CN1649997A - 变异碱性纤维素酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及序列号1所示的氨基酸序列或与其具有90％以上同源性的纤维素酶，特别涉及使选自序列号1的343位～377位或相当于该位置的氨基酸残基中的一个以上缺失，将氨基酸残基数2～15的肽插入到该缺失部分的变异碱性纤维素酶以及对该变异纤维素酶进行编码的遗传基因。该变异碱性纤维素酶具有接近洗涤液中的pH值(pH在10.5附近)的最优pH值，适于用作洗涤用酶。

Description

变异碱性纤维素酶
技术领域
本发明涉及可作为衣料用洗剂等的配料的变异碱性纤维素酶。
背景技术
使用衣料用洗剂时，洗涤液中的pH基本上在pH10～11的碱性区域。因此，要求用作衣料用洗剂配料的酶适应碱性环境，且在碱性环境下具有稳定性。
目前，就可用作衣料用洗剂等的配料的碱性纤维素酶而言，已知有，源于属于芽孢杆菌属(Bacillus)的Bacillus sp.KSM-635的碱性纤维素酶(揭示于日本特公昭60-23158号公报，特公平6-030578号公报，美国专利第4945053号说明书等)、源于Bacillus sp.KSM-64的碱性纤维素酶(Shikata et al.Agric.Biol.Chem.，54，91-96，1990；Sumitomo et al.，Biosci.Biotechnol.Biochem.，56，872-877，1992)、由嗜温嗜碱菌Bacillussp.KSM-S237(FERM-BP7875：于平成9年2月6日保藏于日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)的独立行政法人产业技术综合研究所的专利生物保藏中心)生成的耐热性碱性纤维素酶(日本特开平10-313859号公报)、源于Bacillus sp.KSM-N257的碱性纤维素酶(日本特愿平12-281378)、源于Bacillus so.KSM-N131的碱性纤维素酶(日本特愿平12-373859)等，以羧甲基纤维素(CMC)为基质时，它们的最优反应pH值均在9附近，该pH值并不是最适于洗涤的。
而就葡糖苷酶而言，改变其最优反应pH值的研究有：构筑源于嗜碱性芽孢杆菌(Bacillus)的碱性纤维素酶(NK1)和源于枯草杆菌(Bacillus subtilis)的中性纤维素酶(BSC)的嵌合蛋白，改变其pH值特性的实例，它使最优pH值由碱性移向中性(Park et al.，Protein Eng.，6，921-926，1993)。
而最近，有报告指出：源于木霉(Trichoderma reesei)的纤维二糖水解酶(Cel7A)，通过取代其活性中心附近的氨基酸，比野生型更能提高最优pH值(Beker et al，Biochem.J.，356，19-31，2001)，但因野生型酶的最优pH值在酸性区域，其变异体的最优pH值最多不过提高了1个pH值单位。
因此，实际情况是，几乎还未被报知有使葡糖苷酶的最优反应pH值移向碱性侧的实例。
发明内容
而本发明的目的在于，通过改变碱性纤维素酶的遗传基因，提供具有最适于洗剂用酶的pH值的变异碱性纤维素酶。
本发明人等预判了序列号1所示的碱性纤维素酶(Egl-237)的立体构造，特别是以其活性域为中心的立体构造，利用位点特异性诱变法，导入各种变异，寻求目标酶，结果发现：使形成环状构造的局部特定区域的氨基酸残基缺失，并在该部位插入新肽，就能提高CMC分解活性的最优反应pH值。
即，本发明涉及序列号1所示氨基酸序列或与其具有90％以上同源性的纤维素酶，并提供使选自序列号1的343位～377位或相当于该位置的氨基酸残基中的一个以上缺失，将氨基酸残基数2～15的肽插入该缺失部分的变异碱性纤维素酶以及对其进行编码的遗传基因。
本发明还提供含该遗传基因的媒介物，以及含该媒介物的转化体。
附图说明
图1a～1c为与序列号1所示氨基酸序列具有90％以上同源性的纤维素酶的氨基酸序列排列图。
图2为丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸变异体的最优反应pH值示意图。
图3为丙氨酸-组氨酸-丙氨酸变异体的最优反应pH值示意图。
图4为丙氨酸-精氨酸-丙氨酸变异体的最优反应pH值示意图。
具体实施方式
本发明的变异碱性纤维素酶是以序列号1所示氨基酸序列或与其具有90％以上同源性的纤维素酶为变异对象的纤维素酶(下亦称为“母本碱性纤维素酶(parent alkaline cellulase)”)，使选自该序列号1的343位～377位或相当于该位置的氨基酸残基中的一个以上缺失，将氨基酸残基数2～15的肽插入到该缺失部分而形成的，母本碱性纤维素酶既可以是野生型的变异体，也可以是实施了人工变异的变异体。
在本发明中，与母本碱性纤维素酶的序列号1所示的氨基酸序列有90％以上同源性的纤维素酶，更优选为显示出与该氨基酸序列有95％以上同源性的纤维素酶，进一步优选为显示出有98％以上同源性的纤维素酶，它们既可以是野生型，也可以是野生型的变异体。另外，氨基酸序列的同源性可使用GENETYX-WIN的最大匹配法或同源性检索等程序(Software Development Co.)进行计算。
另外，与该以序列号1表示的氨基酸序列具有90％以上同源性的纤维素酶，在使用同源模拟法用3D-1D、XPLORE及PROCHECK程序预测纤维素酶分子构造后的情况下，优选为与序列号1中第42位的亮氨酸～第404号的缬氨酸的活性域具有70％以上、更优选为80％以上、进一步优选为90％以上、更进一步优选为95％以上、特别优选为98％以上的同源性，且优选为相当于序列号1中第343位的天冬氨酸～第377位的亮氨酸的氨基酸序列在纤维素酶分子内具有环状构造。且，此时的氨基酸序列的同源性能以例如Lipman-Pearson法(Science，227，1435，1985)等为基准计算。
而且，母本碱性纤维素酶优选具有：以利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法或凝胶过滤法得到的的分子量为86000±2000的羧甲基纤维素为基质时的最优反应pH值在7.5～9.0之间，最优反应温度在40～50℃的范围内等性质，且母本碱性纤维素酶优选为能像消化羧甲基纤维素一样高效消化地衣多糖，并优选为，即使在pH9、50℃的条件下处理10分钟也具有充分的稳定性。
特别优选为具有如下性质的母本碱性纤维素酶，即，分子量为86000±2000(利用SDS-PAGE法或使用Sephacryl S200柱的凝胶过滤法测得)；最优反应pH值为8.6～9.0；最优反应温度为50℃；能像消化羧甲基纤维素一样高效消化地衣多糖；在pH9的5mM氯化钙的存在下，进行50℃、10分钟的处理的情况下，具有95％以上(以30℃、10分钟处理时的残存活性为100％)的残存活性。
综上，本发明的母本碱性纤维素酶，除了以序列号1表示的碱性纤维素酶以外，如上所述，优选为还有与序列号1的特定活性域具有较高的同源性、且具有序列号1的特定氨基酸序列在纤维素酶分子内有环状构造的氨基酸序列上的特征和/或上述酶类学性质，特别是具有该氨基酸序列上的特征且具有酶类学性质，显示出与序列号1所示氨基酸序列90％以上、优选为95％以上、更优选为98％以上的同源性。
具体可以举出“具有以序列号1表示的氨基酸序列的碱性纤维素酶”的Egl-237(源于Bacillus sp.KSM-S237(FERM BP-7875)、Hakamada等，Biosci.Biotechnol.Biochem.，64，2281-2289，2000)、源于Bacillus sp.1139菌株的碱性纤维素酶(Egl-1139，Fukumori等，J.Gen，Microbiol，132，2329-2335，同源性91.4％)、源于Bacillus sp.KSM-64菌株的碱性纤维素酶(Egl-64，Sumitomo等，Biosci.Biotechnol.Biochem.，56，872-877，1992，同源性91.9％)、源于Bacillus sp.KSM-N131菌株的纤维素酶(Egl-N131b，日本特愿2000-47237号，同源性95.0％)等。
