CN1646163A - 用于治疗炎症的药物的给药 - Google Patents

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Abstract

本申请公开一种通过给予特异性结合α－4整联蛋白或含α－4整联蛋白的二聚体的药物来长时间减轻患者病理性炎症的方法。所给的药物必须具有结合亲和力从而使给药足够抑制病理性炎症，并且该药物长时间给药以便产生对病理性炎症的长期抑制作用。

Description

用于治疗炎症的药物的给药
发明领域
本发明广义地涉及特异性结合并抑制含有α-4(α4)亚基的整联蛋白受体的药物，和其治疗用途。
背景技术
炎症是血管化组织对感染或损伤的一种反应并通过白细胞与血管的内皮细胞的粘附作用及其向周围组织内的侵润来实现。在正常炎症中，侵润性白细胞释放毒性介质杀死侵入的生物，吞噬碎片和死亡细胞，并在组织修复和免疫反应中发挥作用。然而，在病理炎症中，侵润性白细胞过度应答并可能引起严重或致命的损害。参见例如，Hickey的Psychoneuroimmunology II(Academic Press 1990)。
整联蛋白是一族参与细胞粘附、免疫细胞迁移和激活的细胞表面糖蛋白。α-4整联蛋白通过除嗜中性白血病之外的所有循环性白细胞表达，并与β1或β7整联蛋白亚基连接形成杂二聚体受体；α-4β-1(α4β1)和α-4β-7(α4β7)二聚体在白细胞迁移穿过血管内皮中起作用(Springer等，1994细胞76：301-14；和Butcher等，1996 Science272：60-6)并且负责细胞激活和在实质中的存活(Damle等，1993 J.Immunol.151：2368-79；Koopman等，1994 J.Immunol.152：3760-7；和Leussink等，2002 Acta Neuropathol.103：131-136)
具体地，α-4β-1(也称作极迟抗原-4[VLA-4])，结合血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)(Lobb等，1994，J.Clin.Invest.94：1722-8)，其由血管内皮表达在慢性炎症的许多位点上(Bevilacqua等，1993Annu.Rev.Immunol.11：767-804；和Postigo等，1993 Res.Immunol.144：723-35)。α-4β-7二聚体与粘膜地址素细胞粘附分子(MAdCAM-1)相互作用，并介导淋巴细胞向肠内的归航(Farstad等，1997 Am.J.Pathol.150：187-99；和Issekutz等，1991 J.Immunol.147：4178-84)。MAdCAM-1在血管内皮上的表达在患有炎性肠病(IBD)患者的肠道内的炎症位点上也有所增强(Briskin等，1997 Am.J.Pathol.151：97-110)。
粘附分子例如α-4整联蛋白是治疗剂的潜在靶位。譬如，其中α-4整联蛋白是其一个亚基的VLA-4受体是重要靶位，因为它与位于脑内皮细胞上的配体相互作用。由脑炎症导致的疾病和病症具有特别严重的后果。在另一实例中，α-4β-7整联蛋白二聚体是一个重要靶位，因为其参与淋巴细胞归航和胃肠道中病理性炎症。
α-4β-1整联蛋白表达在活化淋巴细胞和单核细胞的细胞外表面，其参与急性炎性脑损伤的发病机理和与多发性硬化症(MS)有关的血脑屏障(BBB)打破(Coles等，1999 Ann.Neurol.46(3)：296-304)。人们测试了抗α-4整联蛋白的药物在体外和体内动物模型中的抗炎功效。参见Yednock等，1992 Nature 356：63-66；1998年11月24日授权于Bendig等的美国专利5,840,299，和1999年12月14日授权给Thorsett等的美国专利6,001,809。体外试验证明α-4整联蛋白抗体阻滞淋巴细胞与脑内皮细胞的附着。人们进行了α-4整联蛋白抗体对模拟多发性硬化症、试验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)的人工诱发条件的影响的实验，已经证实抗-α-4整联蛋白抗体的给药防止动物中的脑炎和继发性麻痹。总之，这些实验确定了抗-α-4整联蛋白抗体作为潜在有效的治疗剂用于治疗多发性硬化症和其他炎性疾病和病症。
在涉及α-4整联蛋白的病理性炎症的另一具体实例中，克罗恩氏病(CD)是一种慢性、不能治愈的、复发性的肠道透壁炎症。该疾病特征在于涉及T细胞、巨噬细胞和嗜中性白细胞的肠道粘膜内不适当的免疫免疫细胞迁移和激活(Schreiber等，1991 Gastroenterology101：1020-30)。用于克罗恩氏病的一线药物包括5-氨基水杨酸盐类(5-ASAs)，此类药物是低效的药物，和皮质类固醇，这类药物具有多种短期或长期的副作用(Munkholm等，1994 Gut 35：360-2)。用一线治疗无法治愈的患者采用免疫抑制剂治疗，例如硫唑嘌呤，6-巯基嘌呤，和甲氨蝶呤，但这些药物缓慢奏效同时存在潜在严重副作用(Stein等，2001 Surg.Clin.North Am.81：71-101，viii)。最近，具有快速奏效的生物药引入到克罗恩氏病的治疗，但此类药物同样存在问题，例如长期功效和副作用。
发明概述
本发明提供了通过长期给药选择性结合α-4整联蛋白的药物来长时间减轻患者病理性炎症的方法。设计α-4药物的长时间给药方案以使(1)该药物特异性结合α-4整联蛋白或整联蛋白类，含有α-4整联蛋白的二聚体，和(2)反复给药该药物以维持α-4整联蛋白受体饱和度在足够的水平从而抑制病理性炎症。本发明的药物可以通过结合和抑制全部含α-4亚基的整联蛋白二聚体来有效抑制炎症，或可以设计为结合特定二聚体，例如，α-4β-1。
在一个实施方式中，可以通过测定特定整联蛋白二聚体的饱和度来判断长时间给药方案的功效。在一个具体实例中，α-4β-1整联蛋白二聚体被认为参与多发性硬化症，因此有效长时间给药方案所需的饱和度水平可以通过测定α-4β-1二聚体受体的饱和度来测量。
在另一实施方式，其中认为多种整联蛋白二聚体参与病理性炎症，可以测量二聚体受体的组合的饱和度来测定长时间给药方案的有效性。在一具体实例中，α-4β-1和α-4β-7二聚体确信参与了与炎性肠病有关的病理性炎症。因此，α-4β-1和α-4β-7饱和水平的测定可能有利于判断特定长时间给药方案的有效性。
在一个实施方式，长时间给药方案的成功可以通过评估病理性炎症的生理标志来测定。例如，在用于MS的长时间给药方案中，利用成像技术通过检测脑损伤的水平可以确定给药方案的成功，例如，磁共振成像(MRI)。在另一实例中，在用于CD的长时间给药方案中，给药方案的成功可以通过检测患者中血清C-反应性蛋白水平来确定。在另一实例中，给药方案的成功可以利用一套与健康有关的标准来判断，例如，CD患者中CDAI的减轻。
本发明的另一实施方式涉及对象的胃肠道的炎性疾病的治疗(例如，克罗恩氏病，溃疡性结肠炎和炎性肠病)，包括给药有效量的含有那他珠单抗(natalizumab)足以治疗或缓解该对象中胃肠道的炎性疾病的组合物。
在一具体实施方式，本发明特征在于一个给药方案，其中药物的反复给药在患者中提供了65-100％的α-4整联蛋白受体饱和度的水平，由此达到对患者中病理性炎症的长期抑制。在另一具体实施方式中，该药物反复给药使患者中达到至少约75-100％的水平。在另一具体实施方式中，该药物反复给药使在患者中达到至少约80-100％的水平。
本发明的一个特征在于可以长期抑制患者病理性炎症的不利副作用，例如，在6个月、1年、2年或更长时间内。
本发明的方法的一个方面在于长时间维持抗-α-4整联蛋白药物在足够的水平以在该段时间内抑制病理性炎症。
本发明的一个特征在于与一次给药相比所述的剂型在较长时间内使病理性炎症的水平降低。
本发明的一个优点在于本发明的方法中使用的药物耐受良好且具有低毒性。
本发明的这些和其他目的、优点和特征对于所属领域技术人员来说在阅读下面的方法和制剂的详细内容后将十分清楚。
附图简述
图1是一线图，其说明了在给药那他珠单抗后MS患者中新Gd-强化的损伤的累计平均数。
图2表示在那他珠单抗MS研究中各时间点的有效扫描的百分比。有效扫描数含有一个或多个新Gd-强化损伤。
图3A-C和4A-C表示MS研究中在给药方案时间点的那他珠单抗的血清浓度.图3A-C表示3-mg/kg研究中的水平；图4A-C表示6-mg/kg研究中的水平。
图5A-F举例说明MS研究中所保持的受体饱和的水平。该水平以百分比值表示。
图6和7表示CD研究中给药后临床反应(图6)或缓解(图7)的患者完成预定标准的百分比。
图8表示在CD研究中一小组基线C-反应性蛋白提高的患者中血清C-反应性蛋白的平均变化。基线值为(mg/l)：安慰剂，38.44(N＝26)；3+0mg/kg组，32.35(N＝38)；3+3mg/kg组，41.16(N＝33)；和6+6mg/kg组，333(N＝26)。
图9A-B分别证实了那他珠单抗对患有活动性克罗恩氏病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)患者中的循环性嗜曙红细胞的作用。图9A证实那他珠单抗在3mg/kg那他珠单抗输注后显著提高克罗恩氏病(n＝18)和溃疡性结肠炎患者(n＝12)中的循环性嗜曙红细胞数量。图9B显示那他珠单抗的给药在3mg/kg那他珠单抗输注后明显提高活动性克罗恩氏病和溃疡性结肠炎患者中的单核细胞数量。
图10A-D证实那他珠单抗给药对TCRαβ+细胞表达活化抗原的影响。方案A证实了那他珠单抗在患有活动性克罗恩氏病的患者中的影响，即，在3mg/kg那他珠单抗输注后至少4周明显增加了TCRαβ+细胞表达的CD26，HLA-DR，CD8CR和CD8CD28。方案B证实那他珠单抗对活化溃疡性结肠炎的患者中的TCRαβ+细胞表达活化抗原的作用，即，在3mg/kg那他珠单抗输注后至少4周明显增加了TCRaβ+细胞表达的CD26，HLA-DR，CD8DR和CD8CD28。方案C证实那他珠单抗给药对患有活动性克罗恩氏病的患者中TCRαβ+细胞表达的活化抗原和记忆和原初标记的作用，即，在那他珠单抗输注后至少4周显著提高了记忆(CD45RO)和原初(CD45RA)TCRαβ+细胞。方案B显示那他珠单抗对患有获得活动性溃疡性结肠炎的患者中的TCRαβ+细胞表达活化抗原，记忆和原初标记的作用，即，那他珠单抗给药后至少1周明显提高了记忆(CD45RO)，原初(CD45RA)，CD69和CD38 TCRαβ+细胞。
图11A-B证实那他珠单抗对分别患有活动性克罗恩氏病和溃疡性结肠炎的患者中的循环性TCRαβ+和NK-型细胞的作用。
发明详述
在说明本发明的方法和治疗剂之前，应理解本发明不限于所述的具体方法和治疗剂，显然它们可以改变。还应理解在此使用的术语是用于描述具体实施方式的目的，并且不起限定作用。
当给出数值范围时，应理解介于该范围的上限和下限之间并且任何其他所述的或该范围的各中间值，至下限的单位的十分之一(除非另外说明)，属于本发明。这些小范围的上限和下限可独立包括在更小的范围内，构成任何所述范围中未具体包括的极限。当所述范围包括一个或两个端值时，不包括这两个端值的范围也属于本发明。
除非另外说明，本发明使用的全部技术和科学术语具有所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义。尽管类似或等同于本发明的方法和物质还可以用于本发明的实施或试验，但现在下文描述优选的方法和物质。本文提及的所有文献在此引入以便公开和说明该文献中引用的方法和/或物质。
必须注意在此使用的单数形式″一个″、″和″以及″该″包括复数含义，除非另外明确说明。所以，例如，所谓″抗体″包括多种抗体和所谓″剂量″包括一种或多种剂量和所属领域技术人员已知的其等效量等等。
本文讨论的文献只是提供其在本申请申请日之前的内容。没有任何内容能够揭示在这些现有技术的文献之前可以推导出本发明。另外，所提供文献的日期可以不同于可能需要单独证实的实际出版日。
定义
在此使用的术语″抗-α-4药物″是指任何药物，其特异性结合含有α-4亚基的整联蛋白并抑制该整联蛋白的活性。这包括特异性结合α-4整联蛋白的药物，以及结合含有α-4整联蛋白的整联蛋白二聚体例如，α-4β-1(α4β1)或α-4β-7(α4β7)的药物。术语″药物″是指包括合成和重组分子(例如，抗体，小分子，肽，或其他合成制备的分子或化合物，以及重组制备的基因产物)和天然存在的化合物(例如，多肽，抗体等)。
在此使用的术语″功效″在长时间给药方案的上下文中是指特定治疗方案的有效性。基于疾病对于本发明的药物的反应过程的变化可以测定功效。例如，在MS的治疗中，功效可以通过复发-缓解MS中复发次数测定，以及通过利用例如MRI的方法来检测中枢神经系统内存在或不存在新损伤测定。
在此使用的术语″成功″在长期治疗方案的上下文中是指特定治疗方案的有效性。这包括功效、毒性(例如，制剂或剂量单位的副作用和患者耐受性)、患者依从性等的均衡。对于视为″成功的″长期治疗方案，必须平衡患者保健和功效的不同方面以提高最适宜的患者结果。
在此使用的术语″特异性结合″或″特异地结合″是指特异性结合对的一员对除其特异性结合配偶体之外的分子没有显示出任何明显结合作用的情形(例如，对其结合配偶体约1,000x或更高的亲和力)。在本发明中，所述的抗-α-4整联蛋白药物对除α-4整联蛋白或含α-4整联蛋白的受体之外的任何多肽不具有明显结合作用。例如，本发明方法中使用的抗体以107mole/l或更高的结合亲和力结合α-4整联蛋白，优选108mole/l或更高，由此称作特异性结合α-4整联蛋白。
在此使用的术语″基本上同源″是指任何在序列上有所改变的多肽，其中功能上等同的氨基酸代替了多肽中一个或多个氨基酸，因此这样的改变对该多肽的结合性质没有产生或产生相对小的影响。例如，序列中的一个或多个氨基酸可以被相似极性的其他氨基酸替代。
在此使用的术语″诱发免疫反应″和″诱发宿主免疫反应″是指向该对象中引入本发明的药物后在该对象中产生对含α-4整联蛋白的受体的免疫应答。该对象中的免疫反应可以通过与α-4整联蛋白受体的血清反应性来描述，该血清反应性至少是未治疗对象的2倍，更优选至少是未治疗对象的反应性的3倍，和特别优选是未治疗对象的反应性的至少4倍，并且利用血清稀释法测定的血清免疫反应性为约1∶100。
术语″赋形材料″是指任何构成制剂一部分、只起载体作用的化合物，即本身没有生物活性。
在此使用的术语″佐剂″是指提高本发明的药物的免疫反应但本身并不诱发免疫反应的组合物添加剂。佐剂可以通过多种生物机理提高免疫反应，包括但不限于淋巴细胞募集，T细胞刺激，B细胞刺激，和巨噬细胞刺激。
在此使用的术语″治疗″和″疗法″等一般是指获得预期药理和生理效果。该效果可以预防、也就是防止或部分防止所述的疾病、其症状或病症和/或可以治疗、也就是部分或完全治愈疾病、病症、症状或该疾病导致的不良影响。在此使用的术语″治疗″包括任何在哺乳动物、特别是人体中的疾病的治疗，和包括：(a)预防对该疾病敏感但诊断为未患病的对象出现疾病；(b)抑制疾病，即，阻止其恶化；或(c)减轻疾病，即，使疾病和/或其症状或病症消退。本发明涉及患有与病理性炎症有关的疾病的患者的治疗。本发明涉及长时间预防、抑制或减轻病理性炎症导致的不良影响和/或由生物系统中存在的不适当炎症的生理反应引起的不良影响。
在此使用的术语″病理性炎症″是指与病症有关的不适和慢性炎症，包括但不限于，哮喘，动脉粥样硬化，AIDS痴呆，糖尿病，炎性肠病，类风湿性关节炎，移植排斥，移植物抗宿主疾病，多发性硬化症(尤其是抑制进一步脱髓鞘)，肿瘤转移，肾炎，特应性皮炎，牛皮癣，心肌局部缺血，慢性前列腺炎，镰刀细胞贫血症导致的并发症，红斑狼疮，和急性白细胞介导的肺损伤。此类炎症特征在于对炎症细胞，包括浸润性白细胞的过高反应。随着时间，此类病理性炎症常常对不适当炎症区内的组织造成损害。
所谓″Antegren″是指包括称作AN100226(抗体编码)或那他珠单抗(USAN命名)的抗体。Antegren是重组、人源化抗-α-4整联蛋白抗体。优选的哺乳动物中被治疗的疾病或病症是一种在给药治疗有效剂量的Antegren时可以调控的疾病或病症。
发明的一般方面
本发明是基于令人惊奇的结果，该结果为一类称作选择性粘附分子抑制剂(SAMIs)的新化合物的长时间给药能够充分保持对整联蛋白二聚体参与的疾病中的炎症的长时间抑制。当中止反复给药方案后，对炎症的抑制作用发生逆转(参见，例如，图2)。现有炎症抑制剂的疗法是相当不同的给药方案，简单地说就是炎症抑制剂的给药应当引起机体自身反应系统的反应，这将导致将炎症识别为病理性并造成长时间缓解该病理性炎症。本发明人在此证明，长时间给药方案不但比短期给药方案更有效，而且事实上需要保持对病理性炎症的抑制作用。所以，为了实现本发明的一些更重要的优点，抗-α-4整联蛋白药物的水平需要维持数月或者甚至数年。
本发明基于抗-α-4整联蛋白抗体，那他珠单抗在患有复发性MS或者患有轻度至重度活动性CD的患者中进行的大量、随机、安慰剂对照的试验的结果。那他珠单抗是抗α-4整联蛋白的重组、人源化单克隆抗体拮抗剂。由这样两种实验获得的结果证实，采用那他珠单抗的治疗改善患有MS和CD的患者的征兆和症状。本发明还涉及其他嵌合抗体，包括灵长类源化TM(primatized)抗体。
