JP2006515272A

JP2006515272A - Ｐｅｇ化ｔ１２４９ポリペプチド

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Publication number: JP2006515272A
Application number: JP2004525220A
Authority: JP
Inventors: バイロン，パスカル・セバスチャン; ウォン，チィ−ヨプ
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2002-07-24
Filing date: 2003-07-16
Publication date: 2006-05-25
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Also published as: UY27900A1; WO2004013165A1; EP1546193A1; MXPA05000798A; RU2005105578A; BR0312841A; HRP20050025A2; PA8577801A1; AR040650A1; AU2003250079A1; CA2492954A1; PL375308A1; CN100352837C; US20040171542A1; NO20050067L; AU2003250079B2; US7084261B2; IL166037A0; KR100630176B1; KR20050027255A

Abstract

ＰＥＧ化Ｔ１２４９ポリペプチド化合物が提供される。ＰＥＧ化Ｔ１２４９ポリペプチド化合物を含有する医薬組成物、および作製のプロセスも提供される。ＨＩＶ感染抑制用の医薬の調製のための、医薬的に許容される賦形剤と混合して、式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物の使用も更に提供される。

Description

本発明は、ＰＥＧ化Ｔ１２４９ポリペプチド化合物、および医薬組成物および処置の治療方法などにおける、このような化合物を使用および作成する関連方法に関する。

一部のウィルス、特にＨＩＶは、宿主細胞に侵入して繁殖するためには、融合と呼ばれる複雑なプロセスを被る必要がある。融合の間、ウィルスの外膜は宿主細胞の膜と融合する。ＨＩＶの場合、ＨＩＶウィルスの外膜は繁殖の間に、ＣＤ４＋Ｔ細胞の膜と融合する。

Ｔ１２４９は、ウィルス／膜融合を阻害する抗ウィルス剤の新しい種類の一種である。ＨＩＶの場合、これは、２つの有益な効果を与える。ＨＩＶの繁殖は阻止されることと、ＣＤ４＋Ｔ細胞の結果としての死は起こらないことである。

最近承認された抗ＨＩＶ薬に対するウィルス耐性は、今日、ＨＩＶの臨床管理での重大な問題である。現在承認されている薬物との併用抗ウィルス薬処置を始める多くの患者は、時間と共にこれらの薬剤の１つ以上への耐性を発現する。しかしながら研究は、Ｔ１２４９が、現在承認されている抗ウィルス薬のどのクラスに対する耐性によっても影響を受けないことを示唆している（２００１年６月４〜８日に、アリゾナ州スコッツデールでの5th International Workshop on Drug Resistance and Treatment Strategiesで紹介されたデータ）。

臨床試験でのＴ１２４９の用量範囲の分析は、ＨＩＶ薬の承認されたすべてのクラスに対する変異を含む、従来の抗ウィルス薬処置経験でなく、Ｔ１２４９の１日用量が、処置経験患者の間でのウィルス負荷軽減に関する唯一の変数であることを示唆している。更なる実験は、Ｔ１２４９のインビトロ活性が、逆転写酵素インヒビターおよびプロテアーゼインヒビターに対する耐性に関連する変異によって影響を受けないことを示している。

多くのポリペプチド治療剤と同様に、Ｔ１２４９は、一般に注射により投与する。現在の治療プロトコルでは、多くの場合、１日１回以上注射をする。

したがって、改善された性能および薬物動態特性を有するＴ１２４９ポリペプチドおよび医薬組成物を提供することは好都合である。Ｔ１２４９のより少ない治療用量、より少ない投与頻度、および／または延長された作用期間を与えることは、特に好都合である。

本発明のこれらおよび他の目的は、以下で更に詳細に説明する。

本発明は、式Ｉ：

（式中、
Ｒ_１は、キャッピング基であり、
ｍは、１〜１７であり、
ｎは、１０〜１，０００であり、
ｐは、１〜３であり、そして
ＮＨＴ１２４９は、その末端α−アミノ基を通じて共有結合したＴ１２４９ポリペプチドである）の化合物を提供する。

本発明の化合物の一実施態様において、Ｒ_１は、メトキシであり、ｍは、１であり、ｎは、１００〜７５０であり、そしてｐは、３である。

医薬的に許容される賦形剤と混合して、Ｒ_１、ｍ、ｎ、ｐ、およびＮＨＴ１２４９が先に定義したとおりである式（Ｉ）の化合物を含む、医薬組成物も提供される。

本発明の医薬組成物の一実施態様において、Ｒ_１は、メトキシであり、ｍは、１であり、ｎは、１００〜７５０であり、そしてｐは３である。

本発明は、更に、医薬的に許容される賦形剤と混合して、Ｒ_１、ｍ、ｎ、ｐ、およびＮＨＴ１２４９が先に定義したとおりである式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物を投与することを含む、ＨＩＶ感染を抑制する方法も提供する。本発明が「化合物を含む、ＨＩＶ感染を抑制する方法」を指す場合、「ＨＩＶの抑制のための薬剤の調製のための化合物の使用」を意味する。

ＨＩＶ感染を抑制する方法の一実施態様において、Ｒ_１はメトキシであり、ｍは１であり、ｎは１００〜７５０であり、そしてｐは３である。

ポリエチレングリコールアルデヒド分子がＴ１２４９ポリペプチドのＮ末端アミノ基に結合している、式（Ｉ）の化合物を生成するために、Ｔ１２４９ポリペプチドを、式中、Ｒ_１、ｍ、ｎ、ｐ、およびＮＨＴ１２４９が先に定義したとおりである、式：

のポリエチレングリコールアルデヒドと反応させることを含む、ＰＥＧ化Ｔ１２４９ポリペプチドを作成する方法も更に提供する。本発明が「作成するための方法」を指す場合、「作成するためのプロセス」を意味する。

先に示したように、Ｔ１２４９は「融合インヒビター」ポリペプチドである。Ｔ１２４９は、３９個のアミノ酸からなる。Ｔ１２４９のポリペプチド配列は：
ＷＱＥＷＥＱＫＩＴＡＬＬＥＱＡＱＩＱＱＥＫＮＥＹＥＬＱＫＬＤＫＷＡＳＬＷＥＷＦ［配列番号：１］である。Ｎ末端（またはアミノ末端）アミノ酸はトリプトファン（Ｗ）である。Ｃ末端（またはカルボキシ末端）アミノ酸は、フェニルアラニン（Ｆ）である。

全体を引用例として本明細書に取りこむ、米国特許第６，３４８，５６８号の表１で述べられているように（配列番号：１０７１）、Ｔ１２４９ポリペプチド配列は、そのアミノおよびカルボキシ末端の一方または両方にて封鎖／誘導体化できる。米国特許第６，３４８，５６８号で述べられているように、トリプトファンのアミノ末端はアシル基によって封鎖／誘導体化され、フェニルアラニンのカルボキシ末端は、アミノ基によって封鎖／誘導体化される（後者は−ＣＯＯＨ→−ＣＯＮＨ_２の変換を生じる）。

本明細書で使用されるように、「Ｔ１２４９」は、アミノ基によりフェニルアラニンＣ末端にて場合により封鎖された［配列番号：１］を意味することが理解されるものとする。言い換えれば、「Ｔ１２４９」に言及する場合、フェニルアラニンＣ末端は、−ＣＯＯＨまたは−ＣＯＮＨ_２のどちらかである。

本発明は、以下の式のＰＥＧ化Ｔ１２４９化合物を提供する。

式中、
Ｒ_１は、キャッピング基であり、
ｍは、１〜１７であり、
ｎは、１０〜１，０００であり、
ｐは、１〜３であり、そして
ＮＨＴ１２４９は、その末端α−アミノ基を通じて共有結合したＴ１２４９ポリペプチドである。

本明細書で使用されるように、Ｒ_１「キャッピング基」は、好みに応じて他の化学部分と一般に非反応性または一般に反応性である、適切などの化学基でもよい。上記の化合物では、ポリエチレングリコールは、Ｔ１２４９のα−アミノ基と共有結合する。Ｒ_１キャッピング基は、二官能性、すなわち興味のある第二の化学部分への共有結合を許容または防止するように選択される。

一般に、キャッピング基が、他の化学部分と非反応性である場合、Ｒ_１は、比較的不活性であり、したがって別の化学部分と共有結合しない。適切な、一般に非反応性のＲ_１キャッピング基は、水素、ヒドロキシル、低級アルキル、低級アルコキシ、低級シクロアルキル、低級アルケニル、低級シクロアルケニル、アリール、およびヘテロアリールを含む。