本发明的变异碱性纤维素酶是在上述母本碱性纤维素酶中，使选自序列号1的343位～377位或相当于该位置的氨基酸残基缺失一个以上，将氨基酸残基数2～15的肽插入该缺失部分的纤维素酶。
缺失的氨基酸残基只要是在序列号1的343位～377位的任意连续或非连续的1～35个氨基酸残基即可，优选为在350位～377位中的、更优选为在355位～365位中的、进一步优选为357位～362位中的氨基酸残基。
特别优选为343位～377位中的任意1～27残基、2～15残基或3～10残基，355位～377位中的任意1～8残基、3～6残基或所有氨基酸残基，357位～362位中的任意2残基、2～5残基或所有氨基酸残基。
发明人推定该序列号1的343位～377位的氨基酸区域为，根据利用同源模拟的立体构造解析(Ozawa et al.，Protein Eng.，14，501-504，2001)，是存在于较大偏离于Egl-237的活性中心的位置，自由度高且与纤维素酶构造的维持密切相关的形成环状构造的局部区域。
而就辨识“相当于序列号1的343位～377位的位置的氨基酸残基”的方法而言，可通过例如使用Lipman-Pearson法等公知算法比较氨基酸序列，赋予存在于各碱性纤维素酶的氨基酸序列中的保存氨基酸残基最大同源性进行。通过用这样的方法排列纤维素酶的氨基酸序列，就可在不受氨基酸序列中的插入、缺失影响地对相同氨基酸残基在各纤维素中的序列中的位置进行定位(图1a～1c)。发明人推测，假设存在于三维构造中的相同位置定义为相同位置，则具有与对象纤维素酶的特性相关的类似效果。
例如，如表示上述Egl-1139、Egl-64、Egl-N131b的相当于以序列号1表示的具有氨基酸序列的纤维素酶(Egl-237)的357位～362位的位置，则如下表1所示。
表1
  Egl-237   Egl-1139   Egl-64   Egl-N131b
  357Gly   357Gly   357Gly   343Gly
  358Lys   358Lys   358Lys   344Lys
  359Ser   359Ser   359Ser   345Ser
  360Asn   360Asn   360Asn   346Asn
  361Ala   361Ala   361Ala   347Ala
  362Thr   362Thr   362Thr   348Thr
应插入该缺失部位的肽，可由20种必需氨基酸的任一种构成，优选含有丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸，特别优选为含有丙氨酸、丙氨酸和组氨酸、丙氨酸和精氨酸。
而构成肽的氨基酸残基的数目优选为2～15，更优选为2～10，进一步优选为2～6，特别优选为3。
这类肽的优选例，可以举出例如天冬氨酸-苏氨酸-丙氨酸-缬氨酸-甘氨酸-异亮氨酸、丙氨酸-丝氨酸-蛋氨酸-亮氨酸-苯基丙氨酸-谷氨酸、半胱氨酸-亮氨酸-甘氨酸-组氨酸-丝氨酸、酪氨酸-谷氨酸-赖氨酸-丙氨酸-丙氨酸、天冬氨酸-蛋氨酸-异亮氨酸-缬氨酸、异亮氨酸-苏氨酸-脯氨酸-赖氨酸、甘氨酸-亮氨酸-半胱氨酸、丝氨酸-缬氨酸-苯基丙氨酸，其中，尤其优选为两端有丙氨酸残基的3～6残基的肽，更优选为丙氨酸-任一氨基酸-丙氨酸，特别优选为丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸、丙氨酸-组氨酸-丙氨酸或丙氨酸-精氨酸-丙氨酸。
另外，本发明的变异碱性纤维素酶只要不丧失碱性纤维素酶活性和可变异性，则上述变异还包括氨基酸序列中1～多个氨基酸残基缺失、取代或加成。
本发明的变异碱性纤维素酶还可例如利用下述方法向母本碱性纤维素酶导入目标变异。
即，可对培养母本碱性纤维素酶而得的培养液进行离心分离，从中分离出菌体，调制含有来自该菌体的碱性纤维素酶遗传基因的染色体DNA(例如，按照Marmar法(J.Mol.Biol.，3，208-212，1961)或斋藤和三浦的方法(Biochim.Biophys.Acta，72，619-629，1963))，使用鸟枪克隆法或PCR法就可克隆对母本碱性纤维素酶(例如具有以序列号1表示的氨基酸序列的碱性纤维素酶)进行编码的遗传基因(序列号2)。向克隆的遗传基因导入变异，使用含变异遗传基因的质体，对适当的宿主菌进行转化，培养转化株，从而由该培养物得到本发明的变异碱性纤维素酶。
将变异导入编码亲性纤维素酶的方法，可使用位点特异性诱变法等。例如，可使用日本Takara公司的“位点直接突变系统突变快速套件(Site-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Km kit)”等。导入了变异的碱性纤维素酶遗传基因可嵌入适当的媒介物。
可用于本发明的媒介物，可使用任意物质，只要可保持在宿主菌内的复制，能表达碱性纤维素酶遗传基因，可稳定保持嵌入的该遗传基因即可。例如，以芽孢杆菌属细菌为宿主时，可举出pUB110、pHY300PLK等，以大肠菌为宿主时，可举出pUC18、pUC19、pBR322或pHY300PLK等。
为使采用如此得到的重组媒介物进行宿主菌的转化，可使用原生质法、感受态细胞法和电穿孔法。对宿主菌无特别限制，可以举出芽孢杆菌属(枯草杆菌)等的革兰氏阳性菌，大肠杆菌(Escherichia coli)等革兰氏阴性菌，链霉菌属(Streptomyces，放线菌)、酵母菌属(Saccharomyces，酵母)、曲霉菌属(Aspergillus，霉菌)等菌属的真菌。
所得转化体可在使用能用于孵化的包括碳源、氮源、金属盐、维生素等的培养基的情况下，在适当条件下培养。利用通常方法，从如此得到的培养液中分离出酶，并精制，通过冻结干燥、喷雾干燥、结晶，即可得到所需酶形态。
如此得到的变异碱性纤维素酶的最优反应pH值高于母本碱性纤维素酶，优选为移向pH9.0～9.5、更优选为pH9.5～10.0的高碱性侧。并优选为除变异碱性纤维素酶的最优反应pH值之外，保持着上述母本碱性纤维素酶其它性质。
实施例
实施例1 Egl-237环状区域的改变
以结晶构造已被解析的CelK的解析数据为基础，通过同源模拟构筑Egl-237的分子模版，模版构造的精密化通过3D-1D、XPLORE和PROCHECK程序进行。然后，根据所得信息，使环状构造内的部分氨基酸(357号甘氨酸～362号苏氨酸)缺失，同时导入新丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸、丙氨酸-组氨酸-丙氨酸及丙氨酸-精氨酸-丙氨酸。该环状区域的变异，分别使用变异导入引物1、2、3(序列号3、4、5)，反义引物使用变异导入引物4(序列号6)。在丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸的变异导入中，将在pHY300PLK中重组的Egl-237遗传基因用作模版DNA。而对于丙氨酸-组氨酸-丙氨酸及丙氨酸-精氨酸-丙氨酸的变异导入，将在pHY300PLK中重组的丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸变异体质体用作模版DNA。具体而言，将模版DNA质体0.5μL(10ng)、变异导入用引物20μL(1μM)、反义引物20μL(1μM)、10倍浓度的PCR用缓冲液10μL、10mM脱氧核苷三磷酸(dNTP)混合液8μL、Pyrobest DNA聚合酶0.5μL(2.5单位，Takara)和去离子水39.5μL混合后，用“gene amp PCR system9700”(Amersham-Pharmacia)实施PCR。反应条件为，经94℃的两分钟热改性后，在94℃-1分钟、60℃-1分钟、72℃-1.5分钟(30次循环)和72℃-3分钟的条件下进行。用“GFX PCR DNA and Gel BandPurification Kit(Amersham-Pharmacia)”精制所得PCR产物(43.5μL)，然后添加5.5μL的10倍浓度的磷酸化用缓冲液和1μL(10单位)多核苷酸激酶，在37℃下进行1小时磷酸化反应后，进行精制。将模版DNA质体2μL(20ng)、10倍浓度的PCR用缓冲液10μL、10mM dNTP混合液8μL、Pyrobest DNA聚合酶1μL(5单位)和去离子水54μL与磷酸化的PCR产物25μL混合，然后进行PCR。反应条件为，经94℃的2分钟热改性后，在94℃-1分钟、58℃-1分钟、72℃-6分钟(30次循环)和72℃-12分钟的条件下进行。精制所得PCR产物后(43.5μL)，添加5.5μL的10倍浓度的磷酸化用缓冲液和1μL(10单位)的多核苷酸激酶，在37℃下进行1小时磷酸化反应。使利用乙醇沉淀而回收的10μL的DNA溶液，在使用ligation kit ver.2(Takara)、16℃的条件下，进行18小时连接反应，自封闭成环后，再利用乙醇沉淀回收DNA混合液。
