JP2003310270A

JP2003310270A - 変異アルカリセルラーゼ

Info

Publication number: JP2003310270A
Application number: JP2002124474A
Authority: JP
Inventors: Yoshihiro Hakamata; 佳宏袴田; Tadahiro Ozawa; 忠弘小澤; Toru Kobayashi; 徹小林
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2002-04-25
Filing date: 2002-04-25
Publication date: 2003-11-05
Anticipated expiration: 2022-04-25
Also published as: JP4417608B2; AU2003235831A1; CN1649997A; US20050287656A1; US7364891B2; CN101104849A; CN1324128C; EP1498476A4; EP1498476A1; DE60324127D1; WO2003091422A1; DK1498476T3; EP1498476B1

Abstract

(57)【要約】（修正有）【解決手段】特定アミノ酸配列又はこれと９０％以上
の相同性を有するセルラーゼについて、上記アミノ酸配
列の３４３位〜３７７位又はこれに相当する位置のアミ
ノ酸残基から選ばれる１以上を欠失させ、当該欠失部分
にアミノ酸残基数２〜１５のペプチド残基を挿入した変
異アルカリセルラーゼ；これをコードする遺伝子。【効果】本発明の変異アルカリセルラーゼは、洗濯液
中のｐＨ（ｐＨ１０．５付近）に近い最適ｐＨを有し、
洗剤用酵素として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は衣料用洗剤等に配合
可能な変異アルカリセルラーゼに関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】衣料用
洗剤使用時における洗濯液中のｐＨは、殆どがｐＨ１０
〜１１までのアルカリ性領域にある。従って、衣料用洗
剤に配合される酵素は、アルカリ性至適で且つアルカリ
性環境下で安定なものが要求されてきた。

【０００３】従来、衣料用洗剤等に配合可能なアルカリ
セルラーゼとしては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属するＢａ
ｃｉｌｌｕｓｓｐ. ＫＳＭ−６３５由来のアルカリ
セルラーゼ（特公昭６０−２３１５８号公報、特公平６
−０３０５７８号公報、米国特許第４９４５０５３号明
細書等）、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ. ＫＳＭ−６４由
来のアルカリセルラーゼ（Shikata et al. Agric.Biol.
Chem.,54,91-96,1990、Sumitomo et al.,Biosci. Biote
chnol.Biochem.,56,872-877,1992）、中温性の好アルカ
リ性菌Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＫＳＭ−Ｓ２３７
（ＦＥＲＭ−ＢＰ７８７５）により生産される耐熱性ア
ルカリセルラーゼ（特開平１０−３１３８５９号公
報）、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ. ＫＳＭ−Ｎ２５７由
来のアルカリセルラーゼ（特願平１２−２８１３７８
号）、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ. ＫＳＭ−Ｎ１３１由来
のアルカリセルラーゼ（特願平１２−３７３８５９号）
等が知られているが、これらはカルボキシメチルセルロ
ース（ＣＭＣ）を基質とした場合の最適反応ｐＨがいず
れも９付近であり、洗濯に対して最適なｐＨを有するも
のではない。

【０００４】一方、糖質分解酵素において、その最適反
応ｐＨを変化させるという研究としては、好アルカリ性
Ｂａｃｉｌｌｕｓ由来のアルカリセルラーゼ（ＮＫ1）
とＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の中性セル
ラーゼ（ＢＳＣ）のキメラタンパク質を構築し、そのｐ
Ｈ特性を変化させた例が報告されているが、これは、最
適ｐＨをアルカリ性から中性にシフトさせたものである
（Park et al.,Protein Eng.,6,921-926,1993）。

【０００５】また最近では、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ
ｒｅｅｓｅｉ由来のセロビオヒドロラーゼ（Ｃｅｌ7
Ａ）に関し、その活性中心近傍のアミノ酸を置換するこ
とで、野性型と比較してより最適ｐＨを上昇させた報告
がなされているが（Beker et al,Biochem. J.,356,19-3
1,2001）、これは野生型酵素の最適ｐＨが酸性領域にあ
り、その変異体の最適ｐＨは１ｐＨユニット以内の上昇
にすぎない。このように、糖質分解酵素においては、そ
の最適反応ｐＨをアルカリ性側にシフトさせた報告例は
殆ど無いのが実情である。

【０００６】本発明は、アルカリセルラーゼの遺伝子を
改変することによって、洗剤用酵素として最適のｐＨを
有する変異アルカリセルラーゼを提供することを目的と
する。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、配列番号
１に示すアルカリセルラーゼ（Ｅｇｌ−２３７）につい
て、その活性ドメインを中心に立体構造を予測し、部位
特異的変異法により種々の変異を導入することにより目
的の酵素を探索した結果、ループ構造の一部を構成する
特定領域のアミノ酸残基を欠失させ、当該部位に新たな
ペプチド残基を挿入することで、ＣＭＣ分解活性におけ
る最適反応ｐＨを上昇できることを見出した。

【０００８】すなわち本発明は、配列番号１で示される
アミノ酸配列又はこれと９０％以上の相同性を有するセ
ルラーゼについて、配列番号１の３４３位〜３７７位又
はこれに相当する位置のアミノ酸残基から選ばれる１以
上を欠失させ、当該欠失部分にアミノ酸残基数２〜１５
のペプチド残基を挿入した変異アルカリセルラーゼ、及
びそれをコードする遺伝子を提供するものである。

【０００９】また本発明は、該遺伝子を含有するベクタ
ー、該ベクターを含有する形質転換体を提供するもので
ある。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明の変異アルカリセルラーゼ
は、配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと９０
％以上の相同性を有するセルラーゼを変異の対象となる
セルラーゼ（以下、「親アルカリセルラーゼ」ともい
う）とし、当該配列番号１の３４３位〜３７７位又はこ
れに相当する位置のアミノ酸残基から選ばれる１以上を
欠失させ、当該欠失部分にアミノ酸残基数２〜１５のペ
プチド残基を挿入してなるものであり、これらは野生型
の変異体或いは人為的に変異を施した変異体であっても
よい。

