CN1671735A - 聚乙二醇化的t1249多肽 - Google Patents

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Abstract

提供了聚乙二醇化的T1249多肽化合物。还提供了包含聚乙二醇化的T1249多肽化合物的药物组合物以及生产此类化合物及组合物的方法。还提供了包含与可药用赋形剂混合的式(I)化合物的药物组合物的用途，用于制备抑制HIV感染的药物。

Description

聚乙二醇化的T1249多肽
本发明涉及聚乙二醇化的T1249多肽化合物，还涉及使用和制备此类化合物的方法，例如在药物组合物中使用和制备此类化合物的方法，并且还涉及进行治疗的治疗性方法。
一些病毒，尤其是HIV，必须经过一个称为融合的复杂过程以进入宿主细胞和繁殖。在融合过程中，病毒的外膜与宿主细胞的细胞膜融合。在HIV的情况下，HIV病毒的外膜与繁殖期间的CD4 +T细胞的细胞膜融合。
T1249是一类新的抑制病毒/细胞膜融合的抗病毒剂中的一员。在为HIV的情况下，其提供两方面有益的作用：阻断HIV的繁殖并且不会发生由此引起的CD4 +T细胞死亡。
在目前的HIV临床治疗手段中，对新近批准的抗HIV药物产生病毒抗性是一个突出问题。随着时间的推移，开始联合使用新近批准的抗逆转录病毒药物治疗的许多患者都会对这些药物中的一种或更多种产生抗性。但是，研究表明，T1249不受对任一目前批准的抗逆转录病毒类药物所产生的抗性的影响。(所述数据在2001年6月4-8日于亚利桑那州斯科茨代尔举行的第5届国际药物抗性和治疗策略的会议上给出)。
临床试验中对T1249剂量范围的分析表明：之前没有经历抗逆转录病毒治疗，其中包括对所有批准的HIV药物类型的突变而言，T1249的日剂量是唯一与经历治疗患者中病毒载量降低相关的变量。其他实验表明T1249的体外活性不受对逆转录酶抑制剂及蛋白酶抑制剂抗性相关突变的影响。
象许多多肽治疗剂一样，T1249通常经注射施用。目前的治疗方案通常涉及一天多于一次的注射。
所以，提供具有较高性能和药物动力学特性的T1249多肽及药物组合物是有利的。能提供较低T1249治疗剂量、较少施用频率和/或具有作用持续时间延长的T1249是尤其有利的。
以下更详细地描述了本发明的这些和其他目的。
本发明提供了下式的化合物：
Figure A0381767900061
其中
R1为封端基团，
m为1-17，
n为10-1,000，
p从1-3，且
NHT1249为通过其末端α-氨基共价连接的T1249多肽。
在本发明化合物的一个实施方案中，R1为甲氧基，m为1，n为100-750，p为3。
还提供了药物组合物，其包含与可药用赋形剂混合的式(I)化合物，其中R1、m、n、p和NHT1249如上所述。
在本发明药物组合物的一个实施方案中，R1为甲氧基，m为1，n为100-750，且p为3。
本发明还提供了抑制HIV感染的方法，包括施用包含与可药用赋形剂混合的式(I)化合物的药物组合物，其中R1、m、n、p和NHT1249如上所述。如果本发明涉及“包含一种化合物的抑制HIV感染的方法”是指“使用化合物来制备抑制HIV的药物”。
抑制HIV感染方法的一个实施方案中，R1为甲氧基，m为1，n为100-750，p为3。
还提供了产生聚乙二醇化T1249多肽的方法，其包括使T1249多肽与下式的聚乙二醇醛反应：
其中R1、m、n、n和p如上所述，以产生公式(I)的化合物，其中聚乙二醇醛分子与T1249多肽的N末端氨基连接。如果本发明提到“制备…方法”是指“制备…过程”。
图1显示了PEG修饰的和未修饰的T1249多肽经酶促消化的比较。也显示了用内切蛋白酶Lys-C的消化和随后用反相HPLC的分离。
图2显示了收集的HPLC PEG-34级分(图1)的基质辅助激光解吸离子化飞行时间(MALDI TOF)质谱。光谱通过使用反-3-吲哚丙烯酸作为基质的线性方式获得。
图3显示了收集的HPLC PEG-34级分(图1)的N-端(Edman)测序。
图4显示了一次皮下剂量施用之后大鼠中mPEG20k-CMAB-T1249的浓度-时间分布图。
图5显示了一次皮下剂量施用之后大鼠中T1249的浓度-时间分布图。
图6显示了T1249和mPEG20k-CMAB-T1249施药对SCID小鼠中HIV-1病毒载量的影响。
如上所提到的，T1249是“融合抑制剂”多肽。T1249由39个氨基酸组成。T1249的多肽序列是：
WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF[SEQ.ID.NO：1]N-末端(或氨基端)的氨基酸是色氨酸(W)。C-末端(或羧基端)的氨基酸是苯丙氨酸(F)。
如美国专利号6,348,568表1中(Seq.ID No.1071)所述(在此全部引用作为参考)T1249多肽序列可在其氨基端和羧基端之一端或两端封闭/衍生。如美国专利号6,348,568中所述，色氨酸氨基端可由酰基封闭/衍生，苯丙氨酸羧基端可由氨基封闭/衍生(后者造成-COOH到-CONH2的变换)。
正如在此使用的，“T1249”应理解是指[SEQ.ID.NO：1]，其任选地在苯丙氨酸C末端用氨基封闭。也就是说，当谈及“T1249”时，苯丙氨酸C末端或者是-COOH或者是-CONH2。
本发明提供了下式的聚乙二醇化T1249化合物：
Figure A0381767900081
其中
R1为封端基团，
m为1-17，
n为10-1,000，
p为1-3，且
NHT1249是通过其末端α-氨基共价连接的T1249多肽。
正如在此使用的，R1“封端基团”可以是任一适当的化学基团，根据优选，其通常与其他化学成分反应或不反应。在上面的化合物中，聚乙二醇与T1249的α-氨基共价连接。选择R1封端基团是为了允许或阻止双官能性，例如，与第二目的化学成分的共价连接。
在封端基团通常不与其他化学成分反应的情况下，R1具有相当的惰性，因此不会与另一化学成分共价连接。通常适当的非反应性R1封端基团包括：氢、羟基、低级烷基、低级烷氧基、低级环烷基、低级链烯基、低级环链烯基、芳基和杂芳基。
正如在此使用的，术语“低级烷基”的意思是直链或支链烷基，其包含1-7个碳原子，优选的是1-4个，例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基、正庚基等等。“低级烷基”任选地用一个或多个这样的基团取代，所述基团独立地选自卤素、低级烷基、低级烷氧基、低级环烷基、低级链烯基、低级环链烯基、芳基和杂芳基。