实施例2转化法
使用实施例1所得DNA混合液5μL，导入枯草杆菌ISW1214菌株，得到转化体(Chang and Cohen，Mol.Gen.Gent，168，111，1979)。将由该方法得到的原生质体涂沫在含四环素(15μg/mL，Sigma)的DM3再生琼脂培养基(0.8％(w/v)，琼脂，和光纯药；0.3M琥珀酸二钠六水合物，0.5％酪蛋白氨基酸，Difco；0.5％酵母提取物；0.35％KH2PO4；0.15％K2HPO4；0.5％葡萄糖；0.4％MgCl2·6H2O；0.01％牛血清蛋白，Sigma；0.5％CMC，关东化学；0.005％台盼蓝，Merck；及氨基酸混合液，亮氨酸、蛋氨酸10μg/mL)上，在30℃下培养72小时，得到转化体。在DM3再生琼脂平板培养基上，在30℃下，将形成菌鞘层(halo)的转化体用含四环素(15μg/mL)的胨培养基(3％胨S；3％麦芽糖；0.5％鱼肉提取物，和光纯药；0.1％酵母提取物；0.1％KH2PO4；0.02％MgSO4·7H2O)摇动培养15小时，收集菌体后，用“Micro PrepPlasmid Purification kit”(Amersham-Pharmacia)回收质体并精制。使用377DNA序列仪(Applied Biosystems)确认插入所取得的质体中的纤维素酶遗传基因的变异序列。为能破译变异导入附近区域，选用适当的序列仪用引物，进行碱基序列破译，甄选导入的目标变异质体。
实施例3纤维素酶变异体的生产
在30℃下经72小时，使用含3％胨S(日本制药制)、0.5％鱼肉提取物、0.05％酵母提取物、0.1％KH2PO4、0.02％MgSO4·7H2O、四环素(15μg/mL)及5％麦芽糖的培养基，培养B.subtilis ISW1214宿主菌株。
培养各种变异体的结果是：环状区域变异体丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸的纤维素酶活性量为36800U/L，丙氨酸-组氨酸-丙氨酸纤维素酶活性量为34700U/L，丙氨酸-精氨酸-丙氨酸的纤维素酶活性量为32400U/L。
纤维素酶活性用3，5-二硝基水杨酸(DNS)法测定。
即，将0.1mL适当稀释的酶液加入含0.2mL的0.5M甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH9.0)、0.4mL的2.5％(w/v)羧甲基纤维素(A01MC，日本制纸)、0.3mL的去离子水的反应液中，在40℃下反应20分钟，然后添加1mL的二硝基水杨酸试剂(0.5％二硝基水杨酸、30％罗谢尔盐、1.6％氢氧化钠水溶液)，在沸水中进行5分钟的还原糖显色。在冰水中急冷，添加4mL的去离子水，测定535nm的吸光度，求得还原糖的生成量。将二硝基水杨酸试剂加入未加酶液处理的反应液中，然后添加酶液，同样进行显色反应，得到空白样品。以在上述反应条件下1分钟内相当于生成1μmol葡萄糖的还原糖量，为1单位(1U)酶。
实施例4  重组纤维素酶环状修饰体的精制
用去离子将重组纤维素酶环状修饰体的培养上清液稀释到10倍，然后点涂至用10mM三氨基甲烷盐酸缓冲液(pH8.0)预平衡的DEAEToyopearl柱(Tosoh，2.5cm×5cm)中。用该缓冲液洗净柱后，利用该缓冲液中0～0.4M氯化钠400mL的直线浓度梯度，使蛋白质溶离。目标重组纤维素酶环状修饰体在氯化钠浓度0.25M附近，以近乎单组份地电泳溶离。脱盐浓缩时，使用超级过滤膜(PM10，Millipore)。
实施例5  重组纤维素酶修饰体的最优反应pH值
使用实施例4所得重组纤维素酶修饰体的精制样品，研究pH值对酶反应的影响。使用甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH8.2～10.9)研究最优反应pH值后，结果判定：重组野生型纤维素酶的最优反应pH值为9.0，而丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸变异体的纤维素酶的最优反应pH值为10，向高碱性侧移动了1pH单位(图2)。另外，丙氨酸-组氨酸-丙氨酸变异体及丙氨酸-精氨酸-丙氨酸变异体的最优反应pH值在9.6附近，且以最优pH值9.6的活性为100％时，pH8.8～pH9.9的相对活性值为95％以上，与母本纤维素酶或丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸变异体相比，得到提高。
产业实用性
本发明的变异碱性纤维素酶具有接近洗涤液中的pH值(pH10.5附近)的最优pH值，适于用作洗涤用酶。
                           序列表
<110>花王株式会社
<120>变异碱性纤维素酶
<130>P
<150>JP P2002-124474
<151>2002-04-25
<160>6
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>824
<212>PRT
<213>芽孢杆菌sp.KSM-S237(Bacillus sp.KSM-S237)
<400>1
Met Met Leu Arg Lys Lys Thr Lys Gln Leu Ile Ser Ser Ile Leu Ile
  1               5                  10                  15
Leu Val Leu Leu Leu Ser Leu Phe Pro Ala Ala Leu Ala Ala Glu Gly
             20                  25                 30
Asn Thr Arg Glu Asp Asn Phe Lys His Leu Leu Gly Asn Asp Asn Val
         35                  40                 45
Lys Arg Pro Ser Glu Ala Gly Ala Leu Gln Leu Gln Glu Val Asp Gly
     50                   55                  60
 Gln Met Thr Leu Val Asp Gln His Gly Glu Lys Ile Gln Leu Arg Gly
  65                  70                  75                  80
Met Ser Thr His Gly Leu Gln Trp Phe Pro Glu Ile Leu Asn Asp Asn
                 85                  90                  95
Ala Tyr Lys Ala Leu Ser Asn Asp Trp Asp Ser Asn Met Ile Arg Leu
             100                   105                  110
Ala Met Tyr Val Gly Glu Asn Gly Tyr Ala Thr Asn Pro Glu Leu Ile
        115                 120                 125
Lys Gln Arg Val Ile Asp Gly Ile Glu Leu Ala Ile Glu Asn Asp Met
    130                 135                 140