本明細書で使用されるように、「低級アルキル」という用語は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチルなどの１〜７個の、好ましくは１〜４個の炭素原子を含有する、直鎖または分岐鎖アルキル基を意味する。「低級アルキル」は、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、低級シクロアルキル、低級アルケニル、低級シクロアルケニル、アリール、およびヘテロアリールから独立して選択される１個以上の基によって場合により置換される。

「低級アルコキシ」という用語は、酸素原子を介して結合された、前に定義した低級アルキル基を意味し、低級アルコキシ基の例は、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｎ−ペントキシなどである。「低級アルコキシ」は、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、低級シクロアルキル、低級アルケニル、低級シクロアルケニル、アリール、およびヘテロアリールから独立して選択される１個以上の基によって場合により置換される。

「低級シクロアルキル」という用語は、３〜７個の、好ましくは４〜６個の炭素原子を含有するシクロアルキル基、すなわちシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルまたはシクロヘプチルを意味する。「低級シクロアルキル」は、場合によりハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、低級シクロアルキル、低級アルケニル、低級シクロアルケニル、アリール、およびヘテロアリールから独立して選択される１個以上の基によって場合により置換される。

本明細書で使用されるように、「低級アルケニル」という用語は、２〜７個の、好ましくは２〜５個の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖アルケニル基、例えばエテニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニルなどを意味する。「低級アルケニル」は、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、低級シクロアルキル、低級アルケニル、低級シクロアルケニル、アリール、およびヘテロアリールから独立して選択される１個以上の基によって場合により置換される。

「低級シクロアルケニル」という用語は、４〜７個の炭素原子を含有するシクロアルケニル基、例えばシクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニルなどを意味する。「低級シクロアルケニル」は、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、低級シクロアルキル、低級アルケニル、低級シクロアルケニル、アリール、およびヘテロアリールから独立して選択される１個以上の基によって場合により置換される。

「アリール」という用語は、非置換であるか、あるいはハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、トリフルオロメチル、ヒドロキシル、カルボン酸、カルボン酸エステル、ニトロ、アミノ、またはフェニルによって、特にハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、トリフルオロメチル、ヒドロキシル、ニトロ、アミノおよびフェニルによって場合により一置換または多置換される、フェニルまたはナフチル基を意味する。

「ヘテロアリール」という用語は、Ｎ、Ｓ、およびＯから選択された１個以上のヘテロ原子を含有し、前に定義した「アリール」と同じ方法でベンズ融合および／または置換された、５または６員へテロ芳香族基を意味する。

好ましい一般に非反応性のＲ_１キャッピング基は、メトキシ、ヒドロキシ、またはベンジルオキシを含む。特に好ましいＲ_１キャッピング基は、メトキシである。Ｒ_１がメトキシである場合、ＰＥＧ化ポリペプチド化合物は本明細書では一部、「ｍＰＥＧ」化合物と呼ばれ、ここで「ｍ」はメトキシを表す。

一般に、Ｒ_１キャッピング基が、他の化学部分と反応性である場合、Ｒ_１は、ペプチドおよび／またはタンパク質中のアミンおよび／またはスルフヒドリル基などの、一部の官能基と反応することが可能である官能基である。このような場合、反応するために強力な触媒または非常に非実際的な反応条件を必要とする基とは対照的に、Ｒ_１は他の分子上の求電子または求核基とただちに反応することができる官能基でもよい。Ｒ_１が比較的反応性である場合、ポリエチレングリコールアルデヒドは別の化学部分と共有結合できる。

適切な一般に反応性のＲ_１キャッピング基の例は、ハロゲン、エポキシド、マレイミド、オルトピリジルジスルフィド、トシラート、イソシアナート、ヒドラジンヒドラート、シアヌル酸ハライド、Ｎ−スクシンイミジルオキシ、スルホ−Ｎ−スクシンイミジルオキシ、１−ベンゾトリアゾリルオキシ、１−イミダゾリルオキシ、ｐ−ニトロフェニルオキシ、および

を含む。

「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素を意味する。好ましい一般に反応性のＲ_１キャッピング基は

である。このＲ_１キャッピング基が存在する場合、本発明の化合物において、第一のｍ、ｎ、および／またはｐが、式中の第二のｍ、ｎ、および／またはｐと同じでも異なっていてもよいことが認識される。しかしながら両方のｍが同じ値を持ち、両方のｎが同じ値を持ち、そして両方のｐが同じ値を持つことが好ましい。

本発明において、ｍは、１〜１７である。好ましい実施態様において、ｍは、１〜１４である。更に好ましくは、ｍは、１〜７であり、なお更に好ましくは、ｍは、１〜４である。最も好ましくは、ｍは、１である。

本発明において、ｎは、１０〜１０００である。本発明の好ましい実施態様において、ｎは、２０〜１，０００である。好ましくは、ｎは、５０〜１，０００であり、なお更に好ましくは、ｎは、７５〜１，０００である。最も好ましくは、ｎは、１００〜７５０である。

本発明において、ｐは、１〜３である。好ましくはは、ｐは、３である。

好ましい実施態様において、ｐは、３であり、Ｒ_１は、メトキシであり、ｍは、１であり、そしてｎは、１００〜７５０である。あるいはｐは、２であり、Ｒ_１は、メトキシであり、ｍは、１であり、そしてｎは、１００〜７５０である。あるいはｐは、１であり、Ｒ_１は、メトキシであり、ｍは、１であり、そしてｎは、１００〜７５０である。

本発明は、Ｒ_１がメトキシであり、ｍが１であり、ｎが１００〜７５０であり、ｐが３であり、ＮＨＴ１２４９が、その末端α−アミノ基を通じて共有結合したＴ１２４９ポリペプチドである、式（Ｉ）の実施態様を提供する。

上述のように、本発明のＰＥＧ化Ｔ１２４９化合物は、Ｔ１２４９のα−アミノ基を、特定の構造を有するポリエチレングリコール誘導体に共有結合させる。これらのＰＥＧ化化合物は、所望のどの方法でも作成できるが、一般にＴ１２４９に、個別に調製したポリエチレングリコール誘導体を反応させることによって調製する。例えばＴ１２４９ポリペプチドは、すべてのリジン残基を封鎖して、この封鎖されたＴ１２４９をポリエチレングリコール誘導体と反応させることによってＰＥＧ化できる。次にＴ１２４９ポリペプチドの封鎖リジン残基を封鎖解除すると、末端ＰＥＧ化Ｔ１２４９が生じる。

Ｔ１２４９ポリペプチドは、適切などの方法でも調製できる。例えば化合物は、Ｂｏｃ−アミノ酸を利用した固相法を包含する古典的なメリフィールド固相合成技法を使用して（Chem.Soc., 85, 2149, 1963）、手動または自動手法を使用して、Ｆｍｏｃ−アミノ酸を利用した固相方法を使用して（Sheppard, R.C.ら、J.Chem.Soc.Chem.Comm., 165〜166頁(1985)）を使用して、ケンタッキー州ルイビルのAdvanced Chemtechにより入手可能なAdvanced Chemtech model 200を使用して、マサチューセッツ州ベッドフォードのMilliporeより入手可能なMillipore 9050+を使用して、又は他の入手可能な機器を使用して合成できる。

Ｔ１２４９は、本発明の化合物をコード化しているｃＤＮＡを機能性ウィルス性または環状プラスミドＤＮＡベクター内に組み込むことによって生成される。ベクターまたはプラスミドは、選択した微生物を形質移入または形質転換するために使用できる。形質転換または形質移入微生物は、ベクターが持つＤＮＡ配列を発現するのに誘発性である条件下で培養可能であり、増殖培地からの所望のペプチドの分離が実施できる（例えば全体を引用例として本明細書に取りこむ、米国特許第５，９５５，４２２号を参照）。

Ｔ１２４９は、当業界で周知の技術を使用して標準組換えＤＮＡ技法によっても調製できる。例えば、Sambrook らMolecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)またはAusubel ら、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York(1995）で概説されている手法の両方を引用例として本明細書に取りこむ。

Ｔ１２４９を作成する詳細な方法は、米国特許第６，２５８，７８７２号および米国特許第６，３４８，６８号に述べられており、それぞれ全体を引用例として本明細書に取りこむ。

