KR20050027255A - 페길화 ｔ1249 폴리펩타이드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 페길화 T1249 폴리펩타이드 화합물을 제공한다. 또한, 페길화 T1249 폴리펩타이드 화합물을 함유하는 약학 조성물, 및 이의 제조방법을 제공한다. 또한, 화학식 I의 화합물을 약학적으로 허용가능한 부형제와 혼합된 형태로 포함하는 약학 조성물의 HIV 감염 억제용 약제를 제조하기 위한 용도를 제공한다.

Description

페길화 Ｔ1249 폴리펩타이드{PEGYLATED T1249 POLYPEPTIDE}
본 발명은 페길화(pegylated) T1249 폴리펩타이드 화합물, 및 이 화합물을 약학 조성물 및 치료를 위한 치료학적 방법에 사용하고 제조하는 방법에 관한 것이다.
몇몇의 바이러스, 특히 HIV는 숙주 세포에 도입되거나 재생산되기 위하여 융합이라 일컫는 복합 공정을 수행해야 한다. 융합 동안 바이러스의 외부 막은 숙주 세포의 막과 융합된다. HIV의 경우, 재생산 동안 HIV 바이러스의 외부 막은 CD4+ T 세포 막과 융합한다.
T1249는 바이러스/막 융합을 억제하는 신규한 부류의 항바이러스제의 구성원이다. HIV의 경우, 두 가지의 유익한 효과: HIV의 재생산이 차단되고, 결과적으로 CD4+ T 세포의 파멸이 일어나지 않는다는 효과를 제공한다.
현재 승인된 항-HIV 약물에 대한 내바이러스성은 오늘날 HIV의 임상적인 취급에서 중요한 논쟁이 되고 있다. 현재 승인되고 있는 약물치료와 함께 항레트로바이러스성 치료를 병행하기 시작한 많은 환자들은 치료 기간 동안 하나 이상의 이들 시약에 대한 내성을 발달시킬 것이다. 그러나, T1249는 현재 승인된 임의의 항레트로바이러스성 부류에 대해 내성으로서 작용하지 않는다고 보고되었다(아리조나 스코츠다일에서 2001년 6월 4일부터 8일에 개최된 약물 내성 및 처리 전략에 관한 제 5 회 국제 워크삽에서 보고된 데이타).
임상적인 시도에서 T1249 투약 범위의 분석은, 이전에 HIV 약물의 모든 승인된 부류에 대한 돌연변이를 포함하는 항레트로바이러스성 치료 경험이 없는 환자의 T1249의 일일 투여량은 단지 치료 경험이 있는 환자 중 바이러스성 부하 감소와 관련하여 변화가능하다는 것을 제안한다. 추가의 실험은 T1249의 생체외 활성이 전사효소 억제제 및 단백질 가수분해효소 억제제를 전환하는 내성과 관련된 돌연변이에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 보여준다.
많은 폴레펩타이드 치료제와 유사한 T1249는 일반적으로 주사로 투여된다. 현재 치료학적 프로토콜은 종종 1회 이상의 매일 주사를 포함한다.
따라서, T1249 폴리펩타이드 및 개선된 성능 및 약물 동력학적 특성을 갖는 약학 조성물을 제공하는 것에 잇점이 있다. 특히 T1249의 보다 적은 치료학적 투여량, 적은 빈도의 투여 횟수 및/또는 증가된 활성 기간을 위해 제공하는 것에 잇점이 있다.
본 발명의 이들 및 기타 목적을 하기에 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 I의 화합물을 제공한다:
상기 식에서,
R1은 캡핑(capping) 기이고;
m은 1 내지 17이고;
n은 10 내지 1,000이고;
p는 1 내지 3이고;
NHT1249는 이의 말단 α-아미노 기를 통하여 공유결합된 T1249 폴리펩타이드이다.
본 발명의 화합물의 하나의 실시태양에서 R1은 메톡시이고, m은 1이고, n은 100 내지 750이고, p는 3이다.
또한, 화학식 1의 화합물(여기에서, R1, m, n, p 및 NHT1249는 상기에서 정의한 바와 같다)을 약학적으로 허용가능한 부형제와 혼합된 형태로 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물의 하나의 실시태양에서 R1은 메톡시이고, m은 1이고, n은 100 내지 750이고, p는 3이다.
본 발명은 또한 화학식 1의 화합물(여기에서, R1, m, n, p 및 NHT1249는 상기에서 정의한 바와 같다)을 약학적으로 허용가능한 부형제와 혼합된 형태로 포함하는 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는 HIV 감염 억제 방법을 제공한다. 본 발명이 "화합물을 포함하는 HIV 감염 억제 방법"에 관한 것일 경우, 이는 HIV 억제용 약제를 제조하기 위한 화합물의 용도"를 의미하는 것이다.
HIV 감염 억제 방법의 하나의 실시태양에서 R1은 메톡시이고, m은 1이고, n은 100 내지 750이고, p는 3이다.
또한, T1249 폴리펩타이드와 하기 화학식 II의 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드를 반응시킴으로써 화학식 I의 화합물을 제조하는 것을 포함하는 페길화 T1249 폴리펩타이드의 제조방법을 제공하며, 이 때 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드 분자는 T1249 폴리펩타이드의 N-말단 아미노 기와 결합된다:
상기 식에서,
R1, m, n 및 p는 상기에서 정의한 바와 같다.
본 발명이 "제조방법"에 관한 것일 경우, 이는 "제조공정"을 의미하는 것이다.
도 1은 PEG-변형된 T1249 및 비변형된 T1249의 효소적 절단을 비교하여 나타낸 것이다. 단백질 내부 가수분해효소 Lys-C를 사용한 절단 및 역상 HPLC를 사용한 연속 분리를 나타낸다.
도 2는 모은 HPLC 분획 PEG-34(도 1)의 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행시간형(matrix assisted laser desorption ionization time of flight, MALDI-TOF) 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다. 스펙트럼은 매트릭스로서 트란스-3-인돌아크릴산을 갖는 선형 모드에서 수득되었다.
도 3은 모은 HPLC 분획 PEG-34(도 1)의 N-말단(에드만, Edman) 서열 분석을 나타낸 것이다.
도 4는 단일 피하 투여량 투여 후 쥐에서 mPEG20K-CMAB-T1249의 농도-시간 프로파일을 나타낸 것이다.
도 5는 단일 피하 투여량 투여 후 쥐에서 T1249의 농도-시간 프로파일을 나타낸 것이다.
도 6은 SCID 마우스에서 HIV-1 바이러스성 부하 상에 투약되는 T1249 및 mmPEG20K-CMAB-T1249의 효과를 나타낸 것이다.
상기한 바와 같이, T1249는 "융합 억제제" 폴리펩타이드이다. T1249는 39개의 아미노산으로 구성된다. T1249의 폴리펩타이드 서열은 하기 서열번호 1과 같다:
N-말단(또는 아미노 말단) 아미노산은 트립토판(W)이다. C-말단(또는 카복시 말단) 아미노산은 페닐알라닌(F)이다.
본원에 참조로서 그대로 인용된 미국 특허 제 6,348,568 호의 표 1(서열번호 1071)에 개시된 바와 같이, T1249 폴리펩타이드 서열은 이의 아미노 및 카복시 말단의 하나 또는 모두에서 차단/유도될 수 있다. 미국 특허 제 6,348,568 호에 개시된 바와 같이, 트립토판 아미노 말단은 아실 기로 차단/유도되고, 페닐알라닌 카복시 말단은 아미노 기로 차단/유도된다(결과적으로, -COOH→-CONH2로의 전환이 이루어진다).
본원에서 사용된 "T1249"는 선택적으로 페닐알라닌 C-말단에서 아미노 기로 차단된 서열번호 1을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 바꾸어 말하면, "T1249"가 인용될 경우, 페닐알라닌 C-말단은 -COOH 또는 -CONH2이다.
본 발명은 하기 화학식 I의 페길화 T1249 화합물을 제공한다:
화학식 I
상기 식에서,
R1은 캡핑 기이고;
m은 1 내지 17이고;
n은 10 내지 1,000이고;
p는 1 내지 3이고;
NHT1249는 이의 말단 α-아미노 기를 통하여 공유결합된 T1249 폴리펩타이드이다.
본원에서 사용된 R1 "캡핑 기"는 임의의 적합한 화학적 기이며, 바람직하게는 일반적으로 비반응성이거나 일반적으로 기타 화학적 잔기와 반응성이다. 상기 화합물에서 폴리에틸렌 글리콜은 T1249의 α-아미노 기와 공유결합된다. R1 캡핑 기는 이작용성, 예를 들어 중요한 제 2 화학적 잔기에 공유 부착을 허용하거나 방지하도록 선택된다.