【００１１】ここで、親アルカリセルラーゼである配列
番号１に示すアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有す
るセルラーゼとしては、当該アミノ酸配列と９５％以上
の相同性を示すものがより好ましく、９８％以上の相同
性を示すものがさらに好ましく、これらは野生型又は野
生型の変異体であってもよい。尚、アミノ酸配列の相同
性はＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮのマキシマムマッチングや
サーチホモロジー等のプログラム（ソフトウェア開発）
を用いて計算することができる。

【００１２】また、斯かる配列番号１で示されるアミノ
酸配列と９０％以上の相同性を有するセルラーゼは、ホ
モロジーモデリングの手法を用い、３Ｄ−１Ｄ、ＸＰＬ
ＯＲＥ及びＰＲＯＣＨＥＣＫプログラムによりセルラー
ゼの分子構造を予測した場合に、配列番号１において４
２番目のロイシンから４０４番目のバリンまでの活性ド
メイン領域と７０％以上、好ましくは８０％以上、より
好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、
特に好ましくは９８％以上の相同性を有し、且つ配列番
号１における３４３番目のアスパラギンから３７７番目
のロイシンに相当するアミノ酸配列がセルラーゼ分子内
においてループ構造を有しているものが好ましい。尚、
この場合のアミノ酸配列の相同性は、例えばＬｉｐｍａ
ｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４
３５，１９８５）等に準じて計算することができる。

【００１３】また親アルカリセルラーゼは、ドデシル硫
酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ）法あるいはゲル濾過法により得られる分子
量が８６，０００±２，０００である、カルボキシメチ
ルセルロースを基質とした場合の最適反応ｐＨが７．５
〜９．０の間にある、最適反応温度が４０〜５０℃の範
囲にある、等の性質を有しているのが好ましく、更にカ
ルボキシメチルセルロースのほかにリケナンを良好に分
解することが好ましく、ｐＨ９で５０℃、１０分間の処
理においても充分に安定であることが好ましい。特に、
分子量が８６，０００±２，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
あるいはSephacryl Ｓ２００カラムによるゲル濾過
法）、最適反応ｐＨが８．６〜９．０、最適反応温度が
５０℃、カルボキシメチルセルロースのほかにリケナン
を良好に分解し、ｐＨ９、５ｍＭ塩化カルシウム存在下
で５０℃、１０分間の処理を行った場合９５％以上（３
０℃、１０分間処理時の残存活性を１００％とする）の
残存活性を認めるような性質を有するものが好ましい。

【００１４】以上より、本発明における親アルカリセル
ラーゼとしては、配列番号１に示すアルカリセルラーゼ
の他、上記段落〔００１２〕で示したアミ酸配列上の特
徴を有するもの及び／又は段落〔００１３〕で示した酵
素学的性質を有するもの、特に段落〔００１２〕で示し
たアミ酸配列上の特徴を有し且つ段落〔００１３〕で示
した酵素学的性質を有するものであり、配列番号１に示
すアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、
更に好ましくは９８％以上の相同性を示すものが好まし
い。

【００１５】具体的には、「配列番号１で示されるアミ
ノ酸配列を有するアルカリセルラーゼ」であるＥｇｌ−
２３７［バチルスエスピーＫＳＭ−Ｓ２３７（ＦＥＲ
ＭＢＰ−７８７５）由来、Hakamadaら，Biosci. Biotec
hnol. Biochem., 64, 2281-2289, 2000］、バチルス
エスピー１１３９株由来のアルカリセルラーゼ（Ｅｇ
ｌ−１１３９）（Fukumori ら，J. Gen, Microbiol, 13
2, 2329-2335）（相同性９１．４％）、バチルスエス
ピーＫＳＭ−６４株由来のアルカリセルラーゼ（Ｅｇ
ｌ−６４）（Sumitomo ら，Biosci. Biotechnol. Bioch
em., 56, 872-877, 1992）（相同性９１．９％）、バチ
ルスエスピーＫＳＭ−Ｎ１３１株由来のセルラーゼ
（Ｅｇｌ−Ｎ１３１ｂ）（特願２０００−４７２３７
号）（相同性９５．０％）等が挙げられる。

【００１６】本発明の変異アルカリセルラーゼは、上記
親アルカリセルラーゼにおいて、配列番号１の３４３位
〜３７７位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基から
選ばれる１以上を欠失させ、当該欠失部分にアミノ酸残
基数２〜１５のペプチド残基を挿入してなるものであ
る。欠失させるアミノ酸残基は、配列番号１の３４３位
〜３７７位における任意の連続又は非連続の１〜３５個
のアノ酸残基であればよく、好ましくは３５０位〜３７
７位中、より好ましくは３５５位〜３６５位中、更に好
ましくは３５７位〜３６２位中のアノ酸残基である。特
に、３４３位〜３７７位中の任意の１〜２７残基、２〜
１５残基又は３〜１０残基、３５５位〜３７７位中の任
意の１〜８残基、３〜６残基又は全てのアミノ酸残基、
３５７位〜３６２位中の任意の２残基、２〜５残基又は
全てのアミノ酸残基が好ましい。

【００１７】斯かる配列番号１の３４３位〜３７７位の
アミノ酸領域は、ホモロジーモデリングによる立体構造
解析（Ozawa et al.,Protein Eng.,14,501-504,2001）
によれば、Ｅｇｌ−２３７の活性中心から比較的離れた
位置に存在し、自由度が高く、且つセルラーゼ構造の維
持に深く関与している考えられるループ構造の一部を形
成する領域であると推定される。

【００１８】尚、「配列番号１の３４３位〜３７７位に
相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法として
は、例えばリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリ
ズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各アルカリセルラ
ーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最
大の相同性を与えることにより行うことができる。セル
ラーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させるこ
とにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわら
ず、相同アミノ酸残基の各セルラーゼにおける配列中の
位置を決めることが可能である（図１）。相同位置は、
三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象のセ
ルラーゼの特異的機能に関して類似した効果を有するこ
とが推定できる。例えば、配列番号１で示されるアミノ
酸配列を有するアルカリセルラーゼ（Ｅｇｌ−２３７）
の３５７位〜３６２位に相当する位置を、前述したＥｇ
ｌ−１１３９、Ｅｇｌ−６４、Ｅｇｌ−Ｎ１３１ｂにつ
いて示せば、下記表１のとおりである。