開裂および脱保護の後、Ｔ１２４９は、適切などの手段によっても精製できる。例えば、イオン交換、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび／または逆相カラム／ＨＰＬＣシステムを用いて、全長Ｔ１２４９をその断片から精製することができる。Ｎ末端（例えばアシル基）および／またはＣ末端（例えばアミノ基）に結合した封鎖／保護基を備えたＴ１２４９前駆物質が最初に調製される場合、これらの基の一方または両方を、既知の技法で除去することができる。

Ｔ１２４９のアミノ酸配列は、標準アミノ酸分析はもちろんのこと、各アミノ酸の手動および自動エドマン分解および決定を用いても確認および同定できる。ＨＰＬＣ分析および質量分析法も、Ｔ１２４９の生成を確認するために使用できる。

Ｔ１２４９と反応できるポリエチレングリコールアルデヒド化合物は、どの所望の方法でも作成できる。しかしながら、ポリエチレングリコールは、全体を引用例として本明細書に取りこむ、「Polyethylene Glycol Aldehydes」という題の、２００２年６月２４日に出願された米国特許出願第６０／３９８，１９６号に述べた方法に従って作成できることが好ましい。

一般に、式：

（式中、Ｒ_１、ｍ、ｎ、およびｐは、先に定義したとおりである）のポリエチレングリコールアルデヒドを用いて、Ｔ１２４９をＰＥＧ化する。Ｔ１２４９をＰＥＧ化するのに使用されるポリエチレングリコールアルデヒドは、適切などの手段によっても調製できる。１つの好ましいポリエチレングリコールアルデヒドは、以下：

のように調製される。

様々なサイズ（例えばｎ値を変える）のポリエチレングリコールアルデヒドは、上記の一般反応スキームに従って調製できる。

本発明のＰＥＧ化Ｔ１２４９化合物は、適切などの手段によっても調製できる。しかしながら、本発明によって、式：Ｒ_１−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｍ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｐ−ＣＨ_２−ＮＨＴ１２４９（Ｉ）（式中、ポリエチレングリコールアルデヒド分子は、Ｔ１２４９ポリペプチドのＮ末端アミノ基に結合されている）の化合物を生成するために、Ｔ１２４９ポリペプチド、ＮＨＴ１２４９を、式：

（式中、Ｒ_１、ｍ、ｎ、およびｐは先に定義したとおりである）のポリエチレングリコールアルデヒドと反応させることを含む、Ｔ１２４９ポリペプチドをＰＥＧ化するための方法が更に提供される。

ＰＥＧ化Ｔ１２４９は、Ｔ１２４９およびＰＥＧ試薬を１：１〜１：１００のモル比範囲で添加することによって調製される。Ｔ１２４９は、先に論じたように、遊離α−アミノ基（いずれかのアシル基が除去される）および遊離カルボキシ基またはアミノ保護基のどちらかを有する。反応混合物は、室温または４℃、ｐＨ範囲５．５〜７．４のホウ酸またはリン酸緩衝液に約０．５〜２４時間入れる。ＰＥＧ試薬のペプチド／タンパク質に対するモル比は、１：１〜１００：１である。ペプチド／タンパク質の濃度は、１〜１０mg／mlである。緩衝液の濃度は通例、１０〜５００mMである。

ＰＥＧ化Ｔ１２４９は、ＰＥＧ化Ｔ１２４９の反応混合物を取って、それを平衡緩衝液（２０mM Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）で希釈することによって精製する。得られた混合物を次に、Ｑ−セファロースカラムに加える。混合物をＱＡカラムに加えた後、それを平衡緩衝液で洗浄し、７５ＭＮａＣｌで溶離、２００mM ＮａＣｌで溶離、１ＭＮａＣｌで溶離させ、および１ＭＨＯＡＣ＋１ＭＮａＣｌおよび０．５ＮａＯＨによって再生する。

逆相ＨＰＬＣを使用することによって、Ｎ末端、モノＰＥＧ化生成物を混合物中の他の副生成物からただちに分離および単離することが可能である。例えばＰＥＧ化Ｔ−１２４９のクロマトグラムでは、それぞれ異なる保持時間を持つ複数のピークが生じる。第一のピークは、１０．７分に未反応ペプチドを示し、第二のピークは、１７．６分にモノＰＥＧ化ペプチドを示し、１９分にジＰＥＧ化ペプチドが続く。各収集生成物は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）によって確認した。

本発明のＰＥＧ化Ｔ１２４９ポリペプチドの好ましい実施態様において、ｐは、３であり、Ｒ_１は、メチルであり、ｍは、１であり、そしてｎは、１００〜７５０である。またはｐは、２であり、Ｒ_１は、メトキシであり、ｍは、１であり、そしてｎは、１００〜７５０である。またはｐは、１であり、Ｒ_１は、メトキシであり、ｍは、１であり、そしてｎは、１００〜７５０である。

以下の式：ＣＨ_３−Ｏ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｎ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨＴ１２４９（ＩＩＩ）（式中、ｎは１０〜１，０００であり、そしてＮＨＴ１２４９は、その末端α−アミノ基を通じて共有結合されたＴ１２４９ポリペプチドである）のＰＥＧ化Ｔ１２４９ポリペプチドも提供される。一実施態様において、ｎは、約２２５、例えば２２７である。別の実施態様において、ｎは、約４５０である。

このＰＥＧ化Ｔ１２４９ポリペプチドは、いずれかの所望の方法で作成でき、好ましくは実施例７に記載した方法により作成される。

本発明の医薬組成物は、医薬的に許容される賦形剤と混合して、Ｒ_１、ｍ、ｎ、ｐ、およびＮＨＴ１２４９が先に定義した、式（Ｉ）の化合物を含む。

ＰＥＧ化Ｔ１２４９ポリペプチド、またはその塩を含む本発明の医薬組成物は、いずれかの所望の方法、例えば従来の混合、カプセル化、溶解、粒状化、乳化、取り込み（entrapping）、または凍結乾燥プロセスによって製造できる。これらの医薬調製物は、治療的に不活性な無機または有機賦形剤および担体を用いて調合できる。注射用の適切な賦形剤は、水、アルコール、ポリオール、グリセリン、植物油、リン脂質、および表面活性剤を含む。

医薬調製物は、保存剤、可溶化剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、着香剤、浸透圧を変化させるための塩、緩衝剤、コーティング剤、抗酸化剤も含有できる。それらは、追加の活性成分を含む、他の治療的に価値のある物質も含有できる。

注射（腹腔内、筋肉内、皮下、静脈内注射を含む、または持続注入による）による投与に適した調合物は、単位投薬形態で好都合に与えられるか、従来の医薬技法によって調製できる。このような技法は、ＰＥＧ化Ｔ１２４９ポリペプチドおよび医薬担体または賦形剤を結合させるステップを含む。一般に調合物は、ＰＥＧ化Ｔ１２４９ポリペプチドを液体担体を均一および密接に結合させることによって調製する。非経口の投与に適した調合物は、調合物を抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬および対象となるレシピエントの血液と等張性にする溶質を含有する、水性および非水性滅菌注射溶液、ならびに懸濁剤および増粘剤を含む水性および非水性滅菌懸濁液を含む。調合物は、単位用量または複数回用量容器、例えば密封アンプルおよびバイアルで与えられ、使用直前に滅菌液体担体、例えば注射用の水の添加のみを必要とする、フリーズドライ（凍結乾燥）条件で保管できる。

好ましい単位投薬調合物は、本明細書の上で引用したように、１日用量、１日サブ用量、週用量、週サブ用量、あるいは投与成分の適切な分割を含有する調合物である。

好ましくはＰＥＧ化Ｔ１２４９ポリペプチドは、単位投薬形態である。本明細書で使用されるように、「単位投薬形態」は、ＰＥＧ化Ｔ１２４９ポリペプチドが予め測定されたおよび／または予め包装された形態である単回用量に適した量を意味する。これは投与のためのＰＥＧ化Ｔ１２４９ポリペプチドの好都合な調製を可能にし、患者による自己投与すら可能にする。単位投薬量は明らかに、送達されるＰＥＧ化Ｔ１２４９ポリペプチドの量および投与頻度に依存する。

ＰＥＧ化Ｔ１２４９ポリペプチドは、投与の直前に医薬的に許容される賦形剤による再構成に適した、単位投薬量の凍結乾燥粉末形態で提供することもできる。

本発明の特定の医薬組成物は、医薬的に許容される賦形剤と混合して、Ｒ_１がメトキシであり、ｍが１であり、ｎが１００〜７５０であり、そしてｐが３である、式（Ｉ）の化合物を含む。

