TW200427697A - Pegylated t1249 polypeptide - Google Patents

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TW200427697A TW092119718A TW92119718A TW200427697A TW 200427697 A TW200427697 A TW 200427697A TW 092119718 A TW092119718 A TW 092119718A TW 92119718 A TW92119718 A TW 92119718A TW 200427697 A TW200427697 A TW 200427697A
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Description

200427697 玖、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於聚乙二醇T1249多肽化合物，及使用和製備 該等化合物之相關方法，諸如其在醫藥組合物及治療方法 中之使用。 【先前技術】 某些病毒，特別係HI V，必須經受一稱為融合之複雜過 程，以進入宿主細胞並複製。在融合過程中，病毒之外膜 與宿主細胞膜融合。以HI V為例，HI V病毒之外膜在複製過 程中係與CD4+T細胞膜融合。 T1249係一群可抑制病毒/膜融合之新穎抗病毒試劑之成 員。以HIV為例，其可提供兩種有益作用：HIV之複製受到 阻斷，且不會導致CD4+T細胞死亡。 病毒對當前已核准抗HI V藥物之抗性係當今HI V臨床管 理中之一重要問題。許多使用當前已核准藥物進行聯合抗 逆轉錄病毒治療之患者經一段時間後將對一或多種藥劑產 生抗性。然而，研究顯示，T1249不受任一當前已核准之抗 逆轉錄病毒類藥物抗性之影響（參見2001年6月4-8日在亞利 桑那州Scottsdale舉辦之第五屆國際藥物抗性及治療策略之 專題討論會上提交之數據）。 T1249在臨床試驗中之劑量範圍分析顯示，T1249之曰劑 量（無先前抗逆轉錄病毒治療之經歷，包括對所有已核准 HI V類藥物之突變）在治療患者中係病毒性負荷降低之相關 唯一變數。另有實驗顯示，T1249之活體外活性不受與對逆 86594 200427697 轉錄酶抑制劑及蛋白酶抑制劑抗性相關之突變影響。 與許多種多肽治療劑相同，T1249—般係以注射投藥。當 前之療法通常是每日多次注射。 故，提供具有改良性能及藥物動力學特性之醫藥組合物 及丁 1249多肽是有益處的，提供較低T1249治療劑量、較低 投藥頻率及/或較長之作用時間特別是有益處的。 本發明之此等目的及其他目的詳細闡釋於下文中。 【發明内容】 本發明提供一式（I)之化合物： 〇
II R1-(CH2CH2〇)n-CH2CH2-0-(CH2)m-C-NH-(CH2)p-CH2-NHT1249 (!) 其中：
Ri係一封端基團； m介於1至17之間； η介於10至1，000之間； ρ介於1至3之間；且 ΝΗΤ1249係藉由其末端α-胺基共價键結之Τ1249多肽。 在本發明化合物之一個具體實施例中，Ri係曱氧基，m 係1，η介於100至750之間，且ρ係3。 本發明亦提供一醫藥組合物，其包含混與醫藥上可接受 賦形劑之式（I)化合物（其中Ri、m、η、ρ及ΝΗΤ1249係如上 文之定義）。 在本發明醫藥組合物之一個具體實施例中，&係甲氧 86594 200427697 基，m係1，η介於10 0至7 5 0之間，且p係3。 本發明進一步提供一種抑制HIV感染之方法，其包括投予 包含混與醫藥上可接受賦形劑混合之式（I)化合物（其中 Ri、m、η、p及NHT1249係如上文之定義）之醫藥組合物。 若本發明論及「抑制HIV感染之方法，其含有一化合物」， 則其意指「使用一化合物以製備抑制HI V之藥物」。 在抑制HI V感染之方法之一個具體實施例中，I係甲氧 > 基，m係1，η介於100至750之間，且p係3。 本發明進一步提供一種用於製備聚乙二醇Τ1249多肽之 _ 方法，其包含將Τ1249多肽與式（II)聚乙二醇醛反應： 〇
II
Rr(CH2CH20)n-CH2CH2-0-(CH2)m-C-NH-(CH2)p-CH0 (II) 其中Ri、m、η、η及p係如上文之定義；以產生式（I)化合物， 其中聚乙二醇醛分子鍵結至Τ1249多肽之Ν-端胺基上。若本 發明論及「製備方法」，則其意指「製備過程」。 如上所述，Τ1249係一「融合抑制劑」多肽。Τ1249由39 : 個胺基酸組成。Τ1249之多肽序列係： 1
WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF
[SEQ.ID.N0:1] 其N-端（或胺基端）胺基酸為色胺酸（W)。其C-端（或羧基端） 胺基酸為苯丙胺酸（F)。 如美國專利案第6,348,568號表1 (Seq· ID No· 1071)所述 (其全文以引用的方式併入本文參考），可阻斷/衍生化ΤΙ 249 86594 -8- 200427697 多月太序列的胺基端及幾基端之一或兩端。如美國專利案第 6,348,568號中所述，用醯基可阻斷/衍生化色胺酸胺基端， 而用胺基可阻斷/衍生化苯丙胺酸羧基端（後者產生-COOH + -CONH2之轉化）。 應瞭解，本文所用「T1249」意指[SEQ.ID.N〇：1]，視情 況可以胺基阻斷苯丙胺酸C-端。換言之，當提及有關 「T1249」時，苯丙胺酸C-端不是-COOH就是-C〇NH2。 本發明提供下式之聚乙二醇T1249化合物： 一 〇 II -
Rr(CH2CH2〇)n-CH2CH2-〇-(CH2)m-ONH-(CH2)p-CH2-NHT1249 (1) 其中：
Ri係一封端基團； m介於1至17之間； η介於10至1，000之間； ρ介於1至3之間；且 ΝΗΤ1249係藉由其末端.胺基共價键結之Τ1249多肽。 本文所用之Ri「封端基團」係任何合適之化學基團，端 視優先順序，其一般不與其他化學部分反應或一般可發生 反應。在上述化合物中，聚乙二醇共價键結至T1249之 胺基。選用I封端基團以允許或避免雙官能性，例如，共 價結合至感興趣之第二化學部分。 以封端基團一般不與其他化學部分起反應為例，Ri相當 惰性，且因此不會與另一化學部分共價键結。通常合適之 200427697 不易反應之Ri封端基團包括：氫、羥基、低碳數烷基、低 碳數烷氧基、低碳數環烷基、低碳數烯基、低碳數環烯基、 芳基及雜芳基。 本文所用術語「低碳數烷基」意指含有1至7個（較佳為1 至4個）碳原子之直鏈或具支鏈垸基，例如甲基、乙基、正_ 丙基、異丙基、正-丁基、第二丁基、第三丁基、正-戊基、 正-己基、正-庚基及其類似物。「低碳數烷基」視情況經一 或多個獨立選自函素、低碳數烷基、低碳數烷氧基、低碳 數環烷基、-低碳數烯基、低碳數環烯基、芳基及雜芳基之 基團取代。 術语「低碳數燒氧基」意指藉由氧原子键結之上述低碳 數烷基，低碳數烷氧基之實例係曱氧基、乙氧基、正-丙氧 基、異丙氧基、正-丁氧基、第二丁氧基、第三丁氧基、正 -戊氧基及其類似物。「低碳數垸氧基」視情況經一或多個 獨立選自齒素、低碳數烷基、低碳數烷氧基、低碳數環垸 基、低碳數烯基、低碳數環烯基、芳基及雜芳基之基團取 代。 術語「低碳數環燒基」意指含有3至7個（較佳為4至6個） 兔·原子之環坑基’即環丙基、環丁基、環戊基、環己基或 環庚基。「低碳數環烷基」視情況經一或多個獨立選自鹵 素、低碳數烧基、低碳數烷氧基、低碳數環烷基、低碳數 烯基、低碳數環烯基、芳基及雜芳基之基團取代。 本文所用術語「低碳數烯基」意指含有2至7個（較佳為2 至5個）破原子之直鏈或具支鏈歸基，例如乙晞基、丁稀基、 86594 -10- 200427697 戊烯基、己烯基及其類似物。「低碳數烯基」視情況經一或 多個獨立選自_素、低碳數烷基、低碳數烷氧基、低碳數 環燒基、低碳數稀基、低碳數環稀基、芳基及雜芳基之基 團取代。 術語「低碳數環烯基」意指含有4至7個碳原子之環稀基， 例如環丁烯基、環戊烯基、環己烯基及其類似物。「低碳數 環烯基」視情況經一或多個獨立選自南素、低碳數烷基、 低碳數貌氧基、低碳數環烷基、低碳數烯基、低碳數環烯 基、芳基及雜芳基之基團取代。 術語「芳基」意指，其未經取代或視情況經單-或多個鹵 素、低碳數烷基、低碳數烷氧基、三氟甲基、羥基、複酸、 羧酸酯、硝基、胺基或苯基取代之苯基或莕基，尤其經鹵 素、低碳數烷基、低碳數烷氧基、三氟甲基、羥基、硝基、 胺基及苯基單取代或多取代。 術語「雜芳基」意指5元或6元雜芳基，其含有一或多個 選自氮、硫及氧之雜原子，且其可經苯并融合基團及/或以 與上述「芳基」相同之方式取代。 較佳之一般不易反應之心封端基團包括甲氧基、羥基或 爷氧基。特別佳之K封端基團係曱氧基。當Ri係甲氧基時， 本文中有時將邵分聚乙一醇多肽化合物稱為「mPEG」化合 物，其中「m」代表甲氧基。 若Ri封端基團一般與其他化學部分發生反應，則Ri係可 與某些官能基（例如肽及/或蛋白中之胺基及/或巯基）反應 <頁能基。在此情況下，與彼等需要強催化劑或極難實現 86594 -11 - 200427697 之反應條件以發生反應之基團相反的是，K可係易於與其 他分子上之親電子或親質子基團反應之官能基。若Ri相對 而言易發生反應，則聚乙二醇醛可與另一化學部分共價鍵 結。 合適之一般易於反應之1封端基團之實例包括：鹵素、 環氧化物、馬來醯亞胺、鄰吡啶基二硫化物、甲基績酸基、 異氰酸基、水合肼、氰尿酿鹵、N-琥ίό酿亞胺基氧基、硫 代琥轴醯亞胺基氧基、1-苯并三唆基氧基、1_味也基氧 基、對-硝基苯氧基及 〇
^ II -CH2CH2-〇.(CH2)m-C-NH-(CH2)p-CHO. 術居「鹵素」意指氟、氣、溴或琪。一般較佳之反應性 之Ri封端基團係 〇 -CH2CH2-0-(CH2)J-NH-(CH2)p-CH0.。當存在該 Rl 封端基團 時，應瞭解，在本發明之化合物中，第一個m、n及/或口可 與居式中第二個m、η及/或p相同或不同。然而，較佳狀況 係，兩個m具有相同值，兩個η具有相同值，及兩個ρ具有相 同值。 在本發月中，m介於1至1 7之間。在一較佳具體實施例中， m介於1至14之間。m更佳介於1至7之間，且尤佳者係m介於 1至4之間。m最佳係1。 在本發明中，η介於10至1，000之間。在本發明之一較佳具 86594 -12 - 200427697 體實施例中，η介於20至1，000之間。η較佳介於50至1，000之 間，且η更佳介於75至1，000之間。η最佳介於100至750之間。 在本發明中，ρ介於1至3之間。ρ較佳係3。 在較佳具體實施例中，Ρ係3，1係甲氧基，m係1，且η 介於100至7 50之間；或ρ係2，R!係甲氧基，m係1，且η介於 100至750之間；或ρ係1，I係甲氧基，m係1，且η介於100 至750之間。 本發明提供具體實施例之式（I)中，其中Ri係甲氧基，m 係1，η介於100至750之間，ρ係3，且NHT1249係藉由其末端 ® α-胺基共價键結之Τ1249多肽。 如上所述，本發明之聚乙二醇Τ1249化合物係將Τ1249之 α -胺基以共價方式键結至具有特殊結構之聚乙二醇衍生物 上。可以任何所需要的方式製造聚乙二醇化合物，但一般 係將Τ1249與個別製備之聚乙二醇衍生物反應而得。舉例而 言，阻斷Τ1249多肽上所有離胺酸殘基，並將此經阻斷Τ1249 與聚乙二醇衍生物反應可將Τ1249聚乙二醇化，然後，將 參 Τ1249多肽之經阻斷離胺酸殘基進行解阻斷作用，以產生末 ： 端聚乙二醇化之Τ1249。 < 可以任何合適之方式製備Τ1249多肽。舉例而言，以採用 Boc-胺基酸之固相法（Chem. Soc·，85, 2149，1963)相關之經 典梅裏菲爾德（Merrifield)固相合成技術合成該化合物，其 藉由使用手動或自動操作、使用Fmoc-胺基酸之固相法 (Sheppard, R.C.等人，J. Chem. Soc. Chem. Comm·，pp. 165-166 (1985))、使用一自 Advanced Chemtech·，Louisville， 86594 -13 - 200427697
Ky.獲得之 Advanced Chemtech模型 200、使用自 Millip〇re Bedford Mass獲得之Millipore 9050 +或其他合適之儀器完 成。 將編碼本發明之CDNA合合物結合至具有功能性病毒或 環狀質體DNA載體中可製備T1249,載體或質體可用來轉染 或轉化經選擇之微生物，該等經轉化或轉染之微生物可在 有助於表現經載體媒介的DNA序列之條件下培養，且自生 長培養基中分離所需之肽即可完成（參見，舉例而言，美國 專利案第\955,422號，該案之全文以引用的方式併入本文 參考）。 亦可使用技藝中所熟知之方法以標準重組DNA技術製備 T1249。舉例而言，該等方法闡釋於Sambrook等人之「分子 選殖：實驗室手冊」(Molecular Cloning: A Laboratory Mannal-2nd edition，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor， N. Y·)或Ausubel等人之「分子生物學之當前方案」(Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons，New York (1995))中，二者均以引用的方式併入本文參考。 製備T1249之一特定方法揭示於美國專利案第6,258,7872 號及美國專利案第6,348,568號中，二者均以引用的方式併 入本文參考。 在切除及去保護後，可以任何合適方式純化T1249。舉例 而言，離子交換、凝膠過濾、層析及/或反相管柱/HPLC系統 可用於透過T1249片段中純化全長之T1249。當首先製備 T1 249前驅體的情況下，可利用已知的技術將結合至其N- 86594 -14 - 200427697 端（例如酿基）及/或c -端（例如胺基）的阻斷/保護基團之一或 二者去除。 使用標準胺基酸分析及手動及自動埃德Edman)分解與測 定每一胺基酸來驗證及鑒定T1249的胺基酸序列。HPLC分 析及質譜法亦可用於驗證T1249之產生。 亦可以任何所需要之方式製造與T1249反應之聚乙二醇 醛化合物。然而，較佳者係根據2002年7月24日以「聚乙二 醇醛」之名稱同時申請之美國專利申請案第60/398，196號之 方法製造聚乙二醇，該專利案全文以引用的方式併入本文 參考。 一般而言，式（II)之聚乙二醇醛可將T1249聚乙二醇化： 〇
II R1-(CH2CH2〇)n-CH2CH2-0-(CH2)m-C-NH-(CH2)p-CHO (II) 其中Ri、m、η及p係如上文之定義。將T124 9聚乙二醇化所 用之聚乙二醇醛可藉由任何合適方式製備。一較佳聚乙二 醇醛係如下製備： 86594 -15 - 200427697 mPEGiOK-丁醇醛之反應示意圖 ⑴ h3C\
第三丁醇鉀 溴乙酸第三丁酯
(Chb)3 水解 ⑵ 0. Η3σ
1-羥基苯并二唑/ 二環己基碳二亞胺 (4) 4-胺基丁醛 二乙基縮酸 10%
〇
(OC^CH3)2 氟乙酸
h3c
不同大小（例如，不同η值）之聚乙二醇醛皆可根據上述通 用反應示意圖製備。 本發明之聚乙二醇Τ1249化合物可藉由任何合適之方式 製備。然而，本發明進一步提供將Τ1249多肽聚乙二醇化之 方法，其包含使Τ1249多肽（ΝΗΤ1249)與式（II)之聚乙二醇醛 反應， 〇
II R1-(CH2〇H2〇)n-CH2CH2-〇-(CH2)nn_C-NH-(CH2)p-CHO (II) 其中Ri、m、η、η及p係如上文之定義。 86594 -16 - 200427697 以生成式（i)化合物：
Rr(CH2CH2〇)n-CH2CH2.〇-(CH2)m-CO-NH-(CH2)p-CH2-NHT1249 (I) 其中聚乙二醇醛分子键結至T1249多肽之N-端胺基。 加入1:1至1:100莫耳比範圍之T1249及PEG試劑以製備聚 乙二醇T1249。如上所述，該T1249有一游離α-胺基（任何醯 基已被去除）及一游離羧基或一胺基保護之羧基。在室溫或 4°C及介於5.5至7.4間之pH值下，將該反應混合物置於硼酸 或磷酸緩衝液中約.5至24小時。PEG試劑與肽/蛋白之莫耳 _ 比介於1:1至100:1之間。肽/蛋白之濃度介於1至10毫克/毫升 之間。緩衝液之濃度通常為10至500 mM。 藉由提取聚乙二醇T1249之反應混合物，並用平衡緩衝液 (2〇111%1[1^，？117.5)將其稀釋，純化聚乙二醇1[1249。然後 將所得混合物施於Q-瓊脂糖凝膠（Q-Sepharose)管柱上。在 將該混合物施加至QA管柱上後，分別用經75MNaCl沖堤之 平衡緩衝液、經200 mM NaCl沖堤之平衡緩衝液、經1M NaCl 沖堤之平衡緩衝液洗滌；並用1M H0AC+1M NaCl及0.5M ^
NaOH再生。 使用反相HPLC，可輕易地使混合物中之N-端單聚乙二醇 產物與其他副產物分開及分離。舉例而言，在聚乙二醇 T-1249之圖譜中，形成數個圖峰，每個圖峰有不同之停滯 時間。第10.7分鐘的第一個圖峰代表未反應之肽，而第17.6 分鐘的第二個圖峰代表單聚乙二醇肽，隨後為第19分鐘出 現之雙聚乙二醇肽。可藉由基質輔助之雷射解析/電離-飛行 86594 •17- 200427697 時間質譜（MALDI-TOF)確認每一個所收集的產物。 在本發明聚乙二醇T1249多肽之較佳具體實施例中，p係 3，Ri係甲氧基，m係1，且η介於100至750之間；或p係2， 1係甲基，m係1，且η介於100至750之間；或ρ係1，R!係甲 氧基，m係1，且η介於100至750之間； 本發明亦提供具有下式之聚乙二醇Τ1249多肽： CH3-0-(CH2-CH2-0)n-CH2-CH2-0-CH2-CH2-CH2-NHT1249 (III) 其中η介於10至1，000之間，且NHT1249係藉由其末端α-胺基 春 共價键結之Τ1249多肽。在一個具體實施例中，η約為225， 舉例而言，η為227。在另一個具體實施例中，η約為450。 該聚乙二醇Τ1249多肽可以任何所需要之方式製造，較佳 地，其係以實例7中所述之方法製造。 本發明醫藥組合物包含混與醫藥上可接受賦形劑之式（I) 化合物，其中Ri、m、η、ρ及ΝΗΤ1249係如上文之定義。 包含聚乙二醇Τ1249多肽或其鹽類之本發明醫藥組合物 可以任何所需要之方式製造，例如，藉由熟知之混合法、 包膠法、溶解法、顆粒化法、乳化法、包埋法或冷凍乾燥 法製造。該等醫藥製劑可與醫療學上為惰性之無機或有機 賦形劑及載劑調配之。適合注射用之賦形劑包括水、乙醇、 多元醇、甘油、植物油、磷脂及表面活性劑。 該等醫藥製劑亦可含有防腐劑、增溶劑、穩定劑、潤濕 劑、乳化劑、甜味劑、著色劑、矯味劑、用於改變滲透壓 之鹽類、緩衝液、塗布劑或抗氧化劑。其亦可含有其他治 -18- 86594 200427697 療上有價值之物質，包括另外之活性成分。 適合以注射（包括腹膜内注射、肌肉注射、皮下注射、靜 脈内注射，或連續輸注）投藥之調配物可方便地以單位劑量 形式呈現’且可由熟知之醫藥技術製備。該等技術包括使 聚乙二醇T1249多肽與醫藥載劑或賦形劑結合之步驟。一般 而言，該調配物可藉由使聚乙二醇T1249多肽與液體載劑均 勻及充分結合來製備。適用於非經腸投予之調配物包括·· 含水及無水之無菌注射液，其可含有抗氧化劑、緩衝液、 抑菌劑及可提供使調配物與預期接受者之血液等滲之溶 質；及含水和無水之懸浮液，其可包括懸浮劑及增稠劑。 該調配物可以單位劑量或多劑量容器形式呈現，舉例而 言，密封之安瓶及小瓶，且其可儲存於冷凍乾燥（凍乾）之條 件下且僅需要在使用前加入用於注射之無菌液體載劑，舉 例而言，水。 較佳單位劑量調配物係彼等含有投予成份之日劑量、日 分次劑量、週劑量、週分次劑量（如上文所述）或其一適宜部 分者。 較佳地，該聚乙二醇T1249多肽為單位劑量形式。本文所 用「單位劑量形式」意指適於單劑之聚乙二醇T1249多肽之 含量’其係以預先量測及/或預先包裝之形式呈現。由此可 方便地製備適於投予之聚乙二醇T1249多肽，且甚至可允許 患者自行投藥。該單位劑量顯然端視欲傳送之聚乙二醇 T1249多肽之含量及投予頻率而定。 聚乙二醇T1249多肽亦可為單位劑量之冷凍乾燥粉末形 86594 -19- 200427697 式，其適用於在投藥前與醫藥上可接受賦形劑進行復水作 本發明之一特殊醫藥組合物包含混與醫藥上可接受賦形 劑之式（I)化合物（其中Ri係甲氧基，m係1，η介於100至750 之間，且ρ係3)。 本發明之另一醫藥組合物係包含混與醫藥上可接受賦形 劑混合之式（III)化合物（其中η介於10至1，000之間，且 ΝΗΤ1249係藉由其末端α-胺基共價键結之Τ1249多肽）之醫 藥組合物，-。在一個具體實施例中，η約為225，舉例而言， η為227。在另一具體實施例中，η約為450。 本發明進一步提供抑制HIV感染之方法，其包含投予患者 包含混與醫藥上可接受賦形劑混合之式（I)化合物（其中 Ri、m、η、ρ及ΝΗΤ1249係如上文之定義）之醫藥組合物。 聚乙二醇Τ1249多肽一般以（未聚乙二醇化之）Τ1249多肽 之當前投予方式投予。然而，可加以修飾以利用聚乙二醇 Τ1249多肽之改良藥物動力學特性。 在本發明之抑制HI V之方法中，該醫藥組合物可以任何合 適方式及途徑投予。在一較佳方法中，聚乙二醇T1249多肽 以注射液或懸浮液之形式投予。該注射液或懸浮液較佳藉 由皮下注射或經靜脈投予。 在另一較佳方法中，聚乙二醇T1249多肽藉由經皮傳遞裝 置投予，例如，經皮貼片。 在本發明抑制HI V之方法中，該醫藥組合物可以任何合適 之劑量及療程投予。本發明之醫藥組合物可以所需要之任 86594 -20 - 200427697 何形式及藉由任何途徑投予。然而，一般而言，本發明之 聚乙二醇T1249多肽以非經腸方式投予，舉例而言，以注射 液形式投予。 治療有效量之確定係為熟習此項技藝者所熟知，且根據 本發明之聚乙二醇T1249多肽之治療有效量或劑量可變 化，且其在每一特定案例中可根據個體需求調整。一般而 言，約70公斤重成人以注射方式投藥狀況而言，日劑量約 50毫克至約300毫克為宜，較佳約50毫克至約200毫克為 宜，惟當需要時可超出該上限。該劑量可以單次劑量、分 次劑量或以連續輸注形式投予。 該醫藥組合物可以任何方便之給藥療程投藥。較佳地， 該醫藥組合物以每日一次、每日兩次、每隔一天一次、每 週一次或每週兩次之形式投予。更佳地，該醫藥組合物每 週投藥一次。 較佳地，該醫藥組合物以約300毫克至約1，500毫克之劑量 每週投予一次，更佳地，該醫藥組合物以約400毫克至約 1，〇〇〇毫克之劑量每週投予一次，尤佳地，該醫藥組合物以 約100毫克至約200毫克之劑量每週投予一次。 本發明亦提供一種抑制HIV感染之方法，其包括投予包含 混與醫藥上可接受賦形劑之式（I)化合物（其中Ri係甲氧 基，m係1，η介於100至750之間，且p係3)之醫藥組合物。 亦涵蓋於本發明之範圍中者為抑制HI V感染之方法，其包 括投予包含混與醫藥上可接受賦形劑之式（III)化合物（其中 η介於10至1，000之間，且NHT1249係藉由其末端α-胺基共價 86594 -21 - 200427697 键結之Τ1249多肽）之醫藥組合物。在一個具體實施例中，n 約為225，舉例而言，η為227。在另一具體實施例中，^约 為 450。 【實施方式】 下述實例係用以進一步闡釋本發明之化合物、組合物及 方法。該等實例僅用於舉例說明之目的，而非以任何方式 限定本發明之範圍。 實例1 - PEG·-丁醇醛之製備 將溶於240毫升甲苯分子量為1〇,〇〇〇之mPEG (30.0克，3 毫莫耳）加熱回流2小時共沸乾燥，隨後去除120毫升甲苯。 將所得溶液冷卻至室溫，然後在該PEG溶液中加入溶於20 毫升無水第三丁醇及20毫升甲苯中之第三丁醇鉀（0.68克，6 毫莫耳）。在氬氣中於室溫下，攪拌2小時所得混合物。溴 代醋酸第三丁酯（1.00毫升，6.75毫莫耳）藉由注射器加入該 反應液中，並在氬氣中於室溫下隔夜攪拌該反應液。然後， 以旋轉蒸發濃縮該反應液。加入二乙醚沈澱殘餘物。過濾 出所沉澱的mPEG10K羧甲基醚第三丁酯產物，並真空乾燥。 產量：28克。NMR (d6-DMS〇）： 1.40 ppm (t，9H，-CH3); 3.21 PPm (s，-〇CH3); 3.50 ppm (s，_〇-CH2CH2-0-); 3.96 ppm (s， 2H，-〇-CH2-COO-)。 然後將mPEG10k羧甲基醚第三丁酯（26.5克）溶解於350毫 升1 N氫氧化鈉中，並在室溫下隔夜攪拌該溶液。加入6>1鹽 酸調節該混合物之pH值至2.5，並用二氯甲烷萃取該混合 86594 -22- 200427697 物。有機層經硫酸鈉乾燥、過濾、濃縮並在二乙基醚中沈 澱。過濾收集產物m-PEG1QK-羧甲基酸並真空乾燥。產量： 24克。NMR (d6-DMS〇）： 3.21 ppm (s，-OCH3); 3.5 ppm (s， -0-CH2CH2-〇-); 3.99 ppm (s，2H，-0-CH2-C00H)。 然後將mPEG1QK-羧甲基酸（6克，0.6毫莫耳）溶解於無水二 氯甲烷（30毫升）中，隨後加入4-胺基丁醛二乙基縮醛（140毫 升，0.9毫莫耳）、1-羥基苯并三唑（80毫克，0.6毫莫耳）及二 環己基碳二亞胺（160毫克，0.78毫莫耳），在氬氣中於室溫 下隔夜攪拌該混合物。將反應混合物過濾、離心，並用2-丙醇與二乙基醚（1:1)之混合物沈澱。mPEG1()K-丁醇縮醛產 物隔夜真空乾燥。產量：5.4克。NMR(d6-DMSO): 1.07-1.12 ppm(t，6H，（-0-CH2_CH3)2);1.46ppm(m，4H，-NHCH2CH2-CH2-CH-); 3.08-3.11 ppm (q5 2H，-NHCH2CH2CH2-CH-); 3·21 ppm (s, -OCH3); 3.5 ppm (s5 -0-CH2CH2-0-)； 3.85 ppm (s5 2H, -0-CH2-C〇-NH-); 4.44 ppm (t，1H，-NHCH2CH2CH2-CH-); 7.67 ppm (-NH-)。 然後將mPEG1GK-丁醇縮醛（2克，0.2毫莫耳）溶解於20毫升 80%之CF3COOH中，且於室溫下隔夜攪拌該溶液。加入1 N NaOH溶液將混合物之pH值調節至6.0，加入氣化鈉（10重量 比），然後加入INNaOH將溶液之pH值調節至7.0。利用二氣 甲烷萃取該混合物。有機層經硫酸鈉乾燥、過濾、濃縮並 在二乙基醚中沈澱。過漉收集產物mPEG1()K-丁醇醛並在真 空中乾燥。產量：1.7 克。NMR (d6_DMSO): 3.21 ppm (s， -OCH3); 3.5 ppm (s, -O-CH2CH2-O-)； 3.85 ppm (s? 2H, -O- 86594 -23 - 200427697 CH2-CO-NH-); 7.67 ppm (-NH-); 9.66 ppm (-CHO-)。 實例2 使用11^£01(^-丁醇醛使丁1249聚乙二醇化 以每一莫耳T1249比5莫耳試劑之莫耳比例，將根據實例1 所製備分子量為10 kDa之PEG丁醇醛（mPEG1GK-CMAB)加至 溶於1.0毫升緩衝液（50 mM磷酸鉀，pH值6.5)之20毫克T1249 (純度93.7%)中。T1249多肽的α-胺基端脫去醯基，但其在羧 基端以-ΝΗ2保護。將10% (體積比）之0.5 Μ氰基硼氫化鈉之 水溶液加至該反應混合物中，並在室溫下攪拌4小時。利用 離子交換層析法（QA)純化反應混合物中的聚乙二醇Τ-1249 利用。以溶於20 mM Tris中，pH 7.5之65 mM至1 M NaCl之 漸增鹽濃度）分級梯度將聚乙二醇ΤΙ249及未經修飾之 Τ1249分離。 實例3 mPEG，w丁醇醛之製借 溶於800毫升甲苯分子量為20,000之mPEG (60.0克，3毫莫 耳）加熱回流2小時共沸乾燥，隨後去除200毫升甲苯。將所 得溶液冷卻至室溫，然後在該PEG溶液中加入溶於20毫升無 水第三丁醇及20毫升曱苯中之第三丁醇鉀（0.68克，6毫莫 耳）。在氬氣中於室溫下攪拌2小時所得混合物。溴代醋酸 第三丁酯（1.00毫升，6.75毫莫耳）藉由注射器加入該反應液 中，並在氬氣中於室溫下隔夜攪拌該反應液。然後，以旋 轉蒸發濃縮該反應液。加入二乙基醚沈澱殘餘物。過濾出 所沉殿的mPEG2〇K竣甲基醚第三丁酯產物，並真空乾燥。產 86594 -24- 200427697 量：56克。NMR (d6-DMSO): 1.42 ppm (t，9H，-CH3); 3.21 ppm (s5 -〇CH3); 3·50 ppm (s，-O-CI^CHrO); 3.98 ppm (s，2H， -〇-CH2-C〇〇-)。 然後將mPEG2〇k羧甲基醚第三丁酯（28克）溶解於750毫升1 N 氫氧化鈉中，並在室溫下隔夜攪拌該溶液。加入6 N鹽酸將 該混合物之pH值調節至2.5，並用二氯甲烷萃取該混合物。 有機層經硫酸鈉乾燥、過濾、濃縮，並在二乙基醚中沈殿。 過濾收集產物m-PEG2〇K-羧甲基酸，並真空乾燥。產量：25 克。NMR一(d6_DMSO): 3.21 ppm (s5 -〇CH3); 3.5 ppm (s5 -0-CH2CH2_O); 4.01 ppm (s，2H，-0-CH2-C00H)。 然後將mPEG2〇K-羧甲基酸（20克，1.0毫莫耳）溶解於無水 二氯甲烷（100毫升）中，隨後加入4-胺基丁醛二乙基縮醛 (0.77毫升，4毫莫耳）、1_羥基苯并三唑（270毫克，2.0毫莫 耳）及二環己基碳二亞胺（6 20毫克，3.0毫莫耳）。在氬氣中 於室溫下隔夜攪拌該混合物。將所得混合物予以過濾、濃 縮，並用2-丙醇與二乙基醚（1:1)之混合物沈澱。mPEG20K-丁醇縮醛產物隔夜真空乾燥。產量·· 18.6克。NMR (d6-DMSO)·· 1.07-1.12 ppm (t，6H，（-〇-CH2-CH3)2); 1.46 ppm (m, 4H， -NHCH2CH2CH2-CH-); 3.08-3.11 ppm (q? 2H5 -NHCH2CH2-CH2-CH-); 3.21 ppm (s? -OCH3)； 3.5 ppm (s5 -0-CH2CH2-0-); 3.85 ppm (s，2H，-〇-CH2-C〇-NH-); 4.44 ppm (t， 1H， -NHCH2CH2CH2-CH-); 7.67 ppm (-NH-)。 然後將mPEG2QK-丁醇縮醛（14.7克，0.73毫莫耳）溶解於200 毫升10%之CF3COOH中，且於室溫下隔夜攪拌該溶液。加 -25 - 86594 200427697 入1 N NaOH溶液將混合物之pH值調節至6.0,加入氯化鈉（10 重量比），然後加入1 NNa〇H將溶液之pH值調節至7.0。用二 氯甲烷萃取該混合物。有機層經硫酸鈉乾燥、過濾、濃縮， 並在二乙基醚中沈澱。過濾收集產物mPEG2〇K- 丁醇醛並真 空乾燥。產量：13.1 克。NMR (d6-DMS〇）： 3.21 ppm (s，-OCH3); 3.5 ρρπι (s, -O-CH2CH2-O-)j 3.85 ppm (s5 2H? -O-CH2-CO-NH-); 7.67 ppm (-NH-); 9.65 ppm (-CHO_) 0 實例4 使用mPEG9〇K_丁醇醛使T1249聚乙二醇化 以每一莫耳T1249比10莫耳試劑之莫耳比例，將根據實例 3所製備分子量為20 kDa之PEG 丁醇醛加至溶於0.4毫升之 5〇111]^硼酸緩衝液（？^1值9.5)之20毫克1[1249 (純度93.7%) 中，然後利用100 mM磷酸鉀（pH值6.5)稀釋10倍。T1249多 肽的α-胺基端脫去醯基，但其在羧基端以-NH2保護。將0.4 毫升（10%，體積比）之〇·5 Μ氰基硼氫化鈉（NaBH3CN)水溶液 加至該反應混合物中，並在室溫下攪拌4小時。然後反應混 合物以平衡緩衝液（20 mM Tris，pH 7.5)稀釋10倍，並經0.45 微米遽膜過滤。利用離子叉換層析法（Q-Sepharose)自該反 應混合物中純化聚乙二醇T1249。分別使用75 mM、200 mM 至1 M NaCl之漸增鹽濃度分級梯度之平衡緩衝液將雙聚乙 二醇T1249、單聚乙二醇T1249及未經修飾之T1249分離。使 用70毫克T1249、1:10莫耳過量之PEG2GK-丁醇醛重復上述實 驗，且如上所述進行純化。自兩個實驗中所獲得之單聚乙 二醇T1249 (200 mM NaCl沖堤液）收集液混合，濃縮至約2 86594 -26 - 200427697 毫克/毫升，並以保存緩衝液（pBS緩衝液，pH 7 ·3)進行透析 過濾中，且存儲於-20°C下，直至進一步使用之時。使用該 物質分液分析抗病毒活性。 實例5 使用mPEGMKzXJ^醛獲得之簞聚乙二醇T1249百分比、二聚 一醇T1249百分比及三聚乙二醇T1249百分比 以一系列實驗測定使用mPEG20K-丁醇醛所獲得之單聚乙 二醇T1249百分比、二聚乙二醇T1249百分比及三聚乙二醇 T1249百分北，其中T1249:PEG之莫耳比、反應溶液之pH值籲 及反應時間之變化如下表1、2及3中所示。該等實驗之目的 係最佳化聚乙二醇化作用參數。 舉例而言’在表1中，將根據實例3所製備分子量為2〇 kDa 之PEG丁醇趁（mPEG2〇K-CMAB)加至溶於50mM磷酸鉀（pH值 6.5)之5毫克1：1249 (純度93.7%)中。1[1249多肽的.胺基端脫 去醯基’但其在幾基端以-NH2保護。pEG試劑與T1249之莫 耳比為1.1、1.2及1:5。將10 % (體積比）之〇5 Μ氰基硼氫化鋼 水溶液加至該反應混合物中。於室溫下，在2、4、6及24小春< 時之預定時間間隔内取出一分液試樣。 Α1 pH值為6·5之磷醢鉀铭
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以表3而言，係以每一莫耳丁 1249比10莫耳PEG試劑之』 86594 -28- 200427697 耳比例，將根據實例3所製備分子量為2〇 kDa之PEG 丁醇醛 (mPEG2〇K-CMAB)加至溶於50 mM磷酸鉀（pH值5 5)之5毫克 丁1249 (純度93.7%)中。丁1249多肽的〇1-胺基端脫去醯基，但 其在羧基端以-NH2保護。將10% (體積比）之〇 5 乂氰基硼氫 化鈉之水溶液加至該反應混合物中。室溫下，在2、4、6及 24小時之預定時間間隔内取出一分液試樣。 表3 為5.5之磷酸鉀鳐衝译
及三聚乙二醇 Τ1249及未反應游離Τ1249之百分比。上表卜如中所例示 數據說明，於不同之T1249:PEG之莫耳比、ρΗ值及反應時 間條件下達到單聚乙二醇Τ1249之最佳量。舉例而言，在表 1中61 /〇之最佳單聚乙二醇化作用出現於T1249:PEG之莫 耳比為1:5且時間點為6小時下。在表2中，61%之最佳單聚 乙二醇化作用Μ於T1249:PEG之莫#為丨_ig且時間: 為4小時下。在表3中，⑽之最佳單聚乙二醇化作用出現於 T1249:PEG之莫耳比為丨：10且時間點為6小時下。 實例6 歪^二醇化作用位黜^，:目，丨^ 86594 -29- 200427697 為評估T1249與PEG之結合位點而進行一系列的實驗。結 果顯示，95%以上之修飾作用發生在位於N-端的色胺酸殘 基處，其他修飾作用位點較少發生（<5%)，但其確實性質尚 不清楚。 為了測定PEG之修飾作用位點，用内切蛋白酶Lys-C消化 樣品，並以反相HPLC將肽分離。進一步利用納諾（nano)喷 霧ESI (電噴霧離子化作用）質譜、MALDI TOF (基質輔助之 雷射解析/電離飛行時間）質譜及N-端（埃德曼）序列測定分 析個別肽锋。該等操作概述如下。 在環境溫度下，將根據實例4製備分子量為20K之單聚乙 二醇化-丁醇醛-T1249 (20k mPEG_CMAB-T1249)樣品及 T1249 (游離α-胺基端；其羧基端經-NH2保護）用内切蛋白酶 Lys-C以蛋白水解方式消化2小時（其中樣品與酶之比為10/1 (重量比））。加入錯酸至2%之終濃度（體積比）終止反應。 使用裝備有Phenomenex Luna反相管柱（C-18，3μ，150X 200毫米）之ΗΡ1100 HPLC系統，以反相HPLC分離蛋白水解 肽。溶劑系統由水、乙腈及三乳醋酸（0.05%)組成。梯度在 50分鐘内於0.2毫升/分鐘之流速下為5%至64%有機溶劑。收 集含肽♦之分液進一步分析。 然後在Finnigan LCQ離子捕獲儀上使用納諾噴霧ESI質譜 分析所有收集樣品。根據實驗分子量鑑定出個別肽。亦可 用Bruker Reflex儀以MALDI TOF質譜分析含PEG肽之分 液。所用基質為反-3-4丨哚基丙烯酸或α-4-羥基肉桂酸。
然後在Perkin Elmer (ΑΒΙ)精密儀器上自動定序含有PEG 86594 -30- 200427697 肽的分液之N-端（埃德曼）。 聚乙二醇T1249之蛋白水解片段之反相HPLC分析結果顯 示於圖1中。圖1顯示獲自兩個樣品之反相HPLC分析UV圖 譜。對照T1249中觀察到之N_端肽（圖1B中之HT-20峰）在經 PEG修飾之T1249 (圖1A)中完全不存在。取而代之的是出現 一個新的峰（圖1A中之PEG_34峰），其含有經PEG修飾之肽。 分析個別HPLC分液所獲得之質譜結果總結於表4中。未 經修飾之肽之所有實驗分子量均與其計算值一致。 表4:所收矣HPLC分液獲得之分析結果（亦參見圖1) HPLC 辛1 分子量 (計算值)2 Da 分子量 (實驗值)3 Da N-端序列4 肽識別5 Seq ID PEG-17 922.4 922.4 n.A. NEYELQK Seq ID：2 PEG-22 1611.9 1611.7 n.A. ITALLEQAQIQQEK SeqID：3 PEG-34 n.A. 23082.6 XQEWEQK PEG-WQEWEQK Seq ID：4 PEG-37 1122.5 1122.4 n.A. waslwewf-nh2 Seq ID：5 HT-17 922.4 922.4 n.A. NEYELQK Seq ID：2 HT-20 1032.5 1032.4 n.A. WQEWEQK ----一 Seq ID：4 HT-22 1611.9 1611.7 n.A. ITALLEQAQIQQEK Seq ID：3 HT-37 1122.5 1122.4 n.A. WASLWEWF-NH2 Seq ID：5 1亦參見圖1 ; 2以Da表示之計算精確質量；3以Da表示之測量 質量，未經修飾之肽之納諾噴霧ESI質譜及經PEG修飾之肽 之MALDI TOF質譜；4自動埃德曼測序’ η·Α· =未獲得， 未識別；5基於MW —致性及/或埃德曼測序。未經修飾之 T1249樣品之胺基酸序列係： 86594 -31 - 200427697 WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2。 自完整經PEG修飾之T1249獲得之MALDI TOF質譜顯示 於圖2A中，所測得之分子量為26758 Da，注意存在某些未 經修飾之肽，其來源目前尚不清楚，然而其可能係因質譜 儀自身中之量測所造成。自PEG-34分液（圖1)獲得之MALDI TOF質譜顯示於圖2B中，所測得分子量為23083 Da，該分子 量及質譜之圖形可鑑別出HPLC分液PEG-34係含有經PEG 修飾之肽者。以納諾喷霧ESI質譜亦顯示HPLC分液中存在 PEG (數據床顯示）。 自動化N-端測序（埃德曼：Edman)結果顯示於圖3中。已 觀察到之主要序列為N-端内切Lys-C肽xQEWEQK。除了第 一個胺基酸殘基外，所有其他胺基酸均可以相當大之產量 回收。在第一個胺基酸位置上色胺酸基本不能回收（圖3， 循環3)。HPLC UV圖譜、MALDI T〇F質譜及N-端測序之結 果可鑑別出N-端色胺酸為主要之PEG修飾作用位點。 上述結果與聚乙二醇醛及T1249之N-端色胺酸間所存在 之鏈結相一致。儘管無法完全排除直接與色胺酸側鏈之鏈 結，但自N-端定序所獲之結果顯示似乎與N-端胺基處存在’’ 阻斷’TEG部分相互矛盾。 實例7 徒用mPEG1〇ic-丙醛使T1249聚乙二醇化 使用具有下列結構之PEG 10kDa之丙醛。 ch3-o-(ch2-ch2-o)227-ch2-ch2_o-ch2_ch2-cho 以每一莫耳T1249比5莫耳試劑之莫耳比例，將200毫克 86594 -32- 200427697 mPEG l〇k-丙醛加至溶於1.0毫升緩衝液（50 mM磷酸鉀，pH 值6.5)之20毫克T1249 (純度93.7%)中。T1249多肽的a-胺基 端脫去醯基，但其在羧基端以-NH2保護。 將10% (體積比）之0.5 Μ氰基硼氫化鈉水溶液加至該反應 混合物中，並在室溫下攪拌4小時。利用離子交換層析法（QA) 自該反應混合物中純化聚乙二醇Τ1249。該聚乙二醇Τ1249 之結構如下： CH3-〇-(CH2-CH2-0)n-CH2-CH2-〇-CH2-CH2-CH2-NH-T1249 (III) 以溶於20 mM Tris中，pH 7·5之65 mM至1 M NaCl)之漸增 鹽濃度線性梯度將聚乙二醇T1249及未經修飾之T1249分 離。然後以反相HPLC測定單聚乙二醇T1249與未反應之游 離丁1249之百分比，且測定為31.7%。 實例8 cMAGI/MAGI抗病毒分析 該等分析係使用指標細胞株MAGI (半乳苷酶指標劑之多 核活化作用）或CCR5表現衍生物來評價cMAGI感染性病毒 效價之降低量。MAGI細胞系衍生自親本HeLa細胞，其係以 兼嗜性逆轉錄病毒載體引入CD4基因及HIV-1 LTR驅動之 b-gal報告基因（Kimpton J，Emerman M，J Virol 66:2232-9, 1992)後獲得。cMAGI細胞衍生自MAGI細胞株，其係以兼嗜 性逆轉錄病毒載體PA3 I?引入CCR5基因後獲得（Chackerian B，Long EM, Luciw PA? Overbaugh J, J Virol 71:3932-9, 1997)。cMAGI細胞可輔助原始NSI(R5)分離株及實驗室用 86594 -33 - 200427697 X4病毒之複製作用，而MAGI細胞則僅輔助X4病毒之複製 作用。兩種細胞株均利用HI V-l tat的能力以反式激活由 HIV-LTR驅動之b-半乳糖甞酶報告基因之表現。該b-gal報告 基因已經修飾定位於核中，且可在感染幾天内，可利用X-gal 底物作為強烈的核染色予以檢測。若在染色前僅有一輪感 染，則經染色之核之數量可解釋為等於激發接種物中感染 性病毒顆粒之數量。 感染後24小時加入感染及細胞•細胞融合抑制劑，例如， T1249 (Wi4d C5 Greenwell T? Matthews Τ? AIDS Res Hum Retroviruses 9:1051-3，1993)，藉以獲到確切代表單獨一輪 感染之讀數。使用CCD-圖像儀計數感染細胞，且原始分離 株及實驗室用分離株兩者在病毒輸入及圖像儀上所見之感 染細胞數量之間均顯示線性關係。在MAGI及cMAGI分析 中，感染效價明顯降低50% (Vn/VQ=0.5)，且其可提供用於 評價抗病毒活性之原始截距值。感染效價降低90% (Vn/V。) 用作評價抗病毒活性之另一截距值。 48孔微量滴定盤中的病毒接種物調節至約1500-2000感 染細胞/孔，每一測試化合物稀釋液均針對一病毒接種物檢 測兩次。將測試化合物加至cMAGI或MAGI細胞中，隨後加 入病毒接種物，2 4小時後，加入感染及細胞-細胞融合抑制 劑（Wild C，Greenwell T，Matthews T? AIDS Res Hum Retroviruses 9:1051-3，1993)，以阻止繼發感染及細胞-細胞 病毒擴散。將細胞再培養2天、固定並用X-gal受質染色以檢 測感染細胞。用CCD-圖像儀測定每一對照及測試化合物稀 86594 -34 - 200427697 釋液之感染細胞之數量。IC50定義為減少50%感染性病毒效 價之測試化合物之稀釋量。IC90定義為減少90%感染性病毒 效價之測試化合物之稀釋量。 實例9 聚乙二醇T1249之IC50/IC90 T1249及經mPEG20K-丁醇醛聚乙二醇化之T1249 (實例4， 下文中稱之為，fmPEG20K_CMAB-T1249，，）之 IC50 及 IC90 結果 顯示於下表5中。IC5〇及IC9〇值係根據實例8測定。 肽 一 IC50 (微克/毫升） IC90 (微克/毫升） T1249 0.003 0.023 mPEG2〇K-CMAB-T 1249 0.041 (批次 1) 0.206 (批次 1) 0.170 (批次2) 0.835 (批次2) 表5 1C 50及1C 90結果。 與親本T1249分子相比，使用mPEG2〇K-CMAB_T1249時觀 察到活體外抗病毒活性降低（對於批次1，IC50降低13.7倍； IC90降低9倍）。然而，活體外活性之喪失不能預測如闡釋春 於實例12中之結果所例示之活體内生物學活性（參見，圖6)。 、 f例1〇 使用mPEGwic-丙醛聚乙二醇化之T1249之藥物動力學_ 研究設計 9 隻雄性 Wistar 大老鼠（Charles River Laboratories，
Wilmington，DE)(n=3/時間點）以皮下方式接受單次投丁劑 量之經mPEG20K-丙醇醛聚乙二醇化之T1249 (實例4)。 將mPEG20K-CMAB-T1249懸浮於水中，並以NaOH滴定至 86594 -35 - 200427697 pH值為6.8。然後將mPEG2〇K-CMAB-T1249懸浮液溶解於最 小體積之碳酸鈉緩衝液中，並用PBS緩衝液稀釋至pH值為 7.3_7.4。PEG-T1249之用量應足以使最終調配物中mPEG20K-CMAB-T1249之濃度為150毫克/毫升。大鼠之用藥劑量為8 毫克活性成份/公斤體重。 投藥後，在每一時間點自後眼窩竇處採集約1毫升血液。 該等時間點為投藥後0.5、1、3、6、8、16、24、32、48、 72小時。所有血液樣品於室溫下均最長放置30分鐘，並用 冰冷離心法分離出血清。 生物分析方法 所有血液樣品使用由0.05 Μ醋酸胺及乙腈組成之線性梯 度於反相HPLC C18柱上分離。在280奈米處監測吸收值。利 用經mPEG2QK-CMAB-T1249外添加之血清萃取物作為校正 標準，自圖形（曲線v. [mPEG2〇K-CMAB-T1249]下之面積）外 插求出濃度。 已報導之藥物動力學參數係藉由市售動力學分析軟體組 合 WinNonlin 3.3 版（Pharsight Corporation，Mountain View， CA)，使用非區室化分析综合自mPEG20K-CMAB-T1249、其 代謝物及二者之組合之血清濃度曲線獲得。 結果 圖4顯示大老鼠以皮下單次劑量投予mPEG2GK_CMAB-T1249之濃度-時間關係圖。0.5小時時間點上未檢測到 mPEG2〇K-CMAB-Tl 249或代謝產物之含量，此顯示自注射位 點開始之緩慢吸收過程。對於代謝產物而言，第一個可檢 86594 -36- 200427697 測之濃度出現於投藥後6小時，其代表代謝產物生成之緩慢 過程。mPEG2QK-CMAB-T1249及其代謝物之最低血清濃度分 別於投藥後48及72小時檢測到。 系統性C1/F 及 Vd/F、AUC (0-48小時或 0_72小時）、Cmax、
Tmax及半衰期示於下表6中。 參數（單位） mPEG2〇K" CMAB-T1249 mPEG2〇K~CMAB-T1249代謝物 親本化合物 及代謝物 AUC (微克 小時/毫升） 279a 508b 766b Cmax (微克/毫升:Γ 14.8 13.9 27.2 Τι/2 端 (小時） 8.9 15.7 13.8 C1/F (毫升/ 小時/公斤） 27.4 14.6 10.0 Vd/F (毫升/公斤） 353 330 199 Tmax (小時） 16 24 16 表6大老鼠中之mPEG20K-CMAB-T1249之藥物動力學參數 a AUC(K48小時；b AUC 0-72小時 實例11 T124 9之藥物動力學 研究設 每一治療組由9隻雌性及9隻雄性Sprague-Dawley大老鼠 (Charles River Laboratories，Wilmington，DE)組成。治療組 之每一成員以皮下方式或靜脈内方式接受單次劑量之 T1249 (參見實例9/表5之批次2)。大老鼠之用藥劑量為12 86594 -37- 200427697 或15毫克活性成份/公斤體重。 在12小時期間於每一時間點自試驗動物（每組每一性別 二隻大鼠）收集血液樣品。該等時間點為投藥後〇 5、1、2、 4、6、8、10 及 12小時。 生物分析方法 該等血液樣品使用T1249 PcAb ECLIA測定法分析。T1249 PcAb ECLIA係非競爭性兩位點免疫測定法，其使用兩種對 丁 1249具有不同特異性之兔子PcAb製劑。在該測定法中， T1249之測—足係先將稀釋測試樣品置於亦含有生物素標記 抗體（A製劑）及釕標記之抗體⑺製劑）之試管中反應。在下一 步騾中’將塗布鏈黴抗生物素之磁珠加至試管中，以捕# 所生成之抗體-肽-抗體免疫複合物（三明治夾層結構），然後 藉由泵使該混合物通過分析儀中之流動槽，然後將電流施 加至毗鄰流動槽之磁體上，通過結合至檢測抗體之釕金屬 離子與在分析緩衝液中存在之過量三丙胺離子間之環氧化 還原反應可產生光’該光能為量測終點。與含有少量或不 含T1249之樣品相比，含有大量T1249之樣品可呈現較高之 信號。 結果 圖5顯示大老鼠以皮下方式或靜脈内方式單次劑量投予 丁1249後之濃度-時間關係圖。
Tmax、半衰期、AUC (0_12小時及0_c〇小時）&Cmax示於下 表7中。 86594 -38- 200427697 參數 (單位） 劑量組 1.2毫克 /公斤 (皮下） 15毫克 /公斤 (皮下) 1.5毫克 /公斤 (靜脈内） 5.0毫克 /公斤 (靜脈内） Τι/2 端 (小時） 2.02 2.00 2.46 1.86 Tmax (小時） 1.09 1.88 - - Cmax (微克/毫升） 6.37 21.5 15.7 46.3 AUC(〇-i2 小時） (微克小時/毫升） 27.0 107 45.6 118 AUC(0-o〇 小時） (微克小時/毫升） 27.6 110 47.1 120 表7大老鼠中T1249之藥物動力學參數 就mPEG2QK_CMAB-T1249之藥物動力學數據（表6)及以皮 下方式投予15毫克/公斤之T1249 (表7)而論，mPEG20K-CMAB-T1249之最終半衰期增加了 4·5倍。較高的Tmax反應 出，mPEG20K_CMAB-T1249之清除率較T1249低，儘管二者 具有相似之Cmax。另外，一旦自表7獲得之數據因劑量差異 而實施標準化（15毫克/公斤標準化成如實例10中之8毫克/ 公斤），則可觀察到mPEG2QK-CMAB-T1249之AUC之增加量 為T1249的5倍（對於T1249為57.1微克小時/毫升（經標準 化），而對於mPEG2〇K-CMAB-T1249為279微克小時/毫升）。 實例12 T1249及mPEG，麗-CMAB-T1249對小鼠.中之HIV-1病I性畲 荷之作用 86594 -39 - 200427697 每一治療組使用9隻HuPBMC-SCID小鼠（PEG對照組除 外，其使用6隻小鼠）。在第0天，每一治療組經HI V分離株 感染後，接受下午治療。其後，自第1天至第6天每一治療 組每曰接受2次治療（上午及下午）。小鼠於第7天上收集樣 品。給藥詳情參見表8。用於T1249分析之血漿樣品於最後 一次劑量投藥後約14小時時收集。 劑量組 丨劑量 |小鼠/組 |天 I活性 鹽水對照組 0毫克/天 9 1-6 上午劑量 _下午劑量 T1249 0.7毫克/天 9 1-6 上午劑量 2毫克/天 9 下午劑量 7毫克/天 9 _ mPEG2〇K- 0.7毫克/天 9 1-6 上午劑量 CMAB-T1249 2毫克/天 9 下午劑量 _7毫克/天_9__ PEG對照組 7毫克/天 6 ΰ~6 上午劑量 _下午劑量 全部_7_收穫 表8劑量示意圖 血漿中之HIV-1係以實時定量PCR測定。收集血漿以為 Τ1249化合物量化之用。然後對冷凍乾燥之血漿樣品進行化 合物分析。 圖 6 顯示 Τ1249 及 mPEG20K-CMAB-T1249之給藥對 SCID 小 鼠中HIV-1病毒性負荷之作用。 丁 1249及mPEG20K-CMAB-T1249在活體内具有相同之活 86594 -40- 200427697 性。結果顯示，根據所測試化合物之血漿濃度之活體内病 毒抑制活性無可識別的差異性。 上述結果顯示本發明之有益特性，即在血漿濃度相同時 mPEG20K-CMAB-T1249及T1249之活體内生物學活性相等 (實例12)，及如實例10及11之比較所示，mPEG2GK-CMAB-T1249之藥物動力學特性要優越得多。 很明顯，經闡釋之本發明具有多種變化，該等變化不應 視為偏離本發明之主旨及範圍，且所有該等變化皆欲包括 於下述申請專利範圍之範圍内。 【圖式簡單說明】 圖1所示為經PEG修飾T1249及未經修飾T1249之酶促消 化之比較結果。其中所示係以内切蛋白酶Lys-C之消化作用 及隨後以反相HPLC之分離作用。 圖2所示為所收集之HPLC分液PEG_34 (圖1)之基質輔助 之雷射解析電離飛行時間（MALDI TOF)質譜。在使用反-3-吲哚基丙烯酸作為基質之狀況下，獲得之圖譜為線性模式。 圖3所示為所收集之HPLC分液PEG-34 (圖1)之N-端（埃德 曼（Edman))序列。 圖4所示為大老鼠以皮下方式投予單次劑量mPEG20K-CMAB-T1249後之濃度-時間關係圖。 圖5所示為大老鼠以皮下方式投予單次劑量T1249後之濃 度-時間關係圖。 圖 6 所示為 T1249 及 mPEG20K-CMAB_丁 1249 之劑量對 SCID 小鼠中之HIV-1病毒性負荷之作用。 86594 -41 - 200427697 序列表 <11〇> 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 <120>聚乙二醇T1249多肽 <140 092119718 <141> 2003-00-18 <150> US 60/439,213 <151> 7003-01^10^'· <150> US 60/398,190 <151> 2002-07-24 <160> 5 <170> Patentln version 3.1 <210> <211> <212〉 <213> <220> <223> <220> <221> <222> <223> 生 行 法 方 成 合 經 列 T工 Μ 9 R ) ^ 13 Ρ人 多 MOD^RES ¢39)..(39) 39號殘基視情況可用一胺基修飾 <400> Trp Gl 1 n Glu Trp Glu Gin Lys lie 丁hr Ala Leu Leu Glu G]n Ala Gin 5 10 15 lie Gln Gin Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gin Lys Leu Asp Lys Trp 20 25 30
Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe 35 <210> 2 <211〉 7 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>多肽序列經合成方法行生 <400> 2
Asn Glu 丁yr Glu Leu Gin Lys <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213>人工 86594 200427697 21327USl.txt <220> <2 2 3>多肽序列經合成方法行生 <400> 3 lie Thr Ala Leu Leu Glu Gin Ala Gin lie Gin Gin 1 5 10 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213〉人工― <220> <223>多肽序列經合成方法行生 <400> 4 *
Trp Gin Glu Trp Glu Gin Lys 1 5 <210> 5 <211〉 8 <212> PRT <213>人工 <220> <223>多肽序列經合成方法行生 <220> <221〉 MOD一RES <222> (8)..(8) <223> 8號殘基可用一胺基修飾 <400> 5
Trp Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe 1 5 -2 - 86594

Claims (1)

  1. 200427697 拾、申請專利範圍： 1. 一種式（I)之化合物： 〇 Rr(CH2CH2〇)rrCH2CH2-〇-(CH2)m-C-NH-(CH2)p-CH2-NHT1249 (I) 其中： 1係一封端基團； m介於1至17之間； η介於10至1，000之間； ρ介於1至3之間；及 ΝΗΤ1249係藉由其末端α-胺基共價键結之Τ1249多肽。 2. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中心係選自由鹵素、 環氧化物、馬來醯亞胺、鄰吡啶基二硫化物、甲基磺酸 基、異氰酸基、水合肼、氰尿醯鹵、Ν-琥珀醯亞胺基氧 基、硫代琥珀醯亞胺基氧基、1-苯并三唑基氧聯、1_ 咪唑基氧聯、對-硝基苯氧基及 〇 II -CH2CH2-0-(CH2)m-C-NH-(CH2)p-CH0 所組成之群。 3. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中ρ係3。 4. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中ρ係3，I係甲氧基， m係1，且η介於100至750之間。 5. —種式（III)之化合物： CH3-0-(CH2-CH2-0)n-CH2-CH2-〇-CH2-CH2-CH2-NHT1249 (III) 86594 200427697 其中η介於10至1，000之間，且NHT1249係藉由其末端α-胺基共價键結之Τ1249多肽。 6. 如申請專利範圍第5項之化合物，其中η約為450。 7. —種醫藥組合物，其包含混與醫藥上可接受賦形劑之式（I) 化合物： 〇 一 II R1-(CH2CH2〇)n-CH2CH2-0-(CH2)rTrC-NH-(CH2)p-CH2-NHT1249 (I) 其中： 1係一封端基團； m介於1至17之間； η介於10至1，000之間； ρ介於1至3之間；且 ΝΗΤ1249係藉由其末端α-胺基共價键結之Τ1249多肽。 8. 如申請專利範圍第7項之醫藥組合物，其中ρ係3，I係甲 氧基，m係1，且η介於100至750之間。 9. 如申請專利範圍第7項之醫藥組合物，其形式為冷凍乾燥 粉末。 10. 如申請專利範圍第7項之醫藥組合物，其形式為注射液或 懸浮液。 11. 一種包含混與一醫藥上可接受賦形劑之式（I)化合物之醫 藥組合物之用途： 〇 R1-(CH2CH20)n-CH2CH2-0-(CH2)m-C-NH-(CH2)p-CH2-NHT 1249 (I) 86594 200427697 其係用以製備抑制mv感染之藥物， 其中= 1係一封端基團； m介於1至17之間； η介於10至1，000之間； ρ介於1至3之間；且 ΝΗΤ1249係藉由其末端α-胺基共價键結之Τ1249多肽。 12. 如申請專利範圍第11項之用途，其中ρ係3，R!係曱氧基， m係1，且η介於100至750之間。 13. 如申請專利範圍第11項之用途，其中該醫藥組合物經腹 膜内、肌肉、皮下、靜脈内或藉由連續輸注方式注射。 14. 如申請專利範圍第11項之用途，其中該醫藥組合物每次 投用含量約50毫克至約300毫克。 15. —種包含混與一醫藥上可接受赋形劑之式（III)化合物之 醫藥組合物之用途： CH3-0-(CH2-CH2-0)n-CH2_CH2-0-CH2-CH2-CH2-NHT1249 (III) 其係用以製備抑制HIV感染之藥物， 其中η介於10至1，000之間，且NHT1249係藉由其末端α-胺基共價键結之Τ1249多肽。 16·如申請專利範圍第15項之用途，其中該醫藥組合物每週 以單次劑量投予約300毫克至約1500毫克。 86594
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