000转/分钟，并将菌体悬浮于20毫摩尔磷酸钠缓冲液(pH8.0)中，使体积达约20升-30升，加氯化钴(CoCl₂)和氯化镁(MgCl₂)至终浓度分别为200微摩尔和5毫摩尔。

然后用细菌粉碎机粉碎裂解细菌细胞，离心(10℃，4000转/分钟，20分钟)并收集上清液。上清液经80℃处理10-20分钟后，离心(10℃，4000转/分钟，20分钟)并收集上清液，上清液即为纯化的葡萄糖异构酶，可用于酶活性的测定和制备果葡糖浆。

4)葡萄糖异构酶活性测定

取10微升实例3制备的葡萄糖异构酶，加入90微升1.0摩尔的葡萄糖和20毫摩尔磷酸钠缓冲溶液中(pH 6.8)，并加入CoCl₂和MgCl₂至终浓度分别为200微摩尔和10毫摩尔，反应于80℃进行10分钟；将反应物置冰上以终止反应；反应产物D-果糖通过半胱氨酸-咔唑法测定。测定方法参见J.Biol.Chem 1951，192：583-587。用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定酶蛋白浓度；一单位酶比活性定义为每毫克酶蛋白质每分钟转化底物产生的产物微摩尔数。

5)果葡糖浆的生产

于控温反应罐中，注入约1-1.2吨蒸馏水，加热至80℃以上，加入1吨纯度在95％以上的口服用结晶葡萄糖，再注入热蒸馏水，使糖浓度达50％(W/V)；如果条件允许，进行低压排氧；调酸碱度至pH7.5。加入1.6-2升纯化的葡萄糖异构酶，缓慢搅拌反应约12小时后，监测酸碱度和果糖转化率；再加入1.6-2升纯化的葡萄糖异构酶，反应约12小时后，再监测酸碱度和果糖转化率，直至果糖转化率达到55％；反应结束后应迅速降温至室温，过一夹板筛，滤去沉淀物质，室温放置或过活性炭柱。

6)葡萄糖转化为果糖的转化率之测定

用国标法测定实例5产生的果糖含量(参考中华人民共和国国家标准：GB 8274-87)。图1显示葡萄糖异构酶TN在80℃反应条件下生产的果葡糖浆中果糖含量随反应时间延长的变化。

本发明不受上述具体文字描述的限制，本发明可在权利要求书所概括的围内做各种改变。这些改变均在本发明的范围之内。

                       耐高温葡萄糖异构酶

           SEQUENCE LISTING

<110>张力彬

<120>耐高温葡萄糖异构酶及其编码基因和应用

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1335

<212>DNA

<213>Thermotoga neapolitana

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1335)