术语“低级烷氧基”是指如以前定义的通过氧原子连接的低级烷基，低级烷氧基的例子有甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基等等。“低级烷氧基”任选地用一个或多个这样的基团取代，所述基团独立地选自卤素、低级烷基、低级烷氧基、低级环烷基、低级链烯基、低级环链烯基、芳基和杂芳基。
术语“低级环烷基”是指含有3-7个优选4-6个碳原子的环烷基，即环丙基、环丁基、环戊基、环己基或环庚基。“低级环烷基”任选地用一个或多个这样的基团取代，所述基团独立地选自卤素、低级烷基、低级烷氧基、低级环烷基、低级链烯基、低级环链烯基、芳基和杂芳基。
正如在此使用的，术语“低级链烯基”是指含有2-7个优选2-5个碳原子的直链或支链烯基，例如乙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基等等。“低级链烯基”任选地用一个或多个这样的基团取代，所述基团独立地选自卤素、低级烷基、低级烷氧基、低级环烷基、低级链烯基、低级环链烯基、芳基和杂芳基。
术语“低级环链烯基”是指是含有4-7个碳原子的环链烯基，例如环丁烯基、环戊烯基、环己烯基等等。“低级环链烯基”任选地用一个或多个这样的基团取代，所述基团独立地选自从卤素、低级烷基、低级烷氧基、低级环烷基、低级链烯基、低级链烯基、芳基和杂芳基。
术语“芳基”是指这样的苯基或萘基，其未发生取代或任选地由卤素、低级烷基、低级烷氧基、三氟甲基、羟基、羧酸、羧酸酯、硝基、氨基或苯基单取代或多取代，特别是由卤素、低级烷基、低级烷氧基、三氟甲基、羟基、硝基、氨基和苯基单取代或多取代。
术语“杂芳基”是指含有选自N、S和O的一个或多个杂原子的5或6元杂芳基，其还可能是苯并的和/或以如前所述“芳基”同样的方式发生取代。
通常优选的非反应性R1封端基团包括甲氧基、羟基或苄氧基。特别优选的R1封端基团是甲氧基。当R1为甲氧基时，聚乙二醇化的多肽化合物有时在此指“mPEG”化合物，其中m代表甲氧基。
如果R1封端基团通常与其他化学成分反应，那么R1就是能与一些官能团反应的官能团，如肽和/或蛋白质中的胺和/或巯基。在这种情况下，R1可为易于与其他分子上的亲电或亲核基团反应的官能团，与那些需要强催化剂或苛刻的反应条件才能反应的基团形成对比。如果R1是相对活跃的，聚乙二醇醛可以与另一化学成分共价连接。
通常适当的反应性R1封端基团的例子包括：卤素、环氧化物、马来酰亚胺、二硫化邻吡啶(orthopyridyl disulfide)、甲苯磺酸酯、异氰酸酯、水合肼、氰尿酰卤化物、N-琥珀酰亚胺基氧基、硫代-N-琥珀酰亚胺基氧基、1-苯并三唑基氧基、1-咪唑基氧基、对硝基苯基氧基和
Figure A0381767900101
术语卤素是指氟、氯、溴或碘。通常优选的反应性R1封端基团是
当此R1封端基团存在时，应当理解为在本发明的化合物中，式中第一个m、n和/或p可以与第二个m、n和/或p相同或不同。然而优选的是两个m具有相同的数值，两个n具有相同的数值，两个p具有相同的数值。
在本发明中，m为1-17。在优选的实施方案中，m为1-14。更优选的，m为1-7。甚至更优选的m为1-4。最优选的m为1。
在本发明中，n为10-1,000。在本发明优选的实施方案中n为20-1,000。优选的n为50-1,000，甚至更优选的n为75-1,000，最优选的n为100-750。
在本发明中p为1-3。优选的p为3。
在优选的实施方案中，p为3，R1为甲氧基，m为1，n为100-750；或者p为2，R1为甲氧基，m为1，n为100-750；或者p为1，R1为甲氧基，m为1，n为100-750。
本发明提供了式(I)的实施方案，其中R1为甲氧基，m为1，n为100-750，p为3，NHT1249为通过其末端α-氨基共价连接的T1249多肽。
如上所提到的，本发明聚乙二醇化的T1249多肽化合物共价连接T1249的α-氨基基团到具特定结构的聚乙二醇衍生物上。这些聚乙二醇化的化合物可以以任何需要的方式生产，但通常通过使T1249与单独制备的聚乙二醇衍生物反应来制备。例如，T1249多肽可通过封闭所有赖氨酸残基和使封闭的T1249与聚乙二醇衍生物反应来聚乙二醇化。然后对T1249封闭的赖氨酸残基去封闭，得到末端聚乙二醇化的T1249。
T1249多肽可以以任何合适的方式制备。例如，此化合物可以这样合成：使用常规的Merrifield固相合成技术，其涉及利用Boc-氨基酸的固相方法(Chem.Soc.，85，2149，1963)通过手工和自动化步骤合成，还有使用Fmoc-氨基酸的固相方法(Sheppard，R.C.等，J.Chem.Soc.Chem.Comm.，165-166页(1985))，用从Advanced Chemtech.，Louisville，Ky.购买的200型Advanced Chemtech，用从Millipore，Bedford Mass购买的Millipore 9050+或其他有用的仪器合成。
T1249可以通过将编码本发明化合物的cDNA导入有功能的病毒或环状质粒DNA载体来产生。载体或质粒可以用来转染或转化所选择的微生物。转化或转染的微生物在有益于表达载体所带DNA条件下培养，然后就能从生长培养基中分离需要的多肽(例如，见美国专利号5,955,422，在此全部引用作为参考)。
T1249也可以通过标准的重组DNA技术，使用本领域中众所周知的技术来制备。例如Sambrook等描述的方法，Molecular Cloning：A laboratoryManual，第二版，(Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)或者Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons，New York(1995)，它们在此引用作为参考。
产生T1249的特定方法于在此引用的美国专利号6,258,7872和美国专利号6,348,568中阐述，其均在此引用作为参考。
T1249在解离和去保护之后，可以通过任何适当的手段纯化。例如，离子交换、凝胶过滤层析和/或反相柱/HPLC系统可以用来从其片段中纯化全长T1249。在最初制备的T1249前体带有与N-端相连的封闭或保护基团(如酰基)和/或与C-端相连的封闭或保护基团(如氨基)的情况下，能用已知的技术去掉一个或两个这些基团。
T1249的氨基酸序列可以用标准的氨基酸分析法和手动和自动化的Edman降解法来确认和鉴别确定每一个氨基酸。也可以用HPLC分析法和质谱法来确证T1249的产生。
能与T1249  反应的聚乙二醇醛化合物也可以以任何需要的方式生产。然而优选的是聚乙二醇可以根据2002年7月24日申请的美国专利申请顺序号60/398,196中描述的方法生产，标题为“聚乙二醇醛”，在此全部引用作为参考。