通常，本发明的方法不涉及任何具体的给药方式，因为给药方式依赖于活性剂的形式和为该活性剂给药所开发的制剂。然而，在此所述的具体实施例采用那他珠单抗的非肠道给药实施。尽管本发明描述采用特异性结合α-4整联蛋白的抗体，本发明还涉及例如识别提供含有α-4整联蛋白的二聚体的整联蛋白二聚体两种配偶体的二价或多价抗体的长期给药。
本发明的一般性概念涉及在数月或数年的时期内将相对恒定量的活性剂引入到患者的循环系统中。这种选择性结合α-4整联蛋白或含有α-4整联蛋白的二聚体的药物的长期给药能够在一段时间内抑制病理性炎症于稳定水平。通过在一定时间内保持活性剂的治疗水平，可以长期抑制患者病理性炎症。
非常具体地说，本发明涉及在人类患者中使含α-4整联蛋白的二聚体达到并保持在约65％-约100％范围内的受体饱和水平，更优选在约75％-约100％，和特别优选在约80％-约100％。这些受体饱和水平长时间保持在这样的水平(例如，在大约6个月的时期内)从而持续抑制病理性炎症。
选择性结合α-4整联蛋白的药物
不同类型的具有结合并抑制α-4整联蛋白活性的药物可以用于本发明的实践中。许多此类药物已经被识别并被特征描述，下面说明具体药物。本文给出教导，所属领域技术人员应当能够以生物学上模拟或类似所述具体药物的方式鉴定出可抑制含α-4-整联蛋白二聚体的药物，并且本发明涉及此类药物或此类药物的联合形式的长期给药。
抗体
在一具体实施方式中，本发明的药物是选择性结合α-4整联蛋白或含有α-4的二聚体如α-4β-1或α-4β-7的抗体或其免疫活性片段。
当本发明的药物是抗体时，优选单克隆抗体。与多克隆抗体制剂相比，多克隆抗体制剂一般包含定向对抗不同表位的多种抗体，而各种单克隆抗体定向对抗抗原上的一个表位。单克隆抗体的第二个优点在于它们是通过未被其他免疫球蛋白污染的方式合成，例如，通过噬菌体展示或由杂交瘤分离。虽然本发明涉及多克隆和单克隆抗体两者作为本发明的药物，但单克隆抗体由于其高特异性而成为优选，并且本发明主要讨论的是单克隆抗体。
此外，可以利用所属领域采用的技术来鉴定其他抗体。例如，本发明的单克隆抗体可以采用噬菌体展示技术来制备。随后分离选择性结合α-4整联蛋白或含α-4整联蛋白的二聚体的抗体片段。通过噬菌体展示制备此类抗体的优选方法实例公开在美国专利Nos.6,225,447；6,180,336；6,172,197；6,140,471；5,969,108；5,885,793；5,872,215；5,871,907；5,858,657；5,837,242；5,733,743；和5,565,332中。
单克隆抗体可以可以利用常规杂交瘤方法制备。这些方法已经广泛用于制备分泌针对众多特异性抗原的高水平单克隆抗体的杂交细胞系，而且还可以用于制备本发明的单克隆抗体。例如，小鼠(例如，Balb/c小鼠)可以通过腹膜内注射用抗原性α-4整联蛋白表位进行免疫。经过足够发生免疫反应的时间后，处死该小鼠，获得脾细胞并利用所属领域公知的技术，与骨髓瘤细胞融合。所得融合细胞，即杂交瘤，进而在选择性培养基中生长，并且存活的细胞在这样的培养基中利用有限稀释条件生长。克隆和再克隆后，可以分离杂交瘤，其分泌选择性结合靶物，α-4整联蛋白或含α-4整联蛋白的二聚体的抗体(例如，IgG或IgM类或IgG1小类的抗体)。为了制备特别用于人使用的药物，分离的单克隆抗体可以用来制备嵌合和人源化抗体。
本发明的抗体包括，但不限于，多克隆，单克隆，多特异性、人、人源化或嵌合的抗体，单链抗体(例如，scFv)，Fab片段，F(ab′)片段，Fab表达文库制备的片段，抗独特型(抗-Id)抗体(包括，例如，对本发明的抗体的抗-Id抗体)，和上述任意抗体的表位结合片段。最优选的抗体是本发明的人抗原结合性抗体片段，包括但不限于Fab，Fab′和F(ab′)2，Fd，单链Fvs(scFv)，单链抗体，二硫键连接的Fvs(sdFv)和含有VL或VH结构域的片段。抗原结合性抗体片段，包括单链抗体，可以包含独立或与所述整体或下列部分组合的可变区：铰链区，CH1，CH2，和CH3结构域。本发明还包括抗原结合性片段，它可以包含可变区与铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任意组合。本发明的抗体可以来源于任何动物来源，包括鸟和哺乳动物。优选地，所述的抗体是人，鼠(例如，小鼠和大鼠)，驴，绵羊，猴子，兔子，山羊，豚鼠，猪，骆驼，马，或鸡(或其他鸟类)抗体。在此使用，″人″抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括分离自人免疫球蛋白文库或分离自一种或多种人免疫球蛋白转基因但不表达内源性免疫球蛋白的动物的抗体，具体例如在Kucherlapati的美国专利No.5,939,598中所述。
嵌合和人源化抗体可以由非人抗体制成，而且可以与用于制备其的抗体具有相同或相似的结合亲和力。制备嵌合抗体的技术(Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.81：6851；Neuberger等，1984Nature 313：604；Takeda等，1985，Nature 314：452)包括剪接来源于例如具有适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因以及来源于具有适当生物活性的人抗体分子的基因；此类抗体属于本发明范围内。例如，编码小鼠单克隆抗体可变(V)区的核酸可以接合至编码人恒定(C)区例如IgG1或IgG4的核酸。因此所得抗体是种杂交的，通常带有来源于非人抗体的抗原结合结构域和来源于人或灵长类抗体的C或效应器结构域。
人源化抗体是具有主要来源于人抗体(即，接纳体抗体)的可变区的抗体，但其具有基本上来源于非人抗体(供体抗体)的互补决定区。参见，例如，Queen等，Proc.Nat′l.Acad.Sci USA 86：10029-10033(1989)；WO 90/07861，美国专利Nos.6,054,297；5,693,761；5,585,089；5,530,101；和5,224,539。这些抗体的恒定区一般也来源于人抗体。人可变结构域通常选自含有与所需非人可变区结合结构域具有高同源性的序列的人抗体。重链和轻链可变残基可以衍生自相同抗体，或不同的人抗体。此外，可以选择所述序列作为数种人抗体的共有区，例如WO 92/22653中所述。
″灵长类源化TM抗体″是含有灵长类可变序列或抗原结合部分和人恒定结构域序列的重组抗体。参见Newman，Biotechnology，1992，10：1455-60。抗体的灵长类源化获得了含有猴可变结构域和人恒定序列的抗体。详情参见美国专利No.6,113,898。这种技术对抗体进行修饰，使抗体在人体中给药时不因为它们是抗原性的而被排斥。这种技术依赖于cynomolgus猴用人抗原或受体进行免疫。开发这种技术为的是制造对人细胞表面抗原高亲和力的单克隆抗体。
基于预定构象和抗原结合性质，选择人可变区内的特定氨基酸进行替代。这可以利用技术例如计算机模拟、预知氨基酸在可变区上某些位置的行为和结合性质、并且观察替代的效果来测定。例如，当在非人可变区和人可变区之间存在氨基酸差异时，人可变区可被改变用以反映非人可变区的氨基酸组成。
在一特定实施方式中，本发明的长时间给药方案中使用的抗体是人源化抗体，如美国专利No.5,840,299中所述，其在此引入作为参考。
在另一实施方式中，含有人抗体基因的转基因小鼠可以用抗原性α-4整联蛋白结构免疫并且杂交瘤技术可以用来制备选择性结合α-4整联蛋白的人抗体。
嵌合，人和/或人源化抗体可以利用重组表达来制备，例如，在人杂交瘤中(Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985))、在骨髓瘤细胞或在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞内表达。或者，抗体编码序列可以掺入到转基因内以便引入到转基因动物的染色体组中并且随后在转基因动物的乳汁中表达。参见例如，美国专利Nos.6,197,946；5,849,992；5,565,362；5,336,894；和5,304,489。适当的转基因包括具有来源于乳腺特定基因的启动子和/或增强子的转基因，例如酪蛋白或β-乳球蛋白。
小分子
用于本发明的小分子包括多种化学类型，虽然一般它们是有机分子，但优选小的分子量大于50且小于约4,000道尔顿的有机化合物。候选药物含有与蛋白在结构上相互作用，特别是氢键所需的官能团，并且通常至少包括胺、羰基、羟基或羧基，优选至少两个官能团。候选药物常常包括带有一个或多个上述官能团的碳环或杂化结构和/或芳族或多元芳族结构。在生物分子中可以发现候选药物，包括，但不限于：肽，糖类，脂肪酸，甾族化合物，嘌呤，嘧啶，其衍生物、结构类似物或联合形式。
所述的小分子可以得自多种来源，包括合成或天然化合物的文库。例如，许多方式可以用来随机和定向合成大量有机化合物和生物分子，包括随机化寡核苷酸和低聚肽的表达。或者，天然化合物的文库以细菌、真菌、植物和动物提取物的形式获得或者很容易地制备。另外，天然或合成制备的文库和化合物很容易利用常规化学、物理和生物化学方法来修饰，并可以用来制备组合文库。已知的药物可以接受定向或随机化学修饰，例如酰化，烷基化，酯化，酰胺化等，来制备结构类似物。
抗-α-4整联蛋白肽
本发明的方法可以利用任何能够结合α-4整联蛋白或含α-4亚基的二聚体的肽来实施。本发明的方法中包括基本上与细胞外表面基质的区域或被靶向特定α-4整联蛋白受体的天然配体同源的肽。例如，为了长期抑制α-4β-1受体，可以使用含有至少一部分的纤连蛋白IIICS区的肽(例如，含有至少一部分的CS-1肽序列或基本上与CS-1序列同源的序列的肽)，可用于结合受体并抑制含α-4整联蛋白的活性。参见例如USSN 08/452,098，其全文在此引入作为参考。
诱发免疫反应的药物
在一特定实施方式中，本发明的药物是含有α-4整联蛋白的免疫原性片段的肽或肽模拟物。免疫原性片段是指任何含有α-4的表位的片段，并且一般具有来源于天然存在的哺乳动物α-4蛋白的至少3，5，7，10，15，17或20个连续氨基酸。人和鼠α-4两者的肽序列可得自GenBank(登记号AA59613和NP-034706)。所属技术领域的技术人员基于α-4的氨基酸序列和利用编码其的野生型核苷酸(例如，分别为GenBank登记号L12002和NM-01056)可以轻易设计出本发明的肽药物。一旦设计出适当的肽，可以开始针对已知具有所需免疫原活性的抗体，例如，选择性结合α-4结构并且特征在于能抑制含α-4整联蛋白的活性的抗体，进行筛选。
所述的免疫原性片段也可以设计为具有增强免疫原性反应的氨基酸类似物或其他结构元件。特别是，肽片段可以改变C-或N-末端，这样提高分子的总免疫原性同时阻止其诱发免疫反应的能力。所述的类似物的例子包括，但不限于：α，α-二取代的氨基酸，N-烷基氨基酸，乳酸，4-羟基脯氨酸，γ-羧基谷氨酸盐，γ-N，N，N-三甲基赖氨酸，γ-N-乙酰基赖氨酸，O-磷酸丝氨酸，N-乙酰基丝氨酸，N-甲酰基蛋氨酸，3-甲基组氨酸，和5-羟基赖氨酸。其他有用类似物可以参见Sigma，Biochemicals and Reagents，Sigma-Aldrich(2001)。所述的片段也可以用可测标记进行标记，以便能在对象给药后跟踪对象中的所述分子。
肽，类似物结构，肽模拟物等可以分离自天然来源，并且随后任选地加工(例如，经过肽裂解)或另外通过所属领域已知的常规技术合成，例如固相合成或重组表达。参见，例如，Sambrook等，MolecularCloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press，NewYork，第2版，1989)。自动肽合成可以利用制造商出售的仪器来完成，例如Applied Biosystems(Foster City，California)供应的，完成自动肽合成的方法也是已经建立的。蛋白的重组制备可以在原核生物中，例如噬菌体或细菌细胞或真核系统，例如酵母，昆虫，或哺乳动物细胞中进行。或者，蛋白可以利用现有技术中已知的无细胞体外体系制备。
在另一实施例中，噬菌体肽展示文库可以用来表达大量的可体外筛选的肽从而识别特异性结合α-4或含α-4整联蛋白的二聚体的肽。噬菌体展示技术提高了一种表达随机或选择性随机化肽不同种群的方式。多种噬菌体展示的方法和制备不同肽种群的方法是所属领域公知的。例如，Ladner等(美国专利5,223,409)，描述了用于在噬菌体的表面上制备不同结合结构域种群的方法。Ladner等描述了用于制备噬菌体展示文库的噬菌体载体，以及选择潜在结合结构域并制备随机或选择性突变结合结构域的方法。噬菌体展示文库的筛选一般涉及利用纯化靶分子进行文库的体外淘选。结合靶分子的噬菌体可以被回收；可以克隆各个噬菌体，并且可以测定通过克隆噬菌体表达的肽。
类似地，Smith和Scott(Meth.Enzymol.217：228-257(1993)和Science 249：386-390(1990))描述了制备噬菌体肽展示文库的方法，包括使表达的肽的种群多样化的载体和方法(也参见，Huse，WO91/07141和WO 91/07149)。当例如与基于密码子的诱变方法一同使用时，噬菌体展示技术可能特别有力，可以用来制备随机肽或所需偏性肽(参见，例如，美国专利5,264,563)。这些和其他已知的方法可以用于制备噬菌体展示文库，其可以进行本发明的体内淘选方法从而鉴定归航到一个和数个选定器官的肽。
肽噬菌体展示文库的肽还可以以偶联物存在，这可便于回收或识别感兴趣的肽。在此使用，术语″偶联物″是指与物理、化学或生物部分例如但不限于固体底物、塑料微珠、寡核苷酸或细菌噬菌体等连接的文库的肽或肽模拟物。所述的部分可以提供一种识别或回收药物的方式。
一些用来诱发免疫反应的药物模拟适当的表位来诱导对α-4整联蛋白的免疫反应，但其自身过小无法致免疫。在这种情形中，肽药物可以连接易于引起免疫反应的适当载体。适当的载体包括血清白蛋白，匙孔血蓝蛋白(KLH)，免疫球蛋白分子，甲状腺球蛋白，卵白蛋白，破伤风类毒素，或得自其他病原菌例如白喉、大肠杆菌、霍乱或幽门螺杆菌的类毒素，或减毒毒素衍生物。其他载体包括结合多种MHC等位基因的T-细胞表位，例如，至少75％的全人MHC等位基因。此类载体有时在现有技术中称作″通用T-细胞表位″。通用T-细胞表位包括：
流感血凝素：HA307-319PADRE PKYVKQNTLKLAT(SEQ ID NO:2)
                            AKXVAAWTLKAAA(SEQ ID NO:3)，其中
                            优选是环己基丙氨酸，酪氨酸，或苯基丙
                           氨酸
疟疾CS：T3表位              EKKIAKMEKASSVFNV(SEQ ID NO:4)
乙型肝炎表面抗原：          FFLLTRILTI(SEQ ID NO:5)
HBs Ag19-28
热休克蛋白65：hsp65153-171 DQSIGDLIAEAMDKVGNEG(SEQ ID NO:6)
卡介苗                      QVHFQPLPPAVVKL(SEQ ID NO:7)
破伤风类毒素：TT830-844    QYIKANSKFIGITEL(SEQ ID NO:8)
破伤风类毒素：TT947-967     FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ ID NO:
                            9)
HIV gp120 T1                KQIINMWQEVGKAMYA.(SEQ ID NO:10)
刺激或增强免疫反应的其他载体包括细胞因子例如IL-1，IL-1α和β肽，IL-2，γ-INF，IL-10，GM-CSF，和趋化因子，例如巨噬细胞炎症蛋白(MIP)1α和β和RANTES(即，通过活化表达和分泌的正常T细胞调节)。免疫原性药物也可以与增强穿过组织转运的肽连接，如WO97/17613和WO 97/17614中所述。
免疫原性药物可以通过化学交联与载体连接。将免疫原性药物与载体相连的技术包括但不限于利用N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基-硫代)丙酸盐(SPDP)和琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸盐(SMCC)(如果肽没有巯基，可以通过加入的半胱氨酸残基来提供)形成二硫键。这些试剂在其自身与位于一个蛋白上的肽半胱氨酸之间生成二硫键，和经过位于赖氨酸的ε-氨基或其他氨基酸中的其他游离氨基生成酰胺键。许多成二硫键/酰胺试剂描述在Immun.Rev.62：185(1982)中。其他双官能团偶联试剂形成硫醚而不是二硫键。许多硫醚形成剂可以商购且包括6-马来酰亚胺基己酸，2-溴乙酸，2-碘乙酸，和4-(N-马来酰亚胺基-甲基)环己烷-1-羧酸的活性酯。羧基可以通过将它们与琥珀酰亚胺或1-羟基-2-硝基-4-磺酸钠盐混和来活化。