<223>

<400>1

atg gct gaa ttc ttt cca gaa atc ccg aaa gtg cag ttc gaa ggc aaa       48

Met Ala Glu Phe Phe Pro Glu Ile Pro Lys Val Gln Phe Glu Gly Lys

1               5                   10                  15

gaa agc aca aat cca ctt gcg ttc aag ttc tac gat cca gaa gag atc       96

Glu Ser Thr Asn Pro Leu Ala Phe Lys Phe Tyr Asp Pro Glu Glu Ile

            20                  25                  30

atc gac ggc aaa ccc ctc aag gac cat ctg aag ttc tcc gtt gcc ttc      144

Ile Asp Gly Lys Pro Leu Lys Asp His Leu Lys Phe Ser Val Ala Phe

        35                  40                  45

tgg cac acc ttc gtg aac gag gga agg gaa ccc ttc gga gac cca acg      192

Trp His Thr Phe Val Asn Glu Gly Arg Glu Pro Phe Gly Asp Pro Thr

    50                  55                  60

gcc gat cgt ccc tgg aac agg tac acc gat ccc atg gac aag gct ttt      240

Ala Asp Arg Pro Trp Asn Arg Tyr Thr Asp Pro Met Asp Lys Ala Phe

65                  70                  75                  80

gca agg gtg gac gcc ctt ttt gaa ttc tgc gaa aaa ctc aac atc gag      288

Ala Arg Val Asp Ala Leu Phe Glu Phe Cys Glu Lys Leu Asn Ile Glu

                85                  90                  95

tac ttc tgc ttc cac gac aga gac atc gct ccc gag gga aaa acg ctg      336

Tyr Phe Cys Phe His Asp Arg Asp Ile Ala Pro Glu Gly Lys Thr Leu

            100                 105                 110

agg gag aca aac aaa att ttg gac aaa gta gtg gag aga atc aaa gag      384

Arg Glu Thr Asn Lys Ile Leu Asp Lys Val Val Glu Arg Ile Lys Glu

                                            耐高温葡萄糖异构酶

        115                 120                 125

aga atg aaa gac agc aac gtg aag ctc ctc tgg ggt act gca aac ctc      432

Arg Met Lys Asp Ser Asn Val Lys Leu Leu Trp Gly Thr Ala Asn Leu

    130                 135                 140

ttt tcc cac cca agg tac atg cat ggt gca gcg aca acc tgc agt gct      480

Phe Ser His Pro Arg Tyr Met His Gly Ala Ala Thr Thr Cys Ser Ala

145                 150                 155                 160

gat gtt ttt gcg tac gcg gcc gcc cag gtg aaa aaa gcc ctt gag atc      528

Asp Val Phe Ala Tyr Ala Ala Ala Gln Val Lys Lys Ala Leu Glu Ile

                165                 170                 175

acc aaa gaa ctt gga gga gaa ggg tac aca ttc tgg ggt gga aga gaa      576

Thr Lys Glu Leu Gly Gly Glu Gly Tyr Thr Phe Trp Gly Gly Arg Glu

            180                 185                 190

gga tac gaa aca ctc ctc aac acg gac ctt gga ttc gaa ctt gaa aac      624

Gly Tyr Glu Thr Leu Leu Asn Thr Asp Leu Gly Phe Glu Leu Glu Asn

        195                 200                 205

ctc gcc cgc ttc ctc aga atg gct gtg gat tat gca aaa agg atc ggt      672

Leu Ala Arg Phe Leu Arg Met Ala Val Asp Tyr Ala Lys Arg Ile Gly

    210                 215                 220

ttc acc gga cag ttc ctc atc gaa cca aaa ccg aaa gaa ccc acc aaa      720

Phe Thr Gly Gln Phe Leu Ile Glu Pro Lys Pro Lys Glu Pro Thr Lys

225                 230                 235                 240

cac cag tac gac ttc gac gtt gca acc gcc tat gcc ttc ctg aag agc      768

His Gln Tyr Asp Phe Asp Val Ala Thr Ala Tyr Ala Phe Leu Lys Ser

                245                 250                 255

cac ggt ctc gat gaa tac ttc aaa ttc aac atc gag gca aac cac gcc      816