【００１９】

【表１】

【００２０】斯かる欠失部位に挿入すべきペプチド残基
としては、２０種類の必須アミノ酸のいずれから構成さ
れていていもよいが、アラニン、グリシン、ヒスチジ
ン、アルギニンを含むものが好ましく、特にアラニンと
グリシン、アラニンとヒスチジン、アラニンとアルギニ
ンを含むものが好ましい。また、ペプチド残基を構成す
るアミノ酸残基の数としては、２〜１５個であるのが好
ましく、酵素活性の点から、２〜１０個、更には２〜６
個であるのが好ましく、特に３個であるのが好ましい。

【００２１】斯かるペプチド残基の好適な例としては、
例えばアスパラギン−スレオニン−アラニン−バリン−
グリシン−イソロイシン、アラニン−セリン−メチオニ
ン−ロイシン−フェニルアラニン−グルタミン酸、シス
テイン−ロイシン−グリシン−ヒスチジン−セリン、チ
ロシン−グルタミン−リジン−アラニン−アラニン、ア
スパラギン酸−メチオニン−イソロイシン−バリン、イ
ソロイシン−スレオニン−プロリン−リジン、グリシン
−ロイシン−システイン、セリン−バリン−フェニルア
ラニンが挙げられるが、中でも両末端にアラニン残基を
有する３〜６残基のぺプチド残基が好ましく、アラニン
−任意の１個のアミノ酸−アラニンがより好ましく、ア
ラニン−グリシン−アラニン、アラニン−ヒスチジン−
アラニン又はアラニン−アルギニン−アラニンが特に好
ましい。

【００２２】また、本発明の変異アルカリセルラーゼに
は、アルカリセルラーゼ活性並びに改変された特性を失
わない限り、上記の変異とは別に、アミノ酸配列中にお
いて１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加され
たものも包含する。

【００２３】本発明の変異アルカリセルラーゼは、親ア
ルカリセルラーゼに対し目的の変異を導入すればよく、
例えば以下の方法により行われる。すなわち、親アルカ
リセルラーゼを培養して得られた培養液から遠心分離に
より菌体を分離し、該菌体からのアルカリセルラーゼ遺
伝子を含んだ染色体ＤＮＡを調製［例えば、マーマーの
方法（J.Mol.Biol.,3,208-212,1961）や斎藤と三浦の方
法（Biochim.Biophys.Acta,72,619-629,1963）］し、シ
ョットガンクローニング法やＰＣＲ法を用いて親アルカ
リセルラーゼ（例えば配列番号１で示されるアミノ酸配
列を有するアルカリセルラーゼ）をコードする遺伝子
（配列番号２）をクローニングすることができる。クロ
ーニングされた遺伝子に対し変異を導入し、変異遺伝子
を含むプラスミドを用いて適当な宿主菌を形質転換し、
形質転換株を培養することによってその培養物から本発
明の変異アルカリセルラーゼを得ることができる。

【００２４】親アルカリセルラーゼをコードする遺伝子
に変異を導入する方法としては、部位特異的変異法等を
用いることができる。例えばＴａｋａｒａ社のＳｉｔｅ
−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＳｙｓ
ｔｅｍＭｕｔａｎ−ＳｕｐｅｒＥｘｐｒｅｓｓＫ
ｍｋｉｔ等を使用することができる。変異が導入され
たアルカリセルラーゼ遺伝子は適当なベクターに組込む
ことができる。

【００２５】ここで使用可能なベクターとしては、宿主
菌内で複製維持可能であり、アルカリセルラーゼ遺伝子
を発現させることができ、組込まれた該遺伝子を安定に
保持できれば如何なるものも使用可能である。例えば、
Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌を宿主とする場合、ｐＵＢ１１
０やｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられ、大腸菌を宿主と
する場合、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２或い
はｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられる。

【００２６】かくして得られた組換えベクターを用いて
宿主菌を形質転換するにはプロトプラスト法、コンピテ
ントセル法、エレクトロポレーション法等を用いて行う
ことができる。宿主菌としては特に制限されないがＢａ
ｃｉｌｌｕｓ属（枯草菌）等のグラム陽性菌、Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（大腸菌）等のグラム陰性
菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属（放線菌）、Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ属（酵母）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ属（カビ）等の真菌が挙げられる。

【００２７】得られた形質転換体は、資化しうる炭素
源、窒素源、金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適
当な条件下で培養すればよい。かくして得られた培養液
から、一般的な方法によって酵素の分取や精製を行い、
凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶化により必要な酵素形態を得
ることができる。

【００２８】かくして得られる変異アルカリセルラーゼ
の最適反応ｐＨは、親アルカリセルラーゼの値よりも高
く、好ましくは、ｐＨ９．０〜９．５、より好ましくは
ｐＨ９．５〜１０．０まで高アルカリ側にシフトしてい
るものである。さらに変異アルカリセルラーゼの最適反
応ｐＨ以外の諸性質は、段落〔００１３〕に示した親ア
ルカリセルラーゼの諸性質を保持していることが好まし
い。

