NO336235B1 - Anvendelse av et middel som inhiberer alfa-4-integrin eller en dimer som omfatter alfa-4-integrinen i fremstillingen av et medikament for vedvarende anvendelse ved terapeutisk behandling av patologisk inflammasjon forårsaket av multippel sklerose eller en inflammatorisk sykdom i magetarmkanalen. - Google Patents

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse gjelder anvendelse av det monoklonale antistoffet natalizumab eller et immunologisk aktivt fragment derav som inhiberer alfa-4-integrin eller en dimer som omfatter alfa-4-integrinen i fremstillingen av et medikament for anvendelse ved terapeutisk behandling av patologisk inflammasjon forårsaket av multippel sklerose eller en inflammatorisk sykdom i magetarmkanalen hvor den omfatter administrering av middelet til pasienten annenhver uke eller månedlig over et tidsrom på minst 6 måneder.

Oppfinnelsens bakgrunn

Inflammasjon er en respons i vaskulariserte vev på infeksjon eller skade og oppstår ved adhesjon av leukocytter til endotelcellene i blodkar og infiltrasjon av dem inn i de omliggende vev. Ved normal inflammasjon frigir de infiltrerende leukocyttene toksiske mediatorer for å drepe invaderende organismer, de fagocyttiserer cellerester og døde celler og spilleren rolle i vevsreparasjon og i immunresponsen. Ved patologisk inflammasjon er imidlertid de infiltrerende leukocyttene overresponderende og kan forårsake alvorlig eller dødelig skade. Se foreksempel Hickey, Psychoneuroimmunology II (Academic Press 1990).

Integrinene er en familie av glykoproteiner på celleoverflaten som deltar i celle-adhesjon, immuncellemigrasjonen og immuncelleaktivering. Alfa-4-integrin uttrykkes på alle leukocytter i sirkulasjonen, bortsett fra neutrofile celler og danner heterodimere reseptorer sammen med enten beta 1- eller beta 7-integrinsubenheten; både alfa-4-beta-l(a4|31)- og alfa-4-beta-7(a-4 beta-7)-dimeren spiller en rolle for migrasjon av leuko-cytter gjennom det vaskulære endotel (Springer et al., 1994 Cell 76: 301-14, og Butcher et al., 1996 Science 272: 60-6) og bidrar til celleaktivering og celleoverlevelse i parenkym (Damle et al., 1993 J. Immunol. 151: 2368-79, Koopman et al., 1994 J. immunol. 152: 3760-7, og Leussink et al., 2002 Acta Neuropathol. 103: 13-136).

Nærmere bestemt bindes alfa-4-beta-l (også betegnet som svært sent antigen-4 [VLA-4]) til vaskulaturcelle-adhesjonsmolekyl-1 (VCAM-l)(Lobb et al., 1994 J. Clin. Invest. 94:1722-8), som uttrykkes av det vaskulære endotel i mange seter for kronisk inflammasjon (Bevilacqua et al., 1993 Annu. Rev. Immunol. 11: 767-804, og Postigo et al., 1993 Res. Immunol. 144: 723-35). Alfa-4-beta-7-dimeren interagerer med mykosal addressin-celle-adhesjonsmolekyl (MAdCAM-1), og formidler målstyring av lymfocytter til tarmen (Farstad et al., 1997 Am. J. Pathol. 150: 187-99, og Issekutz et al., 1991 J. Immunol. 147: 4178-84). Ekspresjonen av MAdCAM-1 på det vaskulære endotel er også forhøyet i inflammasjonsseter

i mage-tarmkanalen hos pasienter med inflammatorisk tarmsykdom (IBD) (Briskin et al., 1997 Am. J. Pathol. 151: 97-110).

Adhesjonsmolekyler som alfa-4-integrinene er mulige mål for terapeutiske midler. For eksempel er VLA-4-reseptoren, i hvilken alfa-4-integrin er en subenhet, et viktig mål grunnet reseptorens interaksjon med en ligand som foreligger på endotelceller i hjerne. Sykdommer og tilstander som skyldes hjerneinflammasjon, har spesielt alvorlige følger. I et annet eksempel er alfa-4-beta-7-integrindimeren et viktig mål på grunn av at den deltar i målstyring av lymfocytter og patologisk inflammasjon i mage-tarmkanalen.

Alfa-4-beta-l-integrin uttrykkes på den ekstracellulære overflate av aktiverte lymfocytter og monocytter, som har blitt implisert i patogenesen av akutte inflammato-riske hjernelesjoner og nedbryting av blod-hjernebarrieren (BBB) forbundet med multippel sklerose (MS) (Coles et al., 1999 Ann. Neural, 46(3): 296-304). Midler mot alfa-4-integrin har blitt analysert for antiinflammatorisk potensiale, både in vitro og in vivo i dyremodeller. Se Yednock et al., 1992 Nature 356: 63-66, US patentskrift nr. 5 840 299, tildelt Bendig et al. 24. november 1998, og US patentskrift nr. 6 001 809, tildelt Thorsett et al. 14 desember 1999. In wfro-eksperimentene viser at alfa-4-integrin-antistoffer blokkerer binding av lymfocytter til endotelceller i hjernen. Eksperimenter som analyserte virkningen av alfa-4-integrinantistoffer på dyr med en kunstig indusert tilstand som ligner på multippel sklerose, eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE), har vist at tilførsel av anti-alfa-4-integrin-antistoffer forhindrer inflammasjon i hjernen og påfølgende paralyse av dyrene. Sett samlet viser disse eksperimentene at anti-alfa-4-integrinantistoffer er potensielt anvendbare terapeutiske midler for behandling av multip-pel sklerose og andre inflammasjons-sykdommer og -forstyrrelser.

Et annet eksempel på patologisk inflammasjon som omfatter alfa-4-integriner, Crohns sykdom (CD), er en kronisk, uhelbredelig, tilbakevendende og transmural inflammasjon i mage-tarmkanalen. Sykdommen særpreges ved uønsket migrasjon av immunceller og en aktivering i tarmslimhinnene som omfatter T-celler, makrofager og neutrofile celler (Schreiber et al., 1991 Gastroenterology 101:1020-30). Medisinske behandlingsformer i første linje for Crohns sykdom omfatter 5-aminosalicylater (5-ASA), som har lav effektivitet, og kortikosteroider, som har forskjellige kortvarige og langvarige bivirkninger (Munkholm et al., 1994 Gut 35: 360-2). Pasienter som ikke responderer på disse foretrukne behandlingsformene, behandles med immunsupprimerende midler som azatioprin, 6-merkaptopurin og metotrexat, men disse midlene har en virkning som begynner sent, og har muligens alvorlige bivirkninger (Stein et al., Surg. Clin. North Am. 81: 71-101, viii). I senere tid har biologiske midler med hurtigere virkning blitt innført for anvendelse ved behandling av Crohns sykdom, men slike midler lider på tilsvarende måter av faktorer som redusert virkning etter lengre tids behandling, og bivirkninger.

Tubridy N. et al. Neurology. 1999, Vol. 53, No. 3, side 466-472 beskriver hvordan intravenøs injeksjon av natalizumab kan anvendes for å behandle pasienter med MS. Artikkelen viserat korttids behandling med natalizumab fører til signifikant reduksjon av antall nye lesjoner målt ved MRI. US 5,840,299A omtaler anvendelse av humaniserte antistoffer som binder spesifikt til en alfa-4 subenhet for behandling av MS.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende beskrivelse tilveiebringer fremgangsmåter for kronisk reduksjon av patologisk inflammasjon i en pasient ved vedvarende tilførsel av et middel som selektivt bindes til alfa-4-integrin. Det kroniske doseringsregime for et alfa-4-middel er utformet slik at (1) middelet spesifikt bindes til alfa-4-integrin eller en integrindimer som omfatter alfa-4-integrin, og (2) middelet tilføres gjentatte ganger for å holde alfa-4-integrinresep-toren mettet i et nivå som er tilstrekkelig til å undertrykke patologisk inflammasjon. Midlet ifølge beskrivelsen kan være anvendbar for suppresjon av inflammasjon ved at det bindes til og inhiberer alle integrindimerer som omfatter alfa-4-subenheten, eller det kan være utformet slik at det bindes til en spesifikk dimer, f.eks. alfa-4-beta-l.

Foreliggende oppfinnelse kjennetegnes ved at den angir anvendelse av et middel hvor middelet er det monoklonale antistoffet natalizu-mab eller et immunologisk aktivt fragment derav som inhiberer alfa-4-integrin eller en dimer som omfatter alfa-4-integrinen i fremstillingen av et medikament for anvendelse ved terapeutisk behandling av patologisk inflammasjon forårsaket av multippel sklerose eller en inflammatorisk sykdom i magetarmkanalen hvor den omfatter administrering av middelet til pasienten annenhver uke eller månedlig over et tidsrom på minst 6 måneder.

I én utførelse kan effekten av et vedvarende doseringsregime bestemmes ved å måle graden av metting av en spesifikk integrindimer. I et spesielt eksempel antas det at alfa-4-beta-l-integrindimeren er innblandet i multippel sklerose, og således kan metningsnivået som er nødvendig for effektivt vedvarende tilførselsregime, måles ved å måle graden av metning av alfa-4-beta-l-dimerreseptoren.

I en annen utførelse, hvor flere integrindimerer antas å delta i en patologisk inflammasjon, kan metning av en kombinasjon av dimerreseptorer måles for å bestemme effekten av et vedvarende tilførselsregime. I et spesifikt eksempel antas både alfa-4-beta-l-og alfa-4-beta-7-dimeren å delta i den patologiske inflammasjon som er forbundet med inflammatorisk tarmsykdom. Således kan måling av metningsnivået for både alfa-4-beta-l og alfa-4-beta-7 være gunstig for å bestemme effekten av et gitt vedvarende tilførsels-regime.

I én utførelse kan suksessen av et vedvarende doseringsregime bestemmes ved å vurdere en fysiologisk markør for den patologiske inflammasjonen. I f.eks. et vedvarende doseringsregime som tilføres ved MS, kan suksessen av doseringsregimet bekreftes ved å påvise nivået av hjernelesjoner ved anvendelse av en bildeanalyseteknikk, f.eks. bildedannelse ved magnetisk resonans (MRI). I et annet eksempel, ved et vedvarende doseringsregime tilført for CD, kan suksessen av doseringsregimet bekreftes ved å bestemme nivået av C-reaktivt protein i serum hos en pasient. I nok et eksempel kan suksessen av doseringsregimet bestemmes ved å anvende en utvalgt gruppe av kriterier forbundet med helsetilstanden, f.eks. reduksjon av CDAI hos en CD-pasient.

En annen utførelse omfatter behandling av en inflammasjons-sykdom i mage-tarmkanalen (f.eks. Crohns sykdom, ulcerøs kolitt og inflammatorisk tarmsykdom) hos et individ som omfatter tilførsel av en terapeutisk effektiv mengde av et preparat som omfatter natalizumab i en mengde som er tilstrekkelig til å behandle eller lindre inflammasjonssykdommen i individets mage-tarmkanal.

I en spesifikk utførelse omtaler beskrivelsen et doseringsregime hvor gjentatt tilførsel av et middel gis for å oppnå et metningsnivå for alfa-4-integrinreseptoren på 65-100 % i en pasient, hvorved det oppnås vedvarende suppresjon av patologisk inflammasjon i pasienten. I en annen spesifikk utførelse tilføres midlet gjentatte ganger for å oppnå et nivå på minst tilnærmet 75-100 % i en pasient. I nok en spesifikk utførelse tilføres midlet gjentatte ganger for å oppnå et metningsnivå på minst tilnærmet 80-100 % i en pasient.