His Gly Leu Asp Glu Tyr Phe Lys Phe Asn Ile Glu Ala Asn His Ala

            260                 265                 270

aca ctc gcc ggt cac acc ttc cag cac gaa ctg aga atg gca agg atc      864

Thr Leu Ala Gly His Thr Phe Gln His Glu Leu Arg Met Ala Arg Ile

        275                 280                 285

ctt gga aaa ctc gga agc atc gat gca aac caa gga gac ctt ctt ctt      912

Leu Gly Lys Leu Gly Ser Ile Asp Ala Asn Gln Gly Asp Leu Leu Leu

    290                 295                 300

gga tgg gac acc gat cag ttc cca aca aac gtc tac gat aca acc ctt      960

Gly Trp Asp Thr Asp Gln Phe Pro Thr Asn Val Tyr Asp Thr Thr Leu

305                 310                 315                 320

gca atg tac gaa gtg ata aaa gcg gga ggc ttc aca aaa ggt ggg ctc     1008

Ala Met Tyr Glu Val Ile Lys Ala Gly Gly Phe Thr Lys Gly Gly Leu

                325                 330                 335

aac ttc gat gcg aag gtg agg agg gct tct tac aaa gtg gag gac ctc     1056

Asn Phe Asp Ala Lys Val Arg Arg Ala Ser Tyr Lys Val Glu Asp Leu

            340                 345                 350

ttc ata ggg cac ata gcg gga atg gac acc ttt gca ctc ggt ttc aag     1104

Phe Ile Gly His Ile Ala Gly Met Asp Thr Phe Ala Leu Gly Phe Lys

        355                 360                 365

gtg gca tac aaa ctc gtg aag gat ggt gtt ctg gac aaa ttc atc gaa     1152

Val Ala Tyr Lys Leu Val Lys Asp Gly Val Leu Asp Lys Phe Ile Glu

    370                 375                 380

gaa aag tac aga agt ttc agg gag ggc att gga agg gac atc gtc gaa     1200

Glu Lys Tyr Arg Ser Phe Arg Glu Gly Ile Gly Arg Asp Ile Val Glu

385                 390                 395                 400

ggt aaa gtg gat ttt gaa aaa ctt gaa gag tat ata ata gac aaa gaa     1248

Gly Lys Val Asp Phe Glu Lys Leu Glu Glu Tyr Ile Ile Asp Lys Glu

                405                 410                 415

acg ata gaa ctt cca tct gga aag caa gaa tac ctg gaa agc ctc atc     1296

                                            耐高温葡萄糖异构酶

Thr Ile Glu Leu Pro Ser Gly Lys Gln Glu Tyr Leu Glu Ser Leu Ile

            420                 425                 430

aac agt tac ata gtg aag acc att ctg gaa ctg agg tga                  l335

Asn Ser Tyr Ile Val Lys Thr Ile Leu Glu Leu Arg

        435                 440

<210>2

<211>444

<212>PRT

<213>Thermotoga neapolitana

<400>2

Met Ala Glu Phe Phe Pro Glu Ile Pro Lys Val Gln Phe Glu Gly Lys

1               5                   10                  15

Glu Ser Thr Asn Pro Leu Ala Phe Lys Phe Tyr Asp Pro Glu Glu Ile

            20                  25                  30

Ile Asp Gly Lys Pro Leu Lys Asp His Leu Lys Phe Ser Val Aia Phe

        35                  40                  45

Trp His Thr Phe Val Asn Glu Gly Arg Glu Pro Phe Gly Asp Pro Thr

    50                  55                  60

Ala Asp Arg Pro Trp Asn Arg Tyr Thr Asp Pro Met Asp Lys Ala Phe

65                  70                  75                  80

Ala Arg Val Asp Ala Leu Phe Glu Phe Cys Glu Lys Leu Asn Ile Glu

                85                  90                  95

Tyr Phe Cys Phe His Asp Arg Asp Ile Ala Pro Glu Gly Lys Thr Leu

            100                 105                 110

Arg Glu Thr Asn Lys Ile Leu Asp Lys Val Val Glu Arg Ile Lys Glu