캡핑 기가 일반적으로 기타 화학적 잔기와 비반응성인 경우에는 R1이 상대적으로 비활성이며, 이에 따라 또다른 화학적 잔기와 공유결합되지 않는다. 적합한 일반적인 비반응성 R1 캡핑 기로는 수소, 하이드록실, 저급 알킬, 저급 알콕시, 저급 사이클로알킬, 저급 알켄일, 저급 사이클로알켄일, 아릴 및 헤테로아릴이 포함된다.
본원에서 사용된 "저급 알킬"이란 용어는 탄소수 1 내지 7, 바람직하게는 1 내지 4의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소프로필, n-부틸, s-부틸, t-부틸, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸 등을 의미한다. "저급 알킬"은 할로겐, 저급 알킬, 저급 알콕시, 저급 사이클로알킬, 저급 알켄일, 저급 사이클로알켄일, 아릴 및 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된다.
"저급 알콜시"란 용어는 상기에서 정의된 바와 같이 산소 원자를 통하여 결합된 저급 알킬 기를 의미하는 것으로, 이의 예로는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 아이소프로폭시, n-부톡시, s-부톡시, t-부톡시, n-펜톡시 등이 있다. "저급 알콕시"는 할로겐, 저급 알킬, 저급 알콕시, 저급 사이클로알킬, 저급 알켄일, 저급 사이클로알켄일, 아릴 및 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된다.
"저급 사이클로알킬"이란 용어는 탄소수 3 내지 7, 바람직하게는 4 내지 6의 사이클로알킬 기를 의미하는 것으로, 즉 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실 또는 사이클로헵틸이 있다. "저급 사이클로알킬"은 할로겐, 저급 알킬, 저급 알콕시, 저급 사이클로알킬, 저급 알켄일, 저급 사이클로알켄일, 아릴 및 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된다.
본원에서 사용된 "저급 알켄일"이란 용어는 탄소수 2 내지 7, 바람직하게는 2 내지 5의 직쇄 또는 분지쇄 알켄일 기를 의미하며, 이의 예로는 에텐일, 부텐일, 펜텐일, 헥센일 등이 있다. "저급 알켄일"은 할로겐, 저급 알킬, 저급 알콕시, 저급 사이클로알킬, 저급 알켄일, 저급 사이클로알켄일, 아릴 및 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된다.
"저급 사이클로알켄일"이란 용어는 탄소수 4 내지 7의 사이클로알켄일 기를 의미하며, 이의 예로는 사이클로부텐일, 사이클로펜텐일, 사이클로헥센일 등이 있다. "저급 사이클로알켄일"은 할로겐, 저급 알킬, 저급 알콕시, 저급 사이클로알킬, 저급 알켄일, 저급 사이클로알켄일, 아릴 및 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된다.
"아릴"이란 용어는 비치환되거나 선택적으로 할로겐, 저급 알킬, 저급 알콕시, 트라이플루오로메틸, 하이드록실, 카복실산, 카복실 에스터, 니트로, 아미노 또는 페닐, 특히 할로겐, 저급 알킬, 저급 알콕시, 트라이플루오로메틸, 하이드록실, 니트로, 아미노 및 페닐로 일- 또는 다-치환된 페닐 또는 나프틸 기를 의미한다.
"헤테로아릴"이란 용어는 N, S 및 O로부터 선택된 하나 이상의 헤테로 원자를 함유하고 상기 "아릴"에 대해 정의된 바와 동일한 방식으로 벤즈-융합되고/거나 치환된 5- 또는 6-원 헤테로방향족 기를 의미한다.
바람직한 일반적인 비반응성 R1 캡핑 기로는 메톡시, 하이드록시 또는 벤질옥시가 포함된다. 특히 바람직한 R1 캡핑 기는 메톡시이다. R1이 메톡시일 경우, 페길화 폴리펩타이드 화합물은 때때로 본원에서 언급되며, 일부에서는 "mPEG" 화합물로 언급되는데 이 때 "m"은 메톡시이다.
R1 캡핑 기가 일반적으로 기타 화학적 잔기와 반응성일 경우, R1은 몇몇 작용성 기, 예컨대 펩타이드 및/또는 단백질에서 아민 및/또는 설프히드릴과 반응할 수 있는 작용성 기이다. 이 경우 R1은 반응을 위하여 강한 촉매 또는 고도로 비실행적인 반응 조건을 요구하는 이들 기들과는 대조적으로 기타 분자 상의 친전자성 또는 친핵성 기와 쉽게 반응할 수 있다. R1이 상대적으로 반응성일 경우, 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드는 또다른 화학적 잔기와 공유결합될 수 있다.
적합한 일반적인 반응성 R1 캡핑 기의 예로는 할로겐, 에폭사이드, 말레이미드, 오르토피리딜 다이설파이드, 토실레이트, 아이소시아네이트, 하이드라진 하이드레이트, 사아누르 할라이드, N-숙신이미딜옥시, 설포-N-숙신이미딜옥시, 1-벤조트라이아졸일옥시, 1-이미다졸일옥시, p-니트로페닐옥시 및 를 들 수 있다.
"할로겐"이란 용어는 불소, 염소, 붕소 또는 요오드를 의미한다. 바람직한 일반적인 반응성 R1 캐핑 기는 이다. R1 캡핑 기가 존재할 경우, 본 발명의 화합물에서 제 1의 m, n 및/또는 p는 화학식에서 제 2의 m, n 및/또는 p와 동일하거나 상이할 수 있다는 것이 인식될 것이다. 그러나, 모든 m이 동일한 값을 갖고, 모든 n이 동일한 값을 갖고 모든 p가 동일한 값을 갖는 것이 바람직하다.
본 발명에서 m은 1 내지 17이다. 바람직한 실시태양에서 m은 1 내지 14이다. 보다 바람직하게 m은 1 내지 7이고, 보다 더욱 바람직하게 m은 1 내지 4이다. 가장 바람직하게 m은 1이다.
본 발명에서 n은 10 내지 1,000이다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서 n은 20 내지 1,000이다. 바람직하게 n은 50 내지 1,000이고, 보다 더욱 바람직하게 n은 75 내지 1,000이다. 가장 바람직하게 n은 100 내지 750이다.
본 발명에서 p는 1 내지 3이다. 바람직하게 p는 3이다.
바람직한 실시태양에서 p는 3이고, R1은 메톡시이고, m은 1이고 n은 100 내지 750이거나; p는 2이고, R1은 메톡시이고, m은 1이고, n은 100 내지 750이거나; 또는 p는 1이고, R1은 메톡시이고, m은 1이고, n은 100 내지 750이다.
본 발명은 화학식 I(여기에서, R1은 메톡시이고, m은 1이고, n은 100 내지 750이고, p는 3이고, NHT1249는 이의 말단 α-아미노 기를 통하여 공유결합된 T1249 폴리펩타이드이다)의 실시태양을 제공한다.
상기에서 지적한 바와 같이, 본 발명의 페길화 T1249 화합물은 특정한 구조를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 유도체에 T1249의 α-아미노 기를 공유적으로 연결한다. 이들 페길화 화합물은 임의의 요구되는 방식으로 제조될 수 있으나, 일반적으로 이들은 T1249를 분리 제조된 폴리에틸렌 글리콜 유도체와 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, T1249 폴리펩타이드는 모든 리신 잔기를 차단하고 차단된 T1249를 폴리에틸렌 글리콜 유도체와 반응시킴으로써 제조될 수 있다. T1249 폴리펩타이드의 차단된 리신 잔기를 탈차단하여 말단 페길화된 T1249를 수득할 수 있다.
T1249 폴리펩타이드는 임의의 적합한 방식으로 제조될 수 있다. 예를 들어 이들 화합물은 지침서 또는 자동화 과정을 사용함으로써 Boc-아미노산을 사용하는 고상 방법을 포함하는 표준적인 메리필드(Merrifield) 고상 합성 기술(문헌[Chem. Soc., 85, 2149, 1963]), Fmoc-아미노산을 사용하는 고상 방법(문헌[Sheppard, R.C. et al., J. Chem. Soc. Chem, Comm., pp. 165-166(1985)], 어드밴스드 켐테크(Advanced Chemtech., 미국 켄터키주 루이빌 소재)로부터 입수가능한 어드벤스트 켐테크 모델 200, 밀리포어(Milipore, 미국 매세추세츠 베드포드 소재)로부터 입수가능한 밀리포어 9050+ 또는 기타 입수가능한 기구를 사용하여 합성될 수 있다.