Tyr Val Ile Val Asp Trp His Val His Ala Pro Gly Asp Pro Arg Asp
145                 150                 155                 160
Pro Val Tyr Ala Gly Ala Lys Asp Phe Phe Arg Glu Ile Ala Ala Leu
                165                 170                 175
Tyr Pro Asn Asn Pro His Ile Ile Tyr Glu Leu Ala Asn Glu Pro Ser
            180                  185                190
Ser Asn Asn Asn Gly Gly Ala Gly Ile Pro Asn Asn Glu GluGly Trp
        195                 200                 205
Lys Ala Val Lys Glu Tyr Ala Asp Pro Ile Val Glu Met Leu Arg Lys
    210                 215                 220
Ser Gly Asn Ala Asp Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Ser Pro Asn Trp
225                 230                 235                 240
Ser Gln Arg Pro Asp Leu Ala Ala Asp Asn Pro Ile Asp Asp His His
                245                 250                 255
Thr Met Tyr Thr Val His Phe Tyr Thr Gly Ser His Ala Ala Ser Thr
            260                 265                 270
Glu Ser Tyr Pro Ser Glu Thr Pro Asn Ser Glu Arg Gly Asn Val Met
        275                 280                 285
Ser Asn Thr Arg Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Val Ala Val Phe Ala Thr
    290                 295                 300
Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala Ser Gly Asp Gly Gly Pro Tyr Phe Asp
305                 310                 315                 320
Glu Ala Asp Val Trp Ile Glu Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile Ser Trp
                 325                330                 335
Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn Lys Asn Glu Val Ser Gly Ala Phe Thr
            340                 345                 350
Pro Phe Glu Leu Gly Lys Ser Asn Ala Thr Asn Leu Asp Pro Gly Pro
        355                 360                 365
Asp His Val Trp Ala Pro Glu Glu Leu Ser Leu Ser Gly Glu Tyr Val
    370                 375                 380
Arg Ala Arg Ile Lys Gly Val Asn Tyr Glu Pro Ile Asp Arg Thr Lys
385                 390                 395                 400
Tyr Thr Lys Val Leu Trp Asp Phe Asn Asp Gly Thr Lys Gln Gly Phe
                405                  410                415
Gly Val Asn Ser Asp Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ile Ala Val Asp Asn
            420                  425                430
Glu Asn Asn Thr Leu Lys Val Ser Gly Leu Asp Val Ser Asn Asp Val
        435                 440                 445
Ser Asp Gly Asn Phe Trp Ala Asn Ala Arg Leu Ser Ala Asn Gly Trp
   450                  455                 460
Gly Lys Ser Val Asp Ile Leu Gly Ala Glu Lys Leu Thr Met Asp Val
465                  470                475                 480
Ile Val Asp Glu Pro Thr Thr Val Ala Ile Ala Ala Ile Pro Gln Ser
                485                 490                 495
Ser Lys Ser Gly Trp Ala Asn Pro Glu Arg Ala Val Arg Val Asn Ala
            500                 505                 510
Glu Asp Phe Val Gln Gln Thr Asp Gly Lys Tyr Lys Ala Gly Leu Thr
        515                 520                 525
Ile Thr Gly Glu Asp Ala Pro Asn Leu Lys Asn Ile Ala Phe His Glu
    530                 535                 540
Glu Asp Asn Asn Met Asn Asn Ile Ile Leu Phe Val Gly Thr Asp Ala
545                 550                 555                560
Ala Asp Val Ile Tyr Leu Asp Asn Ile Lys Val Ile Gly Thr Glu Val
                 565                570                 575
Glu Ile Pro Val Val His Asp Pro Lys Gly Glu Ala Val Leu Pro Ser
            580                 585                 590