        115                 120                 125

Arg Met Lys Asp Ser Asn Val Lys Leu Leu Trp Gly Thr Ala Asn Leu

    130                 135                 140

Phe Ser His Pro Arg Tyr Met His Gly Ala Ala Thr Thr Cys Ser Ala

145                 150                 155                 160

Asp Val Phe Ala Tyr Ala Ala Ala Gln Val Lys Lys Ala Leu Glu Ile

                165                 170                 175

Thr Lys Glu Leu Gly Gly Glu Gly Tyr Thr Phe Trp Gly Gly Arg Glu

            180                 185                 190

Gly Tyr Glu Thr Leu Leu Asn Thr Asp Leu Gly Phe Glu Leu Glu Asn

        195                 200                 205

Leu Ala Arg Phe Leu Arg Met Ala Val Asp Tyr Ala Lys Arg Ile Gly

    210                 215                 220

                                             耐高温葡萄糖异构酶

Phe Thr Gly Gln Phe Leu Ile Glu Pro Lys Pro Lys Glu Pro Thr Lys

225                 230                 235                 240

His Gln Tyr Asp Phe Asp Val Ala Thr Ala Tyr Ala Phe Leu Lys Ser

                245                 250                 255

His Gly Leu Asp Glu Tyr Phe Lys Phe Asn Ile Glu Ala Asn His Ala

            260                 265                 270

Thr Leu Ala Gly His Thr Phe Gln His Glu Leu Arg Met Ala Arg Ile

        275                 280                 285

Leu Gly Lys Leu Gly Ser Ile Asp Ala Asn Gln Gly Asp Leu Leu Leu

    290                 295                 300

Gly Trp Asp Thr Asp Gln Phe Pro Thr Asn Val Tyr Asp Thr Thr Leu

305                 310                 315                 320

Ala Met Tyr Glu Val Ile Lys Ala Gly Gly Phe Thr Lys Gly Gly Leu

                325                 330                 335

Asn Phe Asp Ala Lys Val Arg Arg Ala Ser Tyr Lys Val Glu Asp Leu

            340                 345                 350

Phe Ile Gly His Ile Ala Gly Met Asp Thr Phe Ala Leu Gly Phe Lys

        355                 360                 365

Val Ala Tyr Lys Leu Val Lys Asp Gly Val Leu Asp Lys Phe Ile Glu

    370                 375                 380

Glu Lys Tyr Arg Ser Phe Arg Glu Gly Ile Gly Arg Asp Ile Val Glu

385                 390                 395                 400

Gly Lys Val Asp Phe Glu Lys Leu Glu Glu Tyr Ile Ile Asp Lys Glu

                405                 410                 415

Thr Ile Glu Leu Pro Ser Gly Lys Gln Glu Tyr Leu Glu Ser Leu Ile

            420                 425                 430

Asn Ser Tyr Ile Val Lys Thr Ile Leu Glu Leu Arg

        435                 440

Claims (7)

1.一种耐高温葡萄糖异构酶，其特征在于：具有序列表SEQ ID NO：2中的氨基酸序列。

2.按照权利要求1所述耐高温葡萄糖异构酶，其特征在于：所述耐高温葡萄糖异构酶为与序列表SEQ ID NO：2中的氨基酸序列具有同源性≥90％的氨基酸衍生物。

3.一种权利要求1所述耐高温葡萄糖异构酶的编码基因，其特征在于：具有序列表SEQ ID NO：1中的核苷酸序列。

4.按照权利要求3所述耐高温葡萄糖异构酶的编码基因，其特征在于：所述编码基因为与序列表SEQ ID NO：1中的碱基序列具有同源性≥75％的碱基序列。

5.一种权利要求1所述耐高温葡萄糖异构酶在制备果葡糖浆中的应用。

6.按照权利要求5所述耐高温葡萄糖异构酶在制备果葡糖浆中的应用，其特征在于：所述葡萄糖异构酶是纯酶或部分纯化的酶。

7.按照权利要求5所述耐高温葡萄糖异构酶在制备果葡糖浆中的应用，其特征在于：其中耐高温葡萄糖异构酶按如下过程制备，

1)基因扩增和载体构建

利用引物对T1：5’AGA TTA CCT AGG TAC ATA TGG CTG AAT TCT ATCCAG AAA TCC CGA AA 3’和T2：5’ATT TCC GAT GGC GCG CCT CAC CTC AGTTCC AGA ATG GTC TTC 3’从Thermotoga neapolitana中扩增葡萄糖异构酶编码基因序列表SEQ ID NO：1的碱基序列；PCR扩增反应程序为：95℃3分钟，40圈循环：95℃50秒、50℃30秒和72℃1分钟，最后72℃10分钟；扩增的基因连接至载体上，产生质粒；

2)载体的转化；

3)葡萄糖异构酶的制备与纯化：接种单个含质粒pGMT-TN的菌种克隆于种子菌培养基中，得种子液；将上述种子液发酵培养，收集菌体，粉碎裂解细菌细胞，收集纯化获得葡萄糖异构酶。