CN1663609A - 一种治疗结膜炎、角膜炎的滴眼剂 - Google Patents

Abstract

本发明是一种滴眼剂，特别是关于一种用生物制剂与中药合成的滴眼剂，其特征是：滴眼剂中含α－甘露聚糖肽10－50％、黄精多糖10－60％、玻璃酸钠10－70％。所述的滴眼剂1000g中含α－甘露聚糖肽500g，黄精多糖300g，玻璃酸钠200g。这种治疗结膜炎、角膜炎的滴眼剂，采用生物制剂与中药合成滴眼剂，它疗效显著，无毒副作用。

Description

一种治疗结膜炎、角膜炎的滴眼剂

                      所属技术领域

本发明属于一种滴眼剂，特别是关于一种用生物制剂与中药合成的滴眼剂。

                      背景技术

结膜炎、角膜炎是我国常见眼病。结膜、角膜直接与外界接触，容易受到感染和外伤，临床以结膜充血、眼睑肿胀、分泌物增多、角膜混浊等炎症病变为主。因此，控制感染，消除炎症是治疗结膜、角膜炎的核心。结膜、角膜炎的病因比较复杂，直接原因不外乎感染(包括细菌和病毒)、过敏、外伤等三个方面。结膜、角膜炎的病理改变：①充血是基本变化之一，在角膜、睑结膜上呈现弥漫性充血状态，在球结膜上，呈现特有的结膜性充血；②渗出是另一基本变化，分泌物的性质因病因不同而有很大差异，有浆液性，粘液性，纤维素性和脓性之分；③在炎症的刺激下，睑结膜上尚可出现滤泡增殖和乳头肥大的变化，滤泡为结膜上皮下淋巴细胞的聚集，在结膜表面呈现泡状隆起，而乳头肥大则为结膜上皮的增生状态，同时伴有上皮下弥漫性淋巴细胞浸润。

                      发明内容

本发明的目的是制成一种治疗结膜炎、角膜炎的滴眼剂，它采用生物制剂与中药合成滴眼剂，它疗效显著，无毒副作用。

本发明的技术方案是：设计一种治疗结膜炎、角膜炎的滴眼剂，其特征是：滴眼剂中含α-甘露聚糖肽10-50％、黄精多糖10-60％、玻璃酸钠10-70％。

所述的一种治疗结膜炎、角膜炎的滴眼剂每1000g中含α-甘露聚糖肽500g，黄精多糖300g，玻璃酸钠200g。

本发明的特点是：由于α-甘露聚糖肽是一种生物反应调节剂，能调节眼局部的免疫功能，增强抗感染能力，抑制过度的免疫反应，减少淋巴细胞聚集、浸润；黄精多糖可以降低血管的通透性，具有抗渗出和抗增生的作用，还具有抗全身迟发型变态反应；玻璃酸钠具有优良的保湿和润滑作用，制成滴眼剂后，用于各种原因引起的泪腺分泌不足，角膜上皮轻度损伤之不适症状。

                      具体实施方式

由于本发明将α-溶血链球菌菌种搭载返回式太空飞行器(宇宙飞船或返回式卫星)，利用太空中微(零)重力、宇宙射线、交变磁场、高真空、高热深冷等因素的综合作用，使菌株的DNA双链结构断裂，基因组发生重排，从而产生新的菌株。返回地面后，对经过太空搭载的菌株进行培养和筛选，通过研究其形态特征、培养特征、生理生化反应、代谢产物、遗传性状及蛋白表达、遗传稳定性、中试生产指标等内容，优选出其中的正变异、遗传特性稳定的菌种，经培养发酵后得到治疗溃疡性结肠炎的药物。该菌种已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCCNo.1082。