肽药物也用载体表达为融合蛋白(即，异源肽)。肽药物可以在其氨基末端、其羧基末端或这两者连接于载体。任选性地，免疫原性肽的多次重复可以存在于融合蛋白内。任选性地，免疫原性肽可以连接异源肽的多个拷贝，例如，在该肽的N-和C-末端。一些载体肽起诱发辅助T-细胞对载体肽的反应的作用。诱发的辅助T-细胞进而诱导对连接于载体肽的免疫原性肽产生B-细胞反应。
无论给予个体的药物是抗体、多肽、肽、小分子或本发明的其他药用化合物，经过一个长时间给药方案给药。给药的实际量，和给药的速率和时间过程，将取决于被治疗病症的性质和严重性。治疗的指定，例如，决定剂量等，是普通医师和其他医生的职责范围内，并且通常考虑被治疗的疾病、个体患者的情况、给药的位置、给药的方法和医师了解的其他因素。上述技术和方案的实例可以参见Remington′sPharmaceutical Sciences，18th版，Osol，A.(编辑)，1990。
药物组合物
本发明还提高用于在对于易感和/或患有病理性炎症有关的疾病的对象中减轻慢性病理性炎症的药物组合物。
本发明的药物制剂优选含有浓度为该制剂的约0.1-约10％的药物。它们还可以适当地与其他药学活性化合物联合。下列方法和赋形剂仅仅是举例且不以任何方式限定。
对于口服制剂，药物可以单独使用或者与适当的添加剂组合制成片剂、散剂、颗粒剂或胶囊，例如，与常规添加剂，例如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或土豆淀粉；与粘合剂，例如晶体纤维素，纤维素衍生物，阿拉伯胶，玉米淀粉或明胶；与崩解剂，例如玉米淀粉，土豆淀粉或羧甲基纤维素钠；与润滑剂，例如滑石粉或硬脂酸镁；和如果需要，与稀释剂，缓冲剂，保湿剂，防腐剂和矫味剂组合。
当所述的药物为抗体时，该制剂优选以非肠道剂型给药。优选的剂型取决于给药方式和治疗应用。该组合物还可以包括，取决于所需的制剂，药学可接受的、无毒载体或稀释剂，它们通常被定义为通常用于配制对动物或人给药的药物组合物。选择稀释剂应不影响组合的生物活性。所述的稀释剂的实例为蒸馏水、生理磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和Hank氏溶液。此外，该药物组合物或制剂还可以含有其他载体，佐剂，或无毒、非治疗型、非免疫原性稳定剂等。还可以包括载体分子，例如蛋白多糖。此类载体分子的具体实例分子包括，但不限于，糖胺聚糖例如硫酸肝素，透明质酸，硫酸角质素，硫酸软骨素4，硫酸软骨素6，硫酸类肝素和硫酸dermatin，基底膜聚糖，和pentopolysulfate。
本发明的抗体可以作为可注射剂量的溶液或混悬液给药，所述物质与可以是无菌液体如水和油的药学载体存在于生理可接受的稀释剂中并且加入或不加入表面活性剂。其他药学制剂是那些石油、动物、植物和合成来源的，例如，花生油，大豆油，和矿物油。通常，二醇例如丙二醇或聚乙二醇是优选的液体载体，特别是用于可注射溶液。本发明的药物可以以缓释形式给药，例如储库注射，植入制剂，或渗透泵，其可以以使活性成分缓释的方式配制。
此外，本发明的抗体的药物可以通过给药编码全部或部分抗体的多核苷酸来提供(例如，单链Fv)给对象。多核苷酸在适当载体中对对象给药从而在对象中表达治疗有效量的抗体。
本发明的药物可以通过溶解、悬浮或乳化在水或非水溶剂中配制为注射制剂，例如在植物或其他类似的油，合成的脂族酸甘油酯，高级脂族酸的酯或丙二醇中。所述的制剂还可以含有常规添加剂例如增溶剂、等渗剂、助悬剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。
所述的药物可以用于经过吸入或肺部给药的气雾剂。本发明的药物可以配制到加压可接受的抛射剂中，例如二氯二氟甲烷，丙烷，氮气等。
此外，所述的药物可以通过与多种基质例如乳化基质或水溶性基质混和制成栓剂。本发明的试剂可以利用栓剂经直肠给药。该栓剂可以包含在体温下融化，并且在室温下固化的载体例如可可脂、碳蜡和聚乙二醇。
本发明的药物的给药可以通过常规方式实施，包括非肠道注射，并且可以是系统性或局部给药。本发明的药物可以掺入到不同的治疗给药的制剂中。特别是，本发明的药物可以通过与适当的药学可接受载体或稀释剂混和配制为药物组合物，并且可以配制为固体、半固体或气体形式的制剂，例如片剂、胶囊、散剂、颗粒剂、软膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶剂、微球剂和气雾剂。因此，本发明的给药可以通过多种途径达到，包括口服、经颊、直肠、非肠道、腹膜内、真皮内、经皮、气管内、鼻内、胃、肌肉内、颅内、皮下等给药。活性剂可以在给药后到达系统或者利用局部给药、壁内给药定位，或者采用植入物在植入位点保持活性剂量。
可以提高口服或直肠给药的单位剂型例如糖浆剂，酏剂，和混悬剂，其中各剂量单位，例如，一茶匙的容量，一餐匙的容量，片剂或栓剂，含有预定量的含一种或多种本发明药物的组合物。类似地，注射或静脉内给药的单位剂型可以含有组合物形式的本发明药物，该组合物为存在于灭菌水、普通盐水或另一种药学可接受载体中的溶液。
所属领域熟知针对缓释制剂的植入物。将植入物与生物可降解或非生物可降解的聚合物一起配制为微球，厚片等。例如，乳酸和/或羟基乙酸的聚合物形成易蚀性的聚合物，宿主可以很好地耐受它。植入物置于接近蛋白沉积物的位点(例如，与神经变性疾病有关的淀粉样沉积物的形成位点)，由此活性剂的局部浓度在该位点高于机体的其余部分。
对象给药的典型剂量单位包括，但不限于：适合静脉内给药的溶液；每天给药2-6次的片剂；或每天给药一次并含有比例较高的活性成分的一次释放型胶囊或片剂等。利用在不同pH值溶解的胶囊材料，利用渗透压下缓慢释放的胶囊或者利用控释的其他已知方式可以达到定时释放作用。
本发明的某些药物，包括抗体和肽，有时结合佐剂一起给药。不同佐剂可以用于组合抗α-4整联蛋白药物来诱发免疫反应。优选的佐剂增加对药物的内在反应性同时不会引起药物影响反应定性形式的构象改变。优选的佐剂包括氢氧化铝和磷酸铝，3脱氧酰化一磷酰基脂质A(MPLTM)(参见GB 2220211(RIBI ImmunoChem Research Inc.，Hamilton，Montana，现为Corixa一部分)。StimulonTM QS-21是分离自南美发现的Quillaja Saponaria Molina树的树皮中的三萜烯糖苷或皂甙(参见Kensil等，于Vaccine Design：The Subunit andAdjuvant Approach(Powell & Newman，Plenum Press，NY，1995)；美国专利No.5,057,540(Aquila BioPharmaceuticals，Framingham，MA)。其他佐剂是水包油乳液(例如角鲨烯或花生油)，任选性地结合免疫促进剂，例如一磷酰基脂质A(参见Stoute等，1997 N.Engl.J.Med.336：86-91)。另一种佐剂是CpG(WO 98/40100)。或者，药物可以与佐剂偶联。然而，这样的偶联基本上不应当改变所需α-4表位的构象从而影响宿主免疫反应的本质。佐剂可以作为治疗组合物的组分与活性剂一起给药或者在治疗剂给药之前、同时或之后分开给药。
一类优选的用于给药的佐剂是铝盐(alum)，例如氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝。此类佐剂可以结合或不结合其他特定免疫促进剂使用，例如MPL或3-DMP，QS-21，聚合或单体氨基酸例如聚谷氨酸或聚赖氨酸。另一类佐剂是水包油制剂。此类佐剂可以结合或不结合其他特定免疫促进剂使用，例如胞壁酰基肽(例如N-乙酰基胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)，N-乙酰基-去甲胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)，N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1’-2’二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙基胺(MTP-PE)，N-乙酰基谷氨酰氨基-N-乙酰基胞壁酰基-L-Al-D-isoglu-L-Ala-二棕榈酰基-丙酰胺(DTP-DPP)theramideTM，或者其他细菌细胞壁组分。水包油乳剂包括(a)MF59(WO 90/14837)，含有5％角鲨烯，0.5％吐温80，和0.5％司盘85(任选性地含有不同量的MTP-PE)，利用微流化器例如Model 110Y微型流化器配制为亚微米微粒(Microfluidics，Newton MA)，(b)SAF，含有10％角鲨烯，0.4％吐温80，5％泊洛沙姆嵌段聚合物L121，和thr-MDP，或者微流化为亚微米乳液或者涡旋生成较大粒度的乳液，和(c)RibiTM佐剂体系(RAS)，(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)，它含有2％角鲨烯，0.2％吐温80，和一种或多种选自一磷酰基脂质A、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)，和细胞壁骨架(CWS)的细菌细胞壁组分，优选MPL+CWS(DetoxTM)。另一类优选的佐剂是皂角甙佐剂，例如StrimulonTM(QS-21；Aquila，Frsmingham，MA)或者由其形成的微粒，例如ISCOM(免疫促进复合物)和ISCOMATRIX。其他佐剂包括完全和不完全弗氏佐剂(IFA)，细胞因子，例如白介素(IL-1，IL-2和IL-12)，巨噬细胞克隆刺激因子(M-CSF)，和肿瘤坏死因子(TNF)。此类佐剂一般得自商购。
佐剂可以与药物作为一个组合物给药，或者可以在药物给药之前、同时或之后给药。药物和佐剂可以包装在同一瓶内并提供或者可以包装在不同的瓶中并在使用之前混和。药物和佐剂一般包装有指示治疗适应症的标签。如果药物和佐剂分开包装，该包装一般包括使用之前混和的说明书。佐剂和/或载体的选择依赖于多种因素例如含有该佐剂的制剂的稳定性、给药途径、给药时间表、和佐剂对接种物种的效价。在人中，优选的药学可接受佐剂是那些有关管理机构已经批准用于人给药的佐剂。此类人优选的佐剂的实例包括alum，MPL和QS21。任选性地，两种或多种佐剂可以同时使用。优选的组合物包括alum与MPL，alum与QS21，MPL与QS-21，以及alum、QS-21与MPL组合。另外，可以使用不完全弗氏佐剂(Chang等，1998，Advanced DrugDelivery Reviews 32：173-186)，任选性地与alum、QS-21和MPL的任一者组合或者其全部组合。
长时间给药剂量方案
本发明的长时间治疗方案能够使抗α-4整联蛋白药物保持在足够受体饱和的水平从而在需要其的患者中抑制病理性炎症。本发明的方法限定每2周或每1个月给药1次至每2个月给药1次，并且在至少6个月内反复给药，更优选在1年或者更长时间内。本发明的方法涉及在人类患者中达到和保持含有α-4整联蛋白(例如，VLA-4)的二聚体在约65％-100％，更优选在约75％-约100％，和特别优选在约80％-约100％的受体饱和水平。这些受体饱和水平长时间保持在这样的水平(例如，在大约6个月内)一般持续抑制病理性炎症。
在一特定实施方式中，所述的抗-α-4药物是抗体，优选人源化或人抗体(例如，那他珠单抗)，并且给药是按月计。可以监测受体饱和的水平从而测定给药方案的功效，和测定生理标记来证实给药方案的成功。为了确认，可以监测抗体的血清水平来确定抗体的清除率并测定半衰期对治疗功效的潜在影响。
药物在剂量单位中的给药量取决于是否还给予佐剂，在佐剂的存在下一般需要更高的剂量。为了用本发明的药物免疫化，剂量范围在约0.0001-约100mg/kg，和更常用约0.01-5mg/kg的宿主体重。例如，剂量可以是约1mg/kg体重或约10mg/kg体重。剂量和次数可以根据药物在患者中的半衰期而改变。给药的剂量和次数可以根据该治疗是预防或是治疗性的而变化。对于抗体给药，每次注射一般在约2.0-约8.0mg/kg的范围内。按照本发明的教导，通过从患者获得液体样本一般是血清和脑脊液样本，并且利用所属领域已知的方法测定整联蛋白受体饱和度，可以监测有效剂量。理论上，在开始给药之前采样；随后样本是在每次免疫之前和/或之后采集和测定。对于那他珠单抗或其免疫活性片段等效物来说特别优选的量是3mg/kg患者体重/月。
当施用佐剂时，剂量水平根据具体的佐剂和抗-α-4药物的免疫原性的水平而增加。本发明选择的各个药物的剂量是按照标准给药方法，结合在此提供的技术来测定。
另一种包括反复给药的长时间给药，所述的抗-α-4药物可以作为缓释制剂给药，条件是剂量为受体饱和的水平保持在足以抑制炎症。例如，在本发明的范围内控释体系也可以用于抗-α-4药物的长时间给药。适当控释剂型的讨论可以参见Lesczek Krowczynski，Extended-Release Dosage Forms，1987(CRC Press，Inc.)。
许多控释技术涉及到非常广泛的药物剂型。控释技术包括，但不限于物理系统和化学系统。物理系统包括，但不限于，具有速控膜的储库体系，例如微囊，巨囊，和膜体系；没有速控膜的储库体系，例如空心纤维，超微孔三醋酸纤维素，和多孔聚合底物和泡沫；整体式(monolithic)系统，包括那些物理上溶于非多孔、聚合性或弹性基质(例如，非易蚀性、易蚀性、环境因素侵入的，和可降解的)的体系，和物理上分散在非多孔、聚合性或弹性基质(例如，非易蚀性、易蚀性、环境因素侵入的，和可降解的)的体系的材料；片层结构，包括化学上类似或不同于外部控制层的储库层；和其他物理方法，例如渗透泵，或吸收在离子交换树脂上。
化学体系包括，但不限于，聚合物基质的化学腐蚀(例如，异种，或同种腐蚀)，或聚合物基质的生物腐蚀(例如，异种，或同种)。其他种类的控释体系可以参见Agis F.Kydonieus，Controlled ReleaseTechnologies：Methods，Theory and Applications，1980(CRCPress，Inc.)。
本发明的方法可以用来治疗由病理性炎症参与或导致的疾病感染的患者，或预防性治疗存在某种患病危险性的患者。预防所需的给药方案与治疗性处理可以不同，并且应按照具体用途和被治疗疾病的要求进行设计。
在一些方法中，同时给药两种或多种药物(例如，具有不同结合特异性的单克隆抗体)，在这种情况中各药物的给药剂量介于所述的范围内。间隔也可以是不规则的，这可以通过测定受体饱和水平或跟踪疾病过程的其他标记指示。
技术人员很容易理解，剂量水平可以作为具体药物、症状的严重性和对象对副作用的敏感性的函数而改变。一些具体药物壁其他药物更加有效。所给予药物的优选剂量很容易由所属领域技术人员利用多种方式来决定。一种优选的方式是测定所给药物的生理效能。
治疗的适应症
本发明的控释制剂可以用在广泛的预期效果中。特别是，本发明的制剂基本上可有效治疗任何可以通过长时间给药以病理性炎症为靶向的抗炎药物来治疗的疾病或症状。
本发明还提供利用抗-α-4整联蛋白药物阻断α-4-依赖性相互作用的性能的治疗方法。与内皮细胞上的VCAM-1配体的α-4-依赖性相互作用是许多炎症反应中的早期活动，包括中枢神经系统的那些。由炎症导致并存在急性和/或慢性临床恶化的不良疾病和病症包括多发性硬化症(Yednock等，1992 Nature 356：63；Baron等，1993 J.Exp.Med.177：57)，脑膜炎，大脑炎，中风，其他脑部创伤，炎性肠病(IBD)包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病(CD)(Hamann等，1994 J.Immunol.152：3238)，(Podolsky等，1993 J.Clin.Invest.92：372)，类风湿性关节炎(van Dinther-Janssen等，1991 J.Immunol.147：4207；van Dinther-Janssen等，1993 Annals Rheumatic Diseases52：672)；Elices等，1994 J.Clin.Invest.93：405)；Postigo等，1992 J.Clin.Invest.89：1445)，哮喘(Mulligan等，1993 J.Immunol.150：2407)和急性幼年发作的糖尿病(1型)(Yang等，1993PNAS 90：10494)；Burkly等，1994糖尿病43：529)；Baron等，1994 J.Clin.Invest.93：1700)，AIDS痴呆(Sasseville等，1994Am.J.Path.144：27)；动脉粥样硬化(Cybulsky等，1991 Science251：788-91，Li等，1993 Arterioscler.Thromb.13：197)，肾炎(Rabb等，1995 Springer Semin.Immunopathol.16：417-25)，视网膜炎，特应性皮炎，牛皮癣，心肌局部缺血，慢性前列腺炎，镰刀细胞贫血症的并发症，红斑狼疮，和急性白血病介导的肺部损伤，例如出现在成人呼吸窘迫综合症中。