本発明の別の医薬組成物は、医薬的に許容される賦形剤と混合して、ｎが１０〜１，０００であり、そしてＮＨＴ１２４９がその末端α−アミノ基に共有結合したＴ１２４９ポリペプチドである式（ＩＩＩ）の化合物を含む医薬組成物である。一実施態様において、ｎは、約２２５、例えば２２７である。別の実施態様において、ｎは、約４５０である。

本発明は更に、医薬的に許容される賦形剤と混合して、Ｒ_１、ｍ、ｎ、ｐ、およびＮＨＴ１２４９が先に定義したとおりである式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物を患者に投与することを含む、ＨＩＶ感染を抑制する方法を提供する。

ＰＥＧ化Ｔ１２４９ポリペプチドは一般に、（非ＰＥＧ化）Ｔ１２４９ポリペプチドが現在投与されている方法で投与される。しかしながら、ＰＥＧ化Ｔ１２４９ポリペプチドの改善された薬物動態特性を利用するために、変更を行うことができる。

ＨＩＶを抑制する本発明の方法において、医薬組成物は、いずれかの適切な方法および経路で投与できる。好ましい方法において、ＰＥＧ化Ｔ１２４９ポリペプチドは、注射用溶液または懸濁液の形態で投与される。好ましくは注射用溶液または懸濁液は、皮下注射によって、または静脈内に投与される。

別の好ましい方法において、ＰＥＧ化Ｔ１２４９ポリペプチドは、経皮送達デバイス、例えば経皮パッチを通じて投与される。

ＨＩＶを抑制する本発明の方法において、医薬組成物は、いずれかの適切な投薬量およびスケジュールで投与できる。本発明の医薬組成物は、所望の、いずれかの形態およびいずれかの経路で投与できる。一般に、しかしながら、本発明のＰＥＧ化Ｔ１２４９ポリペプチドは、非経口的に、例えば注射溶液の形態で投与される。

治療的有効量の決定は、当技術分野の範囲内であり、本発明によるＰＥＧ化Ｔ１２４９ポリペプチド治療的有効量または投薬量は、変化することがあり、特定の各症例における個別の要件に調整される。一般に、体重約７０kgの成人男性への注射による投与の場合、約５０mg〜約３００mg、好ましくは約５０mg〜約２００mgの１日投薬量が適切であるが、指示される場合は上限を超えてもよい。投薬量は、単回用量として、分割用量で、または持続注入によって投与できる。

医薬組成物は、いずれかの好都合な投与スケジュールで投与できる。好ましくは医薬組成物は、１日１回、１日２回、１日おき、週１回、または週２回投与される。更に好ましくは、医薬組成物は週１回投与される。

好ましくは医薬組成物は、週１回、約３００mg〜約１，５００mgの用量で投与される。更に好ましくは、医薬組成物は、週１回、約４００mg〜約１，０００mgの用量で投与される。なお更に好ましくは、医薬組成物は、週１回、約１００mg〜約２００mgの用量で投与される。

本発明は、医薬的に許容される賦形剤と混合して、Ｒ_１が、メトキシであり、ｍが、１であり、ｎが、１００〜７５０であり、そしてｐが、３である式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物を投与することを含む、ＨＩＶ感染を抑制する方法も提供する。

医薬的に許容される賦形剤と混合して、ｎが、１０〜１，０００であり、ＮＨＴ１２４９が、その末端α−アミノ基に共有結合されたＴ１２４９ポリペプチドである式（ＩＩＩ）の化合物を含む医薬組成物を投与することを含む、ＨＩＶ感染を抑制する方法も、本発明の範囲内で考慮される。一実施態様において、ｎは、約２２５、例えば２２７である。別の実施態様において、ｎは、約４５０である。

以下の実施例は、本発明の化合物、組成物、および方法を更に説明するために提供される。これらの実施例は、例示のみであり、本発明の範囲を決して制限するものではない。

ｍＰＥＧ_１０Ｋ−ブタノアルデヒドの調製
トルエン２４０ml中の分子量１０，０００のｍＰＥＧ（３０．０ｇ、３mmol）を２時間還流し、それに続くトルエン１２０mlの除去によって共沸乾燥させた。得られた溶液は室温まで冷却し、次に無水ｔｅｒｔ−ブタノール２０mlおよびトルエン２０ml中のカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（０．６８ｇ、６mmol）を、ＰＥＧ溶液に添加した。得られた混合物をアルゴン雰囲気下、室温にて２時間攪拌した。ｔｅｒｔ−ブチルブロモアセタート（１．００mL、６．７５mmol）を注射器で反応物に添加し、反応物をアルゴン雰囲気下、室温にて一晩攪拌した。次に反応溶液を回転蒸発により濃縮した。ジエチルエーテルへの添加により残留物を沈殿させた。沈殿したｍＰＥＧ_１０Ｋｔ−ブチルカルボキシメチルエステル生成物を濾過して、真空中で乾燥させた。収量：２８ｇ。

次にｍＰＥＧ_１０Ｋｔ−ブチルカルボキシメチルエステル（２６．５ｇ）を１Ｎ水酸化ナトリウム３５０ml中に溶解させ、溶液を室温にて一晩攪拌した。６Ｎ塩酸の添加により混合物のｐＨを２．５に調整して、混合物をジクロロメタンで抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥、濾過、濃縮させて、そしてジエチルエーテル中で沈殿させた。生成物ｍＰＥＧ_１０Ｋ−カルボキシメチル酸を濾過により収集して、真空中で乾燥させた。収量：２４ｇ。

次にｍＰＥＧ_１０Ｋ−カルボキシメチル酸（６ｇ、０．６mmol）を無水ジクロロメタン（３０mL）に溶解させ、４−アミノブチルアルデヒドジエチルアセタール（１４０ml、０．９mmol）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（８０mg、０．６mmol）、およびジクロロヘキシルカルボジイミド（１６０mg、０．７８mmol）の添加が続いた。混合物をアルゴン雰囲気下、室温にて一晩攪拌した。反応混合物を濾過、濃縮し、そして、２−プロパノールおよびジエチルエーテル（１：１）の混合物によって沈殿させた。生成物ｍＰＥＧ_１０Ｋ−ブタノアセタールを真空中で一晩乾燥させた。収量：５．４ｇ。

次にｍＰＥＧ_１０Ｋ−ブタノアセタール（２ｇ、０．２mmol）を８０％ＣＦ_３ＣＯＯＨ２０mlに溶解させ、溶液を室温にて一晩攪拌した。１ＮＮａＯＨ溶液の添加により、混合物のｐＨを６．０に調整し、塩化ナトリウム（１０重量％）を添加して、次に１ＮＮａＯＨ溶液の添加により、溶液のｐＨを７．０に調整した。混合物をジクロロメタンで抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥、濾過、濃縮して、そしてジエチルエーテル中に沈殿させた。生成物ｍＰＥＧ_１０Ｋ−ブタノアルデヒドを濾過により収集し、真空中で乾燥させた。収量：１．７ｇ。

ｍＰＥＧ_１０Ｋ−ブタノアルデヒドによるＴ１２４９のＰＥＧ化
実施例１によって調製したＰＥＧ１０kDaのブタノアルデヒド（ｍＰＥＧ_１０Ｋ−ＣＭＡＢ）を、緩衝液（５０mM リン酸カリウム、ｐＨ６．５）１．０ml中のＴ１２４９（純度９３．７％）２０mgに、Ｔ１２４９１モルあたり試薬５モルのモル比で添加した。Ｔ１２４９ポリペプチドは、α−アミノ末端で脱アシル化したが、カルボキシル末端で−ＮＨ_２により保護した。反応混合物に１０％（体積／体積）の０．５Ｍナトリウムシアノボロヒドリド水溶液を添加し、室温にて４時間攪拌した。ＰＥＧ化Ｔ−１２４９は、イオン交換クロマトグラフィー（ＱＡ）を使用して、反応混合物から精製した。２０mM Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５中の、６５mM〜１ＭＮａＣｌの上昇する塩濃度によるステップ勾配を用いて、ＰＥＧ化Ｔ１２４９および未修飾Ｔ１２４９を分離した。