特别是α-溶血链球菌D33菌株经太空搭载诱变，地面上的筛选、分离和纯化后，选育出发酵单位更高、所分泌的甘露聚糖肽含量更高的高产、优质菌株T33株。通过中国科学院微生物研究所对T33菌株及D33菌株的全细胞蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)分析和菌株的基因组DNA限制性酶切分析(RFLP/PFGE)比较，可以证明空间诱变及地面筛选出的T33菌株其基因有变异。该突变菌株在遗传上稳定，有较强的生产适应性，由其发酵产生的甘露聚糖肽含量提高，多肽含量比国家标准(80％)提高3至5倍，西安市药品检验所送样测定达到271.6％，发酵含量比对照组产物含量平均高出三倍以上。该菌种经过神舟系列飞船航天搭载太空诱变，由北京中科院微生物所和西北大学生物系对菌种进一步筛选培养育种形成遗传性质稳定，变异特征明显的高产高效菌种。该菌种每发酵单位中α-太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽含量提高了几倍以上。(见附件材料1：陕西省科学技术厅陕西省科学技术成果鉴定证书材料

附件材料2：太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽生产菌株经“神舟三号”飞船搭载公证书。

附件材料3：太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽生产菌株经“神舟三号”飞船搭载返回地面筛选报告

附件材料4：中国科学院微生物所关于“神舟三号”飞船搭载太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽生产菌株与地面对照菌的形态生理生化鉴定报告书

附件材料5：中国科学院微生物所关于“神舟三号”飞船搭载太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽生产菌株与地面对照菌的SDS-PAGE及RFLP/PFGE分析鉴定报告书

附件材料6：陕西省药品检验所“神舟三号”太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽口服液检测报告

附件材料7：科技查新报告复印件

附件材料8：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏菌种保藏受理通知书)

本发明菌种选育：在α-溶血链球菌生长规律的基础上，选定较合适生长时期的菌种，采用平皿生长的菌落、浸入其它物质中的菌悬液、带菌的砂土等方法，于2002年3月25日搭载“神舟三号”宇宙飞船。在太空轨道(近地点高度200公里、远地点高度350公里)进行了6天零18小时的在轨飞行。太空的特殊条件主要体现为微重力、高真空、高辐射、交变磁场等特殊环境。在外层空间飞行的菌种被置于一个与地球上的生态环境完全不同的环境中，主要包括来自磁场俘获的电子、质子及低能重粒子；来自银河系的宇宙射线如质子、粒子及更重的高能重粒子；来自太阳磁暴的质子及重粒子等。这些粒子作用于微生物细胞核中的DNA双链结构，可导致双链断裂。微重力、高真空环境可使DNA的碱基序列发生重组，即基因组的重组和变异。变异后产生的新菌株，其形态特征、培养特征、生理生化反应、代谢产物、遗传性状及蛋白表达、中试生产指标等均会发生不同程度的变化。在宇宙飞船返回地面后，经过进一步筛选，仅优选出其中0.2％的正变异且遗传特性稳定的菌株，经培育制成生产菌种。这种经航天搭载诱变后选育出的菌种已经在在2003年12月29日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCCNo.1082。

实验及中试生产结果表明，经空间诱变后的新型太空菌种在遗传特性上稳定，有较强的生产适应性，由其发酵产生的甘露聚糖肽含量提高，多肽含量比国家标准(80％)提高3至5倍，西安市药品检验所送样测定达到271.6％，发酵含量比对照组产物含量平均高出三倍以上，发酵周期大大缩短。

制备方法：

太空诱变菌种生产甘露聚糖肽的制备过程：

本发明所述的太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽是由以下方法制备：太空菌种制备---一级发酵---二级发酵-----发酵液提纯，最终生产出甘露聚糖肽。

①太空菌种制备：

以经过空间诱变育种精心选育的α-溶血链球菌作为生产菌种。

A.斜面种子培养基：牛肉膏0.5％，酵母膏0.6％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.4％，氯化钠0.5％，琼脂3％，绵羊血8％；pH7.4。

斜面种子培养基灭菌温度121℃，时间30分钟，蒸汽压力0.12Mpa。

启封菌种冷冻管，用无菌肉汤培养基稀释，在无菌条件下接入血斜面，接种后置38℃恒温培养30小时。

B.肉汤种子培养基：牛肉膏0.5％，酵母膏0.6％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.4％，氯化钠0.5％；pH7.4。

肉汤种子培养基灭菌温度121℃，时间30分钟，蒸汽压力0.12Mpa。

将培养好的斜面菌种在无菌条件下按9％接种量，接入肉汤种子培养基内，38℃恒温培养30小时。

②发酵过程：

发酵培养基：牛肉膏0.4％，酵母膏0.5％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.4％，氯化钠0.5％。