炎性肠病是两种相似疾病的总称，这两种疾病分别称作克罗恩氏病(CD)和溃疡性结肠炎。CD是一种自发的、慢性溃疡性狭窄炎性疾病，特征在于由于肉芽肿炎症反应导致所有层肠壁的极度缩窄且通常涉及透壁。胃肠道的任何节段，自口腔至肛门，可以发生该病，虽然最常见该疾病出现在末端回肠和/或结肠。溃疡性结肠炎是一种非常局限在结肠粘膜和粘膜下层的炎症反应。淋巴细胞和巨噬细胞大量存在于炎性肠病的病灶中并且可以导致炎症损伤。
哮喘是一种特征为气管支气管树对多种刺激的响应能力增强，由此加强了支气管呼吸道的阵发性收缩的疾病。刺激诱发IgE覆盖的肥大细胞释放多种炎症介质，包括组胺，嗜曙红细胞的和嗜中性白细胞的趋化因子，白三烯，前列腺素和血小板活化因子。这些因子的释放征募嗜碱细胞、嗜曙红细胞和嗜中性白细胞，由此导致炎症损伤。
动脉粥样硬化是一种动脉(例如，冠状动脉，颈动脉，主动脉和髂动脉)的疾病。基础损害，动脉粥样化，是由内膜中增加的病灶斑组成，具有脂质核和覆盖的纤维顶。动脉粥样化减少动脉血流且削弱感染的动脉。心肌和脑梗塞是这种疾病的主要后果。巨噬细胞和白细胞被征募至动脉粥样化并导致炎症损伤。
类风湿性关节炎是一种慢性、复发性炎症疾病，它主要引起关节的损害和破坏。类风湿性关节炎通常首先感染手足的小关节，但随后影响到手腕，手肘，踝和膝。关节炎是由于滑液细胞与白细胞的相互作用造成的，所述白细胞由循环系统侵润到关节的滑液层。参见例如，Paul，Immunology(第3版，Raven Press，1993)。
另一种抗α-4药物长时间给药的适应症是器官或移植物排斥的治疗。近年来，移植组织和器官(例如皮肤、肾脏、肝脏、心脏、肺、胰腺和骨髓)的外科技术的效率明显改进。非常突出的问题也许在于缺少满意的药物来引发接受者对移植的同种移植物和器官的免疫耐受性。当将同种异体细胞或器官移植到宿主中时(即，供体和受体是相同物种的不同个体)，该宿主的免疫系统似乎增加对外来抗原在移植物中的免疫反应(宿主抗移植反应)，导致移植的组织被破坏。CD8+细胞，CD4+细胞和单核细胞参与移植物组织的排斥。对α-4整联蛋白的抗体特别有效地阻滞同种抗原在受体中诱发的免疫反应，由此防止此类细胞参与对移植物组织或器官的破坏。参见，例如，Paul等，1996 TransplantInternational 9：420-425；Georczynski等，1996 Immunol.87：573-580)；Georcyznski等，1995 Transplant.Immunol.3：55-61)；Yang等，1995 Transplantation 60：71-76)；Anderson等，1994 APMIS 102：23-27。
抗α-4药物的有关应用是调控参与″移植物抗宿主″疾病(GVHD)的免疫反应。参见例如，Schlegel等，J.Immunol.155，3856-3865(1995)。GVHD是一种潜在致命的疾病，其是在免疫活性细胞转移到同种异体接受者时发生。在这种情况中，供体的免疫活性细胞可以攻击接受者的组织。皮肤、肠上皮和肝脏的组织常常成为靶位并可能在GVHD的过程中被破坏。当免疫组织被移植，例如骨髓移植中，该疾病带来特别严重的问题；但不严重的GVHD也在其他情况中有所报道，包括心脏和肝脏移植物。本发明的治疗剂特别有效，阻断供体T-细胞的活化，由此干扰其溶解宿主中的靶细胞的性能。
本发明的抗α-4药物的另一种应用是抑制肿瘤转移。数种肿瘤细胞据报道表达α-4整联蛋白，并且据报道α-4整联蛋白的抗体阻断此类细胞对内皮细胞的粘附(Steinback等，1995 Urol.Res.23：175-83)；Orosz等，1995 Int.J.Cancer 60：867-71)；Freedman等，1994 Leuk.Lymphoma 13：47-52)；Okahara等，1994 Cancer Res.54：3233-6)。
抗-α-4药物的另一种应用是治疗多发性硬化症。多发性硬化症(MS)是一种进行性神经自身免疫疾病，其在美国感染了约250,000-350,000人。多发性硬化症被认为是特异性自身免疫反应的结果，其中某些白细胞攻击并开始破坏髓鞘质，即覆盖神经纤维的隔离鞘。在多发性硬化症的动物模型中，抗α-4β-1整联蛋白的鼠科单克隆抗体已经被证实阻断白细胞对内皮的附着，并由此在动物中防止中枢神经系统的炎症和继发性麻痹。
MS的发作可以是显著的或非常轻微以致不会引起患者去寻求医疗护理。大多数常见症状包括虚弱(在一个或多个肢体，眼科神经炎导致的视力模糊，感觉紊乱，复视和共济失调。该疾病的过程可以分为三个常见类型：(1)复发性MS，(2)慢性进行性MS，和(3)非活动性MS。复发性MS特征在于神经机能障碍的复发发作。MS发作一般是在数天至数周内展开并且此后可以完全、部分或无法恢复。由发作恢复一般是在数周至数月内出现由症状高峰恢复，虽然非常少的恢复可以持续2或更多年。
慢性进行性MS导致逐步进行的恶化且没有稳定或缓解的时期。这在患有复发性MS病史的患者中造成恶化，虽然这样的患者占患者的20％，复发无法恢复。急性复发也可能出现在进行过程中。
第三种形式为非活动性MS。非活动性MS特征在于可变幅度的固定神经缺失。大多数患有非活动性MS的患者有复发性MS的病史。
MS的过程还取决于患者的年龄。例如，良好预后性因素包括早期发作(不包括儿童期)，复发过程和发作后5年的轻度残余的劳动能力丧失。相反，不良预后与晚期的发作(即，40岁或更高龄)和进行过程有关。这些可变因素是相互独立的，因为慢性进行性MS倾向于在大龄时开始，由此复发MS。慢性进行性MS导致的劳动能力丧失常常归因于个体患者中的进行性截瘫或四肢麻痹。在本发明的一个方面中，当患者是在缓解阶段而不是该疾病的复发阶段时，该患者更适宜接受治疗。
促肾上腺皮质激素(ACTH)或口服皮质类固醇(例如，口服强的松或静脉内甲基强的松龙)的短期使用是唯一用于治疗急性MS恶化的患者的特定治疗方式。
MS的最新疗法包括用干扰素β-1b，干扰素β-1a，和copaxone(在先称作共聚物1)治疗。这三种药物已被证实明显减少该疾病的复发率。这些药物通常可以自行肌肉内或皮下给药。
目前可采用的治疗无一能够抑制脱髓鞘或MS。本发明的一个方面考虑用本发明所述的药物单独或与其他标准治疗药征联合治疗MS。标准治疗药征包括但不限于下列。在此没有讨论的用于与本发明的方法和组合物联合治疗MS的附加治疗药征依赖于被治疗患者中疾病的状况，这些药征对于所属领域专业人员来说是显然的。MS其他病理性炎症的附加治疗药征将包括其他免疫调节剂或免疫抑制剂。
所述的药物和药物组合物可以是为了预防和/或治疗性处理上述炎性病症进行长时间给药，所述炎性病症包括多发性硬化症，炎性肠病，哮喘，动脉粥样硬化，类风湿性关节炎，器官或移植物排斥和移植物抗宿主疾病。在治疗用途中，对易感或已患有所述疾病的患者给药足以治愈或至少部分阻止该疾病的症状及其并发症的量的该组合物。足以实现这种效果的量定义为治疗或药学有效剂量。
在预防性用途中，对易感或有危险患有特定疾病的患者长时间给药足以消除或减小危险性或延迟疾病的发作的量的该组合物。该用量被定义为预防有效剂量。在患有多发性硬化症的处于缓解阶段的患者中，利用NMR成像或者在某些情况中利用患者观察到的症状发生前指征，来评估危险性。
本发明的组合物用于上述病症治疗的有效剂量方案将依赖于许多不同的因素而变化，包括给药的方式，靶位，患者的生理状况，和给药的其他药物。所以，治疗剂量必须确定至最佳安全性和功效。通常，给药方案的每次给药在约0.0001-100mg/kg，和更常见0.01-5mg/kg的宿主体重。一种优选的给药方案是在至少6个月内每个月给药1次300mg，更优选在12个月内并且可能在数年的过程中。另一种优选的给药方案是3mg/kg患者体重/月。这样的方案可以是需要该治疗的儿童或青少年患者所优选的。
联合疗法
本发明的抗-α-4药物可以与有效量的对抗急性和慢性炎症的其他治疗剂一起使用。此类药物包括粘附分子的其他拮抗剂(例如，其他整联蛋白，选择蛋白，和免疫球蛋白(Ig)超家族成员(参见Springer，1990 Nature 346：425-433；Osborn，1990 Cell 62：3；Hynes，1992 Cells 9：11)。整联蛋白是由α链(120-180kDa)和β链(90-110kDa)组成的杂二聚体跨膜糖蛋白，一般具有短细胞质结构域。例如，3种重要的整联蛋白(即，LFA-1，Mac-1和P150，95)具有不同的α亚基，称作CD11a，CD11b和CD11c，并且普通β亚基称作CD18。LFA-1(αLβ2)表达在淋巴细胞、粒细胞和单核细胞上，并且主要结合Ig家族成员反受体，所谓ICAM-1，和有关配体。ICAM-1表达在许多细胞上，包括白细胞和内皮细胞，并且在血管内皮上在细胞因子例如TNF和IL-1的作用下上调。Mac-1(αMβ2)分布在嗜中性白细胞和单核细胞上，并且也结合ICAM-1。第三种β2整联蛋白，P150，95(αxβ2)，也在嗜中性白细胞和单核细胞上发现。选择蛋白由L-选择蛋白、E-选择蛋白和P-选择蛋白组成。
可以与抗α-4药联合使用的其他抗炎药包括细胞因子的抗体和其他拮抗剂，所述细胞因子例如为白介素IL-1至IL-13，肿瘤坏死因子α和β，干扰素α、β和γ，肿瘤生长因子β(TFG-β)，集落刺激因子(CSF)和粒细胞单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)。其他抗炎药包括趋化因子的抗体和其他拮抗剂，所述趋化因子例如为MCP-1，MIP-1α，MIP-1β，RANTES，外毒素和IL-8。其他抗炎药包括NSAIDS，甾族化合物和其他炎症的小分子抑制剂。联合治疗的制剂、给药途径和药物的有效浓度如上文抗α-4整联蛋白的人源化抗体所述。
与介导α-4整联蛋白或含α-4整联蛋白的二聚体联合使用并治疗炎性肠病(IBD)，克罗恩氏病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)的附加药物，包括但不限于5-氨基水杨酸盐，糖皮质激素、硫鸟嘌呤衍生物、甲氨蝶呤(MTX)、环孢菌素、抗生素和英利昔单抗(infliximab)。
5-氨基水杨酸盐包括柳氮磺胺吡啶(也称作Azulfidine)，它是mesalamine通过重氮键与磺胺吡啶相连的偶联物且常常以500mg/天-约6g/天的量给药。5-氨基水杨酸盐也可以与糖皮质激素联合给药。优选地，5-氨基水杨酸盐用于与一种所述治疗溃疡性结肠炎的药物的联合疗法，然而，也可以用于治疗克罗恩氏病。mesalamine的含非磺酰胺制剂包括但不限于ASACOL，CLAVERSA，SALOFALK，PENTASA，DIPENTUM，COLAZIDE和ROWASA。
糖皮质激素从1955年开始已经成为治疗急性严重恶化的IBD的中流砥柱，当它们首先被证实对UC有效时。口服强的松可以与任何本文所述的药物联合给药。通常，20-40mg的口服强的松每天给药1次。糖皮质激素还可以静脉内和通过灌肠法联合给药或并行给药或者在抗-α-4整联蛋白药物给药之前/之后的短时间内。例如，氢化可的松作为潴留灌肠剂使用(100mg/60mL)并且常规剂量为60-mL灌肠剂/夜达2-3周。当与本文所述的疗法和药物联合使用时这可以有所改变，对于所属领域技术人员来说能够理解。可以使用的其他甾族化合物包括，但不限于，甲磺基苯甲酸强的松龙，新戊酸替可的松，丙酸氟地松，二丙酸倍氯米松，和布地奈德。
硫鸟嘌呤衍生物也可以有效治疗IBD，CD和UC。这些包括但不限于6-巯基嘌呤(6-MP)和硫唑嘌呤(IMURAN)。这两种药物可以互换地与任意本文所述的α-4整联蛋白调节药物联合给药。
还考虑甲氨蝶呤(MTX)与本文所述的α-4整联蛋白调节药物联合使用。优选地，MTX经肌肉内注射(i.m.)与抗-α-4整联蛋白药物联合对对象给药。MTX对于甾类化合物依赖性CD有效，但不如在UC中有效。MTX可以以约15-约25mg/周/个对象的量给药或按照所属领域普通技术人员测定的所需量给药。
环孢菌素(例如，SANDIMMUNE，NEORAL)也可以与本文所述的α-4整联蛋白调节剂联合用于治疗肠道的病理性炎症。这可以用于治疗急性、严重的UC，该疾病对糖皮质激素没有反应。
英利昔单抗(即，REMICADE)也可以与本文所述的α-4整联蛋白调节剂联合用于治疗CD。英利昔单抗是一种结合TNF且因此中和其活性的免疫球蛋白。其他抗-TNF抗体，例如CDP571，也可以与本文所公开的α-4整联蛋白调节剂联合使用。
抗生素可以考虑与本文所述的α-4整联蛋白调节剂联合使用用于调控UC，IBD和CD。例如，患者可以用甲硝唑或环丙沙星(或其药理等效物)与所述的α-4整联蛋白介导药物或其混合物的形式联合治疗。
还考虑采用IBD，CD和UC的支持性疗法与介导α-4整联蛋白或含α-4整联蛋白的二聚体的药物联合并治疗炎性肠病，克罗恩氏病和溃疡性结肠炎。支持性疗法包括，但不限于，镇痛、抗胆碱能和止泻剂。联合上述支持性治疗在治疗方案的开始时可以有效减轻患者的症状并改善其生活质量。支持性疗法包括给予口服铁，叶酸盐，和维生素B12。止泻剂包括，但不限于地芬诺酯，可待因，洛派丁胺，和抗胆碱能药物(或其药理等效物)，它们可以给药给患有轻度疾病的患者以便减少肠运动的频率并再生直肠应急。考来烯胺可以用于患者以预防在用本文所述长时间给药方案治疗之前已经接受局部回肠结肠切除术的患者中胆汁盐诱发的结肠分泌。抗胆碱能药物包括，但不限于，克利溴铵，盐酸双环胺，颠茄的药酊等，并且可有效减少腹部痉挛，疼痛和直肠应急。
为了治疗MS，抗-α-4整联蛋白药物(例如，抗-α-4整联蛋白抗体，小化合物α-4整联蛋白拮抗剂等)可以与其他化合物或组合物联合用于治疗、改善或减轻与MS有关的症状。
其他用于治疗、改善或减轻与MS有关的症状的药物，包括但不限于：肌肉松弛剂(例如，安定，环苯扎林，氯硝西泮，可乐定，扑米酮等)，抗胆碱能药物(例如，普鲁本辛，双环胺等)，中枢神经系统兴奋剂(例如，苯异妥英)，非甾族抗炎药(NS例如布洛芬，萘普生和酮洛芬)，干扰素，免疫球蛋白，格拉太咪尔(Copaxone)，米托蒽醌(Novantrone)，米索前列醇，肿瘤坏死因子-α抑制剂(例如，吡非尼酮，英利昔单抗等)和皮质类固醇(例如，糖皮质激素和盐皮质激素)。
治疗多发性硬化症的常用药物包括干扰素β-1b(Betaseron)，干扰素β-1a(Avonex)，高剂量干扰素β-1a(Rebif)，格拉太咪尔(Copaxone)，免疫球蛋白，米托蒽醌(Novantrone)，皮质类固醇(例如，强的松，甲基强的松龙，地塞米松等)。其他皮质类固醇也可以使用，包括但不限于皮质醇，可的松，氟氢可的松，强的松龙，6α-甲基强的松龙，曲安西龙，和倍他米松。
与本文所述化合物和组合物联合使用的药物的剂型将依赖于对象和联合使用的药物而变化。例如，干扰素一般按照下列给药：干扰素β-1a(Avonex)每周给药30μg一次；干扰素β-1a每周给药约22μg或44μg三次；和干扰素β-1b(Betaseron)隔天给药250μg(Durelli等，Lancet 359：1453-60，2002)。通常干扰素给药用于复发或缓解性的多发性硬化症。因此与本文所述的抗-α-4整联蛋白药物联合，干扰素的优选范围可以包括约0.1μg-约250μg并更优选约0.5μg-约50μg，这依赖于该药物与本文所述的其他抗-α-4整联蛋白化合物和组合物给药的方式。
考虑用于本发明的NS或NSAIDs包括但不限于非选择性COX抑制剂和选择性COX-2抑制剂。非选择性COX抑制剂包括但不限于水杨酸衍生物(例如，阿斯匹林，水杨酸钠，三水杨酸胆碱镁，双水杨酯，二氟尼柳，柳氮磺胺吡啶，和偶氮水杨酸)，对氨基酚衍生物(例如，对乙酰氨基酚)，吲哚和茚乙酸(例如，托美丁，双氯芬酸，和痛力克)，杂芳基乙酸(例如，布洛芬(abuprofen)，萘普生，氟比洛芬，酮洛芬，非诺洛芬(fenprofen)，和奥沙普秦)，邻氨基苯甲酸或芬酸类(例如，甲芬酸和甲氯芬那酸)，烯醇酸(例如，昔康类例如吡罗昔康和美洛昔康)，和烷酮(例如，萘丁美酮)。选择性COX-2抑制剂包括二芳基取代的呋喃酮(例如，洛芬昔布)，二芳基取代的吡唑(例如，塞来昔布)，吲哚乙酸(例如，依托度酸)，和磺酰基苯胺(例如，尼美舒利)。NS经常与干扰素联合给药以便减轻接受例如Avonex的患者出现的流感样症状。普通NS药物包括萘普生、布洛芬和酮洛芬。醋氨酚也常常对患者给药。参见，Reess等，2002 Mult.Scler.8：15-8。
醋酸格拉太咪尔(GA，Copaxone)是一种抑制髓鞘质基础蛋白反应性T细胞的激活并诱导特征在于抗炎作用的T-细胞全部组成部分的合成分子。此外，格拉太咪尔可以进入中枢神经系统(CNS)，而干扰素-β无法进入(Dhib-Jalbut，2002 Neurology 58：S3-9；Weinstock-Guttman等，2000 Drugs 59：401-10)。
米托蒽醌是一种蒽二酮合成药物，已经证明它有效治疗继发性进行性多发性硬化症(SP-MS)。然而，这种药物的使用也受到其累积性心脏毒性的限制(Weinstock-Guttman等，2000)。