【００２９】

【実施例】実施例１Ｅｇｌ−２３７のループ領域の改
変Ｅｇｌ−２３７の分子モデルは、既に結晶構造が解析さ
れているＣｅｌＫの解析データを基にホモロジーモデリ
ングにより構築し、モデル構造の精密化は、３Ｄ−１
Ｄ、ＸＰＬＯＲＥ及びＰＲＯＣＨＥＣＫプログラムによ
り行った。次いで、得られた情報を基にループ構造内の
一部のアミノ酸（３５７番グリシンから３６２番スレオ
ニン）を欠失させると同時にアラニン−グリシン−アラ
ニン、アラニン−ヒスチジン−アラニン及びアラニン−
アルギニン−アラニンを新たに導入した。このループ領
域の変異には、それぞれ変異導入プライマー１、２及び
３（配列番号３、４及び５）を用い、アンチセンスプラ
イマーには変異導入プライマー４（配列番号６）を用い
た。アラニン−グリシン−アラニン変異導入においては
鋳型ＤＮＡとしてｐＨＹ３００ＰＬＫ中に組換えられた
Ｅｇｌ−２３７遺伝子を用いた。アラニン−ヒスチジン
−アラニン及びアラニン−アルギニン−アラニン変異導
入には鋳型ＤＮＡにｐＨＹ３００ＰＬＫ中に組換えられ
たアラニン−グリシン−アラニン変異体プラスミドを用
いた。具体的には、鋳型ＤＮＡプラスミド０．５μＬ
(１０ｎｇ)、変異導入用プライマー２０μＬ（１μ
Ｍ）、アンチセンスプライマー２０μＬ（１μＭ）、１
０倍濃度のＰＣＲ用緩衝液１０μＬ、１０ｍＭデオキ
シヌクレオチド３リン酸(ｄＮＴＰ)混液８μL、Ｐｙｒ
ｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ０．５μＬ(２．５ｕｎ
ｉｔｓ、タカラ)及び脱イオン水３９．５μＬを混合し
た後、ｇｅｎｅａｍｐＰＣＲｓｙｓｔｅｍ９７００
（アマシャムファルマシア）でＰＣＲを行った。反応条
件は、９４℃２分間の熱変性後、９４℃１分間、６０℃
１分間、７２℃１．５分間（３０サイクル）及び７２℃
３分間で行った。得られたＰＣＲ産物をＧＦＸＰＣＲ
ＤＮＡａｎｄｇｅｌｂａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎｋｉｔ（アマシャムファルマシア）で精製後（４
３．５μＬ）、５．５μＬの１０倍濃度のリン酸化用緩
衝液及びｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｋｉｎａｓｅ
１μＬ(１０ｕｎｉｔｓ)を加え、３７℃で１時間リン酸
化反応を行った後、精製した。リン酸化されたＰＣＲ産
物２５μＬに、鋳型プラスミドを２μＬ(２０ｎｇ)、１
０倍濃度のＰＣＲ用緩衝液１０μＬ、１０ｍＭｄＮＴ
Ｐ混液８μＬ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ１
μＬ(５ｕｎｉｔｓ)及び脱イオン水５４μＬを混合した
後、ＰＣＲを行った。反応条件は、９４℃２分間の熱変
性後、９４℃１分間、５８℃１分間、７２℃６分間（３
０サイクル）及び７２℃１２分間で行った。得られたＰ
ＣＲ産物を精製後（４３．５μＬ）、５．５μＬの１０
倍濃度のリン酸化用緩衝液及びポリヌクレオチドキナー
ゼ１μＬ(１０ｕｎｉｔｓ)を加え、３７℃で１時間リン
酸化反応を行った。エタノール沈澱により回収された１
０μＬのＤＮＡ溶液をｌｉｇａｔｉｏｎｋｉｔｖｅ
ｒ．２（タカラ）を用いて１６℃で１８時間ライゲーシ
ョン反応を行い、自己閉環した後、再度エタノール沈殿
によりＤＮＡ混液を回収した。

【００３０】実施例２形質転換法実施例１で得られたＤＮＡ混液５μＬを用いてＢａｃｉ
ｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＩＳＷ１２１４株に導入し
て形質転換体を取得した（Chang and Cohen,Mol.Gen.Ge
nt.,168,111,1979）。この方法により得られたプロトプ
ラストをテトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ、シグマ）
を含むＤＭ３再生寒天培地[０．８％（ｗ／ｖ）寒天
（和光純薬）、０．３Ｍコハク酸二ナトリウム６水和
物、０．５％カザミノ酸テクニカル（ディフコ）、
０．５％酵母エキス、０．３５％ＫＨ_２ＰＯ_４、０．
１５％Ｋ_２ＨＰＯ_４、０．５％グルコース、０．４％
ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、０．０１％牛血清アルブミン
（シグマ）、０．５％ＣＭＣ（関東科学）、０．００
５％トリパンブルー（メルク）及びアミノ酸混液 (ロ
イシン、メチオニン１０μg／ｍＬ)]上に塗抹し、３０
℃で７２時間培養して形質転換体を得た。ＤＭ３再生寒
天平板培地上で、ハローを形成した形質転換体をテトラ
サイクリン（１５μｇ／ｍＬ）を含んだポリペプトン培
地（３％ポリペプトンＳ、３％マルトース、０．５％
魚肉エキス（和光純薬）、０．１％酵母エキス、０．
１％ＫＨ_２ＰＯ_４、０．０２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ
_２Ｏ）で、３０℃、１５時間振とう培養を行い、集菌
後、ｍｉｃｒｏｐｒｅｐｐｌａｓｍｉｄｐｕｒｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ（アマシャムファルマシア）に
よりプラスミドを回収、精製した。取得したプラスミド
中に挿入されたセルラーゼ遺伝子の変異配列の確認は、
３７７ＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステ
ム）を用いて行なった。変異導入近辺の領域を解読でき
るような適当なシークエンス用プライマーを用いて塩基
配列解析を行い、目的の変異が導入されているプラスミ
ドを選別した。

【００３１】実施例３セルラーゼ変異体の生産宿主菌Ｂ. ｓｕｂｔｉｌｉｓＩＳＷ１２１４株の培
養は、３％ポリペプトン S（日本製薬製）、０．５％
魚肉エキス、０．０５％酵母エキス、０．１％ＫＨ_２
ＰＯ_４、０．０２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、テトラサ
イクリン（１５μｇ／ｍＬ）及び５％マルトースを含
んだ培地を用いて、３０℃で７２時間行った。各種変異
体を培養した結果、ループ領域変異体アラニン−グリシ
ン−アラニンのセルラーゼ活性量は３６８００Ｕ／Ｌ、
アラニン−ヒスチジン−アラニンの活性量は３４７００
Ｕ／Ｌ及びアラニン−アルギニン−アラニンの活性量は
３２４００Ｕ／Ｌであった。