发酵培养基灭菌温度121℃，时间30分钟，蒸汽压力0.12Mpa。

A.一级发酵罐：将优良的肉汤菌种在无菌条件下按10％接种量，接入一级种子罐，在29℃恒温培养30小时，罐压不超过0.02Mpa，通气量以能翻动培养液为宜，连续充分搅拌。

B.二级发酵罐：将一级发酵培养液在无菌条件下按20％接种量，接入发酵罐，在29℃恒温培养70小时，罐压不0.02Mpa，灭活放罐。灭活采用加温使发酵液温度达到100℃，保温60分钟，冷却静置。

③提取过程：

a、发酵液进行浓缩，使浓缩液体积与发酵液体积比控制在1∶15-1∶20或酌情而定。

b、发酵液的浓缩液加入80-99％乙醇，体积量比控制在1∶1.5-1∶5.5或酌情而定。充分搅拌静置后，离心去除上清液，沉淀用蒸馏水溶解，调pH5.0，得到溶解液并将溶解液静置。

c、再将溶解液离心去除杂质得到上清液，准确量取清液体积，按上清液体积计算出所需乙醇量，调pH值，将乙醇缓慢加入到上清液中，并充分搅拌，静置后离心去除上清液得到沉淀物。

d、沉淀物再用蒸馏水溶解，调pH，离心，上清液再加乙醇沉淀。这样的工艺反复操作至中间检测合格为止，得到的沉淀物为太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽粗品。真空干燥3-8小时，即得到太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽产品。

上述方法得到的产品的检验：

[性状]本品为白色或微黄色无定形粉末；无臭、无味。

本品在水中易溶，在乙醇、氯仿及丙酮中不溶。

比旋度：取本品，精密称定，加水溶解并稀释成每1ml中约含10mg的溶液，依法测定(中国药典2000年版二部附录vIE)，比旋度为+70℃至+80℃。

[鉴别]1、取本品10mg，加水0.5ml使溶解，加a-萘酚乙醇溶液(5-100)1ml，摇匀，沿管壁缓缓加硫酸0.5ml，数分钟后，界面呈紫红色。

2、取本品，加水制成每1ml中含1mg的溶液，取约10ul点于滤纸上，晾干，用无水乙醇固定，置高硝酸溶液(取高碘酸1.2g，加水30ml溶解后.加0.2mol/L醋酸钠溶液1.5ml与乙醇100ml，混匀即得。置暗处保存，可使用数月)中浸泡5分钟，取出，用70％乙醇溶液冲洗，置还原液(取碘化钾5g，硫代硫酸钠5g，加水100ml使溶解，再加乙醇150ml、2mol/L盐酸液2.5ml，随加随搅拌，临用时配)中浸泡5分钟，取出，用70％乙醇溶液冲洗，置品红业硫酸试液中浸泡约30分钟，取出，用焦亚硫酸钠溶液(取焦亚硫酸钠0.4g，加盐酸1ml，加水溶解使成100ml，即得)，冲洗，晾干，在滤纸片点样处应呈紫红色。

3、取供试品和对照品适量，分别加氯化钠注射液制成每1ml中含1mg的溶液作为供试品溶液和对照品溶液，按甘露聚糖肽免疫原性测定法试验，供试品和对照品管应均无溶血发生。

[检查]1、酸度：取本品，加水制成每1ml中含10mg的溶液，依法测定(中国药典2000年版二部附录VIH)，pH值应为3.0-5.0。

2、吸收度：取本品，加水制成每1ml中含0.4mg的溶液，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录VIA)，在260nm的波长处，其吸收度不得大于0.25，在280nm的波长处，其吸收度不得大于0.20。

3、总氮量：取本品，照氮测定法(中国药典2000年版二部附录VIID第二法)测定.按干燥品计算，含总氮量应为0.8-2.0％。

4、免疫原性：取供试品和对照品适量，分别加氯化钠注射液制成每1ml中含10mg的溶液，再分别用磷酸盐缓冲液制成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256的稀释液作为供试品溶液和对照品溶液，依法检查(附甘露聚糖肽免疫原性测定法)，供试品不溶血管的最低浓度应不得高于对照品相应浓度的一倍以上。