Val Phe Glu Asp Gly Thr Arg Gln Gly Trp Asp Trp Ala Gly Glu Ser
        595                 600                 605
Gly Val Lys Thr Ala Leu Thr Ile Glu Glu Ala Asn Gly Ser Asn Ala
    610                 615                 620
Leu Ser Trp Glu Phe Gly Tyr Pro Glu Val Lys Pro Ser Asp Asn Trp
625                 630                 635                 640
Ala Thr Ala Pro Arg Leu Asp Phe Trp Lys Ser Asp Leu Val Arg Gly
                645                  650                655
Glu Asn Asp Tyr Val Ala Phe Asp Phe Tyr Leu Asp Pro Val Arg Ala
            660                 665                 670
Thr Glu Gly Ala Met Asn Ile Asn Leu Val Phe Gln Pro Pro Thr Asn
        675                 680              685
Gly Tyr Trp Val Gln Ala Pro Lys Thr Tyr Thr Ile Asn Phe Asp Glu
    690                 695                 700
Leu Glu Glu Ala Asn Gln Val Asn Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys
705                 710                 715                 720
Ile Asn Val Arg Asp Ile Thr Asn Ile Gln Asp Asp Thr Leu Leu Arg
                725                 730                 735
Asn Met Met Ile Ile Phe Ala Asp Val Glu Ser Asp Phe Ala Gly Arg
            740                 745                 750
Val Phe Val Asp Asn Val Arg Phe Glu Gly Ala Ala Thr Thr Glu Pro
        755                 760                 765
Val Glu Pro Glu Pro Val Asp Pro Gly Glu Glu Thr Pro Pro Val Asp
    770                 775                 780
Glu Lys Glu Ala Lys Lys Glu Gln Lys Glu Ala Glu Lys Glu Glu Lys
785                 790                 795                 800
Glu Ala Val Lys Glu Glu Lys Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Lys Ala
                805                 810                 815
Val Lys Asn Glu Ala Lys Lys Lys
            820
<210>2
<211>2475
<212>DNA
<213>芽孢杆菌sp.KSM-S237
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2475)
<400>2
atg atg tta aga aag aaa aca aag cag ttg att tct tcc att ctt att   48
Met Met Leu Arg Lys Lys Thr Lys Gln Leu Ile Ser Ser Ile Leu Ile
  1               5                  10                  15
tta gtt tta ctt cta tct tta ttt ccg gca gct ctt gca gca gaa gga   96
Leu Val Leu Leu Leu Ser Leu Phe Pro Ala Ala Leu Ala Ala Glu Gly
            20                   25                  30
aac act cgt gaa gac aat ttt aaa cat tta tta ggt aat gac aat gtt   144
Asn Thr Arg Glu Asp Asn Phe Lys His Leu Leu Gly Asn Asp Asn Val
        35                  40                  45
aaa cgc cct tct gag gct ggc gca tta caa tta caa gaa gtc gat gga   192
Lys Arg Pro Ser Glu Ala Gly Ala Leu Gln Leu Gln Glu Val Asp Gly
    50                   55                  60
caa atg aca tta gta gat caa cat gga gaa aaa att caa tta cgt gga   240
Gln Met Thr Leu Val Asp Gln His Gly Glu Lys Ile Gln Leu Arg Gly
 65                  70                  75                  80
atg agt aca cac gga tta cag tgg ttt cct gag atc ttg aat gat aac   288
Met Ser Thr His Gly Leu Gln Trp Phe Pro Glu Ile Leu Asn Asp Asn
                 85                  90                  95
gca tac aaa gct ctt tct aac gat tgg gat tcc aat atg att cgt ctt   336
Ala Tyr Lys Ala Leu Ser Asn Asp Trp Asp Ser Asn Met Ile Arg Leu
            100                 105                 110
gct atg tat gta ggt gaa aat ggg tac gct aca aac cct gag tta atc   384
Ala Met Tyr Val Gly Glu Asn Gly Tyr Ala Thr Asn Pro Glu Leu Ile
        115                 120                 125
aaa caa aga gtg att gat gga att gag tta gcg att gaa aat gac atg   432
Lys Gln Arg Val Ile Asp Gly Ile Glu Leu Ala Ile Glu Asn Asp Met
    130                 135                 140