【００３２】尚、セルラーゼ活性は、３，５-ジニトロ
サリチル酸（ＤＮＳ）法により測定した。即ち、０．２
ｍＬの０．５Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液
（ｐＨ９．０）、０．４ｍＬの２．５％（ｗ／ｖ）カル
ボキシメチルセルロース（Ａ０１ＭＣ；日本製紙）、
０．３ｍＬの脱イオン水から成る反応液に０．１ｍＬの
適当に希釈した酵素液を加え４０℃、２０分間反応させ
た後、１ｍＬのジニトロサリチル酸試薬（０．５％ジ
ニトロサリチル酸、３０％ロッシェル塩、１．６％水
酸化ナトリウム水溶液）を添加し、沸水中で５分間還元
糖の発色を行った。氷水中で急冷し、４ｍＬの脱イオン
水を加え５３５ｎｍにおける吸光度を測定し還元糖の生
成量を求めた。ブランクは酵素液を加えずに処理した反
応液にジニトロサリチル酸試薬を加えた後、酵素液を添
加し、同様に発色させたものを用意した。酵素１単位
（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μｍｏ
ｌのグルコース相当の還元糖を生成する量とした。

【００３３】実施例４組換えセルラーゼループ改変体
の精製組換えセルラーゼループ改変体の培養上清液を脱イオン
水にて１０倍に希釈した後、予め、１０ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥトヨパー
ル（東ソー）カラム（２．５ｃｍ×５ｃｍ）に添着し
た。同緩衝液でカラムを洗浄した後、同緩衝液中０〜
０．４Ｍの塩化ナトリウム４００ｍＬによる直線濃度勾
配によりタンパク質を溶出させた。目的の組換えセルラ
ーゼループ改変体は、塩化ナトリウム濃度０．２５Ｍ付
近で、電気泳動的にほぼ単一な成分として溶出された。
脱塩濃縮は、限外濾過膜（ＰＭ１０、ミリポア）を用い
て行った。

【００３４】実施例５組換えセルラーゼループ改変体
の最適反応ｐＨ実施例４の如く調製して得られた組換えセルラーゼルー
プ改変体の精製標品を用いて、最適反応ｐＨを調べた。
グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．２〜１
０．９）を用いて最適反応ｐＨを調べた結果、組換え野
生型セルラーゼの最適反応ｐＨは、ｐＨ９．０であるの
に対し、アラニン−グリシン−アラニン変異体のセルラ
ーゼの最適反応ｐＨは、ｐＨ１０と１ｐＨユニット高ア
ルカリ性側にシフトすることが判った（図１）。また、
アラニン−ヒスチジン−アラニン変異体及びアラニン−
アルギニン−アラニン変異体の最適反応ｐＨは、９．６
付近であり、さらにｐＨ８．８からｐＨ９．９の活性は
最適ｐＨ９．６での活性を１００％とした場合、相対値
９５％以上と親セルラーゼやアラニン−グリシン−アラ
ニン変異体に比べ高くなっていることも判った（図２、
３）。