5、干燥失重  取本品，在105℃干燥至恒重，减失重量不得过5.0％(中国药典2000年版二部附录VIIIL)。

6、重金属  取本品，在1.0g，依法检查(中国药典2000年版VIIIH)含重金属不得过百万分之二十。

7、异常毒性取本品，加氯化钠注射液制成每1ml中含0.5mg的溶液，依法检查(中国药典2000年版附录XIC).按静脉注射法给药，应符合规定(供注射用)。

[含量测定]

1.对照品溶液的制备

精密称取经105℃干燥至恒重的D-甘露糖对照品0.1g置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度.摇匀；精密量取5ml，置100ml的量瓶中，加水至刻度，摇匀.每1ml中含甘露糖50ug。

2.供试品溶液备

取本品适量，精密称定，加水溶解制成每1ml中含40ug的溶液。

3.标准曲线的制备

精密称取对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分别置具塞试管中，各加水至1.0ml，再加3％苯酚溶液1.0ml，摇匀，冲入硫酸4.5ml，摇匀，放置于室温，以0管为空白.照分光光度法(中国药典2000年版二部附录IVA)在490nm的波长处测定吸收度。以甘露糖ug数对相应的吸收度，计算回归方程。

4.测定法精密量取供试品溶液1.0ml，照标准曲线制备项下自“再加3％苯酚溶液1.0ml”起，依法操作，测定吸收度，由回归方程计算甘露糖的含量。

甘露聚糖肽免疫原性测定法(补体结合法)；

1、试液

A.酸盐缓冲液(pH7.2)

取氯化钠8.5g、磷酸氢二钠0.565g及磷酸二氢钾0.135g，加水至1000ml使其溶解，加10％硫酸镁溶液1ml，摇匀。

B.1％羊红细胞悬液

羊血红细胞的制备：  由绵羊颈静脉无菌采血于盛有等量阿氏液(取葡萄糖20.5g、枸椽酸钠8.0g、氯化钠4.2g，枸椽酸5.5g，加水至1000ml使溶解，100℃灭菌30分钟)的无菌容器中，4℃保存。

1％羊血红细胞悬液的制备：  取上述羊血红细胞适量，用氯化钠注射液洗涤三次，每次离心5分钟(2000转/分)，取压积羊血红细胞，用氯化钠注射液制成1％羊血红细胞悬液。取悬液，用氯化钠注射液稀释20倍制成供试品溶液，另取等量悬液加水稀释20倍作为空白溶液，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录IVA)，在541nm的波长处测定，其吸收度应为0.65-0.70，如超出限度应调节1％羊红细胞悬液的浓度。

C.溶血素及致敏羊血红细胞

溶血素的制备：  取上述压积羊血红细胞，用氯化钠注射液制成25％羊血红细胞悬液.取家兔1只，静脉注射上述羊血红细胞悬液，每日一次，共七次，前三次3ml，后三次5ml，末次注射后七日采血。分离血清，56℃.30分钟灭活，分装，0℃以下保存。

溶血素单位的测定：  取溶血素适量，加磷酸盐缓冲液分别制成1∶1000、1∶2000、1∶3000、1∶4000、1∶5000、1∶6000、1∶7000、1∶8000、1∶9000、1∶10000的稀释液，各取0.1ml置试管中，加1％羊血细胞悬液0.1ml，摇匀，加稀释度为1∶30的豚鼠血清(补体)0.2ml及磷酸盐缓冲液0.2ml，摇匀，37℃保温30分钟，完全溶血管的最高稀释度为1单位溶血素。

致敏羊血红细胞的制备：临用前，将2％的羊血红细胞悬液与2单位溶血索等体积混合，37℃保温15分钟即得。

补体：取三只以上的豚鼠，心脏采血，离心分离血清，0℃以下保存。

补体单位的测定：取补体适量，加磷酸盐缓冲液，分别制成1∶40、1∶60、1∶80、1∶100、1∶120、1∶140、1∶160、1∶180的稀释液，各取0.2ml置试管中，加0.2ml磷酸盐缓冲液，摇匀，37℃保温30分钟后，分别加致敏羊血红细胞0.2ml，摇匀，37℃再保温30分钟.完全溶血管的最高稀释度为1单位的补体。

抗体：取甘露聚糖肽对照品适量，加氯化钠注射液制成每1ml中含10mg的对照品溶液免疫家兔，隔日采用耳静脉注射对照品溶液一次。第一次注射0.2ml，第二次至第五次各注射0.5ml，第六次至第十次各注射1.0ml，第十一次至第十五次各注射2.0ml，末次注射后三日采血，离心分离血清，56℃下30分钟灭活，分装，0℃以下保存(临用前，需56℃30分钟再次灭活)。

抗体单位的测定：取抗体适量，加磷酸盐缓冲液分别制成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32.1∶64、1∶128的稀释液，各取0.1ml置试管中，加甘露聚糖肽对照品溶液0.1ml及2单位补体0.2m]，摇匀，于4-8℃放置4小时以上，置37℃保温30分钟，不溶血管的最高稀释度为1单位抗体。同时设抗原(不加抗体，以0.1ml磷酸盐缓冲液代替)、抗体(不加抗原，以0.1ml磷酸盐缓冲液代替)、补体(不加抗原，抗体，以0.2ml磷酸盐缓冲液代替)对照管，以上三种对照管应全溶血；另设的致敏羊血红细胞(不加抗原、抗体和补体，以0.4ml磷酸盐缓冲液代替)对照管应不溶血。

2、免疫原性测定法

取甘露骤糖肽对照品与供试品适量，照药品项下的规定制成不同浓度的对照品溶液和供试品溶液，各取0.1ml置试管中，加入2单位抗体0.1ml及2单位补体0.2ml.摇匀，于4-8℃放置4小时以上，置37℃保温30分钟，加入致敏羊血红细胞0.2ml，摇匀，37℃再保温30分钟。观察各管的溶血情况，不溶血管的最低浓度代表甘露聚糖肽的免疫原性。同时设抗原(不加抗体，以0.1ml磷酸盐缓冲液代替)、抗体(不加抗原，以0.1ml磷酸盐缓冲液代替)、补体(不加抗原、抗体、以0.2ml磷酸盐缓冲液代替)对照管，以上三种对照管应全溶血：另设的致敏羊血红细胞(不加抗原、抗体和补体，以0.4ml磷酸盐缓冲液代替)对照管应不溶血。

实施例1滴眼剂药物每1000克取上述α-甘露聚糖肽500g，黄精多糖300g，玻璃酸钠200g。

制备时将上述三种药物与适量灭菌注射用水稀释混匀→过滤→灭菌→分装→成品质检合格→入库。

具体生产过程及设备按中华人民共和国药典2000版二部滴眼剂的制备工艺，(国家药典委员会编，化学工业出版社出版)。

本发明所述滴眼剂的毒理研究：①急性毒性试验：家兔眼局部注射2.5ml/kg，未见有死亡及任何不良反应发生。②亚急性毒性试验：大鼠眼局部用药，每隔2小时一次，每次3滴，连续1个月；家兔眼局部用药，每隔2小时一次，每次5滴，连续1个月；检查大鼠和家兔的肝、肾功能、血象及各脏器组织均无异常变化，眼局部未见异常。③眼局部过敏试验阴性。④致畸致死试验均为阴性。

动物药效学试验：

摘要目的：研究本发明所述滴眼液的抗菌作用及其对感染性角结膜炎症状的消除作用。方法：对兔眼损伤金黄色葡萄球菌性结膜炎，兔眼损伤化脓性链球菌性结膜炎及兔眼损伤金黄色葡萄球菌性角膜炎，兔眼损伤绿脓杆菌性角膜炎进行了研究。结果：本发明所述滴眼液对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌所致的动物感染模型，感染性结膜炎和感染性角膜炎有明显的治疗作用，给药5d后细菌培养转阴率100％。结论：本发明所述滴眼液对结、角膜炎的治疗效果确切，比单用α-甘露聚糖肽和妥布霉素滴眼液效果好。

1.实验材料

1.1药物：本发明所述滴眼液(西安亨通光华制药有限公司提供)。

阳性对照药物：α-甘露聚糖肽滴眼液(生产厂商为西安亨通光华

制药有限公司)，含量1mg/ml；妥布霉素滴眼液(辽宁省医药工业研究院)，含量1.5mg/ml。

1.2动物：大耳白兔(由西安交通大学医学院实验动物中心提供，合格证号，陕实动字384)。

1.3试验菌株：大肠杆菌ATCC 25922，绿脓杆菌ATCC 27853，金黄色葡萄球菌ATCC 25927，化脓性链球菌ATCC 19615(均由西安交通大学第一附属医院细菌室提供)。

1.4感染模型

1.4.1兔眼损伤金黄色葡萄球菌性结膜炎及兔眼损伤化脓性链球菌性结膜炎。

1.4.2兔眼损伤金黄色葡萄球菌性角膜炎及兔眼损伤绿脓杆菌性角膜炎。

2.方法与结果

2.1兔眼损伤型结膜炎

将冰箱冷藏保存的黄色葡萄球菌和化脓性链球菌，于实验前1天接种于血琼脂培养基上，37℃培养18小时后，用生理盐水冲下，并用标准管比浊测定其浓度后，将其用生理盐水稀释成黄色葡萄球菌3×10⁹个/ml，化脓性链球菌1×10⁹个/ml，备用。

健康大耳白兔40只，体重2.0-3.0kg，雌雄均有。用无菌8号针头于兔下睑结膜划4×4mm十字痕，以划破为宜，轻拉眼睑成小杯形，用0.25ml注射器向结膜伤痕滴0.1ml菌液，轻轻复原眼睑。感染24小时后，给每只兔眼分级，并进行数理统计，使每组动物模型的程度无明显差异。分组后即刻给药，每天滴药3次，每眼每次0.1ml，连续给药5天，每隔24小时给兔眼打分，分级，并进行统计学处理。

兔眼损伤结膜炎分级0级：血管正常；1级：血管充血呈鲜红色，轻微水肿，少量分泌物；2级：血管充血，呈紫红色，血管不易辨析，明显水肿，部分眼睑外翻，分泌物使眼睑和睫毛潮湿或粘着；3级：弥漫性充血，呈紫色，水肿至眼睑近闭合，分泌物使整个眼睑潮湿或粘着。

在给药第1，3，5天进行细菌检定。方法是用无菌盐水湿棉球轻轻涂擦上下眼睑后投入内装5ml生理盐水的无菌试管中，混摇均匀，在无菌室内取0.5ml倾入已备普通琼脂培养基平皿上，铺匀后放入37℃温箱培养18小时，判断细菌培养阴、阳性。结果见表1、表2、表3、表4。

表1金黄色葡萄球菌所致兔眼结膜炎治疗实验(n＝40)

组别	动物/只	给药前分级	给药后分级
				24/h         48/h          72/h
			盐水对照组本发明所述滴眼液组α-甘露聚糖肽滴眼液组妥布霉素滴眼液组		10101010	2.38±0.552.4±0.522.4±0.522.4±0.52	2.4±0.5    2.25±0.48     2.25±0.461.8±0.4*  0.8±0.79**   0.5±0.52**2.3±0.1    1.8±0.74*    1.1±0.51*2.2±0.4    1.8±0.4*     0.95±0.42*

注：^*P＜0.05，**P＜0.01

表2化脓性链球菌所致兔眼结膜炎治疗实验(n＝32)

组别	动物/只	给药前分级	给药后分级
				24/h        48/h           72/h
			盐水对照组本发明所述滴眼液组α-甘露聚糖肽滴眼液组妥布霉素滴眼液组		8888	2.5±0.532.4±0.522.4±0.522.4±0.52	2.4±0.5      2.38±0.52     2.13±0.351.75±0.46*  1.38±0.52**  0.13±0.35**2.25±0.36    1.88±0.35*   1.53±0.52**2.37±0.41    1.88±0.4*    1.28±0.42**

注：^*P＜0.05，**P＜0.01

表3金黄色葡萄球菌所致兔眼结膜炎细菌检定(n＝40)

组别	动物/只	细菌转阴率/％
			24/h         72/h           120/h
		盐水对照组本发明所述滴眼液组α-甘露聚糖肽滴眼液组妥布霉素滴眼液组		10101010	0/10    0    0/10    0     0/10     00/10    0    5/10    50    10/10    1000/10    0    2/10    20    8/10     800/10    0    3/10    30    8/10     80

                表4化脓性链球菌所致兔眼结膜炎细菌检定(n＝32)

组别	动物/只	细菌转阴率/％
			24/h        72/h           120/h
		盐水对照组本发明所述滴眼液组α-甘露聚糖肽滴眼液组妥布霉素滴眼液组		8888	0/8    0    0/8    0       0/8     00/8    0    4/8    50      10/8    1000/8    0    3/8    37.5    6/8     750/8    0    3/8    37.5    7/8     87.5

2.1兔眼损伤型角膜炎

将冰箱冷藏保存的黄色葡萄球菌和绿脓杆菌菌种，于实验前1天接种于血琼脂培养基上，37℃培养18小时后，用生理盐水冲下，并用标准管比浊测定其浓度后，将其用生理盐水稀释成黄色葡萄球菌3×10⁹个/ml，绿脓杆菌1×10⁹个/ml，备用。

大耳白兔40只，体重2.5-3.5kg，雌雄均有。将乌拉坦按家兔750mg/kg耳静脉麻醉，动物呼吸平稳、心率正常后，每眼角膜滴1滴0.5％利多卡因表面麻醉，然后用直径6mm打孔器压迫于角膜表层中心，匀力旋转，形成6mm的环形伤痕。拉开眼睑成杯形，向角膜伤痕处滴入金黄色葡萄球菌或绿脓杆菌菌悬液0.1ml，并复原眼睑。

兔眼损伤型角膜炎症评分标准0级：眼睛明亮，无红肿和分泌物；0.5级：角膜无覆盖物，眼睛稍有红肿；1级：角膜白色覆盖物＜6mm；2级：角膜白色覆盖物充满6mm；3级：角膜白色覆盖物＞6mm。

家兔眼角膜损伤感染24小时后，根据每只兔眼感染模型炎症评分标准分级后均匀分组，并进行数理统计，使每组动物模型炎症程度无明显差异。分组后即刻给药，每天滴药3次，每眼每次0.1ml，连续给药5天，每隔24小时进行一次评分，并进行统计学处理。于给药第1，3，5天后分别进行细菌检定。将家兔固定后用0.5％利多卡因1滴行角膜麻醉，然后用灭菌的生理盐水湿棉球轻轻涂擦角膜后，将棉球投入5ml无菌生理盐水中(操作过程系无菌操作)混悬均匀，于超净工作台上取出0.5ml倾入已备普通琼脂培养基平皿上。铺匀后放入37℃温箱培养18小时，判断细菌培养阴、阳性。结果见表5、表6、表7、表8。

表5金黄色葡萄球菌所致兔眼角膜炎治疗实验(n＝32)

组别	动物/只	给药前分级	给药后分级
				24/h           48/h          72/h
			盐水对照组本发明所述滴眼液组α-甘露聚糖肽滴眼液组妥布霉素滴眼液组		8888	2.34±0.532.4±0.762.4±0.512.4±0.51	2.63±0.52    2.62±0.74     2.4±0.741.13±0.35*  0.75±0.70**  0.25±0.46**2.3±0.24     1.88±0.74     1.5±0.55*2.0±0.93     1.61±0.75*   0.96±0.45*

注：^*P＜0.05，**P＜0.01

表6绿脓杆菌所致兔眼角膜炎治疗实验(n＝32)

组别	动物/只	给药前分级	给药后分级
				24/h        48/h          72/h
			盐水对照组本发明所述滴眼液组α-甘露聚糖肽滴眼液组妥布霉素滴眼液组		8888	2.5±0.762.4±0.742.4 ±0.742.4±0.74	2.38±0.92    2.25±0.52      2.03±1.01.25±0.46*  1.13±0.52*    0.38±0.15**2.15±0.36    1.34±0.37*    1.20±0.51*2.27±0.41    1.25±0.46*    1.15±0.41*