tat gtt att gtt gac tgg cat gtt cat gcg cca ggt gat cct aga gat   480
Tyr Val Ile Val Asp Trp His Val His Ala Pro Gly Asp Pro Arg Asp
145                 150                 155                 160
cct gtt tat gca ggt gct aaa gat ttc ttt aga gaa att gca gct tta   528
Pro Val Tyr Ala Gly Ala Lys Asp Phe Phe Arg Glu Ile Ala Ala Leu
                165                 170                 175
tac cct aat aat cca cac att att tat gag tta gcg aat gag ccg agt   576
Tyr Pro Asn Asn Pro His Ile Ile Tyr Glu Leu Ala Asn Glu Pro Ser
            180                 185                 190
agt aat aat aat ggt gga gca ggg att ccg aat aac gaa gaa ggt tgg   624
Ser Asn Asn Asn Gly Gly Ala Gly Ile Pro Asn Asn Glu Glu Gly Trp
        195                 200                  205
aaa gcg gta aaa gaa tat gct gat cca att gta gaa atg tta cgt aaa   672
Lys Ala Val Lys Glu Tyr Ala Asp Pro Ile Val Glu Met Leu Arg Lys
    210                 215                 220
agc ggt aat gca gat gac aac att atc att gtt ggt agt cca aac tgg   720
Ser Gly Asn Ala Asp Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Ser Pro Asn Trp
225                 230                  235                240
agt cag cgt ccg gac tta gca gct gat aat cca att gat gat cac cat   768
Ser Gln Arg Pro Asp Leu Ala Ala Asp Asn Pro Ile Asp Asp His His
                245                 250                 255
aca atg tat act gtt cac ttc tac act ggt tca cat gct gct tca act   816
Thr Met Tyr Thr Val His Phe Tyr Thr Gly Ser His Ala Ala Ser Thr
            260                 265                 270
gaa agc tat ccg tct gaa act cct aac tct gaa aga gga aac gta atg   864
Glu Ser Tyr Pro Ser Glu Thr Pro Asn Ser Glu Arg Gly Asn Val Met
        275                 280                 285
agt aac act cgt tat gcg tta gaa aac gga gta gcg gta ttt gca aca   912
Ser Asn Thr Arg Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Val Ala Val Phe Ala Thr
    290                 295                 300
gag tgg gga acg agt caa gct agt gga gac ggt ggt cct tac ttt gat   960
Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala Ser Gly Asp Gly Gly Pro Tyr Phe Asp
305                 310                 315                 320
gaa gca gat gta tgg att gaa ttt tta aat gaa aac aac att agc tgg   1008
Glu Ala Asp Val Trp Ile Glu Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile Ser Trp
                325                 330                 335
gct aac tgg tct tta acg aat aaa aat gaa gta tct ggt gca ttt aca   1056
Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn Lys Asn Glu Val Ser Gly Ala Phe Thr
            340                 345                 350
cca ttc gag tta ggt aag tct aac gca acc aat ctt gac cca ggt cca   1104
Pro Phe Glu Leu Gly Lys Ser Asn Ala Thr Asn Leu Asp Pro Gly Pro
        355                 360                 365
gat cat gtg tgg gca cca gaa gaa tta agt ctt tct gga gaa tat gta   1152
Asp His Val Trp Ala Pro Glu Glu Leu Ser Leu Ser Gly Glu Tyr Val
    370                  375                380
cgt gct cgt att aaa ggt gtg aac tat gag cca atc gac cgt aca aaa   1200
Arg Ala Arg Ile Lys Gly Val Asn Tyr Glu Pro Ile Asp Arg Thr Lys
385                 390                 395                 400
tac acg aaa gta ctt tgg gac ttt aat gat gga acg aag caa gga ttt   1248
Tyr Thr Lys Val Leu Trp Asp Phe Asn Asp Gly Thr Lys Gln Gly Phe
                405                 410                 415gga gtg aat tcg gat tct cca aat aaa gaa ctt att gca gtt gat aat   1296
Gly Val Asn Ser Asp Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ile Ala Val Asp Asn