En egenskap ved oppfinnelsen er at uønskede virkninger av patologisk inflammasjon kan undertrykkes over lang tid i en pasient, f.eks. over et tidsrom på 6 måneder, ett år, to år eller mer.

En side ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er at et tilstrekkelig nivå av et anti-alfa-4-integrinmiddel tilføres over lengre tidsrom for å undertrykke patologisk inflammasjon gjennom disse tidsrommene.

En egenskap ved oppfinnelsen er at doseringsformen gir lavere nivåer av patologisk inflammasjon over lengre tidsrom, sammenlignet med en enkelt dose.

En fordel ved oppfinnelsen er at midlene som anvendes i fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen, tåles godt og har lav toksisitet.

Disse og andre formål, fordeler og egenskaper ved oppfinnelsen vil bli åpenbare for fagfolk ved gjennomlesning av detaljene i fremgangsmåtene og preparatene, som beskrevet i mer detalj nedenunder.

Kort beskrivelse av figurene

Fig. 1 er en kurve som viser det kumulative gjennomsnittlige antall nye Gd-frem-ende lesjoner hos MS-pasienter etter tilførsel av natalizumab. Fig. 2 viser prosentandelen av aktive scan i hvert tidspunkt under natalizumab-MS-undersøkelsen. Aktive scan er scan som inneholder én eller flere nye Gd-fremmende lesjoner. Fig. 3A-C og 4A-C viser serumkonsentrasjonen av natalizumab etter doseringsregimet på forskjellige tidspunkter i en MS-undersøkelse. Fig. 3A-C viser nivået for undersøkelsen med 3 mg/kg, Fig. 4A-C viser nivået for undersøkelsen med 6 mg/kg. Fig. 5A-F viser reseptormetningsnivået som oppnås i MS-undersøkelsen. De viste nivåer er prosentverdier. Fig. 6 og 7 viser prosentandelen av pasienter som oppnår på forhånd definerte kriterier for klinisk respons (fig. 6), eller remisjon (fig. 7) etter doseringen i CD-under-søkelsen. Fig. 8 viser gjennomsnittlige endringer i nivået av C-reaktivt protein i serum hos en undergruppe av pasienter med forhøyet nivå av C-reaktivt protein ved begynnelsen av CD- undersøkelsen. Begynnelsesverdiene var (i mg/l): Placebo: 38,44 (N=26), gruppen med 3+0 mg/kg: 32,35 (N=38), gruppen med 3+3 mg/kg: 41,16 (N=33) og gruppen med 6+6 mg/kg: 333 (N=26). Fig. 9A-B viser virkningen av natalizumab på eosinofile celler i sirkulasjonen hos pasienter med aktiv Crohns sykdom (CD) henholdsvis ulcerøs kolitt (UC). Fig. 9A viser at natalizumab i signifikant grad forhøyet antall eosinofile celler i sirkulasjonen hos pasienter med Crohns sykdom (n=18) og ulcerøs kolitt (n=12) etter infusjon av 3 mg/kg natalizumab. Fig. 9B viser at tilførsel av natalizumab i signifikant grad forhøyet antall monocytter hos pasienter med aktiv Crohns sykdom og ulcerøs kolitt etter infusjon av 3 mg/kg natalizumab. Fig. 10A-D viser virkningen av natalizumab-tilførsel på TCRa(3+-celler som uttrykker aktiveringsantigen. Felt A viser virkningen av natalizumab hos pasienter med aktiv Crohns sykdom, dvs. en signifikant økning av TCRap<+->celler som uttrykker CD26, HLA-DR, CD8CR og CD8CD28 frem til minst fire uker etter fusjon av 3 mg/kg natalizumab. Felt B viser virkningen av natalizumab på TCRa(3+-celler som uttrykker aktiveringsantigener hos pasienter med aktivert ulcerøs kolitt, dvs. en signifikant økning av TCRap<+->celler som utrykker CD26, HLA-DR, CD8DR og CD8CD28 frem til minst fire uker etter infusjon av 3 mg/kg natalizumab. Felt C viser virkningen av natalizumab-tilførsel på TCRap<+->celler som uttykker aktiveringsantigener og hukommelsesmarkører og naive markører hos pasienter med aktiv Crohns sykdom, dvs. en signifikant økning av hukommelses(CD45RO)- og naive(CD45RA) TCRap<+->celler frem til minst fire uker etter infusjon av natalizumab. Felt B viser virkningen av natalizumab på TCRap<+->celler som uttrykker aktiveringsantigener, hukommelsesmarkører og naive markører hos pasienter med aktiv ulcerøs kolitt, dvs. en signifikant økning av hukommelses(CD45RO)-, naive-(CD45RA)-, CD69- og CD38-TCRap<+->celler én uke etter tilførsel av natalizumab. Fig. 11 A-B viser virkningen av natalizumab på TCRap<+->celler og NK-type-celler i sirkulasjonen hos pasienter med aktiv Crohns sykdom, hhv. ulcerøs kolitt.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Dersom et område for verdier gis, bør det forstås at hver mellomliggende verdi, til en tidel av enheten for den nedre grense, med mindre sammenhengen tydelig tilsier annet, mellom den øvre og nedre grense i området og enhver annen angitt eller mellomliggende verdi i det angitte område omfattes av oppfinnelsen. Den øvre og nedre grense for disse mindre områdene kan uavhengig av hverandre inngå i det mindre, og omfattes av hver spesifikt utelukket grenseverdi i det angitte område. Dersom det angitte område omfatter den ene eller begge grenseverdiene, omfattes områder som utelukker enten begge eller en av grenseverdiene, også av oppfinnelsen.

Dersom de ikke er definert på annen måte, har alle tekniske og vitenskapelige begreper som anvendes her, den samme betydning som vanligvis forstått av en gjennom-snittsfagperson innen faget som foreliggende oppfinnelse tilhører. Selv om enhver frem gangsmåte og ethvert materiale som ligner eller er ekvivalent med de som beskrives her, også kan anvendes ved utførelse eller analyse av foreliggende oppfinnelse, beskrives nå de foretrukne fremgangsmåter og materialer.

Det må bemerkes at som anvendt her, omfatter entallsformene "en", "og" og "den" henvisning til flere objekter med mindre sammenhengen klart sier noe annet. Således omfatter f.eks. henvisning til "et antistoff" et flertall av slike antistoffer, og henvisning til "dosen" omfatter henvisning til én eller flere doser eller ekvivalenter derav som er kjent blant fagfolk, osv.

Publikasjonene som diskuteres her, nevnes kun på grunn av deres beskrivelse før innleveringsdatoen for foreliggende patentsøknad.

Definisjoner

Begrepet "anti-alfa-4-middel" som anvendt her, viser til ethvert middel som bindes spesifikt til et integrin, som omfatter en alfa-4-subenhet og inhiberer integrinets aktivitet. Dette omfatter midler som spesifikt bindes til alfa-4-integrinet, så vel som midler som bindes til en integrindimer, som omfatter alfa-4-integrinet, f.eks. alfa-4-beta-l (a4pi) eller alfa-4-beta-7 (a4p7). Begrepet "midler" er ment å omfatte syntetiske og rekombinante molekyler (f.eks. antistoffer, små molekyler, peptider eller andre syntetisk fremstilte molekyler eller forbindelser, så vel som rekombinant fremstilte genprodukter), så vel som naturlig forekommende forbindelser (f.eks. polypeptider, antistoffer og lignende).

Begrepet "effekten" som anvendt her i forbindelse med et vedvarende doserings-skjema, viser til effektiviteten av et gitt behandlingsskjema. Effekten kan måles basert på endringer i sykdommens forløp som respons på et middel ifølge foreliggende oppfinnelse. Ved f.eks. behandling av MS kan effekten måles ved hyppigheten av tilbakefall i MS med gjentatte tilbakefall og bedringer, og ved nærvær eller fravær av nye lesjoner i sentralnervesystemet, påvist ved anvendelse av fremgangsmåter som MRI.

Begrepet "suksess" som anvendt her i forbindelse med vedvarende behandlings-regimer, viser til effektiviteten av et gitt behandlingsregime. Begrepet omfatter en balanse mellom effektivitet, toksisitet (f.eks. bivirkninger og pasientens toleranse overfor en utforming eller doseringsenhet), pasientens etterlevelse av behandlingsregimet og lignende. For at et vedvarende tilførselsregime skal anses som "vellykket", må det balansere forskjellige sider ved pasientbehandling og virkning for å gi det mest fordelaktige resultat for pasienten.

Begrepene "spesifikt bindes" eller "bindes spesifikt", som anvendt her, viser til den situasjon hvor et medlem av et spesifikt bindingspar ikke vil vise signifikant binding til andre molekyler enn sin spesifikke bindingspartner (f.eks. en affinitet på tilnærmet 1000 x eller høyere for bindingspartneren). I foreliggende oppfinnelse vil anti-alfa-4-integrinmidlet ikke vise signifikant binding til andre polypeptider enn et alfa-4-integrin eller en reseptor som omfatter et alfa-4-integrin. For eksempel sies antistoffer som anvendes i fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen, som bindes til et alfa-4-integrin med en bindingsaffinitet på IO<7>mol/l eller høyere, fortrinnsvis IO<8>mol/liter eller mer, og bindes spesifikt til et alfa-4-integrin.

Begrepet "i det vesentlige homolog", som anvendt her, er ment å bety ethvert polypeptid som har en endring i sekvensen, slik at en funksjonelt ekvivalent aminosyre erstatter én eller flere aminosyrer i polypeptidet, slik at det gis en endring som har ingen eller relativt liten virkning på polypeptidets bindingsegenskaper. Foreksempel kan én eller flere aminosyrerester i sekvensen være erstattet med en annen aminosyre med tilsvarende polaritet.

Begrepene "utløser en immunrespons" og "utløser en vertsimmunrespons" som anvendt her, viser til dannelsen av en immunologisk respons mot en reseptor som omfatter et alfa-4-integrin i et individ etter innføring av et middel ifølge oppfinnelsen, til individet. En immunrespons i individet kan værekarakterisert veden serumreaktivitet mot en alfa-4-integrinreseptor som er minst to ganger høyere enn i et ubehandlet individ, mer foretrukket tre ganger høyere enn reaktiviteten i et ubehandlet individ, og enda mer foretrukket, minst fire ganger høyere enn reaktiviteten i et ubehandlet individ, hvor serumimmunreaktiviteten måles ved anvendelse av en serumfortynning på tilnærmet 1:100.

Begrepet "eksipiensmateriale" er ment å omfatte enhver forbindelse som utgjør en del av preparatet som kun er ment å fungere som en bærer, dvs. ikke ment å ha biologisk aktivitet i seg selv.

Begrepet "adjuvans" som anvendt her, viser til et tilsetningsstoff til et preparat som forsterker immunresponsen overfor et middel ifølge oppfinnelsen, men som ikke i seg selv vil utløse en immunrespons. Adjuvanser kan forsterke immunresponsen ved anvendelse av en rekke biologiske mekanismer, innbefattet lymfocyttrekruttering, T-cellestimulering, B-cellestimulering og makrofagstimulering.