通常，下式的聚乙二醇醛用于聚乙二醇化T1249
其中R1、m、n和p如上所述，用于聚乙二醇化T1249的聚乙二醇醛可以通过任何合适的手段制备。一个优选的聚乙二醇醛如下所述得到制备：mPEG10k-丁醛反应方案
Figure A0381767900124
Figure A0381767900125
Figure A0381767900126
不同大小的聚乙二醇醛(例如n值不同)可以按照以上的反应图解来制备。
本发明聚乙二醇化的T1249化合物可以通过任何适当的手段制备。本发明还提供了使T1249多肽聚乙二醇化的方法，其包括使T1249多肽NHT1249与下式的聚乙二醇醛反应：
其中R1、m、n、p如上所述，以产生下式的化合物：
R1-(CH2CH2O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-CO-NH-(CH2)p-CH2-NHT1249(I)
其中聚乙二醇醛分子与T1249多肽的N-端氨基连接。
聚乙二醇化的T1249通过加入摩尔比从1∶1到1∶100的T1249和聚乙二醇试剂来制备。如上所讨论的，T1249具有游离α-氨基(去掉所有酰基)以及游离羧基或氨基保护的羧基。反应混合物在5.5-7.4pH值范围的硼酸盐或磷酸盐缓冲液中于室温或4℃放置约0.5到24小时。聚乙二醇试剂与肽/蛋白质的摩尔比在1∶1到100∶1之间。肽/蛋白质的浓度为1-10毫克/毫升。缓冲液的浓度通常为10-500mM。
聚乙二醇化的T1249通过取出聚乙二醇化的T1249反应混合物，然后用平衡缓冲液(20mM Tris，pH值7.5)稀释来纯化。将得到的混合物过Q-琼脂糖柱。得到的混合物加入QA柱之后，用平衡缓冲液洗；75M NaCl洗脱；200mMNaCl洗脱；1M NaCl洗脱；用1M HOAC+1M NaCl和0.5NaOH再生。
通过使用反相HPLC，可能容易地从混合物的其他副产物中分离和离析N-端单聚乙二醇化的产物。例如，在聚乙二醇化的T1249的色谱层析中，会有多个峰形成，每一峰具有不同的存留时间。第一个峰可能代表未反应的多肽，在10.7分钟时出现，第二个峰可能代表单聚乙二醇化的多肽，在17.6分钟时出现，然后是双聚乙二醇化的多肽，在19分钟时出现。每一份收集的产物通过基质辅助激光解吸离子化飞行时间(MALDI TOF)质谱来验证。
在本发明聚乙二醇化的T1249多肽的优选实施方案中，p为3，R1为甲基，m为1，n为100-750；或者p为2，R1为甲氧基，m为1，n为100-750；或者p为1，R1为甲氧基，m为1，n为100-750。
本发明还提供了下式的聚乙二醇化的T1249多肽：
    CH3-C-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-NHT1249(III)
其中n为10-1,000，NHT1249为通过末端α-氨基基团共价连接的T1249多肽。在一个实施方案中n大约为225，例如227。在另一个实施方案中，n大约为450。
这种聚乙二醇化的T1249多肽可以用任何需要的方式生产，优选的是用实施例7所述方法生产。
本发明的药物组合物包含与可药用赋形剂混合的式(I)的化合物，其中R1、m、n、p和NHT1249如上所述。
包含聚乙二醇化T1249多肽或其盐的本发明药物组合物可以任何需要的方式产生，例如，通过常规的混合、包封、溶解、粒化、乳化、包埋或者冷冻干燥方法。这些药物制剂可以与治疗用惰性的、无机或有机的赋形剂和载体制剂。适于注射的赋形剂包括水、醇类、多羟基化合物、甘油、植物油、磷脂和表面活性剂。
药物制剂也可包含防腐剂、促溶剂、稳定剂、着湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、调味剂、用以改变渗透压的盐类、缓冲剂、包衣剂或者抗氧化剂。它们还可包含其他治疗上有用的物质，包括额外的活性成分。
适宜注射施用的制剂(包括腹膜内、肌肉内、皮下、静脉内、皮内注射或连续输注)可以方便地以单位剂量形式提供并可以通过常规的药物学技术制备。此类技术包括建立聚乙二醇化的T1249多肽和药物载体或赋形剂联系的步骤。一般来说，制剂通过全面而密切地建立聚乙二醇化的T1249多肽和液体载体的联系来制备。适宜的注射施用的制剂包括含水溶和非含水无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂，和使制剂与目的接受者的血液等渗的溶质；可能含有悬浮剂和增稠剂的含水和非含水无菌悬浮液。制剂可以以单位剂量或多剂量容器形式提供，例如，密封安瓿和小瓶，制剂可以在冷干(冷冻干燥)的条件下储存，只需在使用前立即加入无菌液体载体例如注射用水。
优选的单位剂量制剂是那些包含如上所述施用成分的每日剂量，每日亚剂量，每周剂量，每周亚剂量或者其施用成分的适当级分。
聚乙二醇化的T1249多肽优选地是单位剂量形式。正如在此使用的，“单位剂量形式”意思是适于一次剂量的聚乙二醇化的T1249多肽的量为预先称量和/或预先包装形式。这允许施方便地制备用于施用地聚乙二醇化的T1249多肽，甚至允许患者的自我施用。剂量单位的数量显然取决于待递送的聚乙二醇化T1249多肽的量和用药频率。
聚乙二醇化T1249多肽也可以按单位剂量的量以冷冻干燥粉末形式提供，其适于在施用之前与可药用赋形剂重建。
本发明的特定药物组合物包含与可药用赋形剂混合的式(I)的化合物，其中R1为甲氧基，m为1，n为100-750，p为3。
本发明的另一种药物组合物是包含与可药用赋形剂混合的式(III)的化合物的药物组合物，其中n为10-1,000，且NHT1249是通过末端α-氨基共价连接的T1249多肽。在一个实施方案中n约为225，例如227。在另一个实施方案中n大约为450。
本发明还提供了抑制HIV感染的方法，其包括给患者施用包含与可药用赋形剂混合的式(I)化合物的药物组合物，其中R1、m、n、p和NHT1249如上所述。
聚乙二醇化T1249多肽一般以(非聚乙二醇化)T1249多肽当前施用方式施用。然而可作一些改进以利用聚乙二醇化T1249多肽提高的药物动力学特性。
在本发明抑制HIV的方法中，药物组合物可以以任何适当的方式和途径施用。在优选的方法中，聚乙二醇化的T1249多肽以可注射的溶液或悬浮液形式施用。优选地，可注射的溶液或悬浮液通过皮下注射或静脉内注射施用。
在另一种优选的方法中，聚乙二醇化的T1249多肽通过透皮递送设备例如透皮贴片施用。
在本发明抑制HIV的方法中，药物组合物可以以任何适当的剂量和方案施用。本发明的药物组合物可以以任何需要的形式，通过任何需要的途径施用。然而本发明的聚乙二醇化T1249多肽一般肠胃外施用，例如，以注射液的形式施用。
治疗有效量的确定属于本领域的技术范畴，并且根据本发明的聚乙二醇化T1249多肽的治疗有效量或剂量可根据每一特别情况下个别需要改变和调整。一般而言，在给体重大约70Kg的成人注射施用的情况下，每天大约50毫克到大约300毫克的剂量应该是合适的，优选的是大约50毫克到大约200毫克，但在说明时上限可能过量。此剂量可以作为一次剂量、分开的剂量或连续的输注施用。
药用组合物可以以任何便利的剂量方案施用。药用组合物优选地每天一次，每天两次，隔天一次，每周一次或每周两次施用。药物组合物更优选地每周一次施用。
药物组合物优选地每周一次以约300毫克到约1,500毫克的剂量施用。药物组合物更优选地每周一次以约400毫克到约1,000毫克的剂量施用。药物组合物甚至更优选地每周一次以约100毫克到约200毫克的剂量施用。
本发明还提供抑制HIV感染的方法，其包括施用包含与可药用赋形剂混合的式(I)化合物的药物组合物，其中R1为甲氧基，m为1，n为100-750，p为3。
在本发明范畴之内还预期了抑制HIV感染的方法，其包括施用包含与可药用赋形剂混合的式(III)化合物的药物组合物，其中n为10-1,000，NHT1249为通过末端α-氨基共价连接的T1249多肽。在一个实施方案中n大约为225，例如227。在另一个实施方案中，n大约为450。
提供以下实施例是为了进一步阐述本发明的化合物、组合物和方法。这些实施例子只作为例证，并非意在以任何方式限制本发明的范围。
                          实施例1
                   PEG10K-丁醛的制备
240毫升甲苯中的分子量为10,000的mPEG(30.0克，3毫摩尔)通过回流2小时共沸干燥，然后除去120毫升甲苯。得到的溶液冷却到室温，然后向PEG溶液中加入叔丁醇钾(0.68克，6毫摩尔)在20毫升无水叔丁醇和20毫升甲苯中的溶液。得到的混合物于氩环境下在室温搅拌两小时。反应中通过注射器加入溴乙酸叔丁基酯(1.00毫升，6.75毫摩尔)然后反应于氩环境下在室温搅拌过夜。然后旋转蒸发浓缩反应溶液。加入二乙醚沉淀残留物。沉淀下来的mPEG10k叔丁基羧甲基酯产物过滤分离和真空干燥。产量：28克。NMR(d6-DMSO)：1.40ppm(t，9H，-CH3)；3.21ppm(s，-OCH3)；3.50ppm(s，-O-CH2CH2-O-)；3.96ppm(s，2H，-O-CH2-COO-)。
然后将mPEG10k叔丁基羧甲基酯(26.5克)溶于350毫升1N氢氧化钠中，然后此溶液室温搅拌过夜。加入6N盐酸调节混合物的pH值到2.5，然后用二氯甲烷提取混合物。有机层用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，然后沉淀到二乙醚中。通过过滤和真空干燥收集m-PEG10k-羧甲基酸产物。产量：24克。NMR(d6-DMSO)：3.21ppm(s，-OCH3)；3.5ppm(s，-O-CH2CH2-O-)；3.99ppm(s，2H，-O-CH2-COOH)。
然后将m-PEG10k-羧甲基酸(6克，0.6毫摩尔)溶于无水二氯甲烷(30毫升)中，然后加入4-氨基丁醛二乙基缩醛(140毫升，0.9毫摩尔)，1-羟基苯并三唑(80毫克，0.6毫摩尔)和二环己基碳二亚胺(160毫克，0.78毫摩尔)。在氩环境下室温搅拌混合物过夜。过滤、浓缩反应混合物，并用2-丙醇和二乙醚(1∶1)混合物沉淀。将mPEG10k-丁缩醛产物真空干燥过夜。产量：5.4克。NMR(d6-DMSO)：1.07-1.12ppm(t，6H，(-O-CH2-CH3)2)；1.46ppm(m，4H，-NHCH2CH2CH2-CH-)；3.08-3.11ppm(q，2H，-NHCH2CH2CH2-CH-)；3.21ppm(s，-OCH3)；3.5ppm(s，-O-CH2CH2-O-)；3.85ppm(s，2H，-O-CH2-CO-NH-)；4.44ppm(t，1H，-NHCH2CH2CH2-CH-)；7.67ppm(-NH-)。
然后将mPEG10k-丁缩醛(2克，0.2毫摩尔)溶于20毫升80％CF3COOH中，将溶液室温搅拌过夜。加入1NNaOH溶液调整混合物的pH值到6.0，加入氯化钠(10wt％)然后加入1NNaOH调整溶液的pH值到7.0。用二氯甲烷提取混合物。有机层用硫酸钠干燥、过滤、浓缩并沉淀到二乙醚中。通过过滤和真空干燥收集mPEG10k-丁醛产物。产量：1.7克。NMR(d6-DMSO)：3.21ppm(s，-OCH3)；3.5ppm(s，-O-CH2CH2-O-)；3.85ppm(s，2H，-O-CH2-CO-NH-)；7.67ppm(-NH-)；9.66ppm(-CHO-)。
                       实施例2
                 用PEG10k-丁醛聚乙二醇化T20
1.0毫升含20毫克T1249(纯度93.7％)的缓冲液(50毫摩尔磷酸钾，pH 6.5)中，按每一摩尔T1249使用5摩尔试剂的摩尔比加入PEG(10kDa)的丁醛(mPEG10k-CMAB)(见实施例1)。T1249多肽在α-氨基端去酰基，但在羧基端受-NH2保护。向反应混合物中加入10％(V/V)0.5M氰基氢硼化钠水溶液并在室温下搅拌4小时。用离子交换层析(QA)从反应混合物中纯化聚乙二醇化的T1249。增加的盐浓度即20mMTris(pH7.5)中65mM到1M NaCl的线性梯度用来分离聚乙二醇化的T1249和未受修饰的T1249。
                           实施例3
                     mPEG20K-丁醛的制备
800毫升甲苯中分子量20,000的mPEG(60.0克，3毫摩尔)通过回流2小时共沸干燥，然后除去200毫升甲苯。得到的溶液冷却到室温，然后向PEG溶液中加入叔丁醇钾(0.68克，6毫摩尔)在20毫升无水叔丁醇和20毫升甲苯中的溶液。得到的混合物于氩环境下在室温搅拌两小时。反应中通过注射器加入溴乙酸叔丁基酯(1.00毫升，6.75毫摩尔)然后反应于氩环境下在室温搅拌过夜。然后旋转蒸发浓缩反应溶液。加入二乙醚沉淀残留物。沉淀下来的mPEG10k叔丁基羧甲基酯产物过滤分离和真空干燥。产量：56克。NMR(d6-DMSO)：1.42ppm(t，9H，-CH3)；3.21ppm(s，-OCH3)；3.50ppm(s，-O-CH2CH2-O-)；3.98ppm(s，2H，-O-CH2-COO-).
然后将mPEG20k羧甲基叔丁酯(28克)溶于750毫升1N氢氧化钠中，然后此溶液室温搅拌过夜。加入6N盐酸调整混合物的pH值到2.5，然后用二氯甲烷提取混合物。有机层用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，然后沉淀到二乙醚中。通过过滤和真空干燥收集m-PEG20k-羧甲基酸产物。产量：25克。NMR(d6-DMSO)：3.21ppm(s，-OCH3)；3.5ppm(s，-O-CH2CH2-O-)；3.99ppm(s，2H，-O-CH2-COOH)。
然后将m-PEG20K-羧甲基酸(20克，1.0毫摩尔)溶于无水二氯甲烷(100毫升)中，然后加入4-氨基丁醛二乙基缩醛(0.77毫升，4毫摩尔)，1-羟基苯并三唑(270毫克，2.0毫摩尔)和二环己基碳二亚胺(620毫克，3.0毫摩尔)。在氩环境下室温搅拌混合物过夜。过滤、浓缩反应混合物，并用2-丙醇和二乙醚(1∶1)混合物沉淀。将mPEG20k-丁缩醛产物真空干燥过夜。产量：18.6克。NMR(d6-DMSO)：1.07-1.12ppm(t，6H，(-O-CH2-CH3)2)；1.46ppm(m，4H，-NHCH2CH2CH2-CH-)；3.08-3.11ppm(q，2H，-NHCH2CH2CH2-CH-)；3.21ppm(s，-OCH3)；3.5ppm(s，-O-CH2CH2-O-)；3.85ppm(s，2H，-O-CH2-CO-NH-)；4.44ppm(t，1H，-NHCH2CH2CH2-CH-)；7.67ppm(-NH-)。
然后将mPEG20k-丁缩醛(14.7克，0.73毫摩尔)溶于200毫升10％CF3COOH中，将溶液室温搅拌过夜。加入1N NaOH溶液调整混合物的pH值到6.0，加入氯化钠(10wt％)然后加入1N NaOH调整溶液的pH值到7.0。用二氯甲烷提取混合物。有机层用硫酸钠干燥、过滤、浓缩并沉淀到二乙醚中。通过过滤和真空干燥收集mPEG20k-丁醛产物。产量：13.1克。NMR(d6-DMSO)：3.21ppm(s，-OCH3)；3.5ppm(s，-O-CH2CH2-O-)；3.85ppm(s，2H，-O-CH2-CO-NH-)；7.67ppm(-NH-)；9.66ppm(-CHO-)。
                      实施例4
              用PEG20k-丁醛聚乙二醇化T1249
20毫克T1249(纯度93.7％)中，其溶解于0.4毫升50mM硼酸盐pH9.5缓冲液中，加入根据实施例3制备的PEG(20kDa)的丁醛，然后按每摩尔T1249 10摩尔试剂的摩尔比用100mM pH6.5磷酸钾稀释10倍。T1249多肽在α-氨基端去酰基，但在羧基端受-NH2保护。向反应混合物中加入0.4mL10％(V/V)0.5M氰基氢硼化钠(NaBH3CN)水溶液并在室温下搅拌4小时。用平衡缓冲液(20mM Tris，pH7.5)10倍稀释反应混合物并通过0.45um滤器过滤。用离子交换层析(Q-琼脂糖凝胶)从反应混合物中纯化聚乙二醇化的T1249。增加的盐浓度即平衡缓冲液中75mM、200mM到1MNaCl的线性梯度分别用来分离双-聚乙二醇化的T1249、单-聚乙二醇化的T1249和未受修饰的T1249。以上的实验以开始用70毫克T1249，1∶10摩尔过量的PEG20k-丁醛重复，并如前所述纯化。混合从两个实验中收集的单-聚乙二醇化的T1249(200mM NaCl洗脱)，浓缩到大约2毫克/毫升并渗滤到储存缓冲液(PBS缓冲液，pH7.3)中于-20℃保存直到进一步使用。材料的等分试样用作抗病毒活性分析。
                   实施例5
带有PEG20k-丁醛的％单-、％双-、％三-聚乙二醇化的T1249多肽
带有PEG20k-丁醛的％单-、％双-、％三-聚乙二醇化的T1249多肽通过一系列实验确定，其中T1249和聚乙二醇的摩尔比，反应溶液的pH值和反应时间如下表1、表2和表3中变化。这些实验的目的是为了优化聚乙二醇化的参数。
例如，在表1中，向含5毫克T1249(纯度93.7％)的50mM磷酸钾pH6.5缓冲液中加入根据实施例3制备的PEG 20kDa(mPEG20k-CMAB)的丁醛。T1249多肽在α-氨基端去酰基化，但在羧基端受-NH2保护。PEG试剂与T1249的摩尔比为1∶1，1∶2到1∶5。反应混合物中加入10％(v/v)0.5M氰基氢硼化钠水溶液。室温下在2、4、6和24小时的预定时间间隔取出等分试样。
                                      表1
                              pH6.5的磷酸钾缓冲液
T1249∶PEG摩尔比   时间点   ％单-聚乙二醇化   ％双-聚乙二醇化   ％三-聚乙二醇化 ％T1249
1∶1   2小时   14   0.1   0   84
1∶1   4小时   18   0.19   0   81
1∶1   6小时   21   0.21   0   78
1∶1   24小时   25   0.91   0   72
1∶2   2小时   29   0.69   0   68
1∶2   4小时   34   1.14   0   63
1∶2   6小时   37   1.55   0   59
1∶2   24小时   39   3.16   0   54
1∶5   2小时   53   5   0   39
1∶5   4小时   59   9   0   26
1∶5   6小时   61   12   0   20
1∶5   24小时   55   23   0   15
表2中，含5毫克T1249(纯度93.7％)的50mM磷酸钾pH6.0缓冲液中，按每摩尔T1249 10摩尔PEG试剂的摩尔比加入根据实施例3制备的PEG 20kDa(mPEG20k-CMAB)的丁醛。T1249多肽在α-氨基端去酰基化，但在羧基端受-NH2保护。PEG试剂与T1249的摩尔比为1∶1，1∶2到1∶5。反应混合物中加入10％(v/v)0.5M氰基氢硼化钠水溶液。室温下在2、4、6和24小时的预定时间间隔取出等分试样。
                            表2
                     pH6.0的磷酸钾缓冲液
T1249∶PEG摩尔比   时间点   ％单-聚乙二醇化   ％双-聚乙二醇化   ％三-聚乙二醇化 ％T1249
1∶10   2小时   60   11   0   22
1∶10   4小时   61   23   0   10
1∶10   6小时   59   24   5   7
1∶10   24小时   38   38   18   4
表3中，含5毫克T1249(纯度93.7％)的50mM磷酸钾pH5.5缓冲液中，按每摩尔T1249 10摩尔PEG试剂的摩尔比加入根据实施例3制备的PEG 20kDa(mPEG20k-CMAB)的丁醛。T1249多肽在α-氨基端去酰基化，但在羧基端受-NH2保护。PEG试剂与T1249的摩尔比为1∶1，1∶2到1∶5。反应混合物中加入10％(v/v)0.5M氰基氢硼化钠水溶液。室温下在2、4、6和24小时的预定时间间隔取出等分试样。
                          表3
                    pH5.5的磷酸钾缓冲液
T1249∶PEG摩尔比   时间点   ％单-聚乙二醇化   ％双-聚乙二醇化   ％三-聚乙二醇化 ％T1249
1∶10   2小时   47   7   0   41
1∶10   4小时   58   16   0   20
1∶10   6小时   60   22   3   10
1∶10   24小时   32   38   25   3
通过反相HPLC获得每一反应混合物的单-，双-和三-聚乙二醇化的T1249和未反应的游离T1249的百分比。以上表1、2和3中作为例子的数据描述了在T1249∶PEG摩尔比，pH值和反应时间的多种条件下何时能得到单-聚乙二醇化的T1249的最佳数量。例如表1中61％的最佳单-聚乙二醇化在1∶5的T1249∶PEG摩尔比和6小时的时间点出现。例如表2中61％的最佳单-聚乙二醇化在1∶10的T1249∶PEG摩尔比和4小时的时间点出现。例如表3中60％的最佳单-聚乙二醇化在1∶10的T1249∶PEG摩尔比和6小时的时间点出现。
                        实施例6
                  聚乙二醇化位点的确定
进行一系列实验以评定聚乙二醇与T1249连接的位点。结果表明95％以上的修饰位于N-端色氨酸残基。其他修饰位点较少出现(＜5％)，但它们精确的特征尚未清楚确定。
为确定聚乙二醇修饰位点，样品用内切蛋白酶Lys-C消化然后通过反相HPLC分离多肽。用纳喷射ESI(电喷射离子化)质谱、MALDI TOF(基质辅助激光解吸离子化飞行时间)质谱和N-端(Edman)测序来进一步分析单个的多肽峰。下面概述了这些过程。
根据实施例4制备的20k单-聚乙二醇化-丁醛-T1249(20kmPEG-CMAB-T1249)和T1249(游离α-氨基端；羧基端受-NH2保护)样品室温下按10/1的样品与酶的比例用蛋白内切酶Lys-C蛋白水解消化2小时。加入终浓度2％(v/v)的乙酸终止反应。
通过使用装有Phenomenex Luna反相柱(C-18，3pt，150×200毫米)的HP1100 HPLC系统的反相HPLC来分离蛋白水解肽。溶剂系统由水、乙腈和三氟乙酸(0.05％)组成。梯度为50分钟内以0.2毫升/分钟流速从5％到64％的有机溶剂。收集含肽的峰用于进一步分析。
用Finnigan LCQ离子分离器上纳喷射ESI质谱分析所有收集的样品。基于实验分子量确定单个的肽。含聚乙二醇肽的级分也用Bruker反射器上进行MALDI TOF质谱分析。所用的基质为反式-3-吲哚乙酸或α-4-羟基肉桂酸。
含聚乙二醇的肽级分用Perkin Elmer(ABI)精密仪器进行自动N-端(Edman)测序。
聚乙二醇化的T1249蛋白水解片段反相HPLC分析的结果在图1中显示。图1显示了从两个样品反相HPLC分析获得的紫外追踪。在T1249对照(图1B中HT-20峰)中观察到的N-端肽在聚乙二醇修饰的T1249中几乎全部消失(图1A)。取而代之出现一新峰(图1A中PEG-34峰)。其含有聚乙二醇修饰的肽。
单个HPLC级分质谱分析结果总结于表4中。所有非修饰肽实验分子量与经计算的非修饰肽分子量一致。
                    表4：从收集的HPLC级分获得的分析结果(也见图1)。
  HPLC峰1     分子量(计算)2Da     分子量(实验)3Da N-端序列4 肽特征5  Seq ID
  PEG-17     922.4     922.4  n.A. NEYELQK  Seq ID：2
  PEG-22     1611.9     1611.7  n.A. ITALLEQAQIQQEK  Seq ID：3
  PEG-34     n.A.     23082.6  XQEWEQK PEG-WQEWEQK  Seq ID：4
  PEG-37     1122.5     1122.4  n.A. WASLWEWF-NH2  Seq ID：5
  HT-17     922.4     922.4  n.A. NEYELQK  Seq ID：2
  HT-20     1032.5     1032.4  n.A. WQEWEQK  Seq ID：4
  HT-22     1611.9     1611.7  n.A. ITALLEQAQIQQEK  Seq ID：3
  HT-37     1122.5     1122.4  n.A. WASLWEWF-NH2  Seq ID：5
1也见于图1；
2计算的以Da为单位的准确质量；
3测量的以Da为单位的准确质量，未修饰肽的纳喷射ESI MS和聚乙二醇修饰肽的MALDI TOF MS；
4自动Edman测序，n.A.＝未得到，x＝未确定；
5基于分子量一致性和/或Edman测序。未修饰的T1249样品的氨基酸序列为：
       WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2.
图2A展示了从完整聚乙二醇修饰的T1249获得的MALDI TOF质谱结果。测量的分子量为26758 Da。注意存在一些未修饰的肽。其来源目前尚不了解，然而其可能潜在的由质谱本身的测量所引起。图2B显示了从聚乙二醇-34(图1)获得的MALDI TOF质谱结果。测量的分子量为23083Da。分子量和质谱表象确定此HPLC级分聚乙二醇-34为含有聚乙二醇修饰的肽的级分。纳喷射ESI质谱表明此HPLC级分中存在聚乙二醇(数据未展示)。
图3显示了自动N-端测序(Edman)的结果。观察到的主要序列为N-端内Lys-C肽xQEWEQK。除了第一个氨基酸残基，其他所有的氨基酸都能大量获得。一般不能从第一个氨基酸位置上获得色氨酸(图3，循环3)。HPLC紫外追踪，MALDI TOF质谱和N-端测序结果都确定N-端色氨酸为主要的聚乙二醇修饰位点。
以上的结果与聚乙二醇醛和T1249 N-端色氨酸之间连接的存在一致。虽然不能完全排除直接与色氨酸侧链的连接，N-端测序的结果似乎与N-端氨基酸存在“封闭”聚乙二醇成分相矛盾。
                             实施例7
                   用mPEG10k-丙醛聚乙二醇化T1249
使用具有如下结构的PEG(10kDa)化丙醛
            CH3-O-(CH2-CH2-O)227-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CHO
1.0毫升含20毫克T1249(纯度93.7％)的缓冲液(50毫摩尔磷酸钾，pH 6.5)中，按每一摩尔T1249使用5摩尔试剂的摩尔比加入200毫克mPEG10k-丙醛。T1249多肽在α-氨基端去酰基，但在羧基端受-NH2保护。
反应混合物中加入10％(V/V)的0.5M氰基氢硼化钠水溶液并在室温下搅拌4小时。用离子交换层析(QA)从反应混合物中纯化聚乙二醇化的T1249。聚乙二醇化的T1249多肽结构如下：
        CH3-O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-NH-T1249(III)
20mMTris(pH7.5)中65mM到1M不断上升的NaCl线性浓度梯度用来分离聚乙二醇化的T1249和未受修饰的T1249。然后通过反相HPLC获得单-聚乙二醇化的T1249和未反应的游离T1249的百分比并确定为31.7％。
                        实施例8
                 cMAGI/MAGI抗病毒分析
这些分析使用指示细胞系MAGI(半乳糖苷酶指示剂的多核活化)或者CCR5-表达衍生细胞系cMAGI评价感染性病毒滴度的降低。MAGI细胞系通过用双嗜性逆转录病毒载体引入CD4基因和HIV-1 LTR-控制的b-半乳糖苷酶报告基因，从亲代HeLa细胞衍生而来(Kimpton J，EmermanM，J Virol 66：2232-9，1992)。cMAGI细胞系通过用双嗜性逆转录病毒载体PA317引入CCR5基因，从MAGI细胞系衍生而来(Chackerian B，LongEM，Luciw PA，Overbaugh J，J Virol 71：3932-9，1997)。cMAGI细胞支持原代NSI(R5)分离株和实验室适应株X4病毒的复制，而MAGI细胞只支持X4病毒的复制。两个细胞系都借助HIV-1tat的能力反式激活受HIV-LTR控制的b-半乳糖苷酶报告基因的表达。b-半乳糖苷酶报告基因已被修饰以定位于细胞核，在感染的几天之内，可以强烈的细胞核着色形式用X-gal底物检测到。这样，如果着色前只有一个感染周期，着色细胞核的数量可以认为等于攻击接种中感染性病毒粒子的数量。
感染后24小时加入感染和细胞-细胞融合的抑制剂如T1249(Wild C，Greenwell T，Matthews T，AIDS Res Hum Retroviruses 9：1051-3，1993)，这样是为了允许确定代表了一个感染周期。受感染的细胞使用CCD-成像仪计数，原代分离株和实验室适应的分离株都显示病毒数量和通过成像仪观察到的受感染细胞数量之间的有线性关系。在MAGI和cMAGI分析中，感染滴度降低50％(Vn/Vo＝0.5)有意义并且提供了评价抗病毒活性的主要截断值。感染滴度降低90％(Vn/Vo)用作评价抗病毒活性的附加截断值。
每一种检测化合物的稀释物一式两份地通过对病毒接种物的抗性来检测，在48孔微量滴定板上将病毒接种物调整为大约1500-2000个受感染细胞/孔。将检测化合物加入cMAGI或MAGI细胞，然后加入病毒接种物，24小时后加入感染和细胞-细胞融合的抑制剂(Wild C，Greenwell T，Matthews T，AIDS Res Hum Retroviruses 9：1051-3，1993)以阻止第二轮感染和细胞间病毒扩散。细胞再培养2天，固定，用X-半乳糖苷酶底物染色以检测受感染细胞。每一个对照和检测化合物稀释物的受感染细胞的数量用CCD-成像仪确定。IC50定义为造成感染性病毒滴度降低50％的检测化合物的稀释物。IC90定义为造成感染性病毒滴度降低90％的稀释物。
                        实施例9
              聚乙二醇化的T1249的IC50/IC90
下面表5显示了T1249和用mPEG20K-丁醛聚乙二醇化的T1249(实施例4，此后称为“mPEG20k-CMAB-T1249”)的IC50和IC90结果。IC50和IC90结果根据实施例8确定。
                   表5.IC50和IC90结果
 肽   IC50(μg/ml)   IC90(μg/ml)
 T1249   0.003   0.023
 mPEG20k-CMAB-T1249   0.041(批号1)   0.206(批号1)
  0.170(批号2)   0.835(批号2)
观察到mPEG20k-CMAB-T1249的体外抗病毒活性与亲代T1249分子相比有所降低(第一批中IC50，13.7倍，IC90，9倍)。然而这种体外活性的丧失并不预示如实施例12中所述的结果展示的体内生物学活性(见图6)。
                       实施例10
        用mPEG20k-丙醛聚乙二醇化的T1249的药物动力学
研究方案
9只雄性Wistar大鼠(Charles River实验室，Wilmington，DE)(n＝3/时间点)接受单次皮下剂量的mPEG20k-丙醛聚乙二醇化的T1249(实施例4)。
mPEG20k-CMAB-T1249悬浮于水中并用NaOH滴定到pH值6.8。然后将mPEG20k-CMAB-T1249悬浮物溶解于最小体积的碳酸钠缓冲液中并用PBS缓冲液稀释到pH值7.3-7.4。所使用的PEG-T1249的量足够提供最终制剂中每毫升150毫克的mPEG20k-CMAB-T1249浓度。大鼠按8毫克活性成分/千克体重施用。
药物施用之后，在每一个时间点从眶后窦收集约1mL血液。时间点为药物施用之后的0.5、1、3、6、8、16、24、32、48、72和96小时。所有血液样品室温放置不超过30分钟，低温离心分离血清。
生物分析方法
在反相HPLC C18柱上用含有0.05M醋酸铵和乙腈的线性梯度分离所有的血液样品。280nm下监测吸光度。使用掺有mPEG20k-CMAB-T1249的血清提取物作为校正标准的图中(曲线下的面积v.[mPEG20k-CMAB-T1249])外推出浓度。
所报道的药物动力学参数来源于通过商业动力学分析软件包WinNonlin 3.3版(Pharsight Corporation，Mountain View，CA)使用非区室分析mPEG20k-CMAB-T1249、其代谢产物和二者组合的合并血清浓度分布图。
结果
图4显示了施用一次皮下剂量之后大鼠中mPEG20k-CMAB-T1249的浓度时间曲线。在0.5小时时间点未检测到mPEG20k-CMAB-T1249或代谢产物水平，表明了从注射部位缓慢的吸收过程。对代谢产物来说，最初的可检测浓度在服药后6小时出现，这代表了缓慢的代谢产物形成过程。mPEG20k-CMAB-T1249和其代谢产物最低血清浓度分别在服药后48小时和72小时检测到。
下面表6报告了系统的Cl/F和Vd/F、AUC(0-48小时或0-72小时)、Cmax、Tmax和半衰期。
          表6，大鼠中mPEG20k-CMAB-T1249的药物动力学参数。
参数(单位) mPEG20k-CMAB-T1249  mPEG20k-CMAB-T1249代谢物   母体和代谢物
AUC(μg小时/ml) 279a   508b   766b
Cmax(μg/ml) 14.8   13.9   27.2
T1/2终末(小时) 8.9   15.7   13.8
CI/F(ml/小时/kg) 27.4   14.6   10.0
Vd/f(ml/kg) 353   330   199
Tmax(小时) 16   24   16
aAUC0-48小时  bAUC0-72小时
                              实施例11
                           T1249的药物动力学
研究方案
每一个治疗组由每种性别9只的Sprague-Dawley大鼠组成(CharlesRiver实验室，Wilmington，DE)。组中每一个成员接受单次皮下或静脉剂量的T1249(实施例9/表5引用的批号2)。大鼠按1.2或15毫克活性成分/每千克体重施用。
在12小时的时间内，每个时间点从每组实验动物中每一性别三只大鼠收集血液样品。时间点为施药后的0.5、1、2、4、6、8、10和12小时。
生物分析方法
血液样品用T1249 PcAb ECLIA分析法分析。T1249 PcAb ECLIA是一种非竞争性的二位免疫测定方法，其使用两种不同的对T1249特异的兔PcAb制剂。在这种分析法中，通过首先在也含有生物素-标记的抗体(A制剂)和钌-标记的抗体(B制剂)的试管中孵育被稀释的检测样品进行T1249测定。在下一步骤中，在试管中加入链亲和素包被的磁珠以俘获已形成的抗体-肽-抗体免疫复合体(夹心复合体)。将混合物泵入分析仪中的流式细胞仪，之后给与流式细胞仪相连的磁体施加电流。通过分析缓冲液中与检测抗体相连的钌金属离子和过量存在的三丙胺离子间的循环氧化-还原反应产生的光。光能是测量的终点。含有适量T1249的样品与含有少量和不含T1249的样品相比呈现出更高的信号。
结果
图5显示了施用单次皮下或静脉内剂量之后大鼠中T1249的浓度-时间分布图。
下面表7报告了Tmax、半衰期、AUC(0-12小时或0-∞小时)和Cmax。
                        表7，大鼠中T1249的药物动力学参数。
参数(单位) 剂量组1.2mg/kg(SC) 15mg/kg(SC) 1.5mg/kg(V) 5.0mg/kg(IV)
T1/2终末(小时) 2.02 2.00 2.46 1.86
Tmax(小时) 1.09 1.88 - -
Cmax(μg/m1) 6.37 21.5 15.7 46.3
AUC(0-12小时)(μg小时/ml) 27.0 107 45.6 118
AUC(0-∞)(μg小时/ml) 27.6 110 47.1 120
考虑到mPEG20k-CMAB-T1249(表6)的药物动力学数据和T1249(表7)15毫克/千克的皮下剂量，表明了mPEG20k-CMAB-T1249的终末半衰期提高了4.5倍。较高的Tmax反应了与T1249相比mPEG20k-CMAB-T1249的较低的清除率，虽然具有相似的Cmax。此外，一旦表7中的数据用剂量差异(如实施例10中15毫克/千克归一化到8毫克/千克)归一化，可观察到mPEG20k-CMAB-T1249的AUC比T1249的提高5倍(T1249 57.1μghr/ml(归一化的)对mPEG20k-CMAB-T1249 279μghr/ml)。
                       实施例12
T1249和mPEG20k-CMAB-T1249对小鼠中HIV-1病毒载量的影响
每治疗组使用9只HuPBMC-SCID小鼠(除PEG对照组为6只小鼠外)。在第0天，每个治疗组在HIV分离株感染之后接受午后治疗。之后从第1天到第6天，每个治疗组一天接受两次治疗(上午和午后)。第7天收集小鼠。服药细节见表8。最后剂量施用之后的14小时收集血浆样品用于T1249分析。
                        表8，服药方案
剂量组 剂量 小鼠/组 天 活动
盐水对照T1249mPEG20k-CMAB-T1249PEG对照总共 0mg/天0.7mg/天2mg天7mg/天0.7mg/天2mg/天7mg/天7mg/天 99999996 1-61-61-61-67 上午剂量下午剂量上午剂量下午剂量上午剂量下午剂量上午剂量下午剂量收获
通过实时定量PCR确定血浆中的HIV-1。收集血浆用于T1249化合物的定量。然后冷冻的血浆样品进行化合物分析。
图6显示了施用T1249和mPEG20k-CMAB-T1249对SCID小鼠中HIV-1病毒量的影响。
T1249和mPEG20k-CMAB-T1249在体内具有相同的活性。结果表明在测定检测化合物血浆浓度时没有可辨认的体内病毒抑制活性差别。
以上结果表明了本发明有利的特性，mPEG20k-CMAB-T1249和T1249在等量血浆浓度下相同的体内生物学活性(实施例12)，通过实施例10和11中的比较显示mPEG20k-CMAB-T1249更好的药物动力学特性。
本发明如此描述，显然，其同样可以以多种方式变化。并不认为这样的变化是偏离本发明的精神和范围，并且所有此类修改意在包括在以下权利要求书的范围内。
                              序列表
<110>弗·哈夫曼-拉罗切有限公司
<120>聚乙二醇化的T1249多肽
<130>21327US1
<150>US 60/439,213
<151>2003-01-10
<150>US 60/398,190
<151>2002-07-24
<160>5
<170>PatentIn版本3.1
<210>1
<211>39
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽序列为合成来源的.
<220>
<221>MOD_RES
<222>(39)..(39)
<223>39位残基任选地用氨基修饰
<400>1
Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln
1               5                   10                  15
Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asp Lys Trp
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe
        35
<210>2
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽序列为合成来源的.
<400>2
Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys
1               5
<210>3
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽序列为合成来源的.
<400>3
Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys
1               5                   10
<210>4
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽序列为合成来源的.
<400>4
Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys
1             5
<210>5
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽序列为合成来源的.
<220>
<221>MOD_RES
<222>(8)..(8)
<223>8位残基用氨基修饰
<400>5
Trp Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe
1               5

Claims (16)

1.式(I)的化合物：
Figure A038176790002C1
其中
R1为封端基团，
m为1-17，
n为10-1,000，
p为1-3，且
NHT1249为通过其末端α-氨基共价连接的T1249多肽。
2.根据权利要求1的化合物，其中R1选自卤素、环氧化物、马来酰亚胺、二硫化邻吡啶、甲苯磺酸酯、异氰酸酯、水合肼、氰尿酰卤化物、N-琥珀酰亚胺基氧基、硫代-N-琥珀酰亚胺基氧基、1-苯并三唑基氧基、1-咪唑基氧基、对硝基苯基氧基和
3.根据权利要求1的化合物，其中p为3。
4.根据权利要求1的化合物，其中p为3，R1为甲氧基，m为1，n为100-750。
5.下式的化合物：
   CH3-O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-NHT1249(III)
其中n为10-1,000，NHT1249为通过其末端α-氨基共价连接的T1249多肽。
6.根据权利要求5的化合物，其中n约为450。
7.药物组合物，其包含与可药用赋形剂混合的下式化合物：
其中
R1为封端基团，
m为1到17，
n为10-1,000，
p为1-3，且
NHT1249为通过其末端α-氨基共价连接的T1249多肽。
8.根据权利要求7的药物组合物，其中p为3，R1为甲氧基，m为1，n为100-750。
9.根据权利要求7的药物组合物，其为冷冻干燥粉末形式。
10.根据权利要求7的药物组合物，其为注射用溶液或悬液形式。
11.包含与可药用赋形剂混合的式I化合物的药物组合物的用途，用于制备抑制HIV感染的药物：
其中
R1为封端基团，
m为1到17，
n为10-1,000，
p为1-3，且
NHT1249为通过其末端α-氨基共价连接的T1249多肽。
12.根据权利要求11的用途，其中p为3，R1为甲氧基，m为1，n为100-750。
13.根据权利要求11的用途，其中药物组合物通过腹膜内、肌肉内、皮下、静脉内注射或连续输注。
14.根据权利要求11的用途，其中药物组合物以每次约50毫克-约300毫克的量施用。
15.包含与可药用赋形剂混合的式III化合物的药物组合物的用途，用于制备抑制HIV感染的药物：
   CH3-O-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-O-CH2-CH2-CH2-NHT1249(III)
其中n为10-1,000，且NHT1249为通过其末端α-氨基共价连接的T1249多肽。
16.根据权利要求15的用途，其中药物组合物为每周以约300毫克-约1,500毫克的量单剂量施用。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007515965A (ja) * 2003-12-23 2007-06-21 セントカー・インコーポレーテツド 抗レトロウイルス性の剤、組成物、方法および用途
EP1720899A2 (en) * 2004-02-23 2006-11-15 Borean Pharma A/S Multimerised hiv fusion inhibitors
WO2005089805A2 (en) * 2004-03-15 2005-09-29 Nektar Therapeutics Al, Corporation Polymer-based compositions and conjugates of hiv entry inhibitors
CN100475270C (zh) * 2006-01-20 2009-04-08 清华大学 一种治疗肿瘤的药物及其应用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR850004274A (ko) 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
US5464933A (en) 1993-06-07 1995-11-07 Duke University Synthetic peptide inhibitors of HIV transmission
US5795569A (en) * 1994-03-31 1998-08-18 Amgen Inc. Mono-pegylated proteins that stimulate megakaryocyte growth and differentiation
CH690143A5 (de) 1995-01-27 2000-05-15 Rieter Automotive Int Ag Lambda/4-Schallabsorber.
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US5830879A (en) 1995-10-02 1998-11-03 St. Elizabeth's Medical Center Of Boston, Inc. Treatment of vascular injury using vascular endothelial growth factor
US5990237A (en) 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
US6281331B1 (en) 1998-03-23 2001-08-28 Trimeris, Inc. Methods and compositions for peptide synthesis
US6258782B1 (en) * 1998-05-20 2001-07-10 Trimeris, Inc. Hybrid polypeptides with enhanced pharmacokinetic properties
JO2291B1 (en) * 1999-07-02 2005-09-12 اف . هوفمان لاروش ايه جي Erythropoietin derivatives
US6469136B1 (en) * 1999-07-07 2002-10-22 Trimeris, Inc. Methods and composition for peptide synthesis

Also Published As

Publication number Publication date
HRP20050025A2 (en) 2006-02-28
KR100630176B1 (ko) 2006-10-02
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AU2003250079A1 (en) 2004-02-23
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RU2005105578A (ru) 2005-10-27
WO2004013165A1 (en) 2004-02-12
CA2492954A1 (en) 2004-02-12
IL166037A0 (en) 2006-01-15
AU2003250079B2 (en) 2006-07-27
CA2492954C (en) 2009-12-22
RU2294938C2 (ru) 2007-03-10
EP1546193A1 (en) 2005-06-29
AR040650A1 (es) 2005-04-13
KR20050027255A (ko) 2005-03-18
PA8577801A1 (es) 2004-05-26
US7084261B2 (en) 2006-08-01
TW200427697A (en) 2004-12-16
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