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)可以是脱髓鞘中的关键细胞因子(Walker等，2001 Mult.Scler.7：305-12)。因此拮抗TNF-α功能或抑制其合成的药物的使用可以有效地与本文所述的药物和化合物联合。这可以包括抗-TNF-α抗体(例如，英利昔单抗)以及药物例如吡非尼酮。吡非尼酮是非肽药物，已经证实它减少TNF-α的合成并阻断TNF-α的受体，见上述文献。
大多数脱髓鞘病症和疾病这的长期支柱疗法是使用ACTH、糖皮质激素和肾上腺皮质激素。这些药物利用其抗-水肿和抗-炎症作用。ACTH通常对对象以6-8小时内含于500mL的5％葡萄糖和水中80U的量静脉内给药达3天。还可以以40U/ml静脉内给药，剂量为每12小时40U共7天，然后该剂量减少为每3天给药。参见，S.Hauser，″多发性硬化症和其他脱髓鞘疾病″，于Harrison′s Principles ofInternal Medicine 2287-95(第13版，Isselbacher等编辑1994)。甲基强的松龙一般在6小时内缓慢给药500ml D5W，优选在清晨。常规剂量包括1000mg/天共3天，500mg/天共3天和250mg/天共3天，见上述文献。甲基强的松龙-强的松组合物也常常给药。通常约1,000mg的静脉内甲基强的松龙在3天内给药，随后口服强的松以1mg/kg/天给药达14天。所以，为了与本文所述的化合物和组合物联合使用，甾族化合物可以以约1-约1,000mg/kg的量在约1-14天内根据需要给药。
脱髓鞘病症例如MS中的副作用是，疲劳和减弱的认知功能。药物例如盐酸金刚烷胺和苯异妥英业已常常用来治疗与MS有关的疲劳(Geisler等，1996 Arch.Neurol.53：185-8)。
这种联合疗法的好处在于可以减小在使用某些药物时经常遇到的种类特异性和药物特异性副作用。干扰素-β的种类特异性副作用包括发热，寒战，肌痛，关节痛和其他在注射后2-6小时开始出现并且通常在注射后24小时消散的其他流感样症状。有时候干扰素-β还诱发在先已患有的MS症状的临时性恶化。药物特异性副作用包括干扰素β-1b的注射位点反应。这些作用的控制是通过调节给药的剂量和时间来实现，给予对乙酰氨基酚、非甾族抗炎药(NS或NSAIDS)和甾族化合物的适当组合物。参见Munschauer等，1997 Clin.Ther.19：883-93。
因此，可减少具体药物的给药量的药物的组合可以减小患者遭受的副作用。
当联合给药时，小化合物α-4-整联蛋白拮抗剂可以与这些其他化合物或组合物以同一制剂给药，或者以分开的制剂给药。当联合给药时，所述的抗-α-4-抗体一般是以与其他化合物和组合物分开的制剂给药。当联合给药时，所述的抗-α-4药物可在其他化合物和组合物给药之前、之后或同时给药来治疗、改善或减轻症状。
实施例
给出下列实施例，以便为所属领域普通技术人员提供有关如何完成和采用本发明的实施方式的代表性实例的全面内容和说明，但不对本发明人所述的本发明的范围构成限定，也不代表下列实验是全部或仅有的实施过的实验。已经努力使所用的数量确保精确(例如，量，温度等)，但应当考虑会存在一些试验误差和偏差。除非另外说明，份数是指重量份数，分子量是重均分子量，温度为摄氏度，并且压力是处于或接近于大气压。
实施例1
那他珠单抗在复发性多发性硬化症中的对照试验
患者人群
从1999年9月至2000年5月在美国、加拿大和英国的26个临床中心登记了213名患者。公共评价机构或中央和地区伦理委员会批准了本方案。所有患者签署了书面许可文件。研究的监督权是由独立的安全数据监测委员会进行。
合格的对象要求为18岁至65岁，并且采用临床或实验室定义的Poser标准支持确定为MS，或者复发-缓解型或继发进行性(Poser等，1983 Ann.Neurol.13：227-31；Lublin等，1996 Neurology 46：907-11)，在以往2年内至少复发2次的病史，基线Kurtzke ExpandedDisability Status评分(EDSS)(Kurtzke，1983 Neurology 33：1444-52)在2-6.5之间，并且T2-加权的脑MRI上的三个损害最小。患者如果在过去3个月内接受过免疫抑制或免疫调节剂的治疗，或者经历过复发，或者在过去30天内接受系统性皮质类固醇就被排除掉。
研究设计和随机化
按照计算机生成的块随机化表将患者随后分到三个治疗组中的一个小组：3mg/kg那他珠单抗，6mg/kg那他珠单抗，或安慰剂。患者以28天的间隔接受6次静脉内输注并有6个月的安全跟踪期。调查员、所有其他研究人员和患者均不了解治疗分配。
研究过程和终点
非增强质子密度T2-加权的和Gd-增强性T1-加权的MRI脑扫描是在筛选期(第1月)，各治疗之前即时(第0-5月)，和末次治疗后1个月(第6月)进行。跟踪MRI扫描是在第9和12月获得。采集46个相邻的3-mm厚的通过脑部的中轴切片。MRI分析是由不了解患者治疗和病史的一家中心进行。由两名有经验的临床医师识别硬复拷贝图像上的损伤并达成共识。
预期性初级结果量度是在6个月治疗期内新的Gd增强性损害的数目，该治疗期定义为首次输注至末次输注后1个月的时期。其他评估的MRI参数包括：持续Gd-增强性损害的数量(在以往每月扫描中也增强的增强性损害)；Gd-增强性损害的体积(通过半自动局部阈值法测定；Grimaud等，1996 Magn.Reson.Imaging 14：495-505)；新的活动性损害的数量(即，新的Gd-增强性损害加新的或扩大的、非增强性T2损害)；和有效扫描的数量(即，包括一种或多种新的Gd-增强性损害)。
临床终点包括复发次数和EDSS的变化，和利用视觉模拟等级(VAS)获得的自我报告的综合评估。记录所有副作用。以预定的每三个月的间隔检查患者，并且不定期地对可能的复发进行访查，这是由对患者评估不了解的神经科医师进行处理和评估，处理的神经科医师进行了解医学病史和检查，并记录副作用。评估的神经科医师评价神经状态并评定EDSS分值，他们不了解患者的病史或以往的EDSS评分。
客观的复发被定义为在至少30天的稳定期之后出现持续至少48小时的新或恶化的MS症状的急性发作。还伴随EDSS评分的至少一个点增高，双函数体系评分(FSS)的至少一个点增高，或与基线相比至少FSS的两个点增高，这些由神经科医师评价。不符合上述复发标准但由处理的神经科医师评估为复发的神经症状也加以记录(总的复发)。
在视觉模拟评分(VAS)时，患者沿10cm线标记一个位置来反映其在基线和3和6个月处理后的总体健康的评估，并且较高的评分反映了健康较好。
对患者进行临床跟踪直至第12月。鼓励那些中止治疗但没有达到终点的患者回来跟踪评估。
统计学分析
样本量评价是基于在那他珠单抗的先前临床研究(Tubridy等，1999 Neurology 53：466-72)中首次输注后第1个12周内观察到的新的Gd-增强性损害的数量。基于该先前试验的结果，并且采用适合双侧、双组对比的在显著性为5％水平的样本量方法，基于Wilcoxon-Mann-Whitney统计量(Noether，1987 J.Amer.Stat.Assoc.82：645-7)，计算出对于80％效力(power)来说每组需要约73名患者。
利用Wilcoxon-Mann-Whitney等级-总和试验来评估6mg/kg那他珠单抗和安慰剂之间Gd-增强性损害数量的主要对比以及Gd-增强性体积。用对该患者进行有效扫描获得的损害的平均值代替由于没有进行一次或多次MRI扫描造成的遗漏值。放弃从在前30天内接受系统性皮质类固醇的患者获得的MRI扫描并处理为遗漏值。利用对各组的等间隔评分和对有效初级结果的等级评分，通过Cochran-Mantel-Haenszel相关性统计法用来测试由全部三组获得的数据的剂量反应关系。
人的卡方检验用于比较患有复发的患者的比例。利用双向ANOVA法以及研究中心和治疗组作为独立变量来分析EDSS和VAS中自基线的变化。
所有检验包括全部随机化的患者并遵循希望治疗的原则。所有报告的P值是双尾的。上述三组在基线时在人口统计学特征、MS病史、登录EDSS和MRI参数上没有显著性差异(表1)。
表1：随机化患者的人口统计和基线特征
    那他珠单抗
特征     安慰剂(N＝71)     3MG/KG(N＝68)     6MG/KG(N＝74)
年龄，岁       平均范围     42.922-66     42.822-65     44.930-63
性别  N(％)    男性女性     25(35.2)46(64.8)     21(30.9)47(69.1)     15(20.3)59(79.7)
MS分类 N(％)   R-RS-P     45(63.4)26(36.6)     47(69.1)21(30.9)     52(70.3)22(29.7)
EDSS           平均范围     4.402.0-6.5     4.211.0-6.5     4.320.0-6.5
    那他珠单抗
特征     安慰剂(N＝71)     3MG/KG(N＝68)     6MG/KG(N＝74)
患病时间            平均年                  范围     10.21-32     11.60-40     13.12-39
过去2年内复发次数   平均范围     32-12     2.92-10     3.12-8
自从末次复发的时间  平均月                  范围     6.52-17     7.22-24     62-22
筛选T1加权的MRI(第1个月)具有一个或多个Gd-增强性损害的扫描的数量(％)Gd-增强性脑损害的数量平均范围 28(40)1.60-42 29(43)1.50-18 29(40)1.70-23
基线T1-加权的MRI(第0月)具有一个或多个新Gd-增强性损害的扫描的数量(％)新Gd-增强性脑损害的数量平均范围 22(31)1.30-28 29(43)1.30-32 32(43)1.40-12
初级结果
安慰剂组的患者在6个月的治疗期内表现出9.6新Gd-增强性损害的平均值。接受那他珠单抗组中的相应值对于3mg/kg组来说为0.7(P＜0.0001)和对于6mg/kg组来说是1.1(P＜0.0001)(参见表2)。这种差异分别使新的Gd-增强性损害在3mg/kg和6mg/kg组减少了93％和88％。与安慰剂相比治疗组之间的差别使在首次输注后明显(图1)。
表2：治疗过程(1-6月)中和跟踪期(9和12月)的MRI活动性的概括
    安慰剂   3MG/KG   6MG/KG      P值  *
    新增强性损害M1-平均值中间值SD 9.62.027.4 0.702.1 1.102.7 (i)＜0.0001(ii)＜0.0001
    持续增强性损害M1-6平均值中间值 3.61 0.80 1.30 ＜0.0001
  安慰剂    3MG/KG   6MG/KG      P值   *
   SD     6.5     1.9     2.6
   新的活动性损害M1-6平均值中间值SD 9.72.027.4 0.802.2 1.103 ＜0.0001
   有效扫描M1-6(％)     39％     9％     11％     (i)＜0.0001(ii)＜0.0001
   增强性损害体积M1-6(mm3)平均值中间值SD 1169.02662666 1560359.0 279.00632.0 (i)0.005(ii)0.01
   新的增强性损害M9和12平均值中间值SD 2.51.04.37 2.60.54.58 2.104.96 (i)0.90(ii)0.59
   持续增强性损害M9和12平均值中间值SD 0.200.64 0.100.32 0.100.3 0.029
   新的活动性损害M9和12平均值中间值SD 2.71.04.49 2.80.55.69 2.31.05.11 0.424
   有效扫描M9和12(％)     42％     40％     35％
   增强性损害体积M9和12(mm3)平均值中间值SD 427.088.0797.0 32331.0591.0 2330686 0.260
*(i)安慰剂与3mg/kg那他珠单抗的对比；(ii)安慰剂与6mg/kg那他珠单抗的对比。
二级MRI结果
持续增强性损害的累计数、新的活动性损害、增强性损害的总体积和有效扫描的百分比自1-6月明显和显著减少(表2；图2)。
临床功效结果
在6个月治疗期内，71名安慰剂患者中26人报告了共35次复发；接受3mg/kg那他珠单抗的68名患者中有13人报告18次复发，并且在接受6mg/kg那他珠单抗的74名患者中有14人报告了15次复发(P＝0.05，安慰剂与全部那他珠单抗-处理的患者对比)。采用更加严格的客观复发标准，该效果同样强大：15名安慰剂患者18次复发；3名接受3mg/kg那他珠单抗的患者3次复发；接受6mg/kg那他珠单抗的8名患者8次复发(P＝0.05)。在需要甾族化合物治疗的安慰剂组中复发比上述治疗更多(安慰剂中22次，3mg/kg那他珠单抗中5次，和6mg/kg那他珠单抗组中7次，P＝0.007，安慰剂相对于全部那他珠单抗-处理的患者)。
在VAS上，安慰剂组的患者报告没有变化，而那他珠单抗组中的那些患者报告至6个月时健康有所改善，此时不同组之间的差异非常明显(P＝0.033，安慰剂相对于全部那他珠单抗-处理患者)。在治疗过程中任何组中的EDSS没有出现显著变化。
抗体浓度和受体饱和度
在每次访查时采集患者的血清样本并利用酶联免疫吸附测定(ELISA)定量分析定向特异性对抗那他珠单抗的抗体。在各次输注之前和首次和末次输注之前2小时、24小时、1、2和3周时由每个处理组中一小组的12-14名患者测定那他珠单抗血清水平和那他珠单抗的受体占据情况。
血清抗体浓度利用ELISA试验测定。简单而言，在含有碳酸氢钠至pH 8.3的溶液中制备特异性结合那他珠单抗的捕获抗体的2.0μg/mL溶液。将100μL的抗体溶液加入到Costar 96孔微量滴定平板的各孔内。平板用平板密封带覆盖并在室温下温育12-26小时。抽吸该平板，200μL的封闭缓冲液(0.25％酪蛋白于PBS，pH7.4)加入到各孔，并且在室温下继续温育1小时。随后干燥平板并储存备用，或用300μL洗涤缓冲液洗涤(TBS，pH7.5，含有0.05％吐温-20)。如果将平板干燥，在使用之前通过向各孔加入300μL洗涤缓冲液再水化并温育1-2分钟。抽吸平板并倒置在面巾纸上吸附多余水分。
将试验样本在酪蛋白稀释剂中于ELISA(0.25％酪蛋白于PBS，含有0.05％吐温20，pH7.4)之前稀释。通常，测试试验样本的2或3倍稀释液以确保那他珠单抗值精确。稀释对照样本也利用已知量的那他珠单抗制备从而监测其余步骤的准确度。
将100μL的参照标准、试验样本或稀释对照样本加入到各孔中，并且将该平板在室温下温育60-75分钟。该平板用洗涤缓冲液洗涤3次并出剩余的水分。将100μL新稀释的小鼠抗-人IgG4-碱性磷酸酶偶联物加入到各孔，并且平板在室温下继续温育60分钟。温育后，平板用洗涤缓冲液洗涤4次，并且除去剩余水分。用校准的多道吸量管加入100μL荧光底物A，并且将平板室温下温育45-60分钟。利用fmax荧光微量平板读数仪和SOFTmax Pro Version 1.3.1协议文件conc102.ppr测定各孔中的水平。
结果如图3和4所示。这些图显示，那他珠单抗的水平在给药之间降低，并且直至7或8月(即，末次给药后2-3个月)在大多数患者中无法检测到抗体。
另外在给药研究中利用FACS分析法测定血清抗体浓度，受体饱和的水平，和VLA-4饱和的特定水平。VLA-4饱和的测定通过间接免疫试验利用流动血细胞计数进行。
将患者约1mL的血样等分至两个15mL聚丙烯管内，并且将冷的洗涤缓冲液(人血清[Scantibodies Laboratory，Inc.Part 3SH341]在PBS中稀释至3％)加入到管上的14mL刻度。将该管在10-15℃、2,200rpm下离心5分钟，并且抽吸液体并丢弃。细胞颗粒重新悬浮在冷的洗涤缓冲液中达到1mL。
在缓冲液中制备500μg/mL的那他珠单抗储备参比标准液。将20μL的稀释那他珠单抗储备参比液加入到第一管内，并且20μL洗涤缓冲液加入到第二管内。两个管在冰上避光温育30分钟。温育后，该管用洗涤缓冲液填满至14mL刻度，随后在冷条件下2,200rpm离心5分钟。抽吸上清液，并且再次重复洗涤步骤。二次洗涤后，将细胞再次悬浮在洗涤缓冲液中至1mL刻度。
将10μL的R-藻红蛋白(PE)-偶联的抗-人CDw49d抗体(Pharmingen，Cat.#31475X)加入到各管内并将管子轻轻涡旋。将管子在避光2-8℃下温育10-15分钟。温育后，加入2mL 1X细胞溶解溶液，pH 7.4，并将各管轻轻涡旋。该管在冰上2-8℃下温育10-15分钟，冷条件下离心5分钟，并且抽吸上清液与细胞颗粒分开。将细胞颗粒重新悬浮在4mL冷的染色缓冲液内，并且将该管再次在冷的条件下2,200rpm离心。非常小心地除去上清液，加入0.5mL固定液(Ortho′s Fixative pH7.6)，将该管立刻涡旋以确保细胞重新悬浮在固定液中。该管用铝箔覆盖直至FACS试验。