Begrepene "behandle" og "behandling" og lignende anvendes her for generelt å betegne fremskaffelsen av en ønsket farmakologisk eller fysiologisk effekt. Effekten kan være profylaktisk når det gjelder å forebygge eller delvis forebygge en sykdom, et symptom eller en tilstand, og/eller være terapeutisk når det gjelder en delvis eller fullstendig kurering av en sykdom, en tilstand, et symptom eller en uønsket virkning som skyldes sykdommen. Begrepet "behandling" som anvendt her, dekker enhver behandling av en sykdom i et pattedyr, fortrinnsvis et menneske, og omfatter: (a) å forhindre at sykdommen opptrer i et individ som kan være predisponert for sykdommen, men som ennå ikke har blitt diagnostisert til å ha den, (b) å inhibere sykdommen, dvs. å stanse sykdomsutviklingen, eller (c) å lindre sykdommen, dvs. å gi regresjon av sykdommen og/eller dens symptomer eller tilstander. Oppfinnelsen er rettet mot fremstilling av et medikament for behandling av en pasient som lider av en sykdom forbundet med patologisk inflammasjon. Foreliggende oppfinnelse inngår i forebyggelse, inhibering eller lindring av skadelige virkninger som skyldes patologisk inflammasjon over lengre tidsrom, og/eller som skyldes de fysiologiske responser på uønsket inflammasjon som foreligger i et biologisk system over lengre tidsrom.

Begrepet "patologisk inflammasjon" som anvendt her, viser til en uønsket og kronisk inflammasjon forbundet med forstyrrelser som omfatter astma, aterosklerose, AIDS, dementia, diabetes, inflammatorisk tarmsykdom, reumatoid artritt, transplantatrejeksjon, "graft versus host"-sykdom, multippel sklerose (fortrinnsvis for å inhibere ytterligere demyelinering), tumormetastase, nefritt, atopisk dermatitt, psoriasis, myokardiskemi, kronisk prostatitt, komplikasjoner fra sigdcelleanemi, lupus erytematosus og akutt leukocyttformidlet lungeskade. Slik inflammasjon særpreges ved en forhøyet respons av inflammatoriske celler, innbefattet infiltrerende leukocytter. Med tiden fører slik patologisk inflammasjon ofte til skader på vevet i området for den uønskede inflammasjon.

"Antegren" er ment å omfatte antistoffet som også betegnes AN 100226 (antistoff kode nr.) eller natalizumab (USAN-navn). "Antegren" er et rekombinant, humanisert anti-alfa-4-integrinantistoff. Sykdommen eller tilstanden som behandles i pattedyret, er fortrinnsvis en sykdom som moduleres når en terapeutisk effektiv dose av "Antegren" tilføres.

Generelle sider ved oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse er basert på det overraskende resultat at vedvarende tilførsel av en nyutviklet klasse av nye forbindelser som betegnes selektive adhesjonsmolekyl-inhibitorer (SAMI), er tilstrekkelig til å gi opprettholdelse av vedvarende inflammasjonsundertrykkelse i sykdommer som omfatter integrindimerer. Dersom det gjentatte doseringsregime avbrytes, reverseres undertrykkelsen av inflammasjonen (se f.eks. fig. 2). Tidligere behandlinger med inflammasjonsinhibitorer har nærmet seg doserings-regimene på en helt forskjellig måte, i den tro at tilførsel av en inflammasjonsinhibitor vil forårsake en reaksjon fra kroppens eget responssystem, noe som i sin tur vil føre til at inflammasjonen gjenkjennes som patologisk og en resulterende, vedvarende lindring av den patologiske inflammasjon. Hva oppfinnerne har vist her, erat et vedvarende doseringsregime ikke bare er mer effektivt enn et korttids-doseringsregime, men at det faktisk er nødvendig for å opprettholde undertrykkelsen av den patologiske inflammasjon. For å realisere noen av de viktigere fordeler ved oppfinnelsen, må således nivået av et anti-alfa-4-inte-grinmiddel opprettholdes over en rekke måneder eller til og med o

ar.

Foreliggende oppfinnelse bygger på resultatene fra en stor, randomisert, placebo-kontrollert undersøkelse av et anti-alfa-4-integrinantistoff, natalizumab, i pasienter med tilbakevendende MS eller med moderat til svært aktiv CD. Natalizumab er et rekombinant, humanisert monoklonalt antistoff som er en antagonist av alfa-4-integrin. Resultater fra disse to undersøkelsene har vist at behandling med natalizumab forbedret sykdomstegn og symptomer hos pasienter med MS og CD. Oppfinnelsen er også ment å omfatte andre kimære antistoffer, innbefattet "primatiserte" antistoffer.

Generelt sett omfatter fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ingen spesiell tilførselsmåte, siden tilførselsmåten avhenger av formen av det aktive middel og preparatet som er utviklet for tilførsel av det eller de aktive midlene. De spesifikke eksemplene som beskrives her, ble imidlertid fremskaffet ved anvendelse av parenteral tilførsel av natalizumab. Selv om foreliggende oppfinnelse beskrives ved anvendelse av et antistoff som spesifikt bindes til alfa-4-integrin, er den også ment å omfatte vedvarende tilførsel av f.eks. bivalente eller multivalente antistoffer som gjenkjenner begge partnere i en integrindimer, forutsatt at dimeren omfatter et alfa-4-integrin.

Det generelle begrep ifølge oppfinnelsen gjelder tilførsel av relativt konstante mengder av et aktivt middel til en pasients sirkulatoriske system over et tidsrom på måneder eller år. Denne vedvarende tilførsel av et middel som selektivt bindes til alfa-4-integrin eller en dimer som omfatter alfa-4-integrin, fører til en undertrykkelse av patologisk inflammasjon som opprettholdes i et konstant nivå over et tidsrom. Ved å opprettholde det terapeutiske nivå av et aktivt middel over et tidsrom, kan den patologiske inflammasjon vedvarende undertrykkes hos pasienten.

I en svært spesifikk betydning omtaler beskrivelsen erholdelse og opprettholdelse av et reseptormetningsnivå for en dimer som omfatter alfa-4-integrin i en menneskelig pasient, i et område på mellom tilnærmet 65 % og tilnærmet 100 %, mer foretrukket mellom tilnærmet 75 % og tilnærmet 100 % og ytterligere mer foretrukket mellom tilnærmet 80 % og tilnærmet 100 %. Disse reseptormetningsnivåene opprettholdes ved disse nivåer vedvarende (f.eks. over et tidsrom på 6 måneder eller lignende) for å oppnå fortsatt undertrykkelse av den patologiske inflammasjon.

Midler som selektivt bindes til alfa-4-integriner

Forskjellige typer av midler med evnen til å bindes til og inhibere alfa-4-integrinaktivitet, kan anvendes ved utførelse av oppfinnelsen. Mange slike midler har blitt påvist ogkarakterisert, og spesifikke midler beskrives nedenunder. Ut fra foreliggende beskrivelses lære ligger det godt innenfor kunnskapsområdet til en fagperson å påvise andre midler som kan inhibere de alfa-4-holdige integrindimerene på en måte som biologisk sett etterligner eller tilsvarer de spesifikt beskrevne midler.

Antistoffer

I en spesifikk utførelse er midlene ifølge beskrivelsen antistoffer eller immunologisk aktive fragmenter derav som selektivt bindes til et alfa-4-integrin, eller en dimer som omfatter alfa-4, f.eks. alfa-4-beta-l eller alfa-4-beta-7.

Dersom midlet er et antistoff, foretrekkes et monoklonalt antistoff. I motsetning til preparater av polyklonalt antistoff, som typisk omfatter forskjellige antistoffer rettet mot forskjellige epitoper, er hvert monoklonale antistoff rettet mot én enkelt epitop på antigenet. En andre fordel med monoklonale antistoffer er at de fremstilles ved midler som ikke er forurenset med andre immunglobuliner, f.eks. ved bakteriofagfremvisning eller isolering fra en hybridom. Selv om foreliggende beskrivelse omfatter både polyklonale og monoklonale antistoffer som midler, foretrekkes monoklonale antistoffer, siden disse er svært spesifikke, og oppfinnelsen diskuteres således hovedsakelig når det gjelder monoklonale antistoffer.

I tillegg kan andre antistoffer påvises ved anvendelse av teknikker som er tilgjengelige innen faget. Foreksempel kan monoklonale antistoffer fremstilles ved anvendelse av bakteriofagfremvisningsteknologi. Antistoff-fragmenter som selektivt bindes til et alfa-4-integrin eller en dimer som omfatter et alfa-4-integrin, isoleres så. Eksempler på foretrukne fremgangsmåter for fremstilling av slike antistoffer ved hjelp av bakteriofagfremvisning, beskrives i US patentskrift nr. 6 225 447, 6 180 336, 6 172 197, 6 140 471, 5 969 108, 5 885 793, 5 872 215, 5 871 907, 5 858 657, 5 837 742, 5 733 743 og 5 565 332.

Monoklonale antistoffer kan også fremstilles ved anvendelse av konvensjonelle hybridomfremgangsmåter. Disse fremgangsmåtene har blitt bredt anvendt for fremstilling av hybridcellelinjer som utskiller monoklonale antistoffer mot mange spesifikke antigener i høyt nivå, og de kan også anvendes for fremstilling monoklonale antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse. For eksempel kan mus (f.eks. Balb/c-mus) immuniseres med en antigenisk alfa-4-integrinepitop ved intraperitoneal injeksjon. Etter et tidsrom som er tilstrekkelig til at en immunrespons har blitt oppnådd, avlives musene, og miltcellene erholdes og fusjoneres med myelomceller ved anvendelse av teknikker som er velkjente innen faget. De resulterende fusjonerte cellene, hybridomer, dyrkes så i et selektivt medium, og de over-levende celler dyrkes i et tilsvarende medium ved anvendelse avgrensefortynnings-betingelser. Etter kloning og rekloning, kan det isoleres hybridomer som utskiller antistoffer (f.eks. av IgG-eller IgM-klasse eller IgGl-underklasse), som selektivt bindes til målet, alfa-4-integrin eller en dimer som omfatter et alfa-4-integrin. For fremstilling av midler som spesifikt er beregnet for human anvendelse, kan det isolerte monoklonale antistoff så anvendes for fremstilling av kimære og humaniserte antistoffer.

Antistoffer ifølge beskrivelsen omfatter polyklonale, monoklonale, multispesifikke, humane, humaniserte og kimære antistoffer, énkjedede antistoffer (f.eks. scFv), Fab-fragmenter, F(ab')-fragmenter, fragmenter fremstilt fra et Fab-ekspresjonsbibliotek, antiidiotypiske (anti-Id) antistoffer (innbefattet f.eks. anti-Id-antistoffer mot antistoffer ifølge oppfinnelsen) og epitopbindende fragmenter fra alle de ovenfor nevnte. Mest foretrukket er antistoffene humane antigenbindende antistoffragmenter ifølge foreliggende oppfinnelse og omfatter Fab, Fab' og F(ab')2, Fd, enkeltkjedede Fv (scFv), enkeltkjedede antistoffer, disulfidsammenkoblede Fv(sdFv), og fragmenter som omfatter enten et VL- eller VH-domene. Antigenbindende antistoffragmenter, innbefattet enkeltkjedede antistoffer, kan omfatte det eller de variable områder alene eller i kombinasjon med hele eller en del av følgende: hengselområdet, CHl-domenet, CH2-domenet og CH3-domenet. Også omfattet av oppfinnelsen er antigenbindende fragmenter som kan omfatte enhver kombinasjon av variable områder med et hengselområde, CHl-domenet, CH2-domenet og CH3-domenet. Antistoffene kan ha opphav i ethvert dyr, innbefattet fugler og pattedyr. Antistoffene er fortrinnsvis fra menneske, mus (f.eks. mus og rotte), esel, sau, ape, kanin, geit, marsvin, gris, kamel, hest eller høns (eller andre fugler). Som anvendt her omfatter "humane" antistoffer antistoffer med aminosyresekvensen til et humant immunglobulin og omfatter antistoffer som er isolert fra humane immunglobulinbiblioteker eller fra dyr som er transgene for ett eller flere humane immunglobuliner og som ikke uttrykker endogene immunglobuliner, som beskrevet nedenfor og foreksempel i U.S. patentskrift nr. 5939598, tilhørende Kucherlapati et al.