T1249는 본 발명의 화합물을 코딩하는 cDNA를 기능성 바이러스성 또는 환형 플라스미드 DNA 벡터에 혼입시킴으로써 제조될 수 있다. 벡터 또는 플라스미드는 선택된 미생물을 감염 또는 형질전환하는데 사용될 수 있다. 벡터-매개 DNA 서열을 발현할 수 있고 성장 배지로부터 목적 펩타이드의 단리를 달성할 수 있는 조건하에서 혈질전환되거나 또는 감염된 미생물을 배양할 수 있다(본원의 참고로서 그대로 인용된 미국 특허 제 5,955,422 호 참조).
T1249는 당분야에 공지된 기술을 사용하는 표준 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 이 과정은 본원에 참조로서 인용된 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.] 또는 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York (1995)]에 개시되었다.
특히 T1249를 제조하는 방법은 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 제 6,258,787 호 및 제 6,348,568 호에 개시되어 있다.
절단 및 탈보호 후, T1249를 임의의 적합한 방식으로 정제할 수 있다. 예를 들어, 이온 교환, 겔 여과 크로마토그래피 및/또는 역상 칼럼/HPLC 시스템을 사용하여 전장 T1249를 이의 단편으로부터 정제할 수 있다. N-말단(예를 들어 아실 기) 및/또는 C-말단(예를 들어 아미노 기)에 부착된 차단/보호 기를 사용하여 T1249 전구체를 먼저 제조할 경우, 이들 기 중 하나 또는 모두는 공지된 기술을 사용하여 제거될 수 있다.
T1249의 아미노산 서열은 표준 아미노산 분석 뿐만 아니라 지침서 및 자동화된 에드만의 각 아미노산 분해 및 결정 분석을 사용하여 확인 및 규정될 수 있다. T1249의 제조를 확인하는데 HPLC 분석 및 질량 분광계를 사용할 수도 있다.
T1249와 반응할 수 있는 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드 화합물은 임의의 요구되는 방식으로 제조될 수도 있다. 그러나, 폴리에틸렌 글리콜은 본원에 참조로서 그대로 인용된 미국 특허 출원번호 제 60/398,196 호("폴리에틸렌 글리콜 알데하이드"라는 발명의 명칭으로 2002년 7월 24일자로 출원됨)에 개시된 방법에 따라 제조하는 것이 바람직하다.
일반적으로, 하기 화학식 II의 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드가 T1249를 페길화하는데 사용된다:
화학식 II
상기 식에서,
R1, m, n 및 p는 상기에서 정의한 바와 같다.
T1249를 페길화하는데 사용되는 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드는 임의의 적합한 방식으로 제조될 수 있다. 하나의 바람직한 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드는 하기 반응식 1과 같은 방법으로 제조된다:
다양한 크기(예를 들어 n 값이 다양함)의 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드를 상기한 일반적인 반응식에 따라 제조할 수 있다.
본 발명의 페길화 T1249 화합물은 임의의 적합한 방식으로 제조될 수 있다. 그러나, 본 발명은 또한 T1249 폴리펩타이드 및 NHT1249를 하기 화학식 II의 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드와 반응시킴으로써 하기 화학식 I의 화합물을 제조하는 것을 포함하는 T1249 폴리펩타이드를 페길화하는 방법을 제공한다:
화학식 II
상기 식에서,
R1, m, n 및 p는 상기에서 정의한 바와 같다.
화학식 I
상기 식에서,
폴리에틸렌 글리콜 알데하이드 분자는 T1249 폴리펩타이드의 N-말단 아미노 기에 결합된다.
페길화 T1249는 1:1 내지 1:100의 몰비로 T1249 및 PEG 시약을 첨가함으로써 제조될 수 있다. T1249는 상기 개시한 바와 같이 유리 α-아미노 기(임의의 아실 기는 제거됨) 및 유리 카복시 기 또는 아미노-보호된 카복시 기를 갖는다. 반응 혼합물을 실온 또는 4℃에서 약 5 내지 24시간동안 pH 5.5 내지 7.4에서 붕산 또는 인산 완충액에 넣는다. PEG 시약 대 펩타이드/단백질에 대한 몰비는 1:1 내지 100:1이다. 펩타이드/단백질의 농도는 1 내지 10mg/ml이다. 완충액의 농도는 통상 10 내지 500mM이다.
페길화 T1249는 페길화 T1249의 반응 혼합물을 취하여 평형 완충액(20mM 트리스, pH 7.5)으로 희석시킴으로써 정제된다. 이어서, 생성 혼합물을 Q-세파로즈 칼럼에 적용한다. 혼합물을 QA 칼럼에 적용한 후, 75M NaCl로 용출된 평형 완충액; 200mM NaCl로 용출된 평형 완충액; 1M NaCl로 용출된 평형 완충액; 및 1M HOAC, 1M NaCl 및 0.5 NaOH으로 재생산된 평형 완충액으로 세척한다.
역상 HPLC를 사용하여 N-말단 일-페길화 산물을 혼합물 중의 기타 부산물로부터 쉽게 분리하고 단리할 수 있다. 예를 들어, 페길화 T-1249의 크로마토그램에서 서로 다른 지체 시간에 몇몇의 피크가 형성될 수 있다. 제 1 피크는 10.7분에서 비반응된 펩타이드를 나타내며, 제 2 피크는 17.6분에서 일-페길화 펩타이드 및 19분에서 이-페길화 펩타이드를 나타낼 수 있다. 각 모은 산물을 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행시간형 질량 스펙트럼으로 확인하였다.
본 발명의 페길화 T1249 폴리펩타이드의 바람직한 실시태양에서 p는 3이고, R1은 메틸이고, m은 1이고, n은 100 내지 750이거나; p는 2이고, R1은 메톡시이고, m은 1이고 n은 100 내지 750이거나; 또는 p는 1이고, R1은 메톡시이고, m은 1이고, n은 100 내지 750이다.
또한, 하기 화학식 III의 페길화 T1249 폴리펩타이드를 제공한다:
상기 식에서,
n은 10 내지 1,000이고;
NHT1249는 이의 말단 α-아미노 기를 통하여 공유결합된 T1249 폴리펩타이드이다.
하나의 실시태양에서 n은 약 225, 예를 들어 227이다. 또다른 실시태양에서 n은 약 450이다.
이러한 페길화 T1249 폴리펩타이드는 임의의 요구되는 방식으로 제조될 수 있으며, 바람직하게는 실시예 7에 개시된 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 화학식 I의 화합물(여기에서, R1, m, n, p 및 NHT1249는 상기에서 정의한 바와 같다)을 약학적으로 허용가능한 부형제와 혼합된 형태로 포함된다.
페길화 T1249 폴리펩타이드 또는 이의 염을 포함하는 본 발명의 약학 조성물은 임의의 요구되는 방식, 예를 들어 통상의 혼합, 캡슐화, 용해, 과립화, 에멀젼화, 트래핑(entrapping) 또는 동결건조 과정으로 조제될 수 있다. 이러한 약학 제제는 치료학적으로 비활성인 무기 또는 무기 부형제 및 담체를 사용하여 제형화될 수 있다. 주사를 위한 적합한 부형제는 물, 알콜, 폴리올, 글리세린, 식물성류, 인지질 및 계면활성제를 포함한다.
약학 제제는 보존제, 용해제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 감미제, 착색제, 풍미제, 삼투압을 변화시키기 위한 염, 완충액, 코팅제 또는 산화방지제를 포함할 수도 있다. 이들은 추가의 활성 성분을 비롯한 기타 치료학적으로 가치있는 물질을 함유할 수도 있다.
주사(복막, 근육, 피하 또는 정맥내 주사, 또는 연속 주입)에 의한 투여에 적합한 제형은 단위 투약 형태로 알맞게 존재할 수 있고 통상의 약학 기술로 제조될 수 있다. 이러한 기술은 페길화 T1249 폴리펩타이드와 약학 담체(들) 또는 부형제(들)의 조합을 초래하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 페길화 T1249 폴리펩타이드와 유체 담체의 조합을 균일하고 친밀하게 초래시킴으로써 제조된다. 주사에 의한 투여에 적합한 제형은 산화방지제, 완충액, 세균 발육 저지제 및 수혈자의 혈액과 등장성 제형이 되도록 하는 용질을 함유하는 수성 및 비수성 멸균 주사용액; 및 현탁제 및 농후제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 제형은 단위 투약 또는 다중 투약 용기, 예를 들어, 밀봉된 앰플 및 유리병 중에 존재할 수 있으며, 사용 직전에 단지 멸균 유체 담체, 예를 들어 주사용 물의 부가를 요구하는 냉동건조(동결건조) 상태로 저장될 수 있다.