利用FACS Calibur流动细胞计数器和CellQuestTM软件测定含有和不含有那他珠单抗的各样本中的VLA-4受体饱和度。CellQuestTM软件能够获得和分析流动细胞计数器的数据。
受体饱和水平如图5所示。在1-4月的受体饱和的水平上在每月给药之前测定的。1个月给药间隔所产生的受体饱和的水平始终相当高，这种长时间的水平足以保持对病理性炎症和该疾病相关生理标志的抑制。平均地，饱和的水平1个月维持在平均值至少为67％且中间值至少为75％。这些水平足以抑制被治疗患者中的脑损害(参见图1)。在2-5月(和在5月给药后21周)预先输注的研究中测定的饱和的最低水平与平均值和中间值相比特别低，这是由于一个患者对那他珠单抗产生抗体反应。
随着患者中的受体饱和水平降低，治疗的功效也如此。治疗人群中42％的平均受体饱和水平和41％受体饱和的中间受体饱和水平与该患者群中脑损害的抑制无关(参见图2和5)，因此高于此的长期受体饱和水平是利用药物例如α-4抑制剂有效抑制病理性炎症所必须的。
安全和耐受性
反复的那他珠单抗治疗，在3或6mg/kg剂量下，可以被患有MS的患者在6个月的治疗期内很好耐受。各组中相近数量的患者遭受了治疗发生的副作用。虽然不显著，某些副作用对于那他珠单抗比安慰剂来说更常出现(表3)。在那他珠单抗给药时在6个月的治疗期内发现了持续的轻度淋巴细胞增多。
表3：那他珠单抗治疗患者相对于安慰剂组的更常见的副作用*
    安慰剂(71)     3MG/KG(68)     6MG/KG(74)
出现副作用的患者的总数 68(96％) 62(91％) 70(95％)
总体感染 10(14％) 14(21％) 14(19％)
消化系统胃胀气 0 4(6％) 0(0％)
神经系统口周机能异常 1(1.0％) 5(7％) 2(3％)
呼吸系统鼻窦炎咽炎 3(4％)8(11％) 7(10％)10(15％) 3(4％)15(20％)
皮肤和附件皮疹 4(6％) 6(9％) 8(11％)
泌尿生殖系统感染 10(14％) 14(21％) 11(15％)
*包括在表中，安慰剂组和那他珠单抗组之一之间需要在副作用的发生率上至少5％的差异。
在安慰剂和治疗组中报告的严重副作用(SAEs)的数量没有显著差异(即，7名安慰剂处理的患者报告了11起SAEs，5名接受3mg/kg的患者报告5起SAEs，和接受那他珠单抗6mg/kg的3名患者报告4起SAEs)。其中，4起被认为是免疫介导的并且与研究的药物有关。在3mg/kg组中有1起过敏性反应同时出现荨麻疹和支气管痉挛，利用抗组胺和甾族药物治疗可以迅速逆转它。在包括安慰剂在内的各组中报告了1起血清病。只有1起活动伴随补体水平的改变并且全部发生在相同的调查位置。总之，在250次输注中，这些活动少于1起。
组之间由于副作用导致的中止治疗的患者的数目没有差异(即，安慰剂组中3人，3mg/kg组中4人和6mg/kg组中3人)。在研究中安慰剂患者中有1起由于继发胸膜癌并发血胸导致死亡。
还评估抗体生成率。总之，15名那他珠单抗治疗的患者(11％)出现抗-那他珠单抗抗体：13人在治疗期内，和2人在治疗后的跟踪期内出现。存在的抗-那他珠单抗抗体的临床关联性当前还不知道。
那他珠单抗的最大血清浓度是剂量依赖性的，并且在反复给药后观察到没有明显蓄积。接受3mg/kg那他珠单抗的患者在治疗期内具有高于80％的VLA-4受体饱和度；受体占据在接受那他珠单抗6mg/kg的患者中较高(约90％)并且时间更长。
治疗后的跟踪：6-12月
新的增强性损害和有效扫描的累计数量(9和12月合并)在所有三个组中相似(表2)。在9个月时6mg/kg组中趋势为活动性减小。3组之间报告的临床复发的总数或通过预定客观标准测定的复发数量没有明显差异：安慰剂组中24人，3mg/kg组中24人，和6mg/kg组中26人。
该研究首先提供了人体中的有力MRI和临床证据，即选择性抑制α-4整联蛋白介导的白细胞粘附和通行是长期治疗MS的有效途径。两种剂量水平的α-4整联蛋白特异性人源化单克隆抗体那他珠单抗大大证实了与安慰剂相比在6个月的治疗期中对患者中新增强性炎性脑损害的抑制作用具有统计学意义的影响。在首次输注后1个月观察到这些损害在那他珠单抗治疗的患者减轻并且在整个治疗期内持续。对于两种剂量水平，减轻了约90％，比报告的β-干扰素减轻的效果高约50-70％(MS/MRI Analysis Group，1995 Neurology 4：1277-1285；Jacobs等，1996 Ann.Neurol.39：285-294；和PRISMS(Preventionof Relapses and Disability by Interferon β-la Subcutaneouslyin Multiple Sclerosis)Study Group，1998 Lancet 352：1498-1504)。
此外，本试验中那他珠单抗对MRI结果的影响得到临床观察的支持。该研究未预见性证明对临床结果的作用。然而，用那他珠单抗治疗使复发率明显降低并且可以感觉到患者健康的改善。当考虑全部报告的临床复发时，两个那他珠单抗组比安慰剂组在6个月的治疗期内复发明显减少。利用预定的复发标准也可以发现这些发作的明显减少；所述预定的复发标准是一种更加严格的量度，因为它要求客观征兆的改变。那他珠单抗对复发的效果超过已往批准用于MS的疗法的效果，后者表现出约30％的作用(MS/MRI Analysis Group，如上所述；Jacobs等，如上所述；PRISMS Study Group，如上所述；Johnson等，1995 Neurology 45：1268-76)。
重要的是，在那他珠单抗组中在治疗结束后发现对新的MRI损害或复发没有反弹作用。此外，6个月每月输注那他珠单抗可以被很好耐受，并且在安全性能上与安慰剂相似并可以被MS的长期治疗接受。
该研究的结果进一步支持α-4整联蛋白和表达它的免疫细胞在患有MS的患者中的急性炎性脑损害的发病机理上的作用。在1个月的治疗中新Gd-增强性损害明显减少。该结果提示那他珠单抗通过防止新损害的出现来早期作用于损害的发展。
总之，已经证实那他珠单抗在本安慰剂对照试验中对于患有复发性MS的患者的临床意义指标具有强有力的影响。在这6个月研究过程中该疗法耐受良好。本研究中观察到的那他珠单抗对新炎性CNS损害的出现、出现临床复发的有益作用和对患者健康的改善显示，该作用对当前长期研究中的劳动能力丧失具有潜在作用。
实施例2
那他珠单抗在克罗恩氏病中的对照试验
方法
在双盲、安慰剂对照试验中，患有轻度至严重活动性克罗恩氏病(CD)的248名患者随机接受安慰剂的2次输注，或者3mg/kg那他珠单抗的输注、随后输注安慰剂；或输注2次3mg/kg或6mg/kg的那他珠单抗，间隔时间为4周。结果量度包括克罗恩氏病活动性指数(CDAI)，与健康有关的生活质量(QOL)，和血清C-反应性蛋白水平。
那他珠单抗提高了临床缓解和临床反应的比率，并且改善患有活动性CD的患者的QOL，同时证实具有针对该疾病治疗可接受的安全性能。
患者群在被地方伦理委员会批准之后，各中心筛选至少18岁的男性和女性患者，这些患者患有轻度至严重的活动性CD的临床症状，他们的CDAI被定义为至少220但小于或等于450。在筛选的311名患者中，1999年9月至2000年8月将在比利时、捷克共和国、丹麦、德国、以色列、荷兰、瑞典和英国的35个中心248人随机化。全部患者提供全面的书面保证书。排除在3个月内接受甲氨蝶呤，环孢菌素，或任何监督药物的患者；接受硫唑嘌呤或6-巯基嘌呤的患者需要有至少4个月的稳定剂量。其他排除包括：先前的抗体疗法；目前使用的超过25mg/天剂量的口服强的松龙；目前采用的基础饮食或非肠道营养；肠道的传染性或瘤性疾病；在3个月内接受肠道手术；结肠开口术、回肠造口术，或结肠直肠吻合术和回肠直肠吻合术的存在；主要由于纤维变性限制导致的症状；和患者似乎在短期内需要紧急腹部手术的临床迹象。
研究设计和随机化
按照计算机生成的块随机化表将患者随后分分配为四种治疗方案之一种方案。各组接受2次间隔时间为4周的静脉内输注。四种治疗方案中，为安慰剂输注2次；3mg/kg那他珠单抗输注1次后，输注安慰剂；和2次输注3或6mg/kg的那他珠单抗。调查员、所有其他研究人员和患者不了解治疗的分配。
研究过程和终点
初级功效终点是在6周时缓解的患者(CDAI＜150)的比例。CDAI中加入8个相关变量：每天液态或非常软的粪便的数量，腹部疼痛或痉挛的严重性，全身健康状况，出现的疾病的肠外表现，腹部块状物的存在，止泻药的使用，血细胞比容，和体重(Best等，1976Gastroenterology 70：439-441；和Summers等，1979Gastroenterology 77：847-69)。评分小于150表示缓解；评分介于150-219表示轻度活动性的疾病，介于220-450之间表示中度活动性的疾病，并且评分大于450表示严重活动性。其他预定终点是证实临床反应的患者的比例(即，CDAI减小至少70个点)，健康有关的生活质量，通过炎性肠病特异性调查表来测定，IBDQ(Irvine等，1994Gastroenterology 106：287-96)，和C-反应性蛋白的血清水平。
整个研究中进行安全性评估，包括记录副作用并进行临床实验的监测。独立的安全数据监测委员会提供附加的监测水平。在每次访查时采集患者的血清样本并利用酶联免疫吸附测定(ELISA)定量分析血清。
统计学分析
针对(LOCF)人群在观察过程中所有功效分析均采用意图治疗(intent-to-treat)(ITT)，其包括全部患者随机化(n＝248)。采用抢救治疗的患者被划分为治疗失败。安全性群体(n＝244)包括那些随机和给药的人。四名因无入选资格患者没有用药。
所有统计学试验是双侧的并且在5％统计学意义水平上。进行与安慰剂相比各种有效治疗的三对试验。缓解和反应率是通过CochranMantel-Haenszel卡方试验(普通关联)(Landis等，1978 Int′l.Stat.Rev.46：237-54)利用国家作为层面进行分析。利用对数回归在6周时分析协方对缓解和反应的影响(有或无)。
每组计算60个对象的样本量来达到在5％显著性水平下80％效力，从而检测在那他珠单抗组的反应率为40％且安慰剂组的反应率为15％的假设下反应率的差异。
将国家和治疗组的方差模型的双向分析和固定作用与偏离基线的平均CDAI减少对比。测试各活性治疗组与安慰剂组的对照。
利用Wilcoxon-Mann-Whitney实验分析C-反应性蛋白和IBDQ数据，以比较3个活性治疗组各组与安慰剂之间偏离基线的变化。在前瞻性计划分析中，将患者的C-反应性蛋白水平与大于基线(0周)上正常范围上限8mg/l的值进行比较。
结果
比较基线处各组之间的人口统计学特征，CDAI评分，疾病的位置，和药物(表4)。在0周时的评估中，大多数患者接受了其他用于CD的药物，包括5-ASA化合物(48-64％)，口服甾族化合物(46-63％)，或硫唑嘌呤/6-巯基嘌呤(18-37％)以及可有可无的其他药物。27名患者自整12周之前的研究开始撤药：安慰剂组中10人，并且在3+0、3+3和6+6mg/kg那他珠单抗组中分别有6、5和6人。
表4：基线的人口统计特征和药疗法
特征                            安慰剂           3+0MG/KG         3+3MG/KG        6+6MG/KG
随机化的患者                    63               68               66              51
平均年龄和范围(年)              34(18-68)        36(18-66)        36(19-64)       35(19-62)
平均患病时期和范围(年)          8.9(0.3-64.3)    8.4(0.5-27.5)    8.1(0.5-22)     7.8(0.6-29)
平均基线CDAI和范围*             300(186-447)     288(211-427)     298(219-442)    296(210-429)
疾病位置：
回肠                            15(24％)         9(13％)          17(26％)        12(24％)
结肠                            11(17％)         16(24％)         16(24％)        16(31％)
回肠结肠                        37(59％)         43(63％)         33(50％)        23(45％)
性别：女性                      33(52％)         41(60％)         36(55％)        26(51％)
平均体重和范围(kg)              68(42-100)       66(41-95)        64(44-97)       69(44-98)
并行的药疗
没有克罗恩氏病的药+并行        12(19％)         11(16％)         9(14％)         5(10％)
5ASA化合物                      30(48％)         40(59％)         42(64％)        30(59％)
口服甾族化合物                  31(49％)         31(46％)         37(56％)        32(63％)
硫唑嘌呤或6-MP(±甾族化合物)    2(35％)          25(37％)         17(26％)        9(18％)
*248名患者中8人在基线时具有CDAI评分＜220。基于其筛选的血细胞比容，这8人中5人是合格的(CDAI≥220)，它是随机获得的值，但在用基线血细胞比容重新计算时评分＜220。其他3名患者的CDAI评分在随机化时计算错误。
+5ASAs，甾族化合物，或免疫抑制剂。
临床反应、缓解和平均CDAI评分
全部3个那他珠单抗组中出现临床反应的患者比例(即，CDAI从基线降低至少70个点)在4、6和8周时在统计学上明显高于安慰剂组(表5和图6)，和这种作用在接受2次那他珠单抗的两个组中持续12周。早在首次治疗后2周就观察到临床反应率提高的趋势，3+3mg/kg那他珠单抗组证实在该时间点在统计学上明显不同于安慰剂。平均CDAI评分由基线降低的结果(表6)支持发现的反应率。
表5：ITT人群中缓解和临床反应的比率
时间点             安慰剂      3+0MG/KG       3+3MG/KG      6+6MG/KG
                   (N＝63)     那他珠单抗     那他珠单抗    那他珠单抗
                               (N＝68)        (N＝66)       (N＝51)
                              缓解(CDAI＜150)
                               患者数   (％)
2周                6(10)        10(15)        13(20)        6(12)
    P值                         0.328         0.127         0.745
4周                9(14)        21(31)        19(29)        15(29)
    P值                         0.02          0.027         0.028
6周 (初级终点)     17(27)       20(29)        29(44)        16(31)
    P值                         0.757         0.030         0.533
8周                10(16)       19(28)        27(41)        22(43)
    P值                         0.107         ＜0.001       ＜0.001
12周               17(27)       19(28)        28(42)        21(41)
    P值                         0.992         0.042         0.091
                           反应(降低≥70点)
                               患者数(％)
2周                19(30)       31(46)        36(55)        22(43)
    P值                         0.081         0.004         0.136
4周                18(29)       32(47)        41(62)        27(53)
    P值                         0.029         ＜0.001       0.006
6周                24(38)       40(59)        47(71)        29(57)
    P值                         0.022         ＜0.001       0.039
8周                22(35)       38(56)        44(67)        28(55)
    P值                         0.018         ＜0.001       0.028
12周               27(43)       34(50)        40(61)        33(65)
    P值                         0.503         0.033         0.018
粗体表示在与安慰剂比较时具有统计学意义的结果。
表6.自基线平均CDAI评分降低程度
时间点               安慰剂        3+0MG/KG        3+3MG/KG       6+6MG/KG
                     (N＝63)       那他珠单抗      那他珠单抗     那他珠单抗
                                   (N＝68)        (N＝66)         (N＝51)
                  自基线CDAI评分的平均降低程度(SD)
2周                  39.3(73.5)    63.5(74.8)      80.0(68.9)     60.5(68.3)
相对于安慰剂的P值                  0.061           0.001          0.103
4周                  37.3(88.8)    79.9(89.5)      100.7(76.4)    84.2(90.5)
相对于安慰剂的P值                  0.004           ＜0.001        0.003
6周                  49.3(97.8)    81.5(86.1)      119.4(79.1)    97.2(94)
相对于安慰剂的P值                  0.042           ＜0.001        0.004
8周                  49.7(99.5)    82.4(87.2)      117.8(90.7)    106.9(102.9)
相对于安慰剂的P值                  0.053           ＜0.001        0.001
12周                 63.1(103.9)   70.1(91.7)      119.2(111)     112.5(96.4)
相对于安慰剂的P值                  0.729           0.001          0.008
定义偏离基线的降低(0周-n周)
SD＝标准偏差
粗体表示在与安慰剂比较时具有统计学意义的结果。
首次治疗后4周，并且在患者接受第2次治疗之前，所有3个那他珠单抗组与安慰剂组中的患者相比具有统计学上明显更高的缓解(表5和图7)。然而，在6周时，预定初级终点，即临床缓解的患者的比例，只有3+3mg/kg那他珠单抗组与安慰剂组相比在统计学意义上增高。8周时，接受2次那他珠单抗输注(3或6mg/kg)的两组被证实与安慰剂组相比具有统计学意义的更高的缓解。12周时，3+3mg/kg那他珠单抗组继续被证实在临床缓解上比安慰剂具有统计学意义的效益，同时6+6mg/kg组的结果证实与安慰剂相比强烈倾向有益。
缓解或反应的预示
利用6周时的结果，进行分析来确定可能预示缓解或临床反应的基线变量。检测的变量包括疾病的位置、疾病的持续时间、基线CDAI评分、口服甾族化合物的并行使用、硫唑嘌呤或6-巯基嘌呤的并行使用和肠外症状。基线CDAI评分是缓解的重要预示(P＜0.001)；具有较高基线CDAI的患者似乎不易达到缓解。然而，基线CDAI不能预示反应的可能性。所有其他分析的变量不是缓解或反应的有效预示。
生活质量
与安慰剂相比，可以在全部那他珠单抗治疗组中在6周时观察到平均IBDQ评分的统计学意义的改进。12周时，只有接受2次那他珠单抗输注的治疗组继续具有明显高于安慰剂组的IBDQ评分(表7)。
表7：平均IBDQ评分
时间点   安慰剂          3+0MG/KG        3+3MG/KG        6+6MG/KG
         (N＝63)         那他珠单抗      那他珠单抗      那他珠单抗
                         (N＝68)         (N＝66)         (N＝51)
                IBDQ评分，平均(范围)
0周      130(66-192)     130(52-188)     136(79-194)     123(55-194)
6周      142(61-219)     157(81-221)     163(99-211)     155(67-224)
    P值                  0.008           ＜0.001         ＜0.001
12周     145(61-217)     151(81-221)     163(86-221)     153(64-215)
    P值                  0.486           0.021           0.014
粗体表示当与各治疗基线相比时IBDQ评分的改进。
C-反应性蛋白
具有基线高血清C-反应性蛋白水平的患者在试验期间接受对这些水平的评价。接受2次那他珠单抗输注的患者在C-反应性蛋白的平均血清水平上与安慰剂组中的患者自基线明显下降(图8)。接受2次输注3mg/kg那他珠单抗的患者保持12周这样的改善作用。
安全性和耐受性
所有剂量水平的那他珠单抗治疗在整个12周的研究期间可以被良好耐受。各组中接近数量的患者由于副作用中止研究(即，安慰剂组中2人，3mg/kg那他珠单抗组中1人，3+3mg/kg那他珠单抗组中2人，和6+6mg/kg那他珠单抗组中3人)。总之，在主要研究期中31名患者报告了严重副作用(即，安慰剂组中9人，3mg/kg那他珠单抗组中8人，3+3mg/kg那他珠单抗组中8人，和6+6mg/kg那他珠单抗组中6人)。研究的药物被评价为没有严重副作用并无一致命；大多数住院是由于与CD有关的并发症或症状。遭受治疗导致的副作用的患者的数量在不同的处理组之间接近：安慰剂组中52(83％)，3mg/kg那他珠单抗组中51(78％)，3+3mg/kg那他珠单抗组中57(88％)，和6+6mg/kg那他珠单抗组中41(80％)。表8显示副作用与CD无关，该副作用在那他珠单抗组中发生率比安慰剂组高至少5％。这些不同类型的副作用无一与安慰剂组具有统计学意义的差异，并且无一被认为对患有中度至重度CD的患者使用那他珠单抗造成不可接受的安全性能。
表8：与克罗恩氏病无关的副作用，发生率比安慰剂和其他关注事件高＞5％
优选项                    安慰剂    3+0         3+3       6+6
                          N＝63(％) N＝65       N＝65     N＝51
胸痛                      0(0)      2(3)        2(3)      4(8)
结膜炎                    0(0)      2(3)        5(8)      0(0)
头晕                      0(0)      6(9)        3(5)      0(0)
发热                      1(2)      4(6)        3(5)      4(8)
流感症状                  6(10)     9(14)       7(11)     10(20)
头痛                      20(32)    19(29)      27(42)    14(27)
疼痛                      4(6)      4(6)        4(6)      11(22)
鼻窦炎                    0(0)      0(0)        0(0)      3(6)
其他作用：
输注反应*                 0(0)      0(0)        1(2)      1(2)
与抗那他珠单抗            0(0)      8(13)       4(6)      1(2)
*导致输注中断或停止。
在12周时检测到13名那他珠单抗治疗患者(7％)中的抗-那他珠单抗抗体。总之，具有可检测到的抗-那他珠单抗抗体的患者与没有可检测到抗-那他珠单抗抗体的患者相比似乎更加不易发生副作用或严重副作用。
2名患者出现输液反应；在这两人中，在二次输注时出现副作用。3+3mg/kg那他珠单抗组中的1名患者出现轻度瘙痒和红斑的症状，并且随后发现对抗-那他珠单抗抗体呈阳性。6+6mg/kg那他珠单抗组中的1名患者出现轻度瘙痒和咳嗽的症状。这些症状可不治而愈，并且随后发现患者对可检测到的抗-那他珠单抗抗体呈阴性。
虽然只有3+3mg/kg那他珠单抗组的预定初级功效终点(临床缓解定义为在6周时CDAI＜150)在统计学意义上优于安慰剂，从3+3mg/kg组的4个时间点(4，6，8，和12周)和6+6mg/kg组的2个时间点(4和8周，在12周具有有益的倾向)观察到该结果明显优于安慰剂。与所有3个那他珠单抗组在4、6和8周时间点和接受2次那他珠单抗输注的两个治疗组在12周的时间点时经历临床反应(定义为CDAI偏离基线减小至少70个点)的患者比例明显优于安慰剂组这一发现相结合，这些数据为那他珠单抗在中度至重度活动性CD中具有功效提供强有力的证据。此外，那他珠单抗基于改善CDAI对临床反应和缓解率的有益作用是通过IBDQ测定的健康相关性QOL的明显改善，和血清C反应性蛋白的改进来确定的，血清C反应性蛋白是一种用来定量一般性炎症的急性期反应物。
CD试验中受体饱和的剂量水平相当于MS试验的剂量，因此受体饱和水平应当与CD试验中的相当。CD试验中受体饱和水平与降低了的炎症水平有关，这通过C-反应性蛋白水平可以证实，并且与由CDAI证实的患者总体健康改善有关。
所有那他珠单抗治疗组没有严重安全性问题。出现可检测到的抗-那他珠单抗抗体的患者的百分比低，严重副作用与可检测的抗-那他珠单抗抗体无关。
本研究为那他珠单抗的α-4整联蛋白拮抗作用在活动性轻度至重度CD的临床征兆和症状的治疗中具有有效性和耐受性提供了强有力的证据。此外，这些数据表明α-4整联蛋白拮抗作用是治疗CD的有效机理的证据提供了如下可能性，也就是这种药征可以更广泛地用于治疗慢性自身免疫性和炎性疾病。
实施例3
那他珠单抗对活动性炎性肠病中的循环性活化白细胞的作用
白细胞亚组的通行是炎性肠病(IBD)的致病机理。由于α-4整联蛋白是白血病迁移穿过血管内皮的关键介质，它们在除嗜中性白细胞之外的所有白血病上表达，单剂量3mg/kg那他珠单抗(Antegren)输注对活动性炎性肠病患者(IBD)中基础循环性白细胞亚组、天然杀伤(NK)细胞和活化T细胞产生作用。先前也证明，单剂量3mg/kg输注的那他珠单抗使动物和健康志愿者中循环性外周血白细胞持续增加(″A six-month weekly intravenous toxicity study withAntegrenTM in cynomolgous monkeys with a six-week recovery″Athena Report 1998，No.723-013-098)。然而，人们不了解那他珠单抗是否对白细胞亚组具有差异性的作用，已知除嗜中性白细胞之外的白细胞都表达α-4整联蛋白。
方法  将由30名克罗恩氏病(CD；18名接受那他珠单抗，12名接受安慰剂)和10名溃疡性结肠炎(UC；全部接受那他珠单抗-无安慰剂)的患者在输注之前、输注后1-、2-、4-、8-和12-周时的外周血提取的白细胞通过荧光激活细胞分选仪(FACS)进行分析。测定各时间点的血清那他珠单抗水平和疾病活动性评分。
分别通过Wilcoxon和Spearman试验测定与基线相比的显著变化(p＜0.05)和相关性。分析白细胞亚组变化的Wilcoxon确定的等级试验与治疗组中的基线比较(p＜0.05代表显著性)。Spearman等级相关性试验用于评价接受那他珠单抗的那些患者中的疾病活动性参数、那他珠单抗水平和白细胞亚组的之间相关性。
那他珠单抗/安慰剂输注之前并且输注之后1、2、4、8和12周时即时采集静脉血。LymphoprepTM方法(Nycomed，Denmark)用于在用多色荧光激活细胞分选仪(FACS；Becton Dickenson，Oxford，UK))结合Consort 30软件(Amlot等，1996 Clin.Exp.Immunol.105：176-82)分析之前分离外周血淋巴细胞(PBLs)。利用FACS分析法测定PBL表达下列标记的百分比：CD19(B细胞)，TCRαβ(T细胞)，CD3(pan-T细胞)，TCRγδ(T细胞)，CD4(辅助/Th-1 T细胞)，CD8(细胞毒/抑制T细胞)和CD16(NK细胞)。
除了原初(CD45RA)和记忆(CD45RO)T细胞亚组和″NK-T细胞″(CD57+/CD3+)外，还测定细胞表达活化抗原CD38，CD25(白介素-2受体的α链)，CD26，CD69和HLA-DR的TCRαβ的百分率。另外测定表达活化抗原CD28和HLA-DR的细胞毒/抑制T细胞(CD8+)的百分率。
结果.嗜曙红细胞，单核细胞，B和T细胞数量在那他珠单抗给药≥1周后均明显升高。总的淋巴细胞数，包括B和T细胞两者的数量，与基线水平相比也明显增高。嗜中性白细胞和嗜碱细胞数没有改变。表达激活标记CD25，CD26，HLA-DR，CD8DR，CD8，CD28，CD45RO和CD45RA的T细胞对于UC和CD患者来说分别在≥4和1周时与基线相比明显升高。CD38+和CD69+T细胞只在UC患者中在≥1周时升高。所有患者中的NK细胞在输注后没有变化但NK型T细胞(CD57+)只在CD患者在1周时升高。发现γ-δ(γδ)T细胞在CD/UC患者中没有明显变化。T细胞亚组的变化与疾病活动性或血清那他珠单抗水平无关。那他珠单抗给药后发现的白细胞变化在安慰剂组中没有检测到。
淋巴细胞数在输注后4周时在克罗恩氏病患者(p＝0.002)和溃疡性结肠炎患者(p＝0.02)中保持升高状态，在第8周恢复到治疗前的值(Gordon等，2002 Aliment.Pharm.& Ther.16：699-706；和Gordon等，2001 Gastroenterology 121：268-74)。
那他珠单抗对循环性嗜曙红细胞和单核细胞的作用如图9A和9B所示。在所有研究的患者组中发现嗜中性白细胞和嗜碱细胞数目保持不变。图10和11证实那他珠单抗给药在克罗恩氏病和溃疡性结肠炎患者中对特定循环性T细胞亚组和天然杀伤细胞的作用。偏差条代表各图表的标准偏差。
在安慰剂输注之后检测发现基础(basic)白细胞亚组没有变化。安慰剂组对11名安慰剂患者的给药如表9。只在克罗恩氏病患者中在孤立时间点检测到表达活化抗原的淋巴细胞有某些变化(表10)。
表9：安慰剂治疗的克罗恩氏病患者中的白细胞亚组
亚组细胞×106/mL     0周平均    SD     1周平均   SD     2周平均   SD     4周平均   SD     8周平均   SD
淋巴细胞嗜中性白细胞嗜曙红细胞嗜碱细胞单核细胞 .60    .33.21    .75.19    .16.19    .30.60    .33 .55    .36.18    .48.17    .13.14    .09.55    .36 .82    .67.86    .36.15    .13.09    .07.82    .67 .48    .29.61    .26.20    .12.09    .03.48    .29 .51    .31.91    .15.14    .10.08    .05.51    .31
表9安慰剂给药后的平均(SD)白细胞亚组值；在任何组中与基线(0周)相比没有明显差异。
表10：安慰剂治疗的克罗恩氏病患者中的T细胞和NK标记
亚组细胞×106/mL     0周平均   SD     1周平均   SD     2周平均   SD     4周平均   SD     8周平均   SD     12周平均   SD
淋巴细胞TCRαβ+CD25+CD26+CD45RA+CD45RO+CD38+CD69+HLA-DR+CD8+CD8+CD28+CD8+DR+CD57+CD3+CD16+CD3-TCRγδ+κMAb+ .36    .57.99    .53.18    .11.49    .32.74    .41.42    .20.42    .29.14    .20.19    .10.11    .09.21    .11.11    .09.08    .06.11    .09.11    .16.02    .02 .12    .57.81    .56.12    .07.38    .27.57    .39.31    .18.31    .23.67    .71.15    .08.09    .06.16    .11.09    .06.06    .05.12    .09.08    .09.03    .05 .83    .08.28    .88.27    .22.80    .61.95    .69.50    .27.46    .38.13    .12.25    .20.16    .15.30    .20.16    .15.10    .10.16    .18.18    .28.05    .08 .34    .98.98    .84.17    .17.54    .49.68    .59.39    .24.35    .27.05    .04.16    .11.09    .07.22    .21.09    .07.07    .04.09    .04.10    .13.07    .09 .28    .74.95    .79.18    .15.54    .55.68    .57.42    .35.33    .25.12    .22.17    .10.08    .05.20    .18.08    .05.07    .05.12    .12.09    .09.03    .04 .62    .SD.17    .81.22    .17.58    .43.84    .56.50    .33.40    .25.10    .08.22    .16.12    .11.23    .14.12    .11.10    .15.17    .19.11    .10.10    .01
表10.柱表示克罗恩氏病研究安慰剂患者的T细胞亚组和NK型细胞与基线值相比的平均计数(SD)(Wilcoxon确定的分级试验；p＜0.05)。粗体表示与基线相比具有显著性差异。斜体数字表示各平均值的标准偏差。
克罗恩氏病或溃疡性结肠炎患者中在总淋巴细胞计数和疾病活动性评分之间没有明显的相关性(表11和12)，在各淋巴细胞亚组与疾病活动性之间也没有发现任何显著的相关性。在血清那他珠单抗水平与白细胞亚组在输注后1、2或4周时的变化之间没有检测到明显的相关性。在8周时几乎在所有患者中都无法检测到那他珠单抗。因此无法计算出该时间点的相关性。
表11：淋巴细胞亚组与疾病活动性比较的SPEARMAN R值
 亚组     克罗恩氏病     溃疡性结肠炎
    1周     2周     4周     1周     2周     4周
 淋巴细胞     0.16     -0.37     -0.01     -0.63     -0.19     0.03
 TCRαβ     0.26     -0.29     0.05     -0.59     -0.39     0
 CD25     0.44     0.07     0.13     -0.39     -0.46     0.17
 CD26     0.31     -0.22     -0.11     -0.39     -0.29     0.10
 CD45RA     0.29     -0.25     0.19     -0.54     -0.39     0.51
 CD45RO     0.32     -0.27     0.34     0.18     -0.17     -0.05
 CD38     0.31     -0.08     0.01     -0.57     0.03     -0.05
 CD69     -0.32     0.12     0.12     -0.15     0.28     0.12
 HLA-DR     0.19     -0.05     -0.01     0.12     -0.13     0.15
 CD8CD28     0.01     -0.17     -0.13     -0.18     -0.04     -0.17
 CD8DR     0.11     -0.19     -0.18     -0.1     0.07     0.24
 CD57     0.19     -0.08     -0.04     0.21     -0.15     0.15
 CD16     -0.08     -0.3     -0.15     -0.19     0.1     -0.32
 TCRγδ     0.34     0.14     -0.31     -0.63     -0.47     -0.66
 κMab     -0.11     -0.02     -0.2     0.05     -0.27     0.19
表11.淋巴细胞亚组计数和CDAI(克罗恩氏病患者)或Powell-Tuck评分(溃疡性结肠炎)之间没有发现明显的相关性。
表12：淋巴细胞亚组与血清那他珠单抗比较的SPEARMAN R值
 亚组     克罗恩氏病     溃疡性结肠炎
    1周     2周     4周     1周     2周     4周
 淋巴细胞     0.03     0.49     0.64     0.1     -0.02     0.18
 TCRαβ     -0.11     0.35     0.51     -0.04     0.28     -0.11
 CD25     -0.09     0.03     0.26     0.25     -0.07     -0.25
 CD26     -0.07     0.28     0.61     0.20     0.22     -0.14
 CD45RA     0.19     0.29     0.62     -0.12     -0.25     -0.32
 CD45RO     -0.16     0.32     0.34     0.37     0.08     0.39
 CD38     0.06     0.18     -0.34     -0.01     -0.45     -0.43
 CD69     0.02     0.26     0.57     0.2     -0.22     0.14
 HLA-DR     0.05     0.13     -0.25     0.08     0.27     -0.07
 CD8CD28     -0.18     0.16     0.41     0.25     0.07     0.32
 CD8DR     0.4     0.16     0.004     0.08     0.3     -0.18
 CD57     0.1     -0.06     -0.31     -0.08     0.03     0
 CD16     0.22     0.19     -0.5     0.13     0.37     0.25
 TCRγδ     0.002     -0.16     -0.2     0.21     0.61     0.6
 κMAb     -0.07     -0.27     0.29     0.41     0.45     -0.41
表12.在疾病活动性和淋巴细胞亚组之间没有明显的相关性，除了在4周时的总淋巴细胞计数之外(p＝0.04)。
基于上述数据，单剂量3mg/kg那他珠单抗输注在患有活动性IBD的患者中使大多数、但不是全部的白细胞亚组的循环水平增高。大多数患者中循环性嗜曙红细胞、单核细胞和淋巴细胞计数在输注后至少4周内明显高于基线。大量的循环性T细胞亚组明显高于治疗之前的值，特别是表达活化抗原的那些。然而，NK细胞计数(CD16+/CD3-)不受那他珠单抗的影响，并且CD57+T细胞受到那他珠单抗的影响程度大大低于其他T细胞亚组。表达γδT细胞受体的淋巴细胞也不受那他珠单抗的影响，揭示了α-4整联蛋白要么没有表达，要么以较低水平在这些细胞上表达。
因此，在活动性IBD患者中，那他珠单抗可以限制通行量且在循环中保持多种白细胞和活化淋巴细胞亚组。NK细胞、γδ细胞、嗜中性白细胞和嗜碱细胞似乎不受那他珠单抗给药的影响，这可以揭示它们在这些细胞种类的通行中是不重要的介质。
虽然本发明参照其具体实施方式进行描述，但所属领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的实质和范围下可以有许多不同的变化并且等同方案可以相互替代。此外，为了适应具体情况、材料、物质的组合、方法、加工步骤可以对本发明的目的、实质和范围进行改进。这些改进方案全部属于本发明的范围内。
美国临时申请60/360,134和60/374,501分别提交于2002年2月25日和2002年4月23日，其全文在此引入作为参考。其中引用的参考文献在此全文引入作为参考。

Claims (58)

1.一种长时间减轻患者病理性炎症的方法，包括对该患者长时间给药治疗有效量的抑制α-4整联蛋白或抑制含α-4整联蛋白的二聚体的药物。
2.权利要求1的方法，其中所述的长时间给药为期至少6个月。
3.权利要求2的方法，其中所述的长时间给药为期至少12个月。
4.权利要求1的方法，其中药物以用以结合α-4整联蛋白或含有α-4整联蛋白的二聚体的方式反复给药，并且其中所述的给药使α-4整联蛋白受体饱和度保持在足以长期抑制患者病理性炎症的水平。
5.权利要求4的方法，其中将所述药物反复对患者给药以便使患者中的α-4整联蛋白受体饱和度为约至少65％-约100％。
6.权利要求5的方法，其中该饱和度为至少75％。
7.权利要求5的方法，其中该饱和度为至少80％。
8.权利要求1或4的任一项的方法，其中该药物结合α-4整联蛋白二聚体。
9.权利要求1或4的任一项的方法，其中该药物是单克隆抗体或其免疫活性片段。
10.权利要求9的方法，其中该单克隆抗体为那他珠单抗。
11.权利要求1的方法，其中该α-4整联蛋白二聚体为α-4β-1。
12.权利要求4的方法，其中该药物以足以使至少一种α-4整联蛋白二聚体受体饱和由此抑制病理性炎症的量给药。
13.权利要求12的方法，其中该二聚体受体为α-4β-1或α-4β-7，并且所述病理性炎症由多发性硬化症引起。
14.权利要求12的方法，其中该二聚体受体是α-4β-1或α-4β-7，并且该病理性炎症由胃肠道的炎性疾病引起。
15.权利要求14的方法，其中该胃肠道的炎性疾病是克罗恩氏病，溃疡性结肠炎或炎性肠病。
16.权利要求1-11任一项的方法，其中该病理性炎症由胃肠道的炎性疾病引起。
17.权利要求16的方法，其中该胃肠道的炎性疾病为克罗恩氏病，溃疡性结肠炎，或炎性肠病。
18.权利要求1-11的任一项的方法，其中该病理性炎症由多发性硬化症引起。
19.一种测定长时间给药方案在治疗对象病理性炎症中的功效的方法，其中该病理性炎症是由α-4整联蛋白调节的，该方法包括测定α-4整联蛋白或含有α-4整联蛋白的二聚体的饱和度。
20.权利要求19的方法，其中该α-4整联蛋白二聚体是α-4β-1或α-4β-7。
21.权利要求19的方法，其中该病理性炎症是由克罗恩氏病引起，并且以患者中C-反应性蛋白和/或CDAI度量测定α-4整联蛋白的饱和度。
22.权利要求19的方法，其中该病理性炎症由多发性硬化症引起。
23.权利要求1的方法，其中该病理性炎症是胃肠道的炎性疾病并且该方法包括对需要的患者长时间给药足以治疗或减轻患者胃肠道的炎性疾病的治疗有效剂量的那他珠单抗或其免疫活性片段。
24.权利要求23的方法，其中该胃肠道的疾病为炎性肠病，克罗恩氏病或溃疡性结肠炎。
25.权利要求23或24的任一项的方法，其中那他珠单抗通过在至少6个月内每4周以约1mg/kg患者-约20mg/kg患者的量输注来进行给药。
26.权利要求25的方法，其中该输注给药至少12个月。
27.权利要求1的方法，其中该病理性炎症为多发性硬化症并且该方法包括对需要的患者长时间给药足以减轻多发性硬化症症状的治疗有效剂量的那他珠单抗或其免疫活性片段。
28.权利要求27的方法，其中那他珠单抗通过在至少6个月内每4周以约1mg/kg患者-约20mg/kg患者的量输注来进行给药。
29.权利要求28的方法，其中该输注给药至少12个月。
30.一种长时间治疗患者病理性炎症的组合物，该组合物含有足以减轻所述患者病理性炎症症状的量的药物。
31.权利要求30的组合物，其中该药物抑制α-4整联蛋白活性和/或α-4整联蛋白二聚体的活性。
32.权利要求30或31任一项的组合物，其中该组合物进一步含有稳定剂、载体和/或赋形剂。
33.权利要求30或31任一项的组合物，其中该药物为那他珠单抗。
34.权利要求33的组合物，其中那他珠单抗配制为用于在至少6个月内每4周给药约1mg/kg患者-约20mg/kg患者的量静脉内输注。
35.权利要求33的组合物，其中该病理性炎症由多发性硬化症引起。
36.权利要求33的组合物，其中该病理性炎症由胃肠道的炎性疾病引起。
37.权利要求36的组合物，其中该胃肠道的炎性疾病为克罗恩氏病，溃疡性结肠炎或炎性肠病。
38.一种长期治疗患者病理性炎症的联合治疗，其中该联合治疗包括使用权利要求30-33任一项的组合物和缓解所述病理性炎症的化合物。
39.权利要求38的联合治疗，其中该病理性炎症由胃肠道的炎性疾病引起。
40.权利要求39的联合治疗，其中该胃肠道的炎性疾病为溃疡性结肠炎，炎性肠病或克罗恩氏病，并且该化合物为5-氨基水杨酸盐，糖皮质激素，硫鸟嘌呤衍生物，甲氨蝶呤，环孢菌素，结合TNF的单克隆抗体，或抗生素。
41.权利要求38的联合治疗，其中该病理性炎症由多发性硬化症引起。
42.α-4整联蛋白抑制剂在制备用于长时间治疗患者病理性炎症的药物中的用途。
43.权利要求42的α-4整联蛋白抑制剂的用途，其中该病理性病症由多发性硬化症引起。
44.权利要求42的α-4整联蛋白抑制剂的用途，其中该病理性病症由胃肠道的炎性疾病引起。
45.权利要求44的α-4整联蛋白抑制剂的用途，其中该α-4整联蛋白抑制剂为那他珠单抗，并且胃肠道的炎性疾病为克罗恩氏病，炎性肠病或溃疡性结肠炎。
46.权利要求42的α-4整联蛋白抑制剂的用途，其中该药物配制为使α-4整联蛋白受体饱和在对患者给药时足以抑制病理性炎症的水平。
47.权利要求46的α-4整联蛋白抑制剂的用途，其中该药物对患者给药时提供约至少65％-约100％的α-4整联蛋白受体饱和度。
48.权利要求47的α-4整联蛋白抑制剂的用途，其中该饱和度为至少75％。
49.权利要求47的α-4整联蛋白抑制剂的用途，其中该饱和度为至少80％。
50.权利要求42-47任一项的α-4整联蛋白抑制剂的用途，其中该抑制剂结合α-4整联蛋白二聚体。
51.权利要求42-47任一项的α-4整联蛋白抑制剂的用途，其中该抑制剂为单克隆抗体。
52.权利要求51的α-4整联蛋白抑制剂的用途，其中该单克隆抗体为那他珠单抗或其免疫活性片段。
53.权利要求50的α-4整联蛋白抑制剂的用途，其中该抑制剂结合α-4β-1。
54.权利要求42的α-4整联蛋白抑制剂的用途，其中该药物以足够饱和一种或多种二聚体受体由此抑制病理性炎症的量给药。
55.权利要求44的α-4整联蛋白抑制剂的用途，其中该药物进一步含有减轻胃肠道的炎性疾病的化合物。
56.权利要求55的α-4整联蛋白抑制剂的用途，其中该化合物为5-氨基水杨酸盐，糖皮质激素，硫鸟嘌呤衍生物，甲氨蝶呤，环孢菌素，结合TNF的单克隆抗体，抗生素，止痛剂，止泻剂，或抗胆碱能剂。
57.权利要求42-56任一项的α-4整联蛋白抑制剂的用途，其中该抑制剂为那他珠单抗并被配制为用于对所述患者在至少6个月内每4周静脉内输注约1mg/kg患者-约20mg/kg患者的量。
58.权利要求57的α-4整联蛋白抑制剂的用途，其中该抑制剂配制为用于在至少12个月内静脉内输注给患者。
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