【００３５】

【発明の効果】本発明の変異アルカリセルラーゼは、洗
濯液中のｐＨ（ｐＨ１０．５付近）に近い最適ｐＨを有
し、洗剤用酵素として有用である。

【００３６】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KAO CORPORATION <120> Mutant alkali Cellulase <130> P01991404 <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 824 <212> PRT <213> Bacillus sp.KSM-S237 <400> 1 Met Met Leu Arg Lys Lys Thr Lys Gln Leu Ile Ser Ser Ile Leu Ile 1 5 10 15 Leu Val Leu Leu Leu Ser Leu Phe Pro Ala Ala Leu Ala Ala Glu Gly 20 25 30 Asn Thr Arg Glu Asp Asn Phe Lys His Leu Leu Gly Asn Asp Asn Val 35 40 45 Lys Arg Pro Ser Glu Ala Gly Ala Leu Gln Leu Gln Glu Val Asp Gly 50 55 60 Gln Met Thr Leu Val Asp Gln His Gly Glu Lys Ile Gln Leu Arg Gly 65 70 75 80 Met Ser Thr His Gly Leu Gln Trp Phe Pro Glu Ile Leu Asn Asp Asn 85 90 95 Ala Tyr Lys Ala Leu Ser Asn Asp Trp Asp Ser Asn Met Ile Arg Leu 100 105 110 Ala Met Tyr Val Gly Glu Asn Gly Tyr Ala Thr Asn Pro Glu Leu Ile 115 120 125 Lys Gln Arg Val Ile Asp Gly Ile Glu Leu Ala Ile Glu Asn Asp Met 130 135 140 Tyr Val Ile Val Asp Trp His Val His Ala Pro Gly Asp Pro Arg Asp 145 150 155 160 Pro Val Tyr Ala Gly Ala Lys Asp Phe Phe Arg Glu Ile Ala Ala Leu 165 170 175 Tyr Pro Asn Asn Pro His Ile Ile Tyr Glu Leu Ala Asn Glu Pro Ser 180 185 190 Ser Asn Asn Asn Gly Gly Ala Gly Ile Pro Asn Asn Glu Glu Gly Trp 195 200 205 Lys Ala Val Lys Glu Tyr Ala Asp Pro Ile Val Glu Met Leu Arg Lys 210 215 220 Ser Gly Asn Ala Asp Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Ser Pro Asn Trp 225 230 235 240 Ser Gln Arg Pro Asp Leu Ala Ala Asp Asn Pro Ile Asp Asp His His 245 250 255 Thr Met Tyr Thr Val His Phe Tyr Thr Gly Ser His Ala Ala Ser Thr 260 265 270 Glu Ser Tyr Pro Ser Glu Thr Pro Asn Ser Glu Arg Gly Asn Val Met 275 280 285 Ser Asn Thr Arg Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Val Ala Val Phe Ala Thr 290 295 300 Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala Ser Gly Asp Gly Gly Pro Tyr Phe Asp 305 310 315 320 Glu Ala Asp Val Trp Ile Glu Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile Ser Trp 325 330 335 Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn Lys Asn Glu Val Ser Gly Ala Phe Thr 340 345 350 Pro Phe Glu Leu Gly Lys Ser Asn Ala Thr Asn Leu Asp Pro Gly Pro 355 360 365 Asp His Val Trp Ala Pro Glu Glu Leu Ser Leu Ser Gly Glu Tyr Val 370 375 380 Arg Ala Arg Ile Lys Gly Val Asn Tyr Glu Pro Ile Asp Arg Thr Lys 385 390 395 400 Tyr Thr Lys Val Leu Trp Asp Phe Asn Asp Gly Thr Lys Gln Gly Phe 405 410 415 Gly Val Asn Ser Asp Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ile Ala Val Asp Asn 420 425 430 Glu Asn Asn Thr Leu Lys Val Ser Gly Leu Asp Val Ser Asn Asp Val 435 440 445 Ser Asp Gly Asn Phe Trp Ala Asn Ala Arg Leu Ser Ala Asn Gly Trp 450 455 460 Gly Lys Ser Val Asp Ile Leu Gly Ala Glu Lys Leu Thr Met Asp Val 465 470 475 480 Ile Val Asp Glu Pro Thr Thr Val Ala Ile Ala Ala Ile Pro Gln Ser 485 490 495 Ser Lys Ser Gly Trp Ala Asn Pro Glu Arg Ala Val Arg Val Asn Ala 500 505 510 Glu Asp Phe Val Gln Gln Thr Asp Gly Lys Tyr Lys Ala Gly Leu Thr 515 520 525 Ile Thr Gly Glu Asp Ala Pro Asn Leu Lys Asn Ile Ala Phe His Glu 530 535 540 Glu Asp Asn Asn Met Asn Asn Ile Ile Leu Phe Val Gly Thr Asp Ala 545 550 555 560 Ala Asp Val Ile Tyr Leu Asp Asn Ile Lys Val Ile Gly Thr Glu Val 565 570 575 Glu Ile Pro Val Val His Asp Pro Lys Gly Glu Ala Val Leu Pro Ser 580 585 590 Val Phe Glu Asp Gly Thr Arg Gln Gly Trp Asp Trp Ala Gly Glu Ser 595 600 605 Gly Val Lys Thr Ala Leu Thr Ile Glu Glu Ala Asn Gly Ser Asn Ala 610 615 620 Leu Ser Trp Glu Phe Gly Tyr Pro Glu Val Lys Pro Ser Asp Asn Trp 625 630 635 640 Ala Thr Ala Pro Arg Leu Asp Phe Trp Lys Ser Asp Leu Val Arg Gly 645 650 655 Glu Asn Asp Tyr Val Ala Phe Asp Phe Tyr Leu Asp Pro Val Arg Ala 660 665 670 Thr Glu Gly Ala Met Asn Ile Asn Leu Val Phe Gln Pro Pro Thr Asn 675 680 685 Gly Tyr Trp Val Gln Ala Pro Lys Thr Tyr Thr Ile Asn Phe Asp Glu 690 695 700 Leu Glu Glu Ala Asn Gln Val Asn Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys 705 710 715 720 Ile Asn Val Arg Asp Ile Thr Asn Ile Gln Asp Asp Thr Leu Leu Arg 725 730 735 Asn Met Met Ile Ile Phe Ala Asp Val Glu Ser Asp Phe Ala Gly Arg 740 745 750 Val Phe Val Asp Asn Val Arg Phe Glu Gly Ala Ala Thr Thr Glu Pro 755 760 765 Val Glu Pro Glu Pro Val Asp Pro Gly Glu Glu Thr Pro Pro Val Asp 770 775 780 Glu Lys Glu Ala Lys Lys Glu Gln Lys Glu Ala Glu Lys Glu Glu Lys 785 790 795 800 Glu Ala Val Lys Glu Glu Lys Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Lys Ala 805 810 815 Val Lys Asn Glu Ala Lys Lys Lys 820 <210> 2 <211> 2475 <212> DNA <213> Bacillus sp.KSM-S237 <220> <221> CDS <222> (1)..(2475) <400> 2 atg atg tta aga aag aaa aca aag cag ttg att tct tcc att ctt att 48 Met Met Leu Arg Lys Lys Thr Lys Gln Leu Ile Ser Ser Ile Leu Ile 1 5 10 15 tta gtt tta ctt cta tct tta ttt ccg gca gct ctt gca gca gaa gga 96 Leu Val Leu Leu Leu Ser Leu Phe Pro Ala Ala Leu Ala Ala Glu Gly 20 25 30 aac act cgt gaa gac aat ttt aaa cat tta tta ggt aat gac aat gtt 144 Asn Thr Arg Glu Asp Asn Phe Lys His Leu Leu Gly Asn Asp Asn Val 35 40 45 aaa cgc cct tct gag gct ggc gca tta caa tta caa gaa gtc gat gga 192 Lys Arg Pro Ser Glu Ala Gly Ala Leu Gln Leu Gln Glu Val Asp Gly 50 55 60 caa atg aca tta gta gat caa cat gga gaa aaa att caa tta cgt gga 240 Gln Met Thr Leu Val Asp Gln His Gly Glu Lys Ile Gln Leu Arg Gly 65 70 75 80 atg agt aca cac gga tta cag tgg ttt cct gag atc ttg aat gat aac 288 Met Ser Thr His Gly Leu Gln Trp Phe Pro Glu Ile Leu Asn Asp Asn 85 90 95 gca tac aaa gct ctt tct aac gat tgg gat tcc aat atg att cgt ctt 336 Ala Tyr Lys Ala Leu Ser Asn Asp Trp Asp Ser Asn Met Ile Arg Leu 100 105 110 gct atg tat gta ggt gaa aat ggg tac gct aca aac cct gag tta atc 384 Ala Met Tyr Val Gly Glu Asn Gly Tyr Ala Thr Asn Pro Glu Leu Ile 115 120 125 aaa caa aga gtg att gat gga att gag tta gcg att gaa aat gac atg 432 Lys Gln Arg Val Ile Asp Gly Ile Glu Leu Ala Ile Glu Asn Asp Met 130 135 140 tat gtt att gtt gac tgg cat gtt cat gcg cca ggt gat cct aga gat 480 Tyr Val Ile Val Asp Trp His Val His Ala Pro Gly Asp Pro Arg Asp 145 150 155 160 cct gtt tat gca ggt gct aaa gat ttc ttt aga gaa att gca gct tta 528 Pro Val Tyr Ala Gly Ala Lys Asp Phe Phe Arg Glu Ile Ala Ala Leu 165 170 175 tac cct aat aat cca cac att att tat gag tta gcg aat gag ccg agt 576 Tyr Pro Asn Asn Pro His Ile Ile Tyr Glu Leu Ala Asn Glu Pro Ser 180 185 190 agt aat aat aat ggt gga gca ggg att ccg aat aac gaa gaa ggt tgg 624 Ser Asn Asn Asn Gly Gly Ala Gly Ile Pro Asn Asn Glu Glu Gly Trp 195 200 205 aaa gcg gta aaa gaa tat gct gat cca att gta gaa atg tta cgt aaa 672 Lys Ala Val Lys Glu Tyr Ala Asp Pro Ile Val Glu Met Leu Arg Lys 210 215 220 agc ggt aat gca gat gac aac att atc att gtt ggt agt cca aac tgg 720 Ser Gly Asn Ala Asp Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Ser Pro Asn Trp 225 230 235 240 agt cag cgt ccg gac tta gca gct gat aat cca att gat gat cac cat 768 Ser Gln Arg Pro Asp Leu Ala Ala Asp Asn Pro Ile Asp Asp His His 245 250 255 aca atg tat act gtt cac ttc tac act ggt tca cat gct gct tca act 816 Thr Met Tyr Thr Val His Phe Tyr Thr Gly Ser His Ala Ala Ser Thr 260 265 270 gaa agc tat ccg tct gaa act cct aac tct gaa aga gga aac gta atg 864 Glu Ser Tyr Pro Ser Glu Thr Pro Asn Ser Glu Arg Gly Asn Val Met 275 280 285 agt aac act cgt tat gcg tta gaa aac gga gta gcg gta ttt gca aca 912 Ser Asn Thr Arg Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Val Ala Val Phe Ala Thr 290 295 300 gag tgg gga acg agt caa gct agt gga gac ggt ggt cct tac ttt gat 960 Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala Ser Gly Asp Gly Gly Pro Tyr Phe Asp 305 310 315 320 gaa gca gat gta tgg att gaa ttt tta aat gaa aac aac att agc tgg 1008 Glu Ala Asp Val Trp Ile Glu Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile Ser Trp 325 330 335 gct aac tgg tct tta acg aat aaa aat gaa gta tct ggt gca ttt aca 1056 Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn Lys Asn Glu Val Ser Gly Ala Phe Thr 340 345 350 cca ttc gag tta ggt aag tct aac gca acc aat ctt gac cca ggt cca 1104 Pro Phe Glu Leu Gly Lys Ser Asn Ala Thr Asn Leu Asp Pro Gly Pro 355 360 365 gat cat gtg tgg gca cca gaa gaa tta agt ctt tct gga gaa tat gta 1152 Asp His Val Trp Ala Pro Glu Glu Leu Ser Leu Ser Gly Glu Tyr Val 370 375 380 cgt gct cgt att aaa ggt gtg aac tat gag cca atc gac cgt aca aaa 1200 Arg Ala Arg Ile Lys Gly Val Asn Tyr Glu Pro Ile Asp Arg Thr Lys 385 390 395 400 tac acg aaa gta ctt tgg gac ttt aat gat gga acg aag caa gga ttt 1248 Tyr Thr Lys Val Leu Trp Asp Phe Asn Asp Gly Thr Lys Gln Gly Phe 405 410 415 gga gtg aat tcg gat tct cca aat aaa gaa ctt att gca gtt gat aat 1296 Gly Val Asn Ser Asp Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ile Ala Val Asp Asn 420 425 430 gaa aac aac act ttg aaa gtt tcg gga tta gat gta agt aac gat gtt 1344 Glu Asn Asn Thr Leu Lys Val Ser Gly Leu Asp Val Ser Asn Asp Val 435 440 445 tca gat ggc aac ttc tgg gct aat gct cgt ctt tct gcc aac ggt tgg 1392 Ser Asp Gly Asn Phe Trp Ala Asn Ala Arg Leu Ser Ala Asn Gly Trp 450 455 460 gga aaa agt gtt gat att tta ggt gct gag aag ctt aca atg gat gtt 1440 Gly Lys Ser Val Asp Ile Leu Gly Ala Glu Lys Leu Thr Met Asp Val 465 470 475 480 att gtt gat gaa cca acg acg gta gct att gcg gcg att cca caa agt 1488 Ile Val Asp Glu Pro Thr Thr Val Ala Ile Ala Ala Ile Pro Gln Ser 485 490 495 agt aaa agt gga tgg gca aat cca gag cgt gct gtt cga gtg aac gcg 1536 Ser Lys Ser Gly Trp Ala Asn Pro Glu Arg Ala Val Arg Val Asn Ala 500 505 510 gaa gat ttt gtc cag caa acg gac ggt aag tat aaa gct gga tta aca 1584 Glu Asp Phe Val Gln Gln Thr Asp Gly Lys Tyr Lys Ala Gly Leu Thr 515 520 525 att aca gga gaa gat gct cct aac cta aaa aat atc gct ttt cat gaa 1632 Ile Thr Gly Glu Asp Ala Pro Asn Leu Lys Asn Ile Ala Phe His Glu 530 535 540 gaa gat aac aat atg aac aac atc att ctg ttc gtg gga act gat gca 1680 Glu Asp Asn Asn Met Asn Asn Ile Ile Leu Phe Val Gly Thr Asp Ala 545 550 555 560 gct gac gtt att tac tta gat aac att aaa gta att gga aca gaa gtt 1728 Ala Asp Val Ile Tyr Leu Asp Asn Ile Lys Val Ile Gly Thr Glu Val 565 570 575 gaa att cca gtt gtt cat gat cca aaa gga gaa gct gtt ctt cct tct 1776 Glu Ile Pro Val Val His Asp Pro Lys Gly Glu Ala Val Leu Pro Ser 580 585 590 gtt ttt gaa gac ggt aca cgt caa ggt tgg gac tgg gct gga gag tct 1824 Val Phe Glu Asp Gly Thr Arg Gln Gly Trp Asp Trp Ala Gly Glu Ser 595 600 605 ggt gtg aaa aca gct tta aca att gaa gaa gca aac ggt tct aac gcg 1872 Gly Val Lys Thr Ala Leu Thr Ile Glu Glu Ala Asn Gly Ser Asn Ala 610 615 620 tta tca tgg gaa ttt gga tat cca gaa gta aaa cct agt gat aac tgg 1920 Leu Ser Trp Glu Phe Gly Tyr Pro Glu Val Lys Pro Ser Asp Asn Trp 625 630 635 640 gca aca gct cca cgt tta gat ttc tgg aaa tct gac ttg gtt cgc ggt 1968 Ala Thr Ala Pro Arg Leu Asp Phe Trp Lys Ser Asp Leu Val Arg Gly 645 650 655 gag aat gat tat gta gct ttt gat ttc tat cta gat cca gtt cgt gca 2016 Glu Asn Asp Tyr Val Ala Phe Asp Phe Tyr Leu Asp Pro Val Arg Ala 660 665 670 aca gaa ggc gca atg aat atc aat tta gta ttc cag cca cct act aac 2064 Thr Glu Gly Ala Met Asn Ile Asn Leu Val Phe Gln Pro Pro Thr Asn 675 680 685 ggg tat tgg gta caa gca cca aaa acg tat acg att aac ttt gat gaa 2112 Gly Tyr Trp Val Gln Ala Pro Lys Thr Tyr Thr Ile Asn Phe Asp Glu 690 695 700 tta gag gaa gcg aat caa gta aat ggt tta tat cac tat gaa gtg aaa 2160 Leu Glu Glu Ala Asn Gln Val Asn Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys 705 710 715 720 att aac gta aga gat att aca aac att caa gat gac acg tta cta cgt 2208 Ile Asn Val Arg Asp Ile Thr Asn Ile Gln Asp Asp Thr Leu Leu Arg 725 730 735 aac atg atg atc att ttt gca gat gta gaa agt gac ttt gca ggg aga 2256 Asn Met Met Ile Ile Phe Ala Asp Val Glu Ser Asp Phe Ala Gly Arg 740 745 750 gtc ttt gta gat aat gtt cgt ttt gag ggg gct gct act act gag ccg 2304 Val Phe Val Asp Asn Val Arg Phe Glu Gly Ala Ala Thr Thr Glu Pro 755 760 765 gtt gaa cca gag cca gtt gat cct ggc gaa gag acg cca cct gtc gat 2352 Val Glu Pro Glu Pro Val Asp Pro Gly Glu Glu Thr Pro Pro Val Asp 770 775 780 gag aag gaa gcg aaa aaa gaa caa aaa gaa gca gag aaa gaa gag aaa 2400 Glu Lys Glu Ala Lys Lys Glu Gln Lys Glu Ala Glu Lys Glu Glu Lys 785 790 795 800 gaa gca gta aaa gaa gaa aag aaa gaa gct aaa gaa gaa aag aaa gca 2448 Glu Ala Val Lys Glu Glu Lys Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Lys Ala 805 810 815 gtc aaa aat gag gct aag aaa aaa taa 2475 Val Lys Asn Glu Ala Lys Lys Lys 820 <210> 3 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 gtgcatttac accattcgag ttagctggcg caaatcttga cccaggtcca gatc 54 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 ccattcgagt tagctcacgc aaatcttgac ccag 34 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 ccattcgagt tagctcgtgc aaatcttgac ccag 34 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 caataacatc cattgtaagc ttctcagcac c 31

【図面の簡単な説明】

【図１】配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以
上の相同性を有するセルラーゼのアミノ酸配列を整列さ
せた図である。

【図２】アラニン−グリシン−アラニン変異体の最適反
応ｐＨを示す図である。

【図３】アラニン−ヒスチジン−アラニン変異体の最適
反応ｐＨを示す図である。

【図４】アラニン−アルギニン−アラニン変異体の最適
反応ｐＨを示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者小林徹栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会社研究所内Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA12 CA06 DA07 GA21 HA01 HA06 4B050 CC04 DD02 FF11 LL04 4B065 AA19X AB01 AC06 CA31 CA57 4H003 DA01 EC03 FA47

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１で示されるアミノ酸配列又は
これと９０％以上の相同性を有するセルラーゼについ
て、配列番号１の３４３位〜３７７位又はこれに相当す
る位置のアミノ酸残基から選ばれる１以上を欠失させ、
当該欠失部分にアミノ酸残基数２〜１５のペプチド残基
を挿入した変異アルカリセルラーゼ。
【請求項２】配列番号１の３５７位〜３６２位又はこ
れに相当する位置のアミノ酸残基から選ばれる１以上を
欠失させ、当該欠失部分にアミノ酸残基数２〜５のペプ
チド残基を挿入した請求項１記載の変異アルカリセルラ
ーゼ。
【請求項３】配列番号１の３５７位〜３６２位又はこ
れに相当する位置のアミノ酸残基を全て欠失させ、当該
欠失部分にアミノ酸残基数３のペプチド残基を挿入した
請求項１又は２記載の変異アルカリセルラーゼ。
【請求項４】挿入するペプチド残基が、アラニン及び
グリシン、アラニン及びヒスチジン、又はアラニン及び
アルギニンのいずれかを構成アミノ酸残基として含むも
のである請求項１〜３のいずれか１項記載の変異アルカ
リセルラーゼ。
【請求項５】挿入するペプチド残基が、アラニン−グ
リシン−アラニン、アラニン−ヒスチジン−アラニン又
はアラニン−アルギニン−アラニンである請求項１〜４
のいずれか１項記載の変異アルカリセルラーゼ。
【請求項６】請求項１〜５記載の変異アルカリセルラ
ーゼをコードする遺伝子。
【請求項７】請求項６記載の遺伝子を含む組換えベク
ター。
【請求項８】請求項７記載の組換えベクターを含む形
質転換体。
【請求項９】宿主が微生物である請求項８記載の形質
転換体。