Kimære og humaniserte antistoffer kan fremstilles fra ikke-humane antistoffer og kan ha den samme eller tilsvarende bindingsaffinitet som antistoffet som de er fremstilt fra. Teknikker for fremstilling av kimære antistoffer (Morrison et al., 1984 Proe. Natl.Acad. Sei. 81: 6851; Neuberger et al., 1984 Nature 312: 604; Takeda et al., 1985 Nature 314; 452) omfatter spleising av genene fra f.eks. et antistoffmolekyl fra mus med egnet antigenspesifisitet til gener fra et humant antistoffmolekyl med egnet biologisk aktivitet, slike antistoffer ligger innenfor foreliggende oppfinnelses område. Foreksempel kan en nukleinsyre som koder for et variabelt område (V)-område fra et monoklonalt museantistoff kobles til en nukleinsyre som koder for et humant konstant område (C)- område, f.eks. IgGl eller IgG4. Det resulterende antistoff er således en artshybrid som generelt har det antigenbindende domene fra det ikke-humane antistoff og C-domenet eller efffektordomenet fra et humant antistoff eller et primatantistoff.

Humaniserte antistoffer er antistoffer med variable områder som primært er fra et humant antistoff (dvs. akseptorantistoffet), men som har komplementaritetsbestemmende områder som i det vesentlige er fra et ikke-humant antistoff (donorantistoffet). Se f.eks. Queen et al., Proe. Nat'l Acad. Sei USA 86: 10029-10033 (1989); WO 90/07861, U.S. patentskrift nr. 6054297, 5693761, 5585089, 5530101 og 5224539. Det konstante område eller de konstante områdene i disse antistoffene er generelt også fra et humant antistoff. De humane variable domenene er typisk utvalgt fra humane antistoffer med sekvenser som viser høy homologi med de ønskede bindingsdomener fra de ikke-humane variable områder. De variable aminosyrerestene i tung- og lettkjeden kan være avledet fra samme antistoff eller et annet humant antistoff. I tillegg kan sekvensene være utvalgt som konsensus-sekvenser for flere humane antistoffer, for eksempel som beskrevet i WO 92/22653.

Et "primatisert antistoff" er et rekombinant antistoff som omfatter variable sekvenser eller antigenbindende deler fra primater og konstant domene-sekvenser fra menneske. Se Newman, Biotechnology, 1992, 10: 1455-60. Primatisering av antistoffer fører til dannelse av antistoffer som inneholder variable domener fra ape og konstante sekvenser fra menneske. For mer detalj, se U.S. patentskrift nr. 6113898. Denne teknikken modifiserer antistoffer slik at de ikke avvises ved tilførsel til mennesker grunnet sin antigenisitet. Denne teknikken bygger på immunisering av cynomolgusaper med humane antigener eller reseptorer. Denne teknikken ble utviklet for frembringelse av monoklonale antistoffer med høy affinitet rettet mot humane celleoverflateantigener.

Spesifikke aminosyrer i det humane variable område utvelges for substitusjon basert på utledet konformasjon og antigenbindende egenskaper. Dette kan bestemmes ved anvendelse av teknikker som datamaskinassistert modellering, forutsigelse av adferd og bindingsegenskapene til aminosyrer i visse posisjoner i det variable område, og observasjon av virkningene av substitusjoner. Dersom for eksempel en aminosyre er forskjellig mellom et ikke-menneskelig variabelt område og et variabelt område fra et menneske kan det variable område fra menneske endres slik at det gjenspeiler aminosyresammensetningen til det ikke-humane variable område.

I en spesifikk utførelse er antistoffene som anvendes i det vedvarende doseringsregime ifølge foreliggende oppfinnelse humaniserte antistoffer som beskrevet i U. S. patentskrift nr. 5840299.

I en annen utførelse kan transgene mus som inneholder humane antistoffgener immuniseres med en antigenisk alfa-4-integrinstruktur, og hybridomteknologi kan anvendes for frembringelse av humane antistoffer som selektivt bindes til alfa-4-integrin.

Kimære, humane og/eller humaniserte antistoffer kan fremstilles ved anvendelse av rekombinant ekspresjon, f.eks. ekspresjon i humane hybridomer (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, s. 77 (1985)), i myelomceller eller i Kinahamster-ovarieceller (CHO-celler). Alternativt kan antistoff kodende sekvenser innføres i transgener for innføring i genomet til et transgent dyr og påfølgende ekspresjon i melken fra det transgene dyr. Se f.eks. U.S. patentskrifter nr. 6197946, 5849992, 5565362, 5336894 og 5304489. Egnede transgener omfatter transgener som har en promoter og/eller enhancer fra et brystkjertelspesifikt gen, for eksempel kasein eller (Haktoglobulin.

Små molekyler

Små molekyler for anvendelse ifølge foreliggende beskrivelse omfatter en rekke kjemiske klasser, selv om de typisk er organiske molekyler, fortrinnsvis små organiske molekyler med en molekylvekt som er høyere enn 50 og lavere enn tilnærmet 4000 Dalton. Kandidatmidler omfatter funksjonelle grupper som er nødvendige for strukturell interaksjon med proteiner, fortrinnsvis hydrogenbinding, og omfatter typisk minst én aminogruppe, karbonylgruppe, hydroksylgruppe eller karboksylgruppe, fortrinnsvis minst to funksjonelle kjemiske grupper. Kandidatmidlene omfatter ofte sykliske karbonstrukturer eller heterosykliske strukturer og/eller aromatiske eller polyaromatiske strukturer som er substituert med én eller flere av de ovenfor nevnte funksjonelle grupper. Kandidatmidler finnes også blant biomolekyler, innbefattet, men ikke begrenset til, peptider, sakkarider, fettsyrer, steroider, puriner, pyrimidiner og derivater, strukturanaloger eller kombinasjoner av disse.

De små molekylene kan fremskaffes fra et bredt utvalg av kilder, innbefattet biblioteker over syntetiske eller naturlige forbindelser. For eksempel er en rekke midler tilgjengelige for tilfeldig og styrt syntese av et bredt utvalg av organiske forbindelser og biomolekyler, innbefattet ekspresjon av randomiserte oligonukleotider og oligopeptider. Alternativt er biblioteker over naturlige forbindelser i form av bakterieekstrakter, soppekstrakter, planteekstrakter eller dyreekstrakter tilgjengelige, eller de kan lett fremstilles. I tillegg kan naturlige eller syntetisk fremstilte biblioteker og forbindelser lett modifiseres ved konvensjonelle kjemiske, fysiske og biokjemiske midler og kan anvendes for fremstilling av kombinatoriske biblioteker. Kjente farmakologiske midler kan utsettes for styrte eller tilfeldige kjemiske modifiseringer, foreksempel asylering, alkylering, forestring, amidering osv. for fremstilling av strukturanaloger.

Anti- alfa- 4- inteqrinpeptider

Fremgangsmåtene ifølge beskrivelsen kan utføres med ethvert peptid som kan bindes til et alfa-4-integrin eller en dimer som omfatter en alfa-4-subenhet. Innbefattet i fremgangsmåtene ifølge beskrivelsen er peptider som i det vesentlige er homologe med et område i den ekstracellulære matriks eller en naturlig ligand for den eller de alfa-4-integrinreseptorene som behandlingen er rettet mot. Foreksempel for vedvarende inhibering av alfa-4-beta-l-reseptoren kan det benyttes peptider som omfatter i det minste en del av IHCS-området i fibronektin (f.eks. peptider som omfatter i det minste en del av CS-1-peptidsekvensen eller en sekvens som i det vesentlige er homolog med CS-l-sekvensen) for binding til en reseptor og inhibering av aktiviteten av det alfa-4-omfattende integrin. Se for eksempel USSN 08/452098.

Midler som utløser en immunrespons

I en spesifikk utførelse er midlene ifølge beskrivelsen peptider eller peptidetterlignende forbindelser som omfatter et immunogent fragment av et alfa-4-integrin. Et immunogent fragment er ethvert fragment som omfatter en alfa-4-epitop og har generelt minst 3, 5, 7, 10, 15, 17 eller 20 på hverandre følgende aminosyrer fra et naturlig forekommende alfa-4-protein fra et pattedyr. Peptidsekvensen for både humant alfa-4 og alfa-4 fra mus er tilgjengelig fra GenBank (aksesjonsbetegnelser AA59613 og NP.034706). En fagperson kan lett utforme et peptidmiddel ifølge beskrivelsen basert på aminosyresekvensen til alfa-4 eller ved anvendelse av villtypenukleotidene som koder for alfa-4 (f.eks. GenBank aksesjonsbetegnelse L12002 henholdsvis NM.01056). Når først et egnet peptid er blitt utformet kan det i utgangspunktet analyseres mot antistoffer som vites å ha den ønskede immunogene aktivitet, f.eks. antistoffer som selektivt bindes til en alfa-4-struktur og som særpreges ved evnen til å inhibere aktiviteten av et integrin som omfatter alfa-4.

Det immunogene fragment kan også være utformet slik at det har aminosyre-analoger eller andre strukturelementer som vil forsterke den immunogene respons. Nærmere bestemt kan peptidfragmenter ha endrede C- eller N-terminale ender som forsterker den totale immunogenisitet av molekylene samtidig som evnen til å utløse en immunrespons ikke svekkes. Eksempler på slike analoger omfatter, men er ikke begrenset til: alfa, alfa-disubstituerte aminosyrer, N-alkylaminosyrer, melkesyre, 4-hydroksyprolin, gamma-karboksyglutamat, gamma-N,N,N-trimetyllysin, gamma-N-acetyllysin, O-fosfoserin, N-acetylserin, N-formylmetionon, 3-metylhistidin, og 5-hydroksylysin. Andre anvendbare analoger kan finnes i Sigma, Biochemicals and Reagents, Sigma-Aldrich (2001). Fragmentet kan også være påvisbart merket for å tillate at molekylet følges i et individ etter tilførsel til individet.

Peptider, analoge strukturer, peptidetterlignende forbindelser og lignende kan isoleres fra naturlige kilder og så om ønskelig etterbehandles (f.eks. ved peptidkløyving) eller alternativt syntetiseres ved konvensjonelle teknikker som er kjente innen faget, for eksempel fast fase-syntese eller rekombinant ekspresjon. Se f.eks. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, New York, 2. utgave 1989). Automatisk peptidsyntese kan utføres ved anvendelse av et kommersielt tilgjengelig apparat fra produsenter som Applied Biosystems (Foster City, California), og fremgangsmåtene for å utføre dette er veletablerte. Rekombinant fremstilling av proteinene kan skje i prokaryote, for eksempel i bakteriofag eller bakterieceller, eller eukaryote systemer, for eksempel gjærceller, insektceller eller pattedyrceller. Alternativt kan proteiner fremstilles ved anvendelse av cellefrie in wtro-systemer som er kjente innen faget.