바람직한 단위 투약 제형은 상기에서 언급한 바와 같이 매일 투약, 매일 서브(sub) 투약, 매주 투약, 매주 서브 투약, 또는 투여되는 성분의 적합한 분획을 함유하는 것이다.
바람직하게 페길화 T1249 폴리펩티드는 단위 투약 형태이다. 본원에서 사용된 "단위 투약 형태"는 페길화 T1249 폴리펩타이드를 단위 투약하기에 적합한 양이 미리측정되고/거나 미리 포장된 형태 중에 있는 것을 의미한다. 이는 투여를 위한 페길화 T1249 폴리펩타이드의 알맞은 제제를 고려하며 심지어 환자에 의한 자가-투여를 고려할 수도 있다. 단위 투여량은 전달될 페길화 T1249 폴리펩타이드의 양 및 투여 빈도 횟수에 의존하는 것이 자명할 것이다.
페길화 T1249 폴리펩타이드는 투여시기 바로 직전에 약학적으로 적합한 부형제를 사용하여 재액상화하기에 적합한 단위 투여량으로 동결건조된 분말 형태로 제공될 수도 있다.
본 발명의 특정한 약학 조성물은 화학식 I의 화합물(여기에서, R1은 메톡시이고, m은 1이고, n은 100 내지 750이고, p는 3이다)을 약학적으로 허용가능한 부형제와 혼합된 형태로 포함한다.
본 발명의 또다른 약학 조성물은 화학식 II의 화합물(여기에서, n은 10 내지 1,000이고, NHT1249는 이의 말단 α-아미노 기를 통하여 공유 결합된 T1249 폴리펩타이드이다)을 약학적으로 허용가능한 부형제와 혼합된 형태로 포함한다. 하나의 실시태양에서 n은 약 225, 예를 들어 227이다. 또다른 실시태양에서 n은 약 450이다.
본 발명은 또한 화학식 1의 화합물(여기에서, R1, m, n, p 및 NHT1249는 상기에서 정의한 바와 같다)을 약학적으로 허용가능한 부형제와 혼합된 형태로 포함하는 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는 HIV 감염 억제 방법을 제공한다.
페길화 T1249 폴리펩타이드는 일반적으로 (비페길화) T1249 폴리펩타이드가 곧 투여되는 방법으로 투여될 수 있다. 그러나, 개질화는 페길화 T1249 폴리펩타이드의 개선된 약물 동력학적 성질의 잇점을 갖도록 할 수 있다.
HIV 감염 억제 방법에서 약학 조성물은 임의의 방식 및 경로로 투여될 수 있다. 바람직한 방법에서, 페길화 T1249 폴리펩타이드는 주사가능한 용액 또는 현탁액의 형태로 투여된다. 바람직하게 주사가능한 용액 또는 현탁액은 피하 주사 또는 정맥내로 투여된다.
또다른 바람직한 방법에서 페길화 T1249 폴리펩타이드는 경피 전달 장치, 예를 들어 경피용 패치를 통하여 투여된다.
HIV 감염 억제 방법에서 약학 조성물은 임의의 적합한 투약 및 스케줄로 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 요구되는 임의의 형태 및 임의의 경로로 투여될 수 있다. 그러나, 일반적으로 본 발명의 페길화 T1249 폴리펩타이드는 비경구 투여, 예를 들어 주사 용액의 형태로 투여될 수 있다.
치료학적으로 효과적인 양은 당분야의 기술 내에서 결정되며, 본 발명에 따른 페길화 T1249 폴리펩타이드의 치료학적으로 효과적인 양 또는 투여량은 변화될 수 있으며, 각 특정 경우에서 개별적인 요건에 부합할 것이다. 지시될 경우 상한치가 초과될 수도 있지만, 일반적으로, 약 70kg의 체중을 갖는 성인에게 주사에 의해 투여할 경우, 약 50 내지 약 300mg, 바람직하게는 약 50 내지 약 200mg의 매일 투여량이 적절하다.
약학 조성물은 임의의 알맞은 투약 스케줄로 투여될 수 있다. 바람직하게 약학 조성물은 하루에 1회, 하루에 2회, 이틀에 1회, 일주일에 1회 또는 일주일에 2회로 투여된다. 보다 바람직하게 약학 조성물은 일주일에 1회 투여된다.
바람직하게 약학 조성물은 약 300 내지 약 1,500mg의 양으로 일주일에 1회 투여된다. 보다 바람직하게는 약학 조성물은 약 400 내지 약 1,000mg의 양으로 일주일에 1회 투여된다. 보다 바람직하게 약학 조성물은 약 100 내지 약 200mg의 양으로 일주일에 1회 투여된다.
본 발명은 또한 화학식 1의 화합물(여기에서, R1은 메톡시이고, m은 1이고, n은 100 내지 750이고, p는 3이다)을 약학적으로 허용가능한 부형제와 혼합된 형태로 포함하는 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는 HIV 감염 억제 방법을 제공한다.
또한, 화학식 III의 화합물(여기에서, n은 10 내지 1,000이고, NHT1249는 이의 말단 α-아미노 기를 통하여 공유 결합된 T1249 폴리펩타이드이다)을 약학적으로 허용가능한 부형제와 혼합된 형태로 포함하는 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는 HIV 감염 억제 방법은 본 발명의 범위 내에서 예측된다. 하나의 실시태양에서 n은 약 225, 예를 들어 227이다. 또다른 실시태양에서 n은 약 450이다.
하기 실시예들은 본 발명의 화합물, 조성물 및 방법을 추가로 예시하기 위해 제공된다. 이러한 실시예들은 단지 예시를 위한 것일 뿐 어떠한 방법으로든 본 발명의 범위를 한정하지 않는다.
실시예 1: mPEG 10k -부타노알데하이드의 제조
240ml의 톨루엔 중의 분자량 10,000의 mPEG(30.0g, 3mmol)를 2시간 동안 환류시킴으로써 공비적으로 건조하여 120ml의 톨루엔을 제거하였다. 생성 용액을 실온에서 식힌 다음 20ml의 순수 t-부탄올 및 20ml의 톨루엔 중의 칼륨 t-부톡사이드(0.68g, 6mmol)를 PEG 용액에 가하였다. 생성 혼합물을 아르곤 하의 실온에서 2시간동안 교반하였다. T-부틸 브로모아세테이트(1.00ml, 6.75mmol)를 주사기를 통하여 반응물에 가하고 반응물을 아르곤 하의 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 용액을 회전식 증발기로 농축하였다. 잔기를 다이에틸 에테르에 첨가시킴으로써 침전시켰다. 침전된 mPEG10k t-부틸 카복시메틸 에스터 산물을 여과하여 제거하고 진공 건조하였다: 수율: 28g.
mPEG10k t-부틸 카복시메틸 에스터(26.5g)를 350ml의 1N 수산화나트륨에 용해시킨 다음 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 6N 염산을 가하여 혼합물의 pH를 2.5로 조정하고 혼합물을 다이클로로메테인으로 추출하였다. 유기 층을 황산나트륨으로 건조하고 여과하고 농축한 다음 다이에틸 에테르에 침전시켰다. 산물 mPEG10k 카복시메틸 산을 여과하여 모으고 진공 건조하였다: 수율: 24g.
mPEG10k 카복시메틸산(6g, 0.6mmol)을 무수 다이클로로메테인(30ml)에 용해시킨 다음 4-아미노부티르알데하이드 다이에틸아세탈(140ml, 0.9mmol), 1-하이드록시벤조트라이아졸(80mg, 0.6mmol) 및 다이사이클로헥실카보다이이미드(160mg, 0.78mmol)를 가하였다. 혼합물을 아르곤 하의 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 여과, 농축하고 2-프로판올 및 다이에틸 에테르의 혼합물(1:1)로 침전시켰다. 산물 mPEG10k-부타노아세탈을 밤새 진공 건조하였다: 수율: 5.4g.
mPEG10k-부타노아세탈(2g, 0.2mmol)을 20ml의 80% CF3COOH에 용해시킨 다음 용액을 실온에서 밤새 교반시켰다. 1N NaOH 용액을 첨가하여 혼합물의 pH를 6.0으로 조정하고 염화 나트륨(10wt%)을 가한 다음, 1N NaOH를 첨가하여 용액의 pH를 7.0으로 조정하였다. 혼합물을 다이클로로메테인으로 추출하였다. 유기 층을 황산 나트륨으로 건조하고 여과하고 농축한 다음 다이에틸 에테르로 침전시켰다. 산물 mPEG10k-부타노알데하이드를 여과하여 모으고 진공 건조하였다: 수율: 1.7g.
실시예 2: mPEG 10k 부타노알데하이드를 사용한 T1249의 페길화
실시예 1에 따라 제조된 PEG 10kDa(mPEG10k-CMAB)의 부타노알데하이드를 1.0ml의 완충액(50mM 인산칼륨, pH 6.5) 중의 20mg의 T1240(순도 93.7%)에 T1249 1몰당 시약 5몰의 몰비로 첨가하였다. T1249 폴리펩타이드를 α-아미노 말단에서 탈아실화시키고 -NH2에 의해 카복시 말단에서 보호시켰다. 반응 혼합물에 물 중 10%(v/v)의 0.5M 시아노보로수소화 나트륨을 첨가한 다음 실온에서 4시간동안 교반하였다. 페길화 T1249를 이온 교환 크로마토그래피(QA)를 사용하여 반응 혼합물로부터 정제하였다. 20mM 트리스(pH 7.5) 중의 NaCl 염의 농도가 65mM에서 1M까지 점차적으로 증가되는 단계 구배를 사용하여 페길화 T1249 및 비변형된 T1249를 분리하였다.
실시예 3: mPEG 20k 부타노알데하이드의 제조
800ml의 톨루엔 중의 분자량 20,000의 mPEG(60.0g, 3mmol)를 2시간 동안 환류시킴으로써 공비적으로 건조시켜 200ml의 톨루엔을 제거하였다. 생성 용액을 실온에서 식힌 다음 20ml의 순수 t-부탄올 및 20ml의 톨루엔 중의 칼륨 t-부톡사이드(0.68g, 6mmol)를 PEG 용액에 가하였다. 생성 혼합물을 아르곤 하의 실온에서 2시간동안 교반하였다. T-부틸 브로모아세테이트(1.00ml, 6.75mmol)를 주사기를 통하여 반응물에 가하고 반응물을 아르곤 하의 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 용액을 회전식 증발기로 농축하였다. 잔기를 다이에틸 에테르에 첨가시킴으로써 침전시켰다. 침전된 산물 mPEG20k t-부틸 카복시메틸 에스터를 여과하여 제거하고 진공 건조하였다: 수율: 56g.
mPEG10k t-부틸 카복시메틸 에스터(28g)를 750ml의 1N 수산화나트륨에 용해시킨 다음 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 6N 염산을 가하여 혼합물의 pH를 2.5로 조정하고 혼합물을 다이클로로메테인으로 추출하였다. 유기 층을 황산나트륨으로 건조하고 여과하고 농축한 다음 다이에틸 에테르에 침전시켰다. 산물 mPEG20k-카복시메틸 산을 여과하여 모으고 진공 건조하였다: 수율: 25g.
mPEG20k-카복시메틸산(20g, 1.0mmol)을 무수 다이클로로메테인(100ml)에 용해시킨 다음 4-아미노부티르알데하이드 다이에틸아세탈(0.77ml, 4mmol), 1-하이드록시벤조트라이아졸(270mg, 2.0mmol) 및 다이사이클로헥실카보다이이미드(620mg, 3.0mmol)를 가하였다. 혼합물을 아르곤 하의 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 여과, 농축하고 2-프로판올 및 다이에틸 에테르의 혼합물(1:1)로 침전시켰다. 산물 mPEG20k 부타노아세탈을 밤새 진공 건조하였다: 수율: 18.6g.
mPEG20k 부타노아세탈(14.7g, 0.73mmol)을 200ml의 10% CF3COOH에 용해시킨 다음 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 1N NaOH 용액을 첨가하여 혼합물의 pH를 6.0으로 조정하고 염화 나트륨(10wt%)을 가한 다음, 1N NaOH를 첨가하여 용액의 pH를 7.0으로 조정하였다. 혼합물을 다이클로로메테인으로 추출하였다. 유기 층을 황산 나트륨으로 건조하고 여과하고 농축한 다음 다이에틸 에테르에 침전시켰다. 산물 mPEG20k 부타노알데하이드를 여과하여 모으고 진공 건조하였다: 수율: 13.1g.
실시예 4: mPEG 20k 부타노알데하이드를 사용한 T1249의 페길화
실시예 3에 따라 제조된 PEG 20kDa의 부타노알데하이드를 0.4ml의 50mM 보레이트 완충액(pH 9.5)에 용해된 20mg의 T1249(순도 93.7%)에 가하고 T1249 1몰당 시약 10몰의 몰비로 100mM 인산칼륨(pH 6.5)으로 10배 희석하였다. T1249 폴리펩타이드를 α-아미노 말단에서 탈아실화시키고 -NH2에 의해 카복시 말단에서 보호시켰다. 반응 혼합물에 물 중 0.4ml(10%, v/v)의 0.5M 시아노보로수소화 나트륨(NaBH3CN) 용액을 첨가한 다음 실온에서 4시간동안 교반하였다. 반응 혼합물을 평형 완충액(20mM 트리스, pH 7.5)으로 10배 희석시킨 다음 0.45㎛ 여과기를 통과시켜 여과시켰다. 페길화 T1249를 음이온 교환 크로마토그래피(Q-세파로즈)를 사용하여 반응 혼합물로부터 정제하였다. 평형 완충액 중의 NaCl 염의 농도가 75mM, 200mM에서 1M까지 점차적으로 증가되는 단계 구배를 사용하여 이-페기화, 일-페길화 및 비변형된 T1249를 각각 분리하였다. 70mg T1249, PEG20k 부타노알데하이드의 1:10 몰 과량을 출발물질로 하여 상기 과정을 반복하여 상기 개시된 바에 따라 정제하였다. 모든 실험으로부터 일-페길화 T1249(200mM NaCl 용출물) 풀(pool)을 모으고 약 2mg/ml로 농축하고 저장 완충액(PBS 완충액, pH 7.3)에 다이아여과하고 추가로 사용될 때까지 -20℃에서 저장하였다. 액적 물질을 항바이러스성 활성 분석에 사용하였다.
실시예 5: mPEG 20k -부타노알데하이드를 사용한 T1249의 일-, 이- 및 삼-페길화%
mPEG20k-부타노알데하이드를 사용한 T1249의 일-, 이- 및 삼-페길화%는 T1249:PEG 몰비, 반응 용액의 pH 및 반응 시간이 하기 표 1, 2 및 3에 나타낸 바와 같이 변화되는 일련의 실험을 통하여 결정하였다. 이러한 실험의 목적을 페길화 매개변수를 적정화하기 위한 것이다.
예를 들어, 표 1에서 실시예 3에 따라 제조된 PEG 20kDa의 부타노알데하이드(mPEG20k-CMAB)를 50mM 인산칼륨(pH 6.5) 중의 5mg의 T1249(순도 93.7%)에 가하였다. T1249 폴리펩타이드를 α-아미노 말단에서 탈아실화시키고 -NH2에 의해 카복시 말단에서 보호시켰다. PEG 시약 대 T1249의 몰비는 1:1, 1:2 및 1:5였다. 반응 혼합물에 물 중의 10%(v/v)의 0.5M 시아노보로수소화나트륨을 가하였다. 미리결정된 시간 간격, 즉, 2, 4, 6 및 24시간 간격으로 실온에서 액적을 제거하였다.
표 2에 있어서, 실시예 3에 따라 제조된 PEG 20kDa의 부타노알데하이드(mPEG20k CMAB)를 50mM 인산칼륨(pH 6.0) 중의 5mg의 T1249(순도 93.7%)에 T1249 1몰당 PEG 시약 10몰의 몰비로 가하였다. T1249 폴리펩타이드를 α-아미노 말단에서 탈아실화시키고 -NH2에 의해 카복시 말단에서 보호시켰다. 반응 혼합물에 물 중의 10%(v/v)의 0.5M 시아노보로수소화 나트륨을 가하였다. 미리결정된 시간 간격, 즉 2, 4, 6 및 24시간 간격으로 실온에서 액적을 제거하였다.
표 3에 있어서, 실시예 3에 따라 제조된 PEG 20kDa의 부타노알데하이드(mPEG20k-CMAB)를 50mM 인산칼륨(pH 5.5) 중의 5mg의 T1249(순도 93.7%)에 T1249 1몰당 PEG 시약 10몰의 몰비로 가하였다. T1249 폴리펩타이드를 α-아미노 말단에서 탈아실화시키고 -NH2에 의해 카복시 말단에서 보호시켰다. 반응 혼합물에 물 중의 10%(v/v)의 0.5M 시아노보로수소화 나트륨을 가하였다. 미리결정된 시간 간격, 즉 2, 4, 6 및 24시간 간격으로 액적을 제거하였다.
각 반응 혼합물에 대한 일-, 이-, 및 삼-페길화 T1249 및 비반응된 유리 T1249의 %를 역상 HPLC로 수득하였다. 상기 표 1, 2 및 3에 예시된 데이터는 T1249:PEG 몰비, pH 및 반응시간 조건의 변화 하에서 일-페길화 T1249의 적정 양이 수득될 때 나타낸 것이다. 예를 들어, 표 1에서 61%의 적정 일-페길화는 T1240:PEG 몰비 1:5 및 6시간 시점에서 나타낸 것이다. 표 2에서 61%의 적정 일-페길화는 T1240:PEG 몰비 1:10 및 4시간 시점에서 나타낸 것이다. 표 3에서 60%의 적정 일-페길화는 T1240:PEG 몰비 1:10 및 6시간 시점에서 나타낸 것이다.
실시예 6: 페길화 부위 측정
T1249에 부착되는 PEG 부위를 측정하기 위하여 일련의 실험을 수행하였다. 이 결과는 95% 초과의 변형이 N-말단 트립토판 잔기 위치에서 일어난다는 것을 증명한다. 추가 부위에서의 변형은 중요하지 않은 정도(5% 미만)로 일어나지만 이들의 정확한 규정은 명확하게 확립되지 않았다.
PEG 변형 부위를 측정하기 위하여 시료를 단백질 내부 가수분해효소 Lys-C로 절단하고 펩타이드를 역상 HPLC로 분리하였다. 각 펩타이드의 피크를 나노 분무 ESI(전자분무 이온화) 질량 분석법, MALDI TOF(매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행시간형 질량 분석법 및 N-말단(에드만) 서열 분석으로 추가로 분석하였다. 이러한 과정을 하기에 요약하였다.
실시예 4에 따라 제조된 20K 일-페길화 부타노알데하이드-T1249(20K mPEG-CMAB-T1249) 및 T1249(유리 α-아미노 말단; -NH2에 의해 보호된 카복실 말단)의 시료를 주변온도에서 2시간동안 단백질 내부 가수분해효소 Lys-C를 사용하여 10/1(w/w)의 시료 대 효소의 비율로 가수분해하여 절단하였다. 아세트산을 2%(v/v)의 최종 농도로 가하여 반응을 중단시켰다.
페노메넥스 누나(Phenomenex Luna) 역상 칼럼(C-18, 3μ, 150x200mm)으로 평형화된 HP1100 HPLC 시스템을 사용하는 역상 HPLC를 수행하여 가수분해하여 펩타이드를 분리하였다. 물, 아세토니트릴 및 트라이플루오로아세트산(0.05%)으로 이루어진 용매 시스템을 사용하였다. 구배는 50분에서 0.2ml/분의 유속에서 5 내지 64%의 유기 용매로 하였다. 피크를 함유하는 펩타이드를 추가의 분석을 위해 모았다.
이어서, 모은 모든 시료를 피니간(Finnigan) LCQ 이온 트랩 기기 상에서 나노 분무 ESI 질량 분석법으로 분석하였다. 각 펩타이드를 실험적인 분자량을 기준으로 하여 확인하였다. 또한, 분획을 함유하는 PEG 펩타이드를 브루커 리플레스(Bruker Reflex) 기기 상에서 MALDI TOF 질량 분석기를 사용하여 분석하였다. 사용된 매트릭스는 트란스-3-인돌아크릴산 또는 알파-4-하이드록시신남산이었다.
이어서, PEG 함유 펩타이드 분획을 퍼킨 엘머(Perkin Elmer, ABI) 정밀 기기 상에서 자동화 N-말단(에드만) 서열 분석하였다.
페길화 T1249의 단백질 가수분해 단편의 역상 HPLC 분석 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1은 두 개의 시료의 역상 HPLC 분석을 통해 수득된 UV 흔적을 나타낸다. 대조군 T1249에서 관찰된 N-말단 펩타이드는 PEG 변형된 T1249에는 거의 전체적으로 존재하지 않는 것으로 나타났다(도 1a). 그 대신 하나의 새로운 피크가 나타났다(도 1a에서 피크 PEG-34). 이는 PEG 변형된 펩타이드(들)를 함유한다.
각 HPLC 분획의 분석으로부터 수득된 질량 분석 결과를 표 4에 요약하였다. 비변형된 펩타이드의 실험적인 분자량은 계산된 것과 일치하였다.
완전 PEG 변형된 T1249로부터 수득된 MALDI TOF 질량 스펙트럼은 도 2a에 나타내었다. 측정된 분자량은 26758Da이었다. 몇몇의 비변형된 펩타이드의 존재를 주의해야 한다. 이의 원인은 현재 알려져 있지 않으나 질량 분광계 자체의 측정에 의해 잠재적으로 유발된다. 분획 PEG-34(도 1)로부터 수득된 MALDI TOF 질량 스펙트럼은 도 2b에 나타내었다. 측정된 분자량은 23083Da이었다. 분자량 및 질량 스펙트럼의 양태는 PEG 변형된 펩타이드(들)를 함유하는 것으로서 이러한 HPLC 분획 PEG-34를 규명한다. 이러한 HPLC 분획에서 PEG의 존재는 나노 분무 ESI 질량 분석(데이타 없음)에 의해 나타날 수도 있다.
자동화 N-말단 서열 분석(에드만) 결과는 도 3에 나타내었다. 관찰된 주요 서열은 N-말단 내부 Lys-C 펩타이드 xQEWEQK였다. 제 1 아미노산 잔기를 제외하고는 모든 기타 아미노산은 실질적인 수율로 회수되었다. 본질적으로 제 1 아마노산 위치에서 회수되는 트립토판은 없다(도 3, 사이클 3). HPLC UV 흔적, MALDI TOF 질량 스펙트럼 뿐만 아니라 N-말단 서열 분석으로부터 수득된 결과는 주요 PEG 변형 부위로서 N-말단 트립토판을 규명한다.
상기 결과는 폴리에틸렌 글리콜 알데하이드 및 T1249의 N-말단 트립토판 사이에 연결이 존재한다는 사실과 일치한다. 트립토판 부쇄에 직접적인 연결이 전적으로 배제될 수는 없지만 N-말단 서열 분석으로부터 수득된 결과는 N-말단 아미노 기에서 "차단" PEG 잔기의 존재와 반대되는 것으로 나타난다.
실시예 7: mPEG 10k -프로피온알데하이드를 사용한 T1249의 페길화
하기 구조를 갖는 PEG 10KDa의 프로피온알데하이드를 사용하였다:
200mg의 mPEG 10K-프로피온알데하이드를 1.0ml의 완충액(50mM 인산칼륨, pH 6.5) 중의 200mg의 T1249(순도 93.7%)에 1몰의 T1249 당 시약 5몰의 몰비로 가하였다. T1249 폴리펩타이드를 α-아미노 말단에서 탈아실화시키고 -NH2에 의해 카복시 말단에서 보호시켰다.
반응 혼합물에 물 중 10%(v/v)의 0.5M 시아노보로수소화 나트륨 용액을 첨가한 다음 실온에서 4시간동안 교반하였다. 페길화 T1249를 이온 교환 크로마토그래피(QA)를 사용하여 반응 혼합물로부터 정제하였다. 페길화 T1249의 구조는 하기 화학식 III과 같다:
화학식 III
20mM의 트리스(pH 7.5) 중의 NaCl 염의 농도가 65mM에서 1M까지 점차적으로 증가되는 선형 구배를 사용하여 페길화 T1249 및 비변형된 T1249를 분리하였다. 일-페길화 T1249 및 비변형된 유리 T1249의 %를 역상 HPLC로 분석하여 31.7%로 결정하였다.
실시예 8: cMAGI/MAGI 항바이러스성 분석
지표 세포주 MAGI(갈락톡시다제 지표의 다핵 활성화) 또는 CCR5-발현 유도체 cMAGI를 사용하여 감염성 바이러스 역가의 감소치를 분석하였다. 암포트로픽(amphotropic) 레트로바이러스 벡터(문헌[Kimpton J, Emerman M, J Virol 66: 2232-9, 1992])를 사용하여 CD4 및 HIV-1 LTR-유래 b-gal 리포터에 대한 유전자를 혼입시킴으로써 모체 HeLa 세포로부터 MAGI 세포주를 수득하였다. 암포트로픽 레트로바이러스 벡터, PA317(문헌[Chackerian B, Long EM, Luciw PA, Overbaugh J, J Virol 71: 3932-9, 1997])를 사용하여 CCR5 유전자를 혼입시킴으로써 MAGI 세포주로부터 cMAGI 세포주를 수득하였다. cMAGI 세포는 주요 NSI(R5) 분리균 및 실험적으로 부합되는 X4 바이러스의 복제를 지지하는 반면, MAGI 세포는 단지 X4 바이러스의 복제를 지지한다. 모든 세포주는 HIV-LTR에 의해 유도된 b-갈락톡시다제 리포터 유전자의 발현을 전이활성화시키기 위해 HIV-1 tat의 능력을 이용한다. b-gal 리포터를 변형시켜 핵내에 집중시켰으며 감염 수일내에 염색되는 강한 핵으로서 X-gal 기질을 사용하여 검색될 수 있다. 따라서, 염색 이전에 단지 하나의 감염 원형이 발견된다면, 염색된 핵의 수는 공격 접종원 중의 염색성 비리온의 수와 일치하는 것으로 해석될 수 있다.
단일 감염 원형이 확실하게 나타나는 해독을 허용하기 위하여 감염한지 24시간 후에 감염 및 세포-세포 융합 억제제, 예를 들어 T1249(문헌[Wild C, Greenwell T, Matthews T, AIDS Res Hum Retroviruses 9: 1051-3, 1993])를 가하였다. 바이러스 유입 및 영상기(imager)에 의해 가시화된 감염된 세포수 사이의 직선 관계를 나타내는 CCD-영상기, 및 일차적 및 실험적으로 부합되는 분리균을 사용하여 감염된 세포를 열거하였다. MAGI 및 cMAGI 분석에서 감연 역가의 50% 감소(Vn/Vo=0.5)는 유의적이며 항바이러스 활성을 분석하기 위한 일차적인 절단 값을 제공한다. 감염 역가(Vn/Vo)에서 90% 감소는 항바이러스성 활성을 분석하는데 추가의 절단 값으로서 사용된다.
48웰 마이크로 역가 플레이트 중 약 1500 내지 2000개의 감염된 세포/웰을 수득하기에 적합한 바이러스성 접종원에 대하여 각 시험 화합물의 희석물을 2회 시험하였다. 시험 화합물을 cMAGI 또는 MAGI 세포에 가한 다음, 바이러스 접종원을 가하고, 24시간 후 감염 및 세포-세포 융합 억제제(문헌[Wild C, Greenwell T, Matthews T, AIDS Res Hum Retroviruses 9: 105-3, 1993])을 가하여 제 2의 감염 원형 및 세포-세포 바이러스 확산을 방지하였다. 세포를 2일 이상 배양하고 X-gal 기질로 고정 및 염색하여 감염 세포를 검색하였다. 각 대조군 및 시험 화합물 희석물에 대한 감염 세포수를 CCD-영상기로 측정하였다. IC50은 감염성 바이러스 역가에서 50%의 감소를 나타내는 시험 화합물의 희석물로서 정의된다. IC90은 감염성 바이러스 역가에서 90%의 감소를 나타내는 희석물로서 정의된다.
실시예 9: 페길화 T1249에 대한 IC 50 /IC 90
T1249 및 mPEG20k-부타노알데하이드로 페길화된 T1249(이하, "mPEG20k-CMAB-T1249"라 칭함, 실시예 4)에 대한 IC50 및 IC90 결과는 하기 표 5에 나타내었다. IC50 및 IC90 값은 실시예 8에 따라 측정하였다.
생체외 항바이러스성 활성의 감소(IC50, 배치 1에 대해 13.7배 및 IC90, 배치 1에 대해 9-배)를 모체 T1249 분자와 비교하여 mPEG20k-CMAB-T1249를 사용하여 관찰하였다. 그러나, 실시예 12(도 6 참조)에 예시된 결과에 의해 증명되는 바와 같이, 생체외 활성에서 이러한 손실로부터 생체내 생물학적 활성의 손실이 예측되지 않는다.
실시예 10: mPEG 10k -프로피온알데하이드로 페길화된 T1249의 약물 동력학
연구 고안
9마리의 수컷 위스타 쥐(찰스 리버(Charles River) 실험실, 독일 윌밍턴 소재)(n=3/시점)에게 mPEG20k-프로피온알데하이드로 페길화된 T1249(실시예 4)를 단일 피하 투여하였다.
mPEG20k-CMAB-T1249를 물에 현탁시키고 NaOH를 사용하여 pH 6.8로 적정화시켰다. mPEG20k-CMAB-T1249 현탁액을 최소부피의 탄산나트륨 완충액에 용해시킨 다음 PBS 완충액으로 희석시켜 pH를 7.3 내지 7.4로 하였다. 사용된 PEG-T1249의 양은 최종 제형 1ml당 150mg의 mPEG20k-CMAB-T1249의 농도를 제공하기에 충분하다. 8mg의 활성성분/kg체중을 쥐에게 투약하였다.
투여량 투여 후, 각 시점에서 약 1ml의 혈액을 레트로 안와 공동으로부터 모았다. 시점은 투여량 투여 후 0.5, 1, 3, 6, 8, 16, 24, 32, 48, 72 및 96시간으로 하였다. 모든 혈액 시료를 실온에서 30분 이하동안 유지시키고 차갑게 원심분리하여 혈청을 분리하였다.
생물분석 방법
0.05M 암모늄 아세테이트 및 아세토니트릴로 이루어진 선형 구배를 사용하는 역상 HPLC C18 칼럼상에서 모든 혈액 시료를 분리하였다. 흡광도는 280nM에서 측정하였다. 표준 눈금으로서 mPEG20k-CMAB-T1249 스파이크 혈청 추출물을 사용하여 플롯([mPEG20k-CMAB-T1249]에 대한 곡선하 면적)으로부터 농도를 추정하였다.
보고된 약물 동력학적 매개변수는 상업적인 동력학 분석 소프트웨어 팩키지인 윈논린(WinNonlin, 버전 3.3, 파사이트 코포레이션(Pharsight Corporation), 캐나다 마운틴 뷰 소재)을 사용하여 mPEG20k-CMAB-T1249, 이의 대사 산물, 이들의 조합의 풀혈청(pooled serum) 농도 프로파일로부터 유래되었다.
결과
도 4는 단일 피하 투여량 투여 후 쥐에서 mPEG20K-CMAB-T1249의 농도-시간 프로파일을 나타낸 것이다. 0.5시간 시점에서 주사 부위로부터 느린 흡착 공정을 지시하는 mPEG20K-CMAB-T1249 또는 대사 산물의 농도는 관찰되지 않았다. 대사 산물에 있어서, 대사 산물 형성의 느린 경과를 나타내는 제 1 관찰가능한 농도가 투여 6시간 후에 발견되었다. mPEG20K-CMAB-T1249 및 이의 대사 산물의 가장 낮은 혈청 농도는 각각 투여 후 48 및 72시간째에 관찰되었다.
시스템 CI/F 및 Vd/F, AUC(0 내지 48시간 또는 0 내지 72시간), Cmax, Tmax 및 반감기를 하기 표 6에 나타내었다.
실시예 11: T1249의 약물 동력학
연구 고안
각 시험 군을 동성의 9마리의 스프라그-다울리 쥐(찰스 리버 실험실, 독일 윌밍턴 소재)로 구성시켰다. 군의 각 성원에게 T1249(실시예 9/표 5에서 인용된 배치 2)를 단일 피하 또는 정맥내 투약하였다. 쥐들에게 투여된 양은 1.2 또는 15mg의 활성 성분/kg체중이었다.
각 시점에서 군당 동성의 3마리의 시험 쥐들로부터 혈액 시료를 12시간을 거쳐 모았다. 시점은 투여량 투여후 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10 및 12시간으로 하였다.