ｍＰＥＧ_２０Ｋ−ブタノアルデヒドの調製
トルエン８００ml中の分子量２０，０００のｍＰＥＧ（６０．０ｇ、３mmol）を２時間還流し、それに続くトルエン２００mlの除去によって共沸乾燥させた。得られた溶液は室温まで冷却し、次に無水ｔｅｒｔ−ブタノール２０mlおよびトルエン２０ml中のカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（０．６８ｇ、６mmol）を、ＰＥＧ溶液に添加した。得られた混合物をアルゴン雰囲気下、室温にて２時間攪拌した。ｔｅｒｔ−ブチルブロモアセタート（１．００mL、６．７５mmol）を注射器で反応物に添加し、反応物をアルゴン雰囲気下、室温にて一晩攪拌した。次に反応溶液を回転蒸発により濃縮した。ジエチルエーテルへの添加により残留物を沈殿させた。沈殿したｍＰＥＧ_２０Ｋｔ−ブチルカルボキシメチルエステル生成物を濾過して、真空中で乾燥させた。収量：５６ｇ。

次にｍＰＥＧ_２０Ｋｔ−ブチルカルボキシメチルエステル（２８ｇ）を１Ｎ水酸化ナトリウム７５０ml中に溶解させ、溶液を室温にて一晩攪拌した。６Ｎ塩酸の添加により混合物のｐＨを２．５に調整して、混合物をジクロロメタンで抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥、濾過、濃縮させて、そしてジエチルエーテル中で沈殿させた。生成物ｍＰＥＧ_２０Ｋ−カルボキシメチル酸を濾過により収集して、真空中で乾燥させた。収量：２５ｇ。

次にｍＰＥＧ_２０Ｋ−カルボキシメチル酸（２０ｇ、１．０mmol）を無水ジクロロメタン（１００mL）に溶解させ、４−アミノブチルアルデヒドジエチルアセタール（０．７７ml、４mmol）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（２７０mg、２．０mmol）、およびジクロロヘキシルカルボジイミド（６２０mg、３．０mmol）の添加が続いた。混合物をアルゴン雰囲気下、室温にて一晩攪拌した。反応混合物を濾過、濃縮し、そして、２−プロパノールおよびジエチルエーテル（１：１）の混合物によって沈殿させた。生成物ｍＰＥＧ_２０Ｋ−ブタノアセタールを真空中で一晩乾燥させた。収量：１８．６ｇ。

次にｍＰＥＧ_２０Ｋ−ブタノアセタール（１４．７ｇ、０．７３mmol）を１０％ＣＦ_３ＣＯＯＨ２００mlに溶解させ、溶液を室温にて一晩攪拌した。１ＮＮａＯＨ溶液の添加により、混合物のｐＨを６．０に調整し、塩化ナトリウム（１０重量％）を添加して、次に１ＮＮａＯＨ溶液の添加により、溶液のｐＨを７．０に調整した。混合物をジクロロメタンで抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥、濾過、濃縮して、そしてジエチルエーテル中に沈殿させた。生成物ｍＰＥＧ_２０Ｋ−ブタノアルデヒドを濾過により収集し、真空中で乾燥させた。収量：１３．１ｇ。

ｍＰＥＧ_２０Ｋ−ブタノアルデヒドによるＴ１２４９のＰＥＧ化
実施例３によって調製したＰＥＧ２０kDaのブタノアルデヒドを、５０mM ホウ酸緩衝液０．４ml、ｐＨ９．５に溶解させたＴ１２４９（純度９３．７％）２０mgに添加し、次にＴ１２４９１モルあたり試薬１０モルのモル比で、１００mM リン酸カリウム、ｐＨ６．５によって１０倍に希釈した。Ｔ１２４９ポリペプチドは、α−アミノ末端で脱アシル化したが、カルボキシル末端で−ＮＨ_２により保護した。反応混合物に０．５Ｍナトリウムシアノボロヒドリド水溶液（ＮａＢＨ_３ＣＮ）０．４mL（１０％、体積／体積）を添加し、室温にて４時間攪拌した。次に反応混合物を平衡緩衝液（２０mM Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）によって１０倍に希釈し、０．４５μmフィルタによって濾過した。ＰＥＧ化Ｔ１２４９は、イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−セファロース）を使用して、反応混合物から精製した。平衡緩衝液中の７５mM、２００mM〜１ＭＮａＣｌの上昇する塩濃度によるステップ勾配を用いて、ジＰＥＧ化、モノＰＥＧ化および未修飾Ｔ１２４９を相互からそれぞれ分離した。上記の実験は、Ｔ１２４９７０mg、ＰＥＧ_２０Ｋ−ブタノアルデヒドの１：１０モル過剰で開始して反復し、先に記載したように精製した。両方の実験によるモノＰＥＧ化Ｔ１２４９（２００mM ＮａＣｌ溶出液）プールを合わせ、約２mg／mLに濃縮し、貯蔵緩衝液（ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．３）中に透析濾過し、使用するまで−２０℃で保管した。物質の分割量を使用して、抗ウィルス活性についてアッセイした。

ｍＰＥＧ_２０Ｋ−ブタノアルデヒドによる％モノ−、％ジ−、および％トリ−ＰＥＧ化Ｔ１２４９
ｍＰＥＧ_２０Ｋ−ブタノアルデヒドによる％モノ−、％ジ−、および％トリ−ＰＥＧ化Ｔ１２４９は、Ｔ１２４９：ＰＥＧモル比、反応溶液のｐＨ、および反応時間を以下の表１、２、および３に見られるように変化させた一連の実験によって決定した。これらの実験の目的は、ＰＥＧ化パラメータを最適化することであった。

例えば表１では、実施例３によって調製したＰＥＧ２０kDaのブタノアルデヒド（ｍＰＥＧ_２０Ｋ−ＣＭＡＢ）を、５０mM リン酸カリウム、ｐＨ６．５中のＴ１２４９（純度９３．７％）５mgに添加した。Ｔ１２４９ポリペプチドは、α−アミノ末端で脱アシル化したが、カルボキシル末端で−ＮＨ_２により保護した。ＰＥＧ試薬のＴ１２４９に対するモル比は、１：１、１：２、および１：５であった。反応混合物に１０％（体積／体積）の０．５Ｍナトリウムシアノボロヒドリド水溶液を添加した。室温にて２、４、６、および２４時間の所定の時間間隔で、分割量を取り除いた。

表２では、実施例３によって調製したＰＥＧ２０kDaのブタノアルデヒド（ｍＰＥＧ_２０Ｋ−ＣＭＡＢ）を、５０mM リン酸カリウム、ｐＨ６．０中のＴ１２４９（純度９３．７％）５mgに、Ｔ１２４９１モルあたりＰＥＧ試薬１０モルのモル比で添加した。Ｔ１２４９ポリペプチドは、α−アミノ末端で脱アシル化したが、カルボキシル末端で−ＮＨ_２により保護した。反応混合物に１０％（体積／体積）の０．５Ｍナトリウムシアノボロヒドリド水溶液を添加した。室温にて２、４、６、および２４時間の所定の時間間隔で、分割量を取り除いた。

表３では、実施例３によって調製したＰＥＧ２０kDaのブタノアルデヒド（ｍＰＥＧ_２０Ｋ−ＣＭＡＢ）を、５０mM リン酸カリウム、ｐＨ５．５中のＴ１２４９（純度９３．７％）５mgに、Ｔ１２４９１モルあたりＰＥＧ試薬１０モルのモル比で添加した。Ｔ１２４９ポリペプチドは、α−アミノ末端で脱アシル化したが、カルボキシル末端で−ＮＨ_２により保護した。反応混合物に１０％（体積／体積）の０．５Ｍナトリウムシアノボロヒドリド水溶液を添加した。室温にて２、４、６、および２４時間の所定の時間間隔で、分割量を取り除いた。

モノ−、ジ−、およびトリ−ＰＥＧ化Ｔ１２４９、および未反応遊離Ｔ１２４９のパーセンテージは、すべて反応混合物について逆相ＨＰＬＣによって得た。上記の表１、２、および３に例示したデータは、モノＰＥＧ化Ｔ１２４９の最適量がＴ１２４９：ＰＥＧモル比、ｐＨ、および反応時間の可変条件下で達成された時を示す。例えば表１において、６１％の最適モノＰＥＧ化は、１：５のＴ１２４９：ＰＥＧモル比および６時間の時点で示されている。表２では、６１％の最適モノＰＥＧ化は、１：１０のＴ１２４９：ＰＥＧモル比および４時間の時点で示されている。表３では、６０％の最適モノＰＥＧ化は、１：１０のＴ１２４９：ＰＥＧモル比および６時間の時点で示されている。