I et annet eksempel kan bakteriofag baserte peptidfremvisningsbiblioteker anvendes for ekspresjon av et stort antall peptider som kan analyseres in vitro for påvisning av peptider som spesifikt bindes til alfa-4 eller en dimer som omfatter et alfa-4-integrin. Bakteriofagfremvisningsteknologi byr på et middel for ekspresjon av en bredt sammensatt populasjon av tilfeldig eller selektivt randomiserte peptider. Forskjellige fremgangsmåter for bakteriofagfremvisning og fremgangsmåter for fremstilling av bredt sammensatte populasjoner av peptider er velkjente innen faget. For eksempel beskriver Ladner et al. (U.S. patentskrift nr. 5223409), fremgangsmåter for fremstilling av sammensatte populasjoner av bindingsdomener på overflaten av en bakteriofag. Ladner et al. beskriver bakteriofag-vektorer som er anvendbare for fremstilling av et bakteriofagfremvisningsbibliotek, så vel som fremgangsmåter for seleksjon av mulige bindingsdomener og fremstilling av tilfeldig eller selektivt muterte bindingsdomener. Gjennomsøking av et bakteriofagfremvisningsbibliotek omfatter generelt in wfro-sikting av biblioteket ved anvendelse av et renset målmolekyl. Bakteriofag som bindes til målmolekylet kan gjenvinnes, enkeltvise bakteriofager kan klones og peptidet som uttrykkes av en klonet bakteriofag identifiseres.

På tilsvarende måte beskriver Smith og Scott (Meth. Enzymol. 217: 228-257 (1993) og Science 249: 386-390 (1990)) fremgangsmåter for fremstilling av peptidfremvisningsbiblioteker i bakteriofager, innbefattet vektorer og fremgangsmåter for diversifisering av den uttrykte peptidpopulasjon (se også Huse, WO 91/07141 og WO 91/07149). Bakteriofagfremvisningsteknologi kan være spesielt kraftfull når den for eksempel anvendes med en kodonbasert mutagenesefremgangsmåte som kan anvendes for fremstilling av tilfeldige peptider eller en ansamling av peptider som er skjevfordelt på ønsket måte (se f.eks. U.S. patentskrift nr. 5264563). Disse og andre velkjente fremgangsmåter kan anvendes for fremstilling av et bakteriofagfremvisningsbibliotek som kan utsettes for in wVo-gjennomsøkingsfremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for påvisning av et peptid som styres til ett eller noen få utvalgte organer.

Molekylene i et bakteriofagbasert peptidfremvisningsbibliotek kan også foreligge som konjugater, noe som kan forenkle gjenvinning eller identifisering av peptidet av interesse. Som anvendt her betyr begrepet "konjugat" et peptid eller en peptidetterlignende forbindelse i biblioteket som er koblet til en fysisk, kjemisk eller biologisk gruppe, for eksempel, men ikke begrenset til, et fast støttemiddel, en mikrokule av plast, et oligonukleotid, en bakteriofag eller lignende. Gruppen kan utgjøre et middel for identifisering eller gjenvinning av et middel.

Noen midler som anvendes for utløsning av en immunrespons etterligner en epitop som er egnet for induksjon av en immunrespons mot alfa-4-integrin, men er for små til å være immunogene i seg selv. I denne situasjon kan et peptidmiddel kobles til et egnet bærestoff for å lette utløsningen aven immunrespons. Egnede bærere omfatter serumalbuminer, albueskjell-hemocyanin (KLH), immunglobulinmolekyler, tyroglobulin, ovalbumin, tetanustoksoid eller et toksoid fra en annen patogen bakterie, for eksempel difteri, E. coli, kolera eller H. pylori, eller et svekket toksinderivat. Andre bærere omfatter T-celleepitoper som bindes til flere MHC-alleler, f.eks. minst 75 % av alle humane MHC-alleler. Slike bærere betegnes av og til innen faget som "universelle T-celleepitoper". Eksempler på universelle T-celleepitoper omfatter:

Andre bærere for stimulering eller forsterking av en immunrespons omfatter cytokiner som IL-1, IL-1 a- og p-peptider, IL-2, y-INF, IL-10, GM-CSF, og kjemokiner som makrofaginflammatorisk protein (MlP)la og p og RANTES (dvs. regulering etter aktivering, normal T-celle-ekspresjon og -sekresjon). Immunogene midler kan også kobles til peptider som fremmer transporten gjennom vev, som beskrevet i WO 97/17613 og WO 97/17614.

Immunogene midler kan kobles til bærere ved kjemisk kryssbinding. Teknikker for kobling av et middel til en bærer omfatter dannelse av disulfidbroer ved anvendelse av N-suksinimidyl-3-(2-pyridyl-tio)propionat (SPDP) og suksinimidyl 4-(N-maleimidometyl)sykloheksan-l-karboksylat (SMCC) (dersom peptidet mangler en sulfhydrylgruppe kan denne tilveiebringes ved innføring av en cysteinrest). Disse reagensene danner en disulfidbinding mellom seg selv og en peptincysteinrest som foreligger i ett protein, og en amidbinding via e-aminogruppen i en lysinrest eller en annen fri aminogruppe i andre aminosyrer. En rekke slike disulfid/amiddannende midler er beskrevet i Immun. Rev. 62: 185 (1982). Andre bifunksjonelle koblingsmidler danner en tioeterbinding snarere enn en disulfidbinding. Mange av disse tioeterdannende midlene er kommersielt tilgjengelige og omfatter reaktive estere av 6-maleimidokaproinsyre, 2-bromeddiksyre, 2-jodeddiksyre og 4-(N-maleimidometyl)sykloheksan-l-karboksylsyre. Karboksylgruppene kan aktiveres ved å la dem reagere med suksinimid eller natriumsaltet av l-hydroksyl-2-nitro-4-sulfonsyre.

Peptidmidler kan også uttrykkes som fusjonsproteiner med bærere (dvs. heterologe peptider). Peptidmiddelet kan være tilkoblet til en bærer via aminoenden, karboksylenden eller begge ender. Om ønskelig kan flere repetisjoner av det immunogene peptid foreligge i fusjonsproteinet. Om ønskelig kan et immunogent peptid være koblet til flere kopier av et heterologt peptid, for eksempel via både N- og C-enden i peptidet. Noen bærerpeptider bidrar til å indusere en hjelper-T-cellerespons mot bærerpeptidet. De induserte hjelper-T-cellene induserer i sin tur en B-cellerespons mot det immunogene peptid som er koblet til bærerpeptidet.

Uansett hvorvidt middelet er et antistoff, et polypeptid, et peptid, et lite molekyl eller en annen farmasøytisk anvendbar forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse som skal tilføres til et individ skjer tilførselen via et vedvarende doseringsregime. Den faktiske mengde som tilføres og hastighet og tidsforløp for en tilførsel vil avhenge av tilstanden som behandles og dens omfang. Foreskrivelse av behandling, f.eks. avgjørelser vedrørende dosering osv. ligger innenfor ansvarsområdet til allmennpraktiserende leger og andre medisinske doktorer og tar typisk hensyn til forstyrrelsen som skal behandles, den enkelte pasients tilstand, tilførselssetet, tilførselsmåten og andre faktorer som er kjente blant allmennpraktikere. Eksempler på teknikker og fremgangsmåter som er nevnt ovenfor kan finnes i Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. utgave, Osol, A. (red.), 1990.

Farmasøytiske preparater

Foreliggende beskrivelse omtaler også farmasøytiske preparater for reduksjon av kronisk, patologisk inflammasjon i et individ som er utsatt for og/eller lider av en forstyrrelse forbundet med patologisk inflammasjon.

Farmasøytiske preparater ifølge beskrivelsen inneholder fortrinnsvis et middel i en konsentrasjon som utgjør fra tilnærmet 0,1 til tilnærmet 10 % av preparatet. De kan også anvendes sammen med andre egnede, farmasøytisk aktive forbindelser.

For orale preparater kan midlene anvendes alene eller i kombinasjon med egnede tilsetningsstoffer for fremstilling av tabletter, pulvere, granulater eller kapsler, for eksempel med konvensjonelle tilsetningsstoffer som laktose, mannitol, maisstivelse eller potetstivelse, med bindemidler som krystallinsk cellulose, cellulosederivater, akasie, maisstivelse eller gelatiner, med disintegrasjonsmidler som maisstivelse, potetstivelse eller natriumkarboksy-metylcellulose, med smøremidler som talkum eller magnesiumstearat og, om ønskelig, med fortynningsmidler, bufringsmidler, fuktningsmidler, konserveringsmidler og smaksmidler.

Dersom middelet er et antistoff tilføres preparatet fortrinnsvis i en parenteral doseringsform. Den foretrukne form avhenger av den påtenkte tilførselsmåte og terapeutiske anvendelse. Preparatene kan også, avhengig av den ønskede utforming, omfatte farmasøytisk aksepterbare, ikke toksiske bærestoffer eller fortynningsmidler, som er definert som bærere som vanligvis anvendes for utforming av farmasøytiske preparater for tilførsel til dyr eller mennesker. Fortynningsmiddelet er utvalgt slik at det ikke påvirker den biologiske aktivitet av kombinasjonen. Eksempler på slike fortynningsmidler er destillert vann, fysiologisk fosfatbufret saltvann, Ringers løsninger, dekstroseløsning og Hanks løsning. I tillegg kan det farmasøytiske preparat eller den farmasøytiske utforming også omfatte andre bærestoffer, adjuvanser, ikke-toksiske, ikke-terapeutiske, ikke immunogene stabilisatorer og lignende. Videre kan preparatet omfatte bærermolekyler, for eksempel proteoglykaner. Spesifikke eksempler på slike bærermolekyler omfatter glykosamino-glykaner som heparinsulfat, hyaluronsyre, keratansulfat, kondroitin-4-sulfat, kondroitin-6-sulfat, heparansulfat og dermatinsulfat, perlekan og pentopolysulfat.

Antistoffer ifølge oppfinnelsen kan tilføres som injiserbare doser av en løsning eller som en suspensjon av forbindelsen i et fysiologisk aksepterbart fortynningsmiddel med et farmasøytisk bærestoff som kan være en steril væske, for eksempel vann eller oljer med eller uten tilsetning av et overflateaktivt middel. Andre farmasøytiske tilsetningsstoffer er petroleumsbaserte eller erholdt fra dyr, planter eller ved kjemisk syntese, for eksempel peanøttolje, soyabønneolje og mineralolje. Generelt er glykoler som propylenglykol eller polyetylenglykol foretrukne flytende bærestoffer, særlig for injiserbare løsninger. Midlene ifølge foreliggende oppfinnelse kan tilføres i en form for vedvarende frigivelse, for eksempel som en deponeringsinjeksjon, som et implanteringspreparat eller ved en osmotisk pumpe, og disse kan være utformet slik at de tillater vedvarende frigivelse av den aktive bestanddel.

I tillegg kan midler som er antistoffer tilføres ved å tilføre et polynukleotid som koder for et helt antistoff eller en del av et antistoff (f.eks. et enkeltkjedet Fv) til et individ. Polynukleotidet tilføres til individet i et egnet bærestoff slik at antistoffet kan uttrykkes i individet i en terapeutisk effektiv mengde.

Midlene ifølge oppfinnelsen kan utformes til preparater for injeksjon ved å løse, suspendere eller emulgere dem i et vandig eller ikke-vandig løsemiddel, for eksempel vegetabilsk olje eller en annen tilsvarende olje, syntetiske, alifatiske syreglyserider, estere av høyere alifatiske syrer eller propylenglykol. Utformingene kan også inneholde konvensjonelle tilsetningsstoffer som solubiliseringsmidler, isotonisitetsmidler, suspensjonsmidler, emulsjonsmidler, stabilisatorer og konserveringsmidler.

Midlene kan benyttes i aerosolutforminger for tilførsel via inhalering eller pulmonar tilførsel. Midlene ifølge foreliggende oppfinnelse kan utformes i akseptable drivgasser under trykk, for eksempel diklordifluormetan, propan, nitrogen og lignende.

Videre kan midlene utformes til stikkpiller ved å blande dem med en rekke baser, foreksempel emulgerende baser eller vannløselige baser. Midlene ifølge foreliggende oppfinnelse kan tilføres rektalt via en stikkpille. Stikkpillen kan omfatte bærestoffer som kakaosmør, karbovoks og polyetylenglykoler som smelter ved kroppstemperatur, men er faste ved romtemperatur.

Tilførsel av et middel ifølge oppfinnelsen kan oppnås ved ethvert egnet middel, innbefattet parenteral injeksjon, og kan være systemisk eller lokalisert tilførsel. Midlene ifølge foreliggende oppfinnelse kan innføres i en rekke utforminger for terapeutisk tilførsel. Nærmere bestemt kan midlene ifølge foreliggende oppfinnelse utformes til farmasøytiske preparater ved sammenblanding med egnede, farmasøytisk aksepterbare bærestoffer eller fortynningsmidler, og kan utformes til preparater i fast, halvfast eller flytende form eller til gassform, for eksempel tabletter, kapsler, pulvere, granulater, salver, løsninger, stikkpiller, injeksjonsløsninger, inhaleringsmidler, geler, mikrokuler og aerosoler. Tilførselen av midlene kan oppnås på forskjellige måter, innbefattet oral, bukal, rektal, parenteral, intraperetoneal, intradermal, transdermal, intratrakeal, intranasal, gastrisk, intramuskulær, intrakraniell, subdermal osv. tilførsel. Det aktive middel kan være systemisk etter tilførselen eller være lokalisert grunnet anvendelse av regional tilførsel, intramural tilførsel eller anvendelse av et implantat som bidrar til å holde den aktive dose i implantasjonssetet.

Enhetsdoseformer for oral eller rektal tilførsel, f.eks. siruper, eliksirer og suspensjoner, hvor hver doseringsenhet, for eksempel hver teskje, spiseskje, tablett eller stikkpille, inneholder en på forhånd bestemt mengde av preparatet som inneholder ett eller flere midler ifølge foreliggende oppfinnelse, kan tilveiebringes. På tilsvarende måte kan enhetsdoseformer for injeksjon eller intravenøs tilførsel omfatte middelet ifølge foreliggende oppfinnelse i et preparat som en løsning i sterilt vann, normalt saltvann eller et annet farmasøytisk aksepterbart bærestoff.

Implantater for utforminger for vedvarende frigivelse er velkjente innen faget. Implantater er utformet som mikrokuler, plater osv. med biodegraderbare eller ikke-biodegraderbare polymerer. For eksempel danner polymerer av melkesyre og/eller glykolsyre en eroderbar polymer som tolereres godt av verten. Implantatet plasseres i nærheten av proteindeponeringssetet (f.eks. setet for dannelse av amyloide avleiringer forbundet med nevrodegenerative forstyrrelser), slik at den lokale konsentrasjon av det aktive middel er forhøyet på dette sete sammenlignet med resten av kroppen.

En typisk doseringsform for tilførsel til et individ omfatter en løsning som er egnet for intravenøs tilførsel, en tablett som skal inntas to til seks ganger daglig eller en kapsel eller tablett for én gangs frigivelse som inntas én gang daglig og som inneholder en proporsjonalt høyere mengde aktiv bestanddel osv. Tidsfrigivelsesvirkningen kan oppnås ved å benytte kapselmaterialer som oppløses ved forskjellige pH-verdier, ved kapsler som frigis langsomt ved osmotisk trykk eller ved ethvert annet kjent middel for kontrollert frigivelse.

Visse midler innbefattet antistoffer og peptider, tilføres noen ganger sammen med en adjuvans. En rekke adjuvanser kan anvendes i kombinasjon med et anti-alfa-4-integrinmiddel for å utløse en immunrespons. Foretrukne adjuvanser forsterker den intrinsiske respons på et middel uten å gi konformasjonsendringer i middelet som påvirker responsens kvalitative form. Foretrukne adjuvanser omfatter aluminiumhydroksid og aluminiumfosfat, 3-De-O-asylert monofosforyllipid A (MPL ™) (se GB 2220211 (RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton, Montana, nå en del av Corixa). "Stimulon" QS-21 er et triterpenglykosid eller saponin som er isolert fra barken fra Quillaja Saponaria Molina-treet som finnes i Sør-Amerika (se Kensil et al., i Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (red. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995): US patentskrift nr. 5057540 (Aquila BioPharmaceuticals, Farmingham, MA). Andre adjuvanser er olje-i-vann-emulsjoner (for eksempel squalen eller peanøttolje), om ønskelig i kombinasjon med immunstimulerende midler som monofosforyllipid A (se Stoute et al., 1997 N. Engl. J. Med. 336:86-91). En annen adjuvans er CpG (WO 98/40100). Alternativt kan et middel være koblet til en adjuvans. Slik kobling bør imidlertid ikke i vesentlig grad endre konformasjonen til den ønskede alfa-4-epitop slik at naturen av vertens immunrespons endres. Adjuvanser kan tilføres som bestanddeler av et terapeutisk preparat med et aktivt middel eller tilføres separat, før, samtidig med eller etter tilførsel av det terapeutiske middel.

En foretrukket klasse av adjuvanser for tilførsel er aluminiumsalter (alun), for eksempel aluminiumhydroksid, aluminiumfosfat og aluminiumsulfat. Slike adjuvanser kan anvendes med eller uten andre, spesifikt immunstimulerende midler som MPL eller 3-DMP, QS-21 eller polymere eller monomere aminosyrer som polyglutaminsyre eller polylysin. En annen klasse av adjuvanser er olje-i-vann-emulsjonspreparater. Slike adjuvanser kan anvendes med eller uten andre, spesifikt immunstimulerende midler som muramylpeptider (f.eks. N-acetylmuramyl-L-treonyl-D-isoglutamin (thr-MDP), N-acetyl-normuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (nor-MDP), N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(l'-2'dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroksyfosforyloksy)-etylamin (MTP-PE), N-acetylgluksaminyl-N-acetylmuramyl-L-AI-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoksypropylamid ("DTP-DPP) teramid", eller andre bestanddeler av bakteriecelleveggen. Olje-i-vann-emulsjoner omfatter (a) MF59 (WO 90/14837), som inneholder 5 % squalen, 0,5 % Tween 80, og 0,5 % Span 85 (om ønskelig inneholdende forskjellige mengder av MTP-PE) utformet til submikrometerpartikler ved anvendelse av en mikrofluidisator, for eksempel en modell 110Y mikrofluidisator (Microfluidics, Newton MA), (b) SAF, som inneholder 10 % squalen, 0,4 % Tween 80, 5 % pluronikk-blokkert polymer L121 og thr-MDP, enten mikrofluidisert til en submikrometer-emulsjon eller vorteksbehandlet for dannelse av en emulsjon med større partikkelstørrelse, og (c) "Ribi"-adjuvanssystemet (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) som inneholder 2 % squalen, 0,2 % Tween 80 og én eller flere bestanddeler av bakteriecelleveggen utvalgt fra gruppen som består av monofosforyllipid A, trehalosedimykolat (TDM) og celleveggskjelett (CWS), fortrinnsvis MPL + CWS ("Detox"). En annen klasse av foretrukne adjuvanser er saponinadjuvanser som "Stimulon" (QS-21; Aquila, Farmingham, MA) eller partikler dannet derav, for eksempel ISCOM (immunstimulerende komplekser) og ISCOMATRIX. Andre adjuvanser omfatter komplett og ukomplett Freunds adjuvans (IFA), cytokiner, for eksempel interleukiner (IL-1, IL-2 og IL-12), makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) og tumornekrosefaktor (TNF). Slike adjuvanser er generelt tilgjengelige fra kommersielle kilder.

En adjuvans kan tilføres med et middel som et enkelt prepart eller tilføres før, samtidig med eller etter tilførsel av middelet. Middelet og en adjuvans kan pakkes og leveres i samme ampulle eller pakkes i separate ampuller og sammenblandes før bruk. Middelet og adjuvansen pakkes typisk med en merkelapp som angir den påtenkte terapeutiske anvendelse. Dersom middelet og adjuvansen pakkes separat omfatter pakken typisk instruksjoner for sammenblanding før bruk. Valg av adjuvans og/eller bærer avhenger av faktorer som stabiliteten av preparatet som inneholder adjuvansen, tilførselsveien, doseringsregimet og adjuvansens effektivitet for arten som skal vaksineres. Hos mennesker er en foretrukket, farmasøytisk aksepterbar adjuvans en adjuvans som er blitt godkjent for tilførsel til mennesker av relevante regulerende institusjoner. Eksempler på slike foretrukne adjuvanser for mennesker omfatter alun, MPL og QS-21. Om ønskelig kan to eller flere forskjellige adjuvanser anvendes samtidig. Foretrukne kombinasjoner omfatter alun med MPL, alun med QS-21, MPL med QS-21 og alun, QS-21 og MPL sammen. Videre kan ukomplett Freunds adjuvans benyttes. (Chang et al., 1998 Advanced Drug Delivery Reviews 32: 1973-186) om ønskelig i kombinasjon med alun, QS-21 eller MPL, eller alle kombinasjoner av disse.

Doseringsregimer for vedvarende tilførsel

De vedvarende behandlingsregimene ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringer anti-alfa-4-integrinmiddel i et nivå som vil opprettholde tilstrekkelig reseptormetning til at patologisk inflammasjon undertrykkes i en pasient med behov for slik undertrykking. Fremgangsmåtene ifølge beskrivelsen omfatter tilførsel fra én gang annenhver uke eller én gang i måneden til én gang annenhver måned, hvor gjentatt dosering skjer over et tidsrom på minst seks måneder og mer foretrukket i ett år eller lenger. Fremgangsmåtene omfatter erholdelse og opprettholdelse av et reseptormetningsnivå i en pasient av en dimer som omfatter alfa-4-integrin (f.eks. VLA-4) i et område fra tilnærmet 65 % til 100 %, mer foretrukket mellom tilnærmet 75 % og tilnærmet 100 % og enda mer foretrukket mellom tilnærmet 80 % og tilnærmet 100 %. Reseptormetningen holdes kronisk på dette nivå

(f.eks. over et tidsrom på 6 måneder eller lignende), slik at kontinuerlig undertrykkelse av patologisk inflammasjon oppnås.

I en spesifikk utførelse er anti-alfa-4-middelet et antistoff, fortrinnsvis et humanisert eller humant antistoff (f.eks. natalizumab), og doseringen skjer på månedlig basis. Reseptormetningsnivået kan følges for å bestemme effekten av doseringsregimet og fysiologiske markører måles for å bekrefte doseringsregimets suksess. Som en bekreftelse kan serumnivået av antistoffet måles for å påvise clearance av antistoffet og for å bestemme den mulige virkningen av halveringstiden på behandlingens effektivitet.

Mengden middel som tilføres i en doseringsenhet kan avhenge av hvorvidt adjuvans også tilføres, hvor høyere doser generelt er nødvendig i nærvær av adjuvans. For immunisering med et middel ifølge oppfinnelsen varierer dosen fra tilnærmet 0,0001 til tilnærmet 100 mg/kg, og mer vanlig fra tilnærmet 0,01 til 5 mg/kg kroppsvekt. For eksempel kan dosen være på tilnærmet 1 mg/kg kroppsvekt eller tilnærmet 20 mg/kg kroppsvekt eller tilnærmet 10 mg/kg kroppsvekt. Dosen og doseringshyppigheten kan variere avhengig av middelets halveringstid i pasienten. Dosen og tilførselshyppigheten kan variere avhengig av hvorvidt behandlingen er profylaktisk eller terapeutisk. For tilførsel av antistoff er hver injiserte dose generelt på mellom tilnærmet 2,0 og tilnærmet 8,0 mg/kg. I samsvar med foreliggende oppfinnelses lære kan effektive doser holdes ved å erholde en væskeprøve fra pasienten, generelt en blodserumprøve eller en prøve av cerebrospinal-væske, og bestemme integrinreseptormetningen ved anvendelse av fremgangsmåter som er velkjente innen faget. Ideelt tas en prøve før den innledende dosering, påfølgende prøver tas og måles før og/eller etter hver immunisering. En spesielt foretrukket mengde er en mengde på 3 mg/kg kroppsvekt pr. måned av natalizumab eller en ekvivalent mengde av et immunologisk aktivt fragment derav.

Dersom adjuvans tilføres forhøyes doseringsnivået i samsvar med den angjeldende adjuvans og immunogenisitetsnivået av anti-alfa-4-middelet. Doser for de enkelte midler, utvalgt i samsvar med foreliggende oppfinnelse, bestemmes ifølge standard doserings-fremgangsmåter sett i forbindelse med den lære som tilveiebringes her.

Som et alternativ til vedvarende tilførsel som omfatter gjentatte enkeltdoseringer kan et anti-alfa-4-middel tilføres som et preparat for vedvarende frigivelse, forutsatt at dosen er slik at reseptormetningsnivået forblir tilstrekkelig høyt til at inflammasjon undertrykkes. For eksempel kan systemer for kontrollert frigivelse anvendes for vedvarende tilførsel av et anti-alfa-4-middel innenfor foreliggende oppfinnelses område. Diskusjoner vedrørende egnede doseringsformer for kontrollert frigivelse kan finnes i Lesczek Krowczynski, Extended-Release Dosage Forms, 1987 (CRC Press, Inc.).

De forskjellige teknologiene for kontrollert frigivelse dekker et svært bredt spektrum av medikamentdoseringsformer. Teknologier for kontrollert frigivelse omfatter fysiske systemer og kjemiske systemer. Fysiske systemer omfatter reservoarsystemer med hastighetskontrollerende membraner, foreksempel mikroinnkapsling, makroinnkapsling og membransystemer, reservoarsystemer uten hastighetskontrollerende membraner, for eksempel hule fibre, ultramikroporøst cellulosetriacetat og porøse, polymere faste støttemidler og skum, monolittiske systemer, innbefattet systemer som fysisk er oppløst i ikke-porøse, polymere eller elastomere støttemidler (f.eks. ikke-eroderbare, eroderbare, miljømiddelingresjon og degraderbare), og materialer som fysisk er dispergert i ikke-porøse, polymere eller elastomere støttemidler (f.eks. ikke-eroderbare, eroderbare, miljømiddelingresjon og degraderbare), laminerte strukturer, innbefattet reservoarlag som kjemisk ligner eller er forskjellige fra ytre kontrollag, og andre fysiske fremgangsmåter, for eksempel osmotiske pumper eller adsorpsjon til ionebytterresiner.

Kjemiske systemer omfatter kjemisk erosjon av polymerstøttemidler (f.eks. heterogen eller homogen erosjon) eller biologisk erosjon av et polymert støttemiddel (f.eks. heterogen eller homogen). En ytterligere diskusjon vedrørende grupper av systemer for kontrollert frigivelse kan finnes i Agis F. Kydonieus, Controlled Release Technologies: Methods, Theory and Applications, 1980 (CRC Press, Inc.).

Fremgangsmåtene kan anvendes for behandling av en pasient som lider av en forstyrrelse som omfatter eller oppstår grunnet patologisk inflammasjon eller for profylaktisk behandling av en pasient som er utsatt for en gitt forstyrrelse. Doseringsregimene som er nødvendige for profylaktisk sammenlignet med terapeutisk behandling kan variere og må utformes for den spesifikke anvendelse og den behandlede forstyrrelse.

I noen fremgangsmåter tilføres to eller flere midler (f.eks. monoklonale antistoffer med forskjellig bindingsspesifisitet) samtidig, og i dette tilfelle ligger dosen for hvert tilførte middel innenfor de angitte grenser. Mellomrommene kan også være uregelmessige, vist ved å måle reseptormetningsnivåer eller ved å følge andre mål på sykdomsprosessen.

Fagfolk vil lett forstå at doseringsnivået kan variere som funksjon av det spesifikke middel, omfanget av symptomene og hvor utsatt pasienten er for bivirkninger. Noen av de spesifikke midlene er kraftigere enn andre. Foretrukne doser for et gitt middel kan lett bestemmes av fagfolk ved en rekke midler. Et foretrukket middel er å måle den fysiologiske virkningen av et gitt middel.

Terapeutiske indikasjoner

Preparatene for kontrollert frigivelse kan anvendes for å oppnå et bredt utvalg av ønskede virkninger. Nærmere bestemt er preparatene anvendbare for behandling av nær sagt enhver sykdomstilstand eller ethvert symptom som kan behandles ved lang tids tilførsel av antiinflammatoriske midler som er rettet mot patologisk inflammasjon.

Beskrivelsen omtaler også behandlingsfremgangsmåter som utnytter evnen til anti-alfa-4-integrinmidler til å blokkere alfa-4-avhengige interaksjoner. Den alfa-4-avhengige interaksjon med VCAM-l-ligand på endotelceller er en tidlig begivenhet i mange inflammatoriske responser, innbefattet responsene i sentralnervesystemet. Uønskede sykdommer og tilstander som skyldes inflammasjon og som har akutt og/eller kronisk klinisk irritasjon omfatter multippel sklerose (Yednock et al., 1992 Nature 356: 63; Baron et al., J. Exp. Med. 177: 57), meningitt, encefalitt, slag, andre hjernetraumer, inflammatorisk tarmsykdom (IBD), innbefattet ulcerøs kolitt og Crohns sykdom (CD) (Hamann et al., 1994 J. Immunol. 152: 3238), (Podolsky et al., 1993 J. Clin. Invest. 92: 372), revmatoid artritt (van Dinther-Janssen et al., 1991 J. Immunol. 147:4207; van Dinther-Janssen et al., 1993 Annals Rheumatic Diseases 52: 672); Elices et al., 1994 J. Clin. Invest 93: 405); Postigo et al., 1992 J. Clin. Invest. 89: 1445), astma (Mulligan et al., 1993 J. Immunol. 150: 2407) og akutt juvenil diabetes (Type 1) (Yang et al., 1993 PNAS 90: 10494); Burkly et al., 1994 Diabetes 43: 529); Baron et al., 1994 J. Clin. Invest. 93: 1700), AIDS-dementia (Sasseville et al., 1994 Am. J. Path. 144: 27); aterosklerose (Cybulsky et al., 1991 Science 251: 788-91, Li et al., 1993 Arterioscler. Thromb. 13: 197), nefritt (Rabb et al., 1995 Springer Semin. Immunopathol. 16: 417-25), retinitt, atopisk dermatitt, psoriasis, myokardischemi, kronisk prostatitt, komplikasjoner fra sigdcelleanemi, lupus erytematosus og akutt, leukocyttformidlet lungeskade, slik som opptrer ved sjokklunge. Inflammatorisk tarmsykdom er en fellesbetegnelse på to sykdommer som ligner på hverandre og som betegnes Crohns sykdom (CD) og ulcerøs kolitt. CD er en idiopatisk, kronisk, ulcerokonstriktiv inflammasjonssykdom som særpreges ved skarpt avgrenset og typisk transmural deltagelse av alle lag i tarmveggen i en granulomatøs inflammasjonsreaksjon. Ethvert segment av mage-tarmkanalen, fra munn til anus, kan være involvert, selv om sykdommen vanligvis rammer den terminale ilium og/eller kolon. Ulcerøs kolitt er en inflammatorisk respons som hovedsakelig er begrenset til kolonslimhinner og submucosa. Lymfocytter og makrofager opptrer i stort antall i lesjoner ved inflammatorisk tarmsykdom og kan bidra til inflammasjonsskader.

Astma er en sykdom som særpreges ved forhøyet responsivitet i trakeobronkialtreet overfor forskjellige stimuli som forsterker paroksysmal konstruksjon av bronkieluftveiene. Stimuliene gjør at forskjellige inflammasjonsformidlere frigis fra IgE-belagte mastceller, innbefattet histamin, eosinofile og nøytrofile kjemotaktiske faktorer, leukotriner, prostaglandin og blodplateaktiverende faktor. Frigivelse av disse faktorene rekrutterer basofile, eosinofile og nøytrofile celler, noe som gir en inflammasjonsskade.

Aterosklerose er en sykdom i arterier (f.eks. kransarterier, karotidarterier, aorta og bekkenarterien). Den basale lesjonen, ateromet, består av en forhøyet, fokal plakk i intima med en lipidkjerne og en dekkende, fibrøs kappe. Ateromer forstyrrer den arterielle blodstrøm og svekker rammede arterier. Myokardinfarkt og cerebralinfarkt er de viktigste følger av denne sykdommen. Makrofager og leukocytter rekrutteres til ateromer og bidrar til inflammasjonsskader.

Revmatoid artritt er en kronisk, tilbakevendende inflammatorisk sykdom som primært gir svekkelse og ødeleggelse av ledd. Revmatoid artritt rammer vanligvis først de små leddene i hender og føtter, men kan så omfatte håndledd, albuer, ankler og knær. Artritten skyldes interaksjoner mellom synovialceller og leukocytter som infiltrerer synovialbelegget i leddene fra sirkulasjonen. Se f.eks. Paul, Immunology (3. utgave, Raven Press, 1993).

En annen indikasjon for vedvarende dosering av anti-alfa-4-midler er behandling av organ- eller transplantatrejeksjon. I senere år har det skjedd en vesentlig forbedring av effektiviteten av kirurgiske teknikker for transplantasjon av vev og organer, for eksempel hud, nyre, lever, hjerte, lunge, bukspyttkjertel og beinmarg. Det kanskje mest fremstående problem er mangelen på tilfredsstillende midler for induksjon av immuntoleranse hos mottakeren av det transplanterte allotransplantat eller organ. Dersom allogeneiske celler eller organer transplanteres inn i en vert (dvs. at donoren og mottakeren er forskjellige individer fra samme art) vil vertens immunsystem sannsynligvis utløse en immunrespons mot fremmede antigener i transplantatet ("host-versus-graft"-sykdom), noe som fører til ødeleggelse av det transplanterte vev. CD8<+->celler, CD4<+->celler og monocytter deltar alle i avvisningen av transplanterte vev. Antistoffer rettet mot alfa-4-integrin er blant annet anvendbare for blokkering av alloantigeninduserte immunresponser i mottakeren, hvorved det forhindres at slike celler deltar i ødeleggelsen av det transplanterte vev eller organ. Se f.eks. Paul et al., 1996 Transplant International 9: 420-425; Georczynski et al., 1996 Immunol. 87: 573-580); Georcyznski et al., 1995 Transplant. Immunol. 3: 55-61); Yang et al., 1995 Transplantation 60: 71-76); Anderson et al., 1994 APMIS 102: 23-27.

En beslektet anvendelse av anti-alfa-4-midler er ved modulering av immunresponsen som inngår i "graft versus host"-sykdom (GVHD). Se f.eks. Schlegel et al., J. Immunol. 155, 3856-3865 (1995). GVHD er en sykdom som kan medføre døden og som opptrer dersom immunologisk kompetente celler overføres til en allogeneisk mottaker. I denne situasjon kan donorens immunkompetente celler angripe vev i mottakeren. Vev i hud, tarmepitel og lever er hyppige mål og kan ødelegges i løpet av GVHD. Sykdommen byr på et spesielt alvorlig problem dersom immunvev transplanteres, for eksempel som ved beinmargstransplantasjon, men mindre alvorlig GVHD er også blitt rapportert i andre tilfeller, innbefattet transplantasjon av hjerte og lever. De terapeutiske midlene ifølge foreliggende beskrivelse benyttes blant annet for å blokkere aktivering av donor-T-cellene, hvorved de interfererer med cellenes evne til å lysere målceller i verten.

En videre anvendelse av anti-alfa-4-midler er inhibering av tumormetastase. Flere tumorceller er blitt rapportert å uttrykke alfa-4-integrin, og antistoffer mot alfa-4-integrin er blitt rapportert å blokkere adhesjon av slike celler til endotelceller (Steinback et al., 1995 Uroi. Res. 23: 175-83); Orosz et al., 1995 Int. J. Cancer 60: 867-71); Freedman et al., 1994 Leuk. Lymphoma 13: 47-52); Okahara et al., 1994 Cancer Res. 54: 3233-6).

Nok en anvendelse av anti-alfa-4-midlene er ved behandling av multippel sklerose. Multippel sklerose (MS) er en progressiv, nevrologisk, autoimmun sykdom som rammer anslagsvis 250000 til 350000 mennesker i de Forente Stater. Multippel sklerose antas å være en følge av en spesifikk autoimmun reaksjon i hvilken visse leukocytter angriper og innleder ødeleggelsen av myelin, det insulerende lag som dekker nervefibrene. I en dyremodell for multippel sklerose har monoklonale antistoffer fra mus rettet mot alfa-4-beta-l-integrin blitt vist å blokkere adhesjon av leukocytter til endotelet og således forhindre inflammasjon i det sentrale nervesystem og påfølgende paralyse av dyrene.

De begynnende symptomer på MS kan være dramatiske eller så milde at de ikke får pasienten til å oppsøke lege. De vanligste symptomene omfatter svakhet (i én eller flere lemmer, visuell uklarhet grunnet optisk nevritt, sensoriske forstyrrelser, dobbeltsyn og ataksi. Sykdomsforløpet kan stratifiseres til tre generelle grupper: (1) tilbakevendende MS, (2) kronisk, progressiv MS og (3) ikke-aktiv MS. Tilbakevendende MS særpreges ved gjentatte anfall av nevrologisk feilfunksjon. MS-angrep utvikles generelt over dager til uker og kan følges av fullstendig, delvis eller ingen gjenvinning. Gjenvinning fra angrepene opptrer generelt i løpet av uker til flere måneder etter symptomtoppen, selv om en viss gjenvinning en sjelden gang kan fortsette i to eller flere år.

Kronisk, progressiv MS fører til en gradvis progressiv forverring uten perioder med stabilisering eller lindring. Denne formen utvikles hos pasienter med tidligere forekomst av tilbakevendende MS, selv om ingen tilbakevending kan erindres hos 20 % av pasientene. Akutte tilbakefall kan også opptre i løpet av den progressive sykdomsutviklingen.

En tredje form er ikke-aktiv MS. Ikke-aktiv MS særpreges ved faste nevrologiske mangler av forskjellig størrelse. De fleste pasienter med ikke-aktiv MS har tidligere hatt tilbakevendende MS.

Sykdomsforløpet ved MS avhenger også av pasientens alder. For eksempel omfatter fordelaktige prognostiske faktorer tidlig begynnelse (bortsett fra barndommen), et tilbakevendende forløp og liten gjenværende svekkelse 5 år etter begynnelsen. I motsetning til dette er dårlig prognose forbundet med sen begynnelse av sykdommen (dvs. en alder på 40 år eller mer) og et progressivt forløp. Disse variablene er avhengige av hverandre, siden kronisk, progressiv MS har en tendens til å begynne ved høyere alder enn tilbakevendende MS. Invaliditet grunnet kronisk, progressiv MS skyldes vanligvis progressiv paraplegi eller kvadriplegi hos enkeltpasienter. I én utførelse av oppfinnelsen vil pasienter fortrinnsvis behandles mens pasienten er i remisjon, snarere enn i et stadium hvor sykdommen forverres.

Kort tids anvendelse av enten adrenokortikotropt hormon (ACTH) eller orale kortikosteroider (f.eks. oralt drednison eller intravenøst metylprednisolon) er de eneste spesifikke terapeutiske tiltak for behandling av pasienter med akutt forverring av MS.

Nyere behandlingsformer for MS omfatter behandling av pasienter med interferon beta-lb, interferon beta-la og "Copaxone" (tidligere betegnet kopolymer 1). Disse tre medikamentene er blitt vist å signifikant redusere tilbakefallshyppigheten for sykdommen. Disse medikamentene tilføres typisk av pasienten selv, intramuskulært eller subkutant.

Ingen av dagens tilgjengelige behandlingsformer inhiberer demyelinering eller MS. Én utførelse av oppfinnelsen omfatter behandling av MS med midler som beskrives her, enten alene eller i kombinasjon med andre standard behandlingsmåter. Standard behandlingsmåter omfatter behandlingsmåtene som beskrives i det påfølgende. Ytterligere behandlingsmåter, som ikke diskuteres her, for anvendelse ved behandling av MS i kombinasjon med fremgangsmåtene og preparatene som beskrives her og som avhenger av pasientens sykdomstilstand, vil være åpenbare for den erfarne fagperson. Slike ytterligere behandlingsmåter for MS og annen type patologisk inflammasjon, vil omfatte andre immunmodulerende eller immunsupprimerende midler.

Midlene og de farmasøytiske preparater som diskuteres ovenfor, kan tilføres vedvarende for profylaktisk og/eller terapeutisk behandling av de tidligere opplistede inflammasjonsforstyrrelsene, innbefattet multippel sklerose, inflammatorisk tarmsykdom, astma, aterosklerose, reumatoid artritt, organ- eller transplantatrejeksjon og "graft versus host"-sykdom. For terapeutisk anvendelse tilføres preparater til en pasient som er utsatt for eller som allerede lider av en slik sykdom, i en mengde som er tilstrekkelig til å kurere, eller i det minste delvis stanse symptomene på sykdommen og dens komplikasjoner. En mengde som er tilstrekkelig til å oppnå dette, defineres som en terapeutisk - eller farmasøytisk - effektiv dose.

Ved profylaktisk anvendelse tilføres farmasøytiske preparater kronisk til en pasient som er utsatt for eller som på annet vis risikerer en gitt sykdom, i en mengde som er tilstrekkelig til å fjerne eller redusere risikoen eller forsinke sykdommens begynnelse. En slik mengde er definert til å være en profylaktisk effektiv dose. Hos pasienter med multippel sklerose i remisjon, kan risikoen anslås ved NMR-bildedannelse eller, i noen tilfeller, ved presymptomatiske indikasjoner som observeres av pasienten.

Effektive doseringsregimer for preparatene for behandling av de ovenfor beskrevne tilstander vil variere, avhengig av mange forskjellige faktorer innbefattet tilførselsmåter, målseter, pasientens fysiologiske tilstand og andre medikamenter som tilføres. Behandlingsdosene må således titreres for optimalisering av sikkerhet og virkning. Generelt vil hver tilførsel i doseringsregimet variere mellom tilnærmet 0,0001 og 100 mg/kg, mer vanlig mellom 0,01 og 5 mg/kg kroppsvekt. Ett foretrukket doseringsregime er 300 mg tilført én gang månedlig over et tidsrom på minst 6 måneder, mer foretrukket 12 måneder og kanskje over et tidsrom på flere år. Et annet doseringsregime som foretrekkes, er 3 mg per kg kroppsvekt per måned. Et slikt skjema kan være å foretrekke for behandling av barn eller ungdom med behov for behandling.

Kombinasjonsbehandling

Anti-alfa-4-midlene ifølge oppfinnelsen kan anvendes med effektive mengder av andre terapeutiske midler mot akutt og kronisk inflammasjon. Slike midler omfatter andre antagonister av adhesjonsmolekyler (f.eks. andre integriner, selektiner og immunglobulin (Ig)-superfamiliemedlemmer (se Springer, 1990 Nature 346: 425-433, Osborn, 1990 Cell 62: 3, Hynes, 1992 Cell 9: 11). Integriner er heterodimere transmembran-glykoproteiner som består av en a-kjede (120-180 kDa) og en p-kjede (90-110 kDa), som generelt har korte cytoplasmatiske domener. Foreksempel har tre viktige integriner (dvs. LFA-1, Mac-1 og P150,95) forskjellige alfa-subenheter som betegnes CDlla, CDllb og CDllc og en felles beta-subenhet som betegnes CD18. LFA-1 (aLp2) uttrykkes på lymfocytter, granulocytter og monocytter, og bindes hovedsakelig til en mot reseptor fra Ig-familien som betegnes ICAM-1 og beslektede ligander. ICAM-1 uttrykkes på mange celler, innbefattet leukocytter og endotelceller, og oppreguleres på vaskulært endotel ved cytokiner som TNF og IL-1. Mac-1(°mP2) er fordelt på neutrofile celler og monocytter og bindes også til ICAM-1. Det tredje p2-integrin, P150,95 (axp2), finnes også på neutrofile celler og monocytter. Selektinene utgjøres av L-selektin, E-selektin og P-selektin.

Andre anti-inflammatoriske midler som kan anvendes i kombinasjon med anti-alfa-4-midlene, omfatter antistoffer og andre antagonister av cytokiner, f.eks. interleu-kinene IL-1 til IL-13, tumornekrosefaktor a og p, interferon a, p og y, tumorvekstfaktor beta(TGF-p), kolonistimulerende faktor (CSF) og granulocytt-monocyttkolonistimu-lerende faktor (GM-CSF). Andre antiinflammatoriske mindler omfatter antistoffer og andre antagonister av chemokiner, f.eks. