CN1650918A - 无花果叶提取物及其用途 - Google Patents

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王桂亭
王志玉
宋艳艳
贾存显
王皞
许洪芝
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Abstract

一种无花果叶提取物及其用途，属于中药技术领域。以无花果叶为原料通过水提取或乙醇提取而得。无花果叶提取物用于制备抗单纯疱疹病毒和/或抗常见致病细菌的药物，药物中无花果叶提取物的最小有效浓度为0.5mg/ml；无花果叶乙醇提取物、水提取物的最大无毒浓度分别为550mg/ml和50mg/ml。本发明使无花果和无花果叶可综合利用，无花果叶提取物可制备不同剂型的系列保健品和抗病原微生物的医药用品，应用广泛。

Description

无花果叶提取物及其用途
(一)技术领域
本发明涉及一种无花果叶提取物及其用途，属于中药技术领域。
(二)背景技术
无花果(Ficus carica L)为桑科无花果属的落叶灌木或小乔木，既可做绿化观赏树，又可食用。其果实软甜可口，营养丰富，含有多种人体所需的维生素和氨基酸，还有大量的食物纤维及果胶、蛋白质分解酶等等，此外还有抗癌防衰、美容嫩肤等医疗保健功能。无花果叶含有补骨脂素、佛手柑内酯、β-谷甾醇、β-香树脂醇和蛇麻脂醇丰富的蛋白酶、类黄酮等活性成分，叶还含有微量元素锶、锰、铁、铜、锌、硒、钴、铬、镍，其中以铁、锌含量最高。同时还测定出镁、钙含量也极高。也与无花果果实所含的微量元素有很大的相似性和可比性，同样能用于防治癌症、痔疮等疾病，还可用于治疗糖尿病，目前国内外在这方面的研究非常活跃。有关无花果叶提取物抗病原微生物方面的实验研究，国内外尚未见详细的报道。
(三)发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种无花果叶提取物及其用途。
无花果叶提取物是以无花果叶为原料通过水提取或乙醇提取而得。
上述的水提取方法具体如下：
自然晾干的无花果叶，先破碎，称取10-20重量份无花果叶(连梗)，放入加热容器中，加入无花果叶8-10倍重量的双蒸水，浸泡20-30小时，过滤；滤液留存，无花果叶再次加水浸泡，方法同前，如此经水连续提取3次；合并3次的滤液，放56℃水浴蒸发滤液至原体积的1/3～1/4，浓缩至生药含量50-60mg/ml，抽滤除菌，分装，-20℃保存。
上述乙醇提取方法具体如下：
将干燥破碎的无花果叶用95％乙醇浸泡20-30小时，无花果叶与95％乙醇的重量比是1∶5-10。加热回流2次，合并提取液，减压浓缩至生药含量330mg/ml，抽滤除菌，分装，-20℃保存。实验时用Hank’s缓冲液稀释。
本发明的无花果叶提取物用于制备抗单纯疱疹病毒和/或抗常见致病细菌的药物。
所述药物中无花果叶提取物的最小有效浓度为0.5mg/ml；无花果叶乙醇提取物、水提取物的最大无毒浓度分别为550mg/ml和50mg/ml。治疗指数分别为1100和100。无花果叶提取物体外对单纯疱疹病毒具有明显的抑制和杀灭作用；无花果叶乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、腊样芽孢杆菌等8种菌株的抑菌环直径均大于7mm；对多种常见微生物均有较强的抑菌和杀菌作用。无花果叶提取物在体外具有明显的抗单纯疱疹病毒和抑菌作用。
本发明的有益效果如下：
无花果在我国广泛种植，其果实营养丰富，有关无花果叶提取物抗病毒、抗细菌方面的实验研究，国内外尚未见详细的报道。本发明对无花果叶提取物浓缩后，进行了比较详细的体外抗单纯疱疹病毒实验、细胞毒性实验和体外抗菌实验，其结果表明，无花果叶提取物体外具有明显的抗单纯疱疹病毒的作用；抗菌实验证明，无花果叶提取物对细菌的抑制作用非常明显，被抑制和杀灭的细菌中既有革兰氏阳性细菌也有革兰氏阴性菌，既有球菌也有杆菌。无花果叶提取物对细菌有广泛的抑制和杀灭作用，有良好的抗菌活性；大大提高了无花果叶药用价值和经济效益。无花果和无花果叶可综合利用，既可利用无花果的营养价值，又可以大力开发无花果叶的药用价值，无花果叶提取物可制备不同剂型的系列保健品和抗病原微生物的医药用品，具有广泛的应用前景。
(四)具体实施方式
实施例1：水提取方法制备无花果叶提取物
20克无花果叶(连梗)，放入500ml三角烧瓶，加入双蒸水200ml浸泡过夜，过滤，经水连续提取3次，去药渣，合并3次滤液共400ml，放56℃水浴蒸发至100ml，浓缩生药含量60mg/ml，抽滤除菌，分装小瓶，放-20℃冰箱保存备用。
实施例2：乙醇提取方法制备无花果叶提取物
将干燥破碎的无花果叶用95％乙醇浸泡过夜，加热回流2次，合并提取液，减压浓缩，生药含量330mg/ml，抽滤除菌，分装小瓶，放-20℃冰箱保存备用。实验时用Hank’s缓冲液稀释。
用实施例1和2所得的无花果叶提取物分别进行抗单纯疱疹病毒实验和抗常见致病细菌的实验，具体方法和结果如下。
一.无花果叶提取物抗单纯疱疹病毒实验方法
1.细胞Hep-2、BHK21和PRK三种细胞，Hep-2、和BHK21引自山东省卫生防疫站，均用Eagle培养基传代培养，原代兔肾细胞(PRK)取自7日内的乳兔，常规方法制备细胞，用5％乳蛋白水解物培养，乳兔由山东省农科院畜牧养殖所提供。
2.病毒HSV-1 B61001株由中国医学科学院病毒研究所提供，用含2％小牛血清的MEM培养基在BHK21细胞上传代。滴度为TCID50＝107，实验用103TCID50/ml。
3.病毒感染性滴度的测定  将不同稀释度的单纯疱疹病毒接种细胞，每管0.1ml，每个稀释度4瓶，37℃吸附1h，弃上清，加2％小牛血清的MEM培养液1ml，置37℃培养，每日检查病毒生长情况，观察特征性细胞病变(CPE)，7天后记录结果。CPE记录方法：-为无CPE，+为25％的细胞出现CP；++为50％的细胞出现CPE；+++为75％的细胞出现CPE；++++为100％的细胞出现CPE；±为可疑。
4.细胞毒性实验将Hep-2、BHK21和PRK分别传代至青霉素小瓶，放37℃ 5％CO2培养。待细胞长满单层时，将实验药物按不同浓度(50.00mg/ml～550mg/ml)分别加入小瓶，每瓶加药物0.1ml，维持液0.9ml，每一浓度的药物均4瓶。4瓶细胞不加药物作为细胞对照，37℃ 5％CO2培养。每日观察细胞生长增殖状况，并记录结果，连续观察6天，与细胞对照组相比，相同培养时间内，未致细胞死亡的最大剂量，作为实验药物抑制病毒活性实验时用药的上限剂量。
5.药物体外对病毒增殖的抑制作用  将病毒接种于已长满单层的细胞瓶上，每瓶接种103TCID50/ml HSV-I病毒液0.1ml，37℃吸附1h，弃上清后，Hank’s液洗3次，每一瓶加入含不同浓度的药物0.1ml，加维持液0.9ml，每个浓度药物均重复4瓶，并设置未加药物的病毒对照和细胞对照。然后置37℃培养箱中培养。每日观察CPE，当病毒对照达到“++++”时，判定结果，使病变减少两个“+”为有效。
6.药物对病毒的直接杀伤作用将不同浓度的药物与103TCID50/ml病毒液等量混合后于37℃培养12h、24h、48h和96h后，将混合液分别接种长满单层的瓶内，每一浓度的药物均重复接种4瓶，每瓶接种0.2ml，放37℃吸附1h，用Hank’s液洗3次，加维持液1ml，置37℃培养箱中培养。同时做细胞对照和病毒对照(HSV-1+Hank’s)，放37℃培养，每日观察CPE，当病毒对照达到“++++”时，判定结果，使病变减少两个“+”为有效。
7.结果判定：细胞对照生长良好，加药物的细胞不出现细胞病变(CPE)，说明药物能抑制病毒增殖，即药物有抗病毒作用；否则，无抗病毒作用；当病毒对照达到“++++”判定结果，以能抑制50％细胞产生病变的药物浓度为有效抑制病毒浓度。
二.无花果叶提取物抗单纯疱疹病毒实验结果
1  病毒感染性滴度 以细胞病变程度来判断，每日观察病毒对细胞致病变情况，计算病毒的半数感染量(TCID50)，HSV-I的TCID50为107TCID50/ml，实验所用103TCID50/ml。
2.实验药物对正常细胞生长的影响  当无花果叶乙醇提取物和无花果叶水提取物的浓度分别小于550mg/ml和50mg/ml时，经培养144h后观察发现，药物对Hep-2细胞、BHK21细胞和原代兔肾细胞均任何无毒性作用，细胞生长旺盛，细胞形态规则，排列紧密有序。由表3看出无花果叶乙醇提取物和无花果叶水提取物最大无毒浓度分别为550mg/ml和50mg/ml。见表1。
3.药物体外对病毒增殖的抑制作用  以细胞病变(CPE)程度来判断，当实验药物浓度≥0.5mg/ml时，药物对HSV-I所致的CPE有较强的抑制作用，细胞形态良好，只有个别衰老细胞，无花果叶乙醇提取物和无花果叶水提取物的抗病毒指数分别为1100和100。药物在每种细胞上对病毒的作用程度一致，提示该药物的抗病毒作用无细胞差异。见表2。
4.药物对病毒的直接杀灭作用  当药物浓度为0.1mg/ml时，药物与病毒作用4h，既可抑制50％的CPE产生，随着药物浓度的增加和作用时间的延长，药物抑制病毒的活性也在增强，当浓度为大于1.0mg/ml时能完全抑制CPE的产生。见表3。
          表1  无花果叶提取物对细胞生长状态的影响
剂量(mg/ml) 无花果叶乙醇提取物 无花果叶水提取物
BHK21  Hep-2   PRK BHK21     Hep-2      PRK
  50.00100.00200.00400.00500.00550.00细胞对照 -       -       --       -       --       -       --       -       --       -       -+       +       +-       -       - -          -          -++         ++         +++++        +++        +++++++       ++++       ++++++++       ++++       ++++++++       ++++       ++++-          -          -
注：‘-’为无CPE，‘+’为25％的细胞出现CPE，‘++’为50％的细胞出现
CPE，‘+++’，为75％的细胞出现CPE，‘++++’为100％的细胞出现CPE。
                 表2  无花果叶提取物体外对病毒增殖的抑制作用
  剂量(mg/ml)   无花果叶乙醇提取物              无花果叶水提取物
  BHK21  Hep-2     PRK           BHK21    Hep-2     PRK
    0.050.100.501.002.00细胞对照病毒对照   +++     +++       +++           +++       +++       +++++      ++        ++            ++        ++        ++-       -         -             -         -         --       -         -             -         -         --       -         -             -         -         --       -         -             -         -         -++++    ++++      ++++          ++++      ++++      ++++
注：表中符号(-、+、++、+++、++++)含义同表1
           表3  无花果叶提取物对病毒的直接杀伤作用(药物和病毒作用5h)
  无花果叶乙醇提取物              无花果叶水提取物
  剂量(mg/ml)   BHK21   Hep-2    PRK           BHK21       Hep-2       PRK
    0.050.100.501.002.00细胞对照病毒对照   +++      +++      +++           +++          +++         +++++       ++       ++            ++           ++          +++        +        +             +            +           +-        -        -             -            -           --        -        -             -            -           --        -        -             -            -           -++++     ++++     ++++          ++++         ++++        ++++
注：表中符号(-、+、++、+++、++++)含义同表1
三.无花果叶提取物抗常见致病细菌的实验
1.菌种  金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、大肠杆菌(8099)、溶血性链球菌、肠球菌、腊样芽孢杆菌、阴沟杆菌、变形杆菌、枯草杆菌(ATCC9372)。
2.培养基  营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、稀释液(含0.1％的胰蛋白胨)。
3.试验器材  压力蒸汽灭菌器(上海安亭仪器厂，型号LDX-40BI)、恒温培养箱(日本三洋，型号MCO-15AC)、净化工作台(苏州仪器厂，型号SW-CJ-2FD)、恒温水浴锅、电动振荡仪、可调移液器、数显游标卡尺、电子天平、培养皿等试验器材。
四.抗菌试验方法
1.细菌悬液的制备：将试验菌种分别接种于营养琼脂斜面，37℃培养18h，用吸管吸取5ml稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。将洗下菌悬液移至另一无菌试管内，用电动混合器混合20s以使细菌悬液均匀。将菌悬液按严格无菌操作程序进行10-1、10-2、10-3……等系列稀释。吸取其中混合均匀的悬液1.0ml加于无菌平皿内，每一稀释度接种3个平皿，将冷至40～45℃的熔化营养琼脂培养基，倾注于已加菌液的平皿中，每平皿15～20ml随即转动平皿，使样液与培养基混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平皿，置37℃培养箱内培养24h计数菌落数，以菌落数在15cfu～300cfu的平板为准，每个稀释度3个平板生长菌落数全合乎上述标准，则以该3个平板的菌落平均值作为结果；若有2个符合上述标准，则以该合格的两个平板菌落的平均值为结果。菌悬液的含量为5×105cfu/ml～5×106cfu/ml。
2.抑菌片的制备：将新华一号定性滤纸，用直径5mm的打孔器打成5mm的圆片，经高压灭菌处理后，置120℃干燥2h，保存备用。取处理好的滤纸片放入洁净无菌平皿内，每4层滤纸片(厚约4mm)滴加含量为100mg/ml的无花果叶乙醇提取物20ul为试验样片；阴性对照样片滴加20ul生理盐水，将两者分别平放于清洁的无菌平皿内，置无菌室晾干备用。
3.试验菌的接种：用无菌棉拭子分别蘸取浓度为5×105cfu/ml～5×106cfu/m试验菌悬液，分别在营养琼脂平板表面均匀涂抹3次，每涂抹1次，将平板转动60°，最后将棉拭子绕平板边缘涂抹一周，盖好平皿，置室温干燥5min。
4.抑菌剂样片贴放：每次试验贴放1个染菌平板，每个平板贴放4片试验样片、1片阴性对照样片放在平皿中心，共5片。无菌镊子取样片贴放于平板表面。各样片中心之间相距25mm以上，与平板的周缘相距15mm以上。贴放好后，用无菌镊子轻压样片，使其紧贴于平板表面，盖好平皿，置37℃温箱培养18～24h，观察结果。测量抑菌环时，选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行测量，用数显游标卡尺测量抑菌环的直径(包括贴片)，并记录测量数据。实验重复4次。
判定标准：抑菌环直径大于7mm者判为有抑菌作用，抑菌环小于或等于7mm者判为无抑菌作用，4次重复试验均达到有抑菌作用结果者，判为合格。阴性对照组应无抑菌环产生，否则试验无效。
5.药物的MIC和MBC测定实验(营养肉汤稀释法)：用蒸馏水将实验药物进行对倍系列稀释，取各稀释度实验药液2.5ml加入到含有2.5ml双倍浓度营养肉汤的试管中；取0.20ul含菌量约为104cfu/ml菌悬液接种于含实验药物的试管中，作为试验组样本。以同样的方法接种不含实验药物的营养肉汤试管中，作为阳性对照组样本；取2支含营养肉汤的试管，作为阴性对照组样本。将试验组样本、阳性对照组样本及阴性对照组样本放37℃培养箱中，培养48h，观察结果。当阳性对照管有菌生长(浑浊)，阴性对照管无菌生长(透明)，试验组以肉眼观察无菌生长的药液最高稀释度为MIC。同时从无菌生长的各实验管内取100ul，分别加入平板内，立即倾注45℃营养放琼脂，置37℃培养箱中，培养48h，观察细菌生长情况，无菌落形成的药液最小浓度为MBC。试验重复4次。
五.抗菌实验结果
1.无花果叶乙醇提取物的抑菌作用(抑菌环实验)，药物对试验菌的抑菌作用，结果见表4。
                              表4  无花果叶乙醇提取物的抑菌效果(抑菌环直径mm)
试验序号        金葡菌 溶血性链球菌   肠球菌   大肠杆菌   腊样杆菌   阴沟杆菌   变形杆菌   枯草杆菌
  1234平均对照   19.2619.1019.3019.5019.290.00     19.0318.5019.1218.7518.850.00   16.4516.2616.1816.5016.350.00   18.5517.5818.2617.6618.010.00   22.4523.5023.1522.5822.920.00   19.5719.8220.0119.8619.820.00   14.5114.2213.8414.1514.180.00   23.4424.2323.5823.6223.720.00
依据中华人民共和国卫生部《消毒技术规范》2002年版第2.1.8.2.4项评价规定，其抑菌环直径大于7mm者，判断为有抑菌作用。由表4可以看出药物对试验菌的抑菌环直径均大于7mm。
2.最小抑菌浓度测定实验(营养肉汤稀释法)由表5可见无花果叶提取物对金黄色葡萄球、枯草杆菌菌、溶血性链球菌等细菌有较强的抑菌作用，结果见表5。
                       表5  无花果叶乙醇提取物抑菌作用
菌种                                 药物稀释度
1∶1 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 1∶128 1∶256 阳性对照 阴性对照
金黄色葡萄球菌溶血性链球菌肠球菌大肠杆菌腊样芽孢杆菌阴沟杆菌变形杆菌枯草杆菌 -    -    -    -    -     -     -     -      +      +        --    -    -    -    -     -     -     +      +      +        --    -    -    -    +     +     +     +      +      +        --    -    -    -    -     -     +     +      +      +        --    -    -    -    -     -     +     +      +      +        --    -    -    -    -     -     +     +      +      +        --    -    -    -    +     +     +     +      +      +        --    -    -    -    -     -     -     -      +      +        -
注：表中“+”表示有菌生长，“-”表示无菌生长。
3.药物的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度结果见表6。
表6  无花果叶乙醇提取物的MIC和MBC(mg/ml)
菌种              MIC     MBC  阳性对照 阴性对照
金黄色葡萄球菌    12.5    12.5    +        -溶血性链球菌      25.0    25.0    +        -肠球菌            200.0   200.0   +        -大肠杆菌          50.0    50.0    +        -腊样芽孢杆菌      50.0    50.0    +        -阴沟杆菌          50.0    50.0    +        -变形杆菌          200.0   200.0   +        -枯草杆菌          12.5    12.5    +        -
注：表中符号“-、+”含义同表5
由表6可知，无花果叶对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌的MIC和MBC均为12.5mg/ml；无花果叶乙醇提取物在25mg/ml时对溶血性链球菌有杀灭作用。而对于肠球菌和变形杆菌的MIC和MBC的为200mg/ml。
六.结论
经实验证明，无花果叶提取物具有明显的抑制病原微生物的活性。药物的最小有效浓度为0.5mg/ml，无花果叶乙醇提取物和水提取物的最大无毒浓度分布为550mg/ml和50mg/ml，治疗指数分别为1100和100。无花果叶提取物体外对单纯疱疹病毒具有明显的抑制和杀灭作用；无花果叶乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、腊样芽孢杆菌等8种菌株的抑菌环直径均大于7mm；对多种常见微生物均有较强的抑菌和杀菌作用。无花果叶提取物在体外具有明显的抗单纯疱疹病毒和抑菌作用。

Claims (5)

1.无花果叶提取物，其特征是以无花果叶为原料通过水提取或乙醇提取而得。
2.如权利要求1所述的无花果叶提取物，其特征是所述的水提取方法具体如下：
自然晾干的无花果叶，先破碎，称取10-20重量份无花果叶，放入加热容器中，加入无花果叶8-10倍重量的双蒸水，浸泡20-30小时，过滤；滤液留存，无花果叶再次加水浸泡，方法同前，如此经水连续提取3次；合并3次的滤液，放56℃水浴蒸发滤液至原体积的1/3～1/4，浓缩至生药含量50-60mg/ml，抽滤除菌，分装，-20℃保存。
3.如权利要求1所述的无花果叶提取物，其特征是所述乙醇提取方法具体如下：
将干燥破碎的无花果叶用95％乙醇浸泡20-30小时，无花果叶与95％乙醇的重量比是1∶5-10，加热回流2次，合并提取液，减压浓缩至生药含量330mg/ml，抽滤除菌，分装，-20℃保存。
4.无花果叶提取物用于制备抗单纯疱疹病毒和/或抗常见致病细菌的药物。
5.如权利要求4所述的无花果叶提取物的应用，其特征是所述药物中无花果叶提取物的最小有效浓度为0.5mg/ml；无花果叶乙醇提取物、水提取物的最大无毒浓度分别为550mg/ml和50mg/ml。
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