ＰＥＧ化部位の決定
Ｔ１２４９へのＰＥＧ付加部位を評価するために、一連の実験を実施した。結果は、Ｎ末端トリプトファン残基に＞９５％の修飾が位置することを示す。追加の修飾部位は、わずかな程度（＜５％）発生するが、その正確な同定は明らかに確立されていない。

ＰＥＧ修飾部位を決定するために、サンプルをエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃによって消化して、ペプチドを逆相ＨＰＬＣで分離した。個々のペプチドピークは、ナノスプレーＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）質量分析法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型）質量分析法およびＮ末端（エドマン）配列決定を用いて更に分析した。これらの手法を以下にまとめる。

実施例４に従って調製した２０ＫモノＰＥＧ化ブタノアルデヒド−Ｔ１２４９（２０ｋｍＰＥＧ−ＣＭＡＢ−Ｔ１２４９）のサンプルおよびＴ１２４９（遊離α−アミノ末端；−ＮＨ_２によって保護されたカルボキシル末端）を、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃによってタンパク質分解により、１０／１（重量／重量）のサンプル対酵素比で周囲温度にて２時間消化した。酢酸を最終濃度２％（重量／重量）まで添加して、反応を停止させた。

タンパク質分解ペプチドの分離は、逆相ＨＰＬＣによって、Phenomenex Luna逆相カラム（Ｃ−１８、３μ、１５０×２００mm）を装備したＨＰ１１００ＨＰＬＣシステムを用いて実施した。溶媒系は、水、アセトニトリルおよびトリフルオロ酢酸（０．０５％）より構成された。勾配は、流速０．２ml／分にて５０分間に５％〜６４％有機溶媒であった。ピークを含有するペプチドは、更なる分析のために収集した。

収集したサンプルはすべて、Finnigan LCQイオントラップ機器でナノスプレーＥＳＩ質量分析法によって分析した。個々のペプチドは、実験分子量に対して同定した。ＰＥＧペプチド含有画分もＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により、Bruker Reflex機器で分析した。使用したマトリックスは、トランス−３−インドールアクリル酸またはアルファ−４−ヒドロキシ桂皮酸であった。

次にＰＥＧ含有ペプチド画分は、Perkin Elmer（ＡＢＩ）精密機器で自動Ｎ末端（エドマン）配列決定を受けさせた。

ＰＥＧ化Ｔ１２４９のタンパク質分解断片の逆相ＨＰＬＣ分析の結果を、図１に示す。図１は、２つのサンプルの逆相ＨＰＬＣ分析から得たＵＶトレースを示す。対照Ｔ１２４９（図１ＢのピークＨＴ−２０）で観測されたＮ末端ペプチドは、ＰＥＧ修飾Ｔ１２４９（図１Ａ）では、ほぼ完全に存在しない。代わりに１個の新たなピークが出現した（図１ＡのピークＰＥＧ−３４）。それはＰＥＧ修飾ペプチドを含有する。

個々のＨＰＬＣ画分の分析から得られた質量分析結果を、表４にまとめる。非修飾ペプチドのすべての実験分子量は、計算した分子量に匹敵した。

^１図１も参照；^２Ｄａの計算した正確な質量；^３Ｄａの測定した質量、非修飾ペプチドのナノスプレーＥＳＩＭＳおよびＰＥＧ修飾ペプチドのＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ；^４自動化エドマン配列決定、ｎ．Ａ．＝該当なし、ｘ＝同定されない；^５分子量適合性および／またはエドマン配列決定に基づく。非修飾Ｔ１２４９サンプルのアミノ酸配列は：ＷＱＥＷＥＱＫＩＴＡＬＬＥＱＡＱＩＱＱＥＫＮＥＹＥＬＱＫＬＤＫＷＡＳＬＷＥＷＦ−ＮＨ_２である。

無傷ＰＥＧ修飾Ｔ１２４９より得たＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを図２Ａに示す。測定した分子量は２６７５８Ｄａであった。非修飾ペプチドの存在に注意する。その起源は現在未知であるが、しかしながら恐らく質量分析計自体での測定によって発生しうる。画分ＰＥＧ−３４（図１）から得たＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを図２Ｂに示す。測定した分子量は、２３０８３Ｄａであった。分子量はもちろんのこと、マススペクトルの外観も、このＨＰＬＣ画分ＰＥＧ−３４をＰＥＧ修飾ペプチドを含有するものとして同定している。このＨＰＬＣ画分中のＰＥＧの存在は、ナノスプレーＥＳＩ質量分析法によっても示すことができる（データは示さず）。

自動Ｎ末端配列決定（エドマン）による結果を図３に示す。観測された主要な配列は、Ｎ末端エンドＬｙｓ−ＣペプチドｘＱＥＷＥＱＫであった。第一のアミノ酸残基を除いて、他のアミノ酸はすべて実質的な収量で回収された。本質的に、第一のアミノ酸位置でトリプトファンは回収できなかった（図３、サイクル３）。ＨＰＬＣＵＶトレース、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルはもちろんのこと、Ｎ末端配列決定からの結果は、Ｎ末端トリプトファンを主要なＰＥＧ修飾部位として同定している。

上記の結果は、ポリエチレングリコールアルデヒドとＴ１２４９のＮ末端トリプトファンとの間の結合の存在と一致する。トリプトファン側鎖への直接の結合は完全に排除できないが、Ｎ末端配列決定からの結果は、Ｎ末端アミノ基の「封鎖」ＰＥＧ部分の存在に矛盾するように思われる。

ｍＰＥＧ_１０ｋ−プロピオンアルデヒドによるＴ１２４９のＰＥＧ化
以下の構造を有する、ＰＥＧ１０kDaのプロピオンアルデヒドを使用した。
ＣＨ_３−Ｏ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_２２７−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨＯ
ｍＰＥＧ１０ｋ−プロピオンアルデヒド２００mgを、緩衝液（５０mM リン酸カリウム、ｐＨ６．５）１．０ml中のＴ１２４９（純度９３．７％）２０mgに、Ｔ１２４９１モルあたり試薬５モルのモル比で添加した。Ｔ１２４９ポリペプチドは、α−アミノ末端で脱アシル化したが、カルボキシル末端で−ＮＨ_２により保護した。

反応混合物に１０％（体積／体積）の０．５Ｍナトリウムシアノボロヒドリド水溶液を添加し、室温にて４時間攪拌した。ＰＥＧ化Ｔ１２４９は、イオン交換クロマトグラフィー（ＱＡ）を使用して反応混合物から精製した。ＰＥＧ化Ｔ１２４９の構造は以下：
ＣＨ_３−Ｏ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｎ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｔ１２４９（ＩＩＩ）
のとおりである。
２０mM Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５中の６５mM〜１ＭＮａＣｌの上昇する塩濃度による直線勾配を使用して、ＰＥＧ化Ｔ１２４９および非修飾Ｔ１２４９を分離した。次にモノＰＥＧ化Ｔ１２４９および未反応遊離Ｔ１２４９のパーセンテージを逆相ＨＰＬＣによって得て、３１．７％と決定した。

ｃＭＡＧＩ／ＭＡＧＩ抗ウィルスアッセイ
これらのアッセイは、インジケータ細胞株ＭＡＧＩ（ガラクトシダーゼインジケータの多核活性化）またはＣＣＲ５発現誘導体ｃＭＡＧＩを利用した、感染性ウィルス力価の低下について評価した。ＭＡＧＩ細胞株は、アンホトロピック・レトロウィルス・ベクターによってＣＤ４およびＨＩＶ−１ＬＴＲ駆動ｂ−ｇａｌレポーターの遺伝子を導入することによって、親ＨｅＬａ細胞から得た（Kimpton J, Emerman M, J Virol 66: 2232-9, 1992）。ｃＭＡＧＩ細胞株は、アンホトロピック・レトロウィルス・ベクター、ＰＡ３１７を用いたＣＣＲ５遺伝子の導入によって、ＭＡＧＩ細胞株から得た（Chackerian B, Long EM, Luciw PA, Overbaugh J, J Virol 71: 3932-9, 1997）。ｃＭＡＧＩ細胞株は、初代ＮＳＩ（Ｒ５）アイソレートおよび実験室適合Ｘ４ウィルスの複製を助けるが、これに対してＭＡＧＩ細胞は、Ｘ４ウィルスのみの複製を助ける。どちらの細胞株も、ＨＩＶ−ＬＴＲによって駆動されるｂ−ガラクトシダーゼ・レポーター遺伝子の発現をトランス活性化するために、ＨＩＶ−１ｔａｔの能力を利用する。ｂ−ｇａｌリポーターは、核に局在するように修飾されており、Ｘ−ｇａｌ基質によって、感染の２、３日以内の強力な核染色として検出できる。それゆえ染色核の数は、染色前に１回の感染のみがある場合、チャレンジ接種での感染性ビリオンの数と等しいとして解釈できる。

感染および細胞−細胞融合のインヒビター、例えばＴ１２４９（Wild C, Greenwell T, Matthews T, AIDS Res Hum Retrovirus 9: 1051-3, 1993）を、１回の感染を確実に示す計測値を可能にするために、感染２４時間後に添加した。感染細胞は、ＣＣＤ撮影機を用いて数え、初代および実験室適合アイソレートの両方が、ウィルス投入と撮影機によって描出された感染細胞数との直線関係を示した。ＭＡＧＩおよびｃＭＡＧＩアッセイにおいて、感染力価の５０％低下（Ｖ_ｎ／Ｖ_０＝０．５）は重大であり、抗ウィルス活性を評価するための一次カットオフ値を提供する。感染力価の９０％低下（Ｖ_ｎ／Ｖ_０）を、抗ウィルス活性の評価での追加のカットオフ値として使用する。

各試験化合物の希釈物は、４８ウェルマイクロタイタープレートの約１５００〜２０００感染細胞／ウェルを与えるように調整されたウィルス接種に対して２回試験した。試験化合物をｃＭＡＧＩまたはＭＡＧＩ細胞に添加し、ウィルス接種が続き、２４時間後に感染および細胞−細胞融合のインヒビター（Wild C, Greenwell T, Matthews T, AIDS Res Hum Retrovirus 9: 1051-3, 1993）を添加して、第２回の感染および細胞−細胞ウィルス蔓延を防止した。細胞を更に２日間培養し、固定して、Ｘ−ｇａｌ基質によって染色し、感染細胞を検知した。各対照および試験化合物希釈物の感染細胞の数は、ＣＣＤ撮影機によって決定した。ＩＣ_５０は、感染性ウィルス力価の５０％低下を生じる試験化合物の希釈度として定義される。ＩＣ_９０は、感染力価の９０％低下を生じる希釈度として定義される。

ＰＥＧ化Ｔ１２４９のＩＣ_５０／ＩＣ_９０
ｍＰＥＧ_２０ｋ−ブタノアルデヒドによってＰＥＧ化したＴ１２４９およびＴ１２４９（実施例４）のＩＣ_５０およびＩＣ_９０の結果は、以下、「ｍＰＥＧ_２０ｋ−ＣＭＡＢ−Ｔ１２４９」として、下の表５に示す。ＩＣ_５０およびＩＣ_９０値は、実施例８に従って決定した。

親Ｔ１２４９分子と比べてｍＰＥＧ_２０ｋ−ＣＭＡＢ−Ｔ１２４９では、インビトロ抗ウィルス活性の低下（バッチ１では、ＩＣ_５０、１３．７倍およびＩＣ_９０、９倍）が見られた。しかしながらインビトロ活性のこの損失は、実施例１２に例示する結果によって証明されるように、インビボ生物活性を予測するものではない（図６を参照）。

ｍＰＥＧ_２０ｋ−プロピオンアルデヒドによってＰＥＧ化したＴ１２４９の薬物動態
研究設計
オスのウィスターラット９匹（デラウェア州ウィルミントンのCharles River Laboratories）（ｎ＝３／時点）は、ｍＰＥＧ_２０ｋ−プロピオンアルデヒドによってＰＥＧ化したＴ１２４９（実施例４）の１回皮下投与を受けた。

ｍＰＥＧ_２０ｋ−ＣＭＡＢ−Ｔ１２４９を水中で懸濁させ、ｐＨ６．８にするためにＮａＯＨによって滴定した。次にｍＰＥＧ_２０ｋ−ＣＭＡＢ−Ｔ１２４９懸濁液を炭酸ナトリウム緩衝液の最小量に溶解させ、ＰＢＳ緩衝液でｐＨ７．３〜７．４まで希釈した。利用したＰＥＧ−Ｔ１２４９の量は、最終調合物１mlあたりｍＰＥＧ_２０ｋ−ＣＭＡＢ−Ｔ１２４９１５０mgの濃度を与えるのに十分であった。ラットは、活性成分８mg／体重１kgで投薬された。

用量投与の後、後眼窩腔から血液約１mlを各時点で収集した。時点は、用量投与の０．５、１、３、６、８、１６、２４、３２、４８、７２、および９６時間後であった。すべての血液サンプルは、３０分まで室温に維持し、冷遠心分離によって血清を分離した。

生分析方法
すべての血液サンプルは、０．０５Ｍ酢酸アンモニウムおよびアセトニトリルからなる直線勾配を使用して、逆相ＨＰＬＣＣ１８カラムで分離した。吸収は、２８０nmにて監視した。濃度は、較正基準としてのｍＰＥＧ_２０ｋ−ＣＭＡＢ−Ｔ１２４９混入血清抽出物を用いて、プロット（曲線ｖ．［ｍＰＥＧ_２０ｋ−ＣＭＡＢ−Ｔ１２４９］の下の面積）から出した。

報告された薬物動態パラメータは、ｍＰＥＧ_２０ｋ−ＣＭＡＢ−Ｔ１２４９、その代謝産物、および２つの組合せのプールされた血清濃度プロフィールから、市販の動力学分析ソフトウェアパッケージであるWin Nonlin, version 3.3（カリフォルニア州マウンテンビューのPharsight Corporation）による、非コンパートメント分析を用いて誘導した。

結果
図４は、１回皮下用量投与後のラットにおける、ｍＰＥＧ_２０ｋ−ＣＭＡＢ−Ｔ１２４９の濃度−時間プロフィールを示す。０．５時間の時点では、ｍＰＥＧ_２０ｋ−ＣＭＡＢ−Ｔ１２４９または代謝産物のレベルは検知されず、注射部位からの遅い吸収プロセスを示す。代謝産物の場合、第一の検知可能濃度は投薬６時間後に見られ、代謝産物形成の遅い経過を表している。ｍＰＥＧ_２０ｋ−ＣＭＡＢ−Ｔ１２４９およびその代謝産物の最低血清濃度は、投薬４８時間および７２時間後にそれぞれ検知された。

全身性ＣＩ／ＦおよびＶｄ／Ｆ、ＡＵＣ（０〜４８時間または０〜７２時間）、Ｃ_ｍａｘ、Ｔ_ｍａｘ、および半減期を下の表６で報告する。

Ｔ１２４９の薬物動態
研究設計
各処置群は、性別ごとにスプラーグ−ドーリー・ラット９匹（デラウェア州ウィルミントンのCharles River Laboratories）からなっていた。群の各メンバーは、Ｔ１２４９の１回の皮下または静脈内用量を受けた（実施例９／表５で引用されたバッチ２）。ラットには、活性成分１．２または１５mg／体重１kgのどちらかを投薬した。

血液サンプルは、１２時間の期間に渡って、群に付き各性別ごとに３匹のラットから、各時点において試験動物から回収した。時点は、用量投与の０．５、１、２、４、６、８、１０、および１２時間後であった。

生化学方法
血液サンプルは、Ｔ１２４９ＰｃＡｂＥＣＬＩＡアッセイを使用して分析した。Ｔ１２４９ＰｃＡｂＥＣＬＩＡは、Ｔ１２４９に特異性であるウサギＰｃＡｂの２つの異なる調製物を利用する、非競合性の、２部位イムノアッセイである。このアッセイでは、Ｔ１２４９の決定は、ビオチン標識抗体（調製物Ａ）およびルテニウム標識抗体（調製物Ｂ）も含有する管内で、希釈した試験サンプルを最初にインキュベートすることによって実施する。次のステップでは、形成された抗体−ペプチド−抗体免疫複合体（サンドイッチ）を捕捉するために、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズを管に加える。次に混合物を分析器内のフローセルからポンプで汲み上げて、その後、フローセルに隣接した磁石に電流を印加する。検知用抗体と結合したルテニウム金属イオンおよびアッセイ緩衝液中に過剰に存在するトリプロピルアミンイオンの間の循環酸化−還元反応によって、光が生成する。この光エネルギーは、測定された終点である。Ｔ１２４９の感知可能な量を含有するサンプルは、Ｔ１２４９をわずかに含むか、含まないサンプルに比べて、より高い信号を呈する。

結果
図５は、１回の皮下または静脈内用量投与後のラットにおけるＴ１２４９の濃度−時間プロフィールを示す。

Ｔ_ｍａｘ、半減期、ＡＵＣ（０〜１２時間および０〜∞時間）、およびＣ_ｍａｘを下の表７で報告する。

ｍＰＥＧ_２０ｋ−ＣＭＡＢ−Ｔ１２４９（表６）およびＴ１２４９による１５mg／kgの皮下投薬（表７）の薬物動態データを検討すると、ｍＰＥＧ_２０ｋ−ＣＭＡＢ−Ｔ１２４９は、末端半減期において４．５倍の上昇を示す。より高いＴ_ｍａｘは、Ｔ１２４９と比較して、より遅いｍＰＥＧ_２０ｋ−ＣＭＡＢ−Ｔ１２４９のクリアランスを反映しているが、同様のＣ_ｍａｘを有する。加えて、表７によるデータを用量の差について正規化すると（実施例１０と同様に、８mg／kgに正規化された１５mg／kg）、ｍＰＥＧ_２０ｋ−ＣＭＡＢ−Ｔ１２４９では、ＡＵＣにおいてＴ１２４９に対して５倍の上昇が観測された（Ｔ１２４９では５７．１μg時／ml（正規化）対ｍＰＥＧ_２０ｋ−ＣＭＡＢ−Ｔ１２４９では２７９μg時／ml）。

マウスのＨＩＶ−１ウィルス負荷に対するＴ１２４９およびｍＰＥＧ_２０ｋ−ＣＭＡＢ−Ｔ１２４９の効果
処置群あたりＨｕＰＢＭＣ−ＳＣＩＤマウス９匹（６匹のマウスを有するＰＥＧ対照を除く）を使用した。第０日に、各処置群は、ＨＩＶアイソレートによる感染後に午後の処置を受けた。その後、各処置群は、第１日から第６日まで１日２回の処置を受けた（午前および午後）。マウスは、第７日に収穫した。投薬の詳細は、表８を参照。Ｔ１２４９分析の血漿サンプルは、最後の用量投与の約１４時間後に回収した。

血漿中のＨＩＶ−１は、リアルタイム定量ＰＣＲによって決定した。血漿を、Ｔ１２４９化合物定量のために収穫した。次に凍結血漿サンプルは、化合物分析を受けた。

図６は、ＳＣＩＤマウスにおけるＴ１２４９およびｍＰＥＧ_２０ｋ−ＣＭＡＢ−Ｔ１２４９投薬のＨＩＶ−１ウィルス負荷に対する効果を示す。

Ｔ１２４９およびｍＰＥＧ_２０ｋ−ＣＭＡＢ−Ｔ１２４９は、インビボで同様に活性である。結果は、試験した化合物の血漿濃度に対して測定されたように、インビボウィルス抑制活性の識別できる相違を示さなかった。

上記の結果は、本発明の好都合な特性、同じ血漿濃度におけるｍＰＥＧ_２０ｋ−ＣＭＡＢ−Ｔ１２４９およびＴ１２４９の同等のインビボ生物活性（実施例１２）、および実施例１０および１１の比較にによって証明される、ｍＰＥＧ_２０ｋ−ＣＭＡＢ−Ｔ１２４９のはるかに優れた薬物動態プロフィールを示す。

本発明を説明したが、同じ方法が多くの方法で変更できることは明らかである。このような変更は、本発明の精神および範囲からの逸脱とは見なされず、このような改変すべては、上記の請求項の範囲内に含まれるものとする。

ＰＥＧ修飾および非修飾Ｔ１２４９の酵素消化物の比較を示す。エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃによる消化およびそれに続く逆相ＨＰＬＣによる分離が示されている。収集したＨＰＬＣ画分ＰＥＧ−３４（図１）のマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）マススペクトルを示す。スペクトルは、マトリックスとしてトランス−３−インドールアクリル酸を用いて線形モードで得た。収集したＨＰＬＣ画分ＰＥＧ−３４（図１）のＮ末端（エドマン）配列決定を示す。１回皮下用量投与後のラットにおける、ｍＰＥＧ_２０ｋ−ＣＭＡＢ−Ｔ１２４９の濃度−時間プロフィールを示す。１回皮下用量投与後のラットにおける、Ｔ１２４９の濃度−時間プロフィールを示す。ＳＣＩＤマウスにおけるＨＩＶ−１ウィルス負荷に対するＴ１２４９およびｍＰＥＧ_２０ｋ−ＣＭＡＢ−Ｔ１２４９の効果を示す。

Claims

式（Ｉ）

（式中
Ｒ_１は、キャッピング基であり、
ｍは、１〜１７であり、
ｎは、１０〜１，０００であり、
ｐは、１〜３であり、そして
ＮＨＴ１２４９は、その末端α−アミノ基を通じて共有結合したＴ１２４９ポリペプチドである）の化合物。
Ｒ_１が、ハロゲン、エポキシド、マレイミド、オルトピリジルジスルフィド、トシラート、イソシアナート、ヒドラジンヒドラート、シアヌル酸ハライド、Ｎ−スクシンイミジルオキシ、スルホ−Ｎ−スクシンイミジルオキシ、１−ベンゾトリアゾリルオキシ、１−イミダゾリルオキシ、ｐ−ニトロフェニルオキシ、および

からなる群より選択される、請求項１記載の化合物。
ｐが、３である、請求項１記載の化合物。
ｐが、３であり、Ｒ_１が、メトキシであり、ｍが、１であり、そしてｎが、１００〜７５０である、請求項１記載の化合物。
式：ＣＨ_３−Ｏ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｎ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨＴ１２４９（ＩＩＩ）（式中、ｎは１０〜１，０００であり、そしてＮＨＴ１２４９は、その末端α−アミノ基を通じて共有結合されたＴ１２４９ポリペプチドである）の化合物。
ｎが、約４５０である、請求項５記載の化合物。
医薬的に許容される賦形剤と混合して、式：

（式中
Ｒ_１は、キャッピング基であり、
ｍは、１〜１７であり、
ｎは、１０〜１，０００であり、
ｐは、１〜３であり、そして
ＮＨＴ１２４９は、その末端α−アミノ基を通じて共有結合したＴ１２４９ポリペプチドである）の化合物を含む、医薬組成物。
ｐが、３であり、Ｒ_１が、メトキシであり、ｍが、１であり、そしてｎが、１００〜７５０である、請求項７記載の医薬組成物。
凍結乾燥粉末の形態である、請求項７記載の医薬組成物。
注射用溶液または懸濁液の形態である、請求項７記載の医薬組成物。
ＨＩＶ感染抑制用の医薬の調製のための、医薬的に許容される賦形剤と混合して、式Ｉ：

（式中
Ｒ_１は、キャッピング基であり、
ｍは、１〜１７であり、
ｎは、１０〜１，０００であり、
ｐは、１〜３であり、そして
ＮＨＴ１２４９は、その末端α−アミノ基を通じて共有結合したＴ１２４９ポリペプチドである）の化合物を含む医薬組成物の使用。
ｐが、３であり、Ｒ_１が、メトキシであり、ｍが、１であり、そしてｎが、１００〜７５０である、請求項１１記載の使用。
医薬組成物が、腹腔内、筋肉内、皮下内、静脈内に、または持続注入によって注射される、請求項１１記載の使用。
医薬組成物が、投与あたり約５０mg〜約３００mgの量で投与される、請求項１１記載の使用。
ＨＩＶ感染抑制用の医薬の調製のための、医薬的に許容される賦形剤と混合して、式ＩＩＩ：ＣＨ_３−Ｏ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｎ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨＴ１２４９（ＩＩＩ）（式中、ｎは１０〜１，０００であり、そしてＮＨＴ１２４９はその末端α−アミノ基に共有結合したＴ１２４９ポリペプチドである）の化合物を含む医薬組成物の使用。
医薬組成物が、単回用量で週あたり約３００mg〜約１５００mgの量で投与される、請求項１５記載の使用。