생물분석 방법
T1249 PcAb ECLIA 분석을 사용하여 혈액 시료를 분석하였다. T1249 PcAb ECLIA는 T1249에 대해 토끼 PcAb 특이적인 두 개의 상이한 제제를 이용하는 비경쟁적인 두 개 부위 면역분석이다. 이 분석에서 T1249 측정은 바이오틴-표지된 항체(제제 A) 및 루테늄-표지된 항체(제제 B)를 함유하는 튜브에서 희석된 시험 시료를 먼저 배양시킴으로써 수행하였다. 다음 단계에서, 형성된 항체-펩타이드-항체 면역 복합체(샌드위치)를 포획하기 위하여 스트렙타비딘-코팅된 자기 비드를 가하였다. 이어서, 전기 전류를 유동-세포에 근접한 자력에 적용한 후 혼합물을 분석기내의 유동-세포를 통하여 펌핑하였다. 검색자 항체에 접합되는 루테늄 금속 이온과 분석 완충액에서 과량으로 존재하는 트라이프로필아민 이온 사이에 주기적인 산화-환원 반응을 통하여 빛을 생성하였다. 이러한 빛 에너지는 말단점(end-point)에서 측정된다. 상당한 양의 T1249를 함유하는 시료는 T1249가 거의 없거나 함유하지 않는 시료와 비교하여 보다 높은 신호를 발산한다.
결과
도 5는 단일 피하 또는 정맥내 투여량 투여 후 쥐에서 T1249의 농도-시간 프로파일을 나타낸 것이다.
Tmax, 반감기, AUC(0 내지 12 시간 및 0 내지 ∞ 시간); 및 Cmax는 하기 표 7에 나타내었다.
mPEG20K-CMAB-T1249(표 6) 및 T1249의 15mg/kg의 피하 투여량(표 7)에 대한 약물 동력학적 데이터을 고려하면 mPEG20K-CMAB-T1249는 말단 반감기가 4.5배 증가한 것으로 나타난다. 보다 높은 Tmax는 유사한 Cmax를 갖는 반면 T1249와 비교하여 mPEG20K-CMAB-T1249에 대해 보다 느린 클리어런스(clearance)를 반영한다. 추가로, 표 7로부터 수득된 데이터가 투여량의 차이에 대해 정상적이라면(실시예 10에서와 같이 15mg/kg이 8mg/kg으로 정상화됨), AUC에서 T1249에 비한 5배 증가가 mPEG20K-CMAB-T1249에 대해 관찰되었다(mPEG20K-CMAB-T1249에 대한 279㎍ hr/ml에 대해 T1249에 대한 (정상화된) 57.1㎍ hr/ml).
실시예 12: 마우스에서 HIV-1 바이러스성 부하에서 T1249 및 mPEG 20K -CMAB-T1249의 효과
처리 군당 9마리의 HuPBMC-SCID 마우스(6마리를 갖는 PEG 대조군 제외)를 사용하였다. 0일째에 HIV 분리균으로 감염시킨 후 각 처리 군을 오후에 처리하였다. 이후, 각 처리 군을 1 내지 6일 동안 하루에 2회(오전 및 오후) 처리하였다. 7일째에 마우스를 회수하였다. 상세한 투약은 표 8에 나타내었다. 마지막 투여량 투여한 지 약 14신 후 T1249 분석을 위한 혈장 시료를 모았다.
혈장에서 HIV-1을 실시간 정량적인 PCR에 의해 측정하였다. 혈장을 T1249 화합물 정량을 위해 회수하였다. 이어서, 동결된 혈장 시료를 화합물 분석하였다.
도 6은 SCID 마우스에서 HIV-1 바이러스성 부하 상에 투약되는 T1249 및 mPEG20K-CMAB-T1249의 효과를 나타낸 것이다.
T1249 및 mPEG20K-CMAB-T1249는 생체내에서 균등하게 활성적이다. 그 결과, 시험 화합물의 혈장 농도에 대해 측정된 바와 같이 생체내 바이러스성 억제 활성에서 식별가능한 차이점을 나타내지 않았다.
상기 결과는 본 발명의 잇점, 즉 동일할 혈장 농도에서 mPEG20K-CMAB-T1249 및 T1249의 생체내 생물학적 활성이 동일하며(실시예 12), 실시예 10 및 11의 비교에서 증명되는 바와 같이 mPEG20K-CMAB-T1249의 보다 우수한 약물 동력학적 프로파일을 갖는다는 것을 보여준다.
이와 같이 개시된 본 발명은 많은 방법으로 변형될 수 있는 것이 자명할 것이다. 이러한 변형은 발명의 범위 및 범주로부터 벗어나는 것으로 간주되지 않으며 이러한 모든 변형은 하기 청구범위의 범주내에 포함되는 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> F. HOFFMANN-LA ROCHE AG <120> PEGYLATED T1249 POLYPEPTIDE <130> 21327US1 <150> US 60/398,190 <151> 2002-07-24 <150> US 60/439,213 <151> 2003-01-10 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide sequence was synthetically derived. <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Residue No. 39 is optionally modified with an amino group. <400> 1 Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln 1 5 10 15 Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asp Lys Trp 20 25 30 Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe 35 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide sequence was synthetically derived. <400> 2 Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys 1 5 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide sequence was synthetically derived. <400> 3 Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys 1 5 10 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide sequence was synthetically derived. <400> 4 Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide sequence was synthetically derived. <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Residue No. 8 is modified with an amino group. <400> 5 Trp Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe 1 5

Claims (16)

  1. 하기 화학식 I의 화합물:
    화학식 I
    상기 식에서,
    R1은 캡핑 기이고;
    m은 1 내지 17이고;
    n은 10 내지 1,000이고;
    p는 1 내지 3이고;
    NHT1249는 이의 말단 α-아미노 기를 통하여 공유결합된 T1249 폴리펩타이드이다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    R1이 할로겐, 에폭사이드, 말레이미드, 오르토피리딜 다이설파이드, 토실레이트, 아이소시아네이트, 하이드라진 하이드레이트, 사아누르 할라이드, N-숙신이미딜옥시, 설포-N-숙신이미딜옥시, 1-벤조트라이아졸일옥시, 1-이미다졸일옥시, p-니트로펜닐옥시 및 로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    p가 3인 화합물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    p가 3이고, R1이 메톡시이고, m이 1이고, n이 100 내지 750인 화합물.
  5. 하기 화학식 III의 화합물:
    화학식 III
    상기 식에서,
    n은 10 내지 1,000이고;
    NHT1249는 이의 말단 α-아미노 기를 통하여 공유결합된 T1249 폴리펩타이드이다.
  6. 제 5 항에 있어서,
    n이 약 450인 화합물.
  7. 하기 화학식 I의 화합물을 약학적으로 허용가능한 부형제와 혼합된 형태로 포함하는 약학 조성물:
    화학식 I
    상기 식에서,
    R1은 캡핑 기이고;
    m은 1 내지 17이고;
    n은 10 내지 1,000이고;
    p는 1 내지 3이고;
    NHT1249는 이의 말단 α-아미노 기를 통하여 공유결합된 T1249 폴리펩타이드이다.
  8. 제 7 항에 있어서,
    p가 3이고, R1이 메톡시이고, m이 1이고, n이 100 내지 750인 약학 조성물.
  9. 제 7 항에 있어서,
    동결건조된 분말의 형태인 약학 조성물.
  10. 제 7 항에 있어서,
    주사가능한 용액 또는 현탁액의 형태인 약학 조성물.
  11. 하기 화학식 I의 화합물을 약학적으로 허용가능한 부형제와 혼합된 형태로 포함하는 약학 조성물의 HIV 감염 억제용 약제를 제조하기 위한 용도:
    화학식 I
    상기 식에서,
    R1은 캡핑 기이고;
    m은 1 내지 17이고;
    n은 10 내지 1,000이고;
    p는 1 내지 3이고;
    NHT1249는 이의 말단 α-아미노 기를 통하여 공유결합된 T1249 폴리펩타이드이다.
  12. 제 11 항에 있어서,
    p가 3이고, R1이 메톡시이고, m이 1이고, n이 100 내지 750인 용도.
  13. 제 11 항에 있어서,
    약학 조성물이 복막, 근육, 피하 또는 정맥내 주사되거나, 또는 연속 주입액에 의해 주사되는 용도.
  14. 제 11 항에 있어서,
    약학 조성물이 투여 당 약 50mg 내지 약 300mg의 양으로 투여되는 용도.
  15. 하기 화학식 III의 화합물을 약학적으로 허용가능한 부형제와 혼합된 형태로 포함하는 약학 조성물의 HIV 감염 억제용 약제를 제조하기 위한 용도:
    화학식 III
    상기 식에서,
    n은 10 내지 1,000이고;
    NHT1249는 이의 말단 α-아미노 기를 통하여 공유결합된 T1249 폴리펩타이드이다.
  16. 제 15 항에 있어서,
    약학 조성물이 주 당 약 300mg 내지 약 1500mg의 양으로 단일 투여량 투여되는 용도.
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