注：^*P＜0.05，**P＜0.01

表7金黄色葡萄球菌所致兔眼角膜炎细菌检定(n＝32)

组别	动物/只	细菌转阴率/％
			24/h          72/h          120/h
		盐水对照组本发明所述滴眼液组α-甘露聚糖肽滴眼液组妥布霉素滴眼液组		8888	0/8    0    0/8    0      0/8    00/8    0    5/8    62.5   8/8    1000/8    0    2/8    25     6/8    750/8    0    3/8    37.5   7/8    87.5

表8绿脓杆菌所致兔眼角膜炎细菌检定(n＝32)

组别	动物/只	细菌转阴率/％
			24/h         72/h          120/h
		盐水对照组本发明所述滴眼液组α-甘聚糖肽滴眼液组妥布霉素滴眼液组		8888	0/8    0    0/8    0       0/8    00/8    0    7/8    87.5    8/8    1000/8    0    3/8    37.5    7/8    87.50/8    0    3/8    37.5    7/8    87.5

3.讨论

本发明所述滴眼液对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌所致的动物感染模型，感染性结膜炎和感染性角膜炎的治疗效果确切，疗效明显优于α-甘露聚糖肽滴眼液和妥布霉素滴眼液。

本发明所述滴眼液给药1天就对金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌所致的家兔眼结膜炎有明显的治疗作用，统计学处理显著。连续给药2天就有非常显著的治疗作用。连续给药5天细菌转阴率达100％。α-甘露聚糖肽滴眼液和妥布霉素滴眼液给药1天，对金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌所致的家兔眼结膜炎的治疗作用不明显，统计学处理无意义。连续给药2天才有治疗效果，统计学处理显著。连续给药5天细菌转阴率达75-87.5％，未完全转阴。

本发明所述滴眼液给药1天对金黄色葡萄球菌及绿脓杆菌所致家兔眼角膜炎有明显的治疗作用，统计学处理显著。连续给药2天对金黄色葡萄球菌所致家兔眼角膜炎有明显的治疗作用，统计学处理非常显著。连续给药3天对绿脓杆菌所致家兔眼角膜炎有明显的治疗作用，统计学处理非常显著。连续给药5天细菌转阴率达100％。α-甘露聚糖肽滴眼液和妥布霉素滴眼液给药1天，对金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌所致的家兔眼结膜炎的治疗作用不明显，统计学处理无意义。连续给药3天才有治疗效果，统计学处理显著。连续给药5天细菌转阴率达75-87.5％，未完全转阴。

本发明所述滴眼剂的临床疗效的验证：王某，男，6岁，外出游玩一天后，晚间出现右眼结膜充血，红肿，畏光，眼部分泌物增多，黄色粘稠状，右眼视力下降至0.8，左眼视力为1.5，经诊断为急性结膜炎。立即给予本发明所述滴眼剂局部滴眼，每天三次，每次2滴。用药2天后，局部充血、红肿减轻，畏光消失，分泌物减少，颜色变白。继续用药，7天后眼部红肿、充血消失，分泌物恢复正常，检查两眼视力，右眼视力为1.5，已恢复正常，左眼视力为1.5。表明本发明所述滴眼剂对角结膜炎有独特的疗效，起效快，疗效好，无任何不良反应。

本发明所述滴眼剂大规模临床疗效统计：收集100例临床角结膜炎患者资料，进行深入分析，统计临床疗效。结果表明：治疗7天后，90例患者眼局部症状如红肿、充血，分泌物增多等均消失，视力检查恢复病前水平，这部分患者已临床痊愈；另有8例患者未彻底痊愈，其中3例结膜稍有充血，无其它症状，视力恢复，另有5例局部症状消失，但视力尚未完全恢复正常；剩余2例症状改善不明显。统计总有效率为98％。

Claims (2)

1、一种治疗结膜炎、角膜炎的滴眼剂，其特征是：滴眼剂中含α-甘露聚糖肽10-50％、黄精多糖10-60％、玻璃酸钠10-70％。

2、根据权利要求1所述的一种治疗结膜炎、角膜炎的滴眼剂，其特征是：所述滴眼剂1000g中含α-甘露聚糖肽500g，黄精多糖300g，玻璃酸钠200g。