            420                 425                 430
gaa aac aac act ttg aaa gtt tcg gga tta gat gta agt aac gat gtt   1344
Glu Asn Asn Thr Leu Lys Val Ser Gly Leu Asp Val Ser Asn Asp Val
        435                 440                 445
tca gat ggc aac ttc tgg gct aat gct cgt ctt tct gcc aac ggt tgg   1392
Ser Asp Gly Asn Phe Trp Ala Asn Ala Arg Leu Ser Ala Asn Gly Trp
    450                 455                 460
gga aaa agt gtt gat att tta ggt gct gag aag ctt aca atg gat gtt   1440
Gly Lys Ser Val Asp Ile Leu Gly Ala Glu Lys Leu Thr Met Asp Val
465                 470                 475                 480
att gtt gat gaa cca acg acg gta gct att gcg gcg att cca caa agt   1488
Ile Val Asp Glu Pro Thr Thr Val Ala Ile Ala Ala Ile Pro Gln Ser
                485                 490                 495
agt aaa agt gga tgg gca aat cca gag cgt gct gtt cga gtg aac gcg   1536
Ser Lys Ser Gly Trp Ala Asn Pro Glu Arg Ala Val Arg Val Asn Ala
            500                 505                 510
gaa gat ttt gtc cag caa acg gac ggt aag tat aaa gct gga tta aca   1584
Glu Asp Phe Val Gln Gln Thr Asp Gly Lys Tyr Lys Ala Gly Leu Thr
        515                 520                 525
att aca gga gaa gat gct cct aac cta aaa aat atc gct ttt cat gaa   1632
Ile Thr Gly Glu Asp Ala Pro Asn Leu Lys Asn Ile Ala Phe His Glu
    530                 535                 540
gaa gat aac aat atg aac aac atc att ctg ttc gtg gga act gat gca   1680
Glu Asp Asn Asn Met Asn Asn Ile Ile Leu Phe Val Gly Thr Asp Ala
545                 550                 555                 560
gct gac gtt att tac tta gat aac att aaa gta att gga aca gaa gtt   1728
Ala Asp Val Ile Tyr Leu Asp Asn Ile Lys Val Ile Gly Thr Glu Val
                565                 570                 575
gaa att cca gtt gtt cat gat cca aaa gga gaa gct gtt ctt cct tct   1776
Glu Ile Pro Val Val His Asp Pro Lys Gly Glu Ala Val Leu Pro Ser
            580                 585                 590
gtt ttt gaa gac ggt aca cgt caa ggt tgg gac tgg gct gga gag tct   1824
Val Phe Glu Asp Gly Thr Arg Gln Gly Trp Asp Trp Ala Gly Glu Ser
        595                 600                 605
ggt gtg aaa aca gct tta aca att gaa gaa gca aac ggt tct aac gcg   1872
Gly Val Lys Thr Ala Leu Thr Ile Glu Glu Ala Asn Gly Ser Asn Ala
    610                 615                 620
tta tca tgg gaa ttt gga tat cca gaa gta aaa cct agt gat aac tgg   1920
Leu Ser Trp Glu Phe Gly Tyr Pro Glu Val Lys Pro Ser Asp Asn Trp
625                 630                 635                 640
gca aca gct cca cgt tta gat ttc tgg aaa tct gac ttg gtt cgc ggt   1968
Ala Thr Ala Pro Arg Leu Asp Phe Trp Lys Ser Asp Leu Val Arg Gly
                645                 650                 655
gag aat gat tat gta gct ttt gat ttc tat cta gat cca gtt cgt gca   2016
Glu Asn Asp Tyr Val Ala Phe Asp Phe Tyr Leu Asp Pro Val Arg Ala
            660                 665                 670
aca gaa ggc gca atg aat atc aat tta gta ttc cag cca cct act aac   2064
Thr Glu Gly Ala Met Asn Ile Asn Leu Val Phe Gln Pro Pro Thr Asn
        675                 680                 685
ggg tat tgg gta caa gca cca aaa acg tat acg att aac ttt gat gaa   2112
Gly Tyr Trp Val Gln Ala Pro Lys Thr Tyr Thr Ile Asn Phe Asp Glu
    690                 695                 700
tta gag gaa gcg aat caa gta aat ggt tta tat cac tat gaa gtg aaa   2160
Leu Glu Glu Ala Asn Gln Val Asn Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys
705                 710                 715                 720att aac gta aga gat att aca aac att caa gat gac acg tta cta cgt   2208
Ile Asn Val Arg Asp Ile Thr Asn Ile Gln Asp Asp Thr Leu Leu Arg
                725                 730                 735
aac atg atg atc att ttt gca gat gta gaa agt gac ttt gca ggg aga   2256
Asn Met Met Ile Ile Phe Ala Asp Val Glu Ser Asp Phe Ala Gly Arg
            740                 745                 750
gtc ttt gta gat aat gtt cgt ttt gag ggg gct gct act act gag ccg   2304
Val Phe Val Asp Asn Val Arg Phe Glu Gly Ala Ala Thr Thr Glu Pro
        755                 760                 765
gtt gaa cca gag cca gtt gat cct ggc gaa gag acg cca cct gtc gat   2352
Val Glu Pro Glu Pro Val Asp Pro Gly Glu Glu Thr Pro Pro Val Asp
    770                 775                 780
gag aag gaa gcg aaa aaa gaa caa aaa gaa gca gag aaa gaa gag aaa   2400
Glu Lys Glu Ala Lys Lys Glu Gln Lys Glu Ala Glu Lys Glu Glu Lys
785                 790                 795                 800
gaa gca gta aaa gaa gaa aag aaa gaa gct aaa gaa gaa aag aaa gca   2448
Glu Ala Val Lys Glu Glu Lys Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Lys Ala
                 805                810                 815
gtc aaa aat gag gct aag aaa aaa taa                               2475
Val Lys Asn Glu Ala Lys Lys Lys
             820
<210>3
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
gtgcatttac accattcgag ttagctggcg caaatcttga cccaggtcca gatc 54
<210>4
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
ccattcgagt tagctcacgc aaatcttgac ccag 34
<210>5
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
ccattcgagt tagctcgtgc aaatcttgac ccag 34
<210>6
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
caataacatc cattgtaagc ttctcagcac c 31

Claims (9)

1.一种变异碱性纤维素酶，其特征在于，使序列号1所示的氨基酸序列或与其具有90％以上同源性的碱性纤维素酶的选自序列号1的343位～377位或相当于该位置的氨基酸残基中的一个以上缺失，将氨基酸残基数2～15的肽插入到所述缺失部分。
2.如权利要求1所述的变异碱性纤维素酶，其特征在于，使选自序列号1的357位～362位或相当于该位置的氨基酸残基中的一个以上缺失，将氨基酸残基数2～5的肽插入到所述缺失部分。
3.如权利要求1或2所述的变异碱性纤维素酶，其特征在于，使序列号1的357位～362位或相当于该位置的氨基酸残基全部缺失，将氨基酸残基数3的肽插入到所述缺失部分。
4.如权利要求1～3任一项所述的变异碱性纤维素酶，其特征在于，所插入的肽是以含有丙氨酸和甘氨酸、丙氨酸和组氨酸、丙氨酸和精氨酸中的任一种作为结构氨基酸残基。
5.如权利要求1～4任一项所述的变异碱性纤维素酶，其特征在于，所插入的肽为丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸、丙氨酸-组氨酸-丙氨酸或丙氨酸-精氨酸-丙氨酸。
6.对权利要求1～5任一项所述的变异碱性纤维素酶进行编码的遗传基因。
7.含有权利要求6所述的遗传基因的重组媒介物。
8.含有权利要求7所述的重组媒介物的转化体。
9.宿主为微生物的如权利要求8所述的转化体。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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EP2257623B1 (en) * 2008-03-25 2012-01-04 Kao Corporation Plasmid vector
CN102482656A (zh) * 2008-08-29 2012-05-30 埃欧金能源公司 具有提高的稳定性的经修饰的β-糖苷酶
US9169458B2 (en) 2010-03-12 2015-10-27 Kao Corporation Mutated alkaline cellulase
JP5727170B2 (ja) * 2010-07-30 2015-06-03 花王株式会社 変異セルラーゼ
JP5977029B2 (ja) * 2012-01-11 2016-08-24 花王株式会社 変異グリコシドハイドロラーゼ
JP6144483B2 (ja) * 2012-12-05 2017-06-07 花王株式会社 変異グリコシドハイドロラーゼ
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WO1987006940A1 (en) * 1986-05-06 1987-11-19 The Regents Of The University Of California ASSAYS AND ANTIBODIES FOR N-myc PROTEINS
GB8627914D0 (en) * 1986-11-21 1986-12-31 Procter & Gamble Softening detergent compositions
EP0269977B1 (en) * 1986-11-27 1994-06-01 Kao Corporation Alkaline cellulases and microorganisms capable of producing same
KR100303619B1 (ko) * 1992-10-06 2001-11-22 피아 스타르 셀룰라제변이체
US6313081B1 (en) * 1995-04-28 2001-11-06 Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien (Kgaa) Detergents comprising cellulases
CN1268166A (zh) * 1997-07-11 2000-09-27 普罗格特-甘布尔公司 含有特殊纤维素酶的碱性洗涤剂组合物
JP4380874B2 (ja) * 2000-02-24 2009-12-09 花王株式会社 アルカリセルラーゼ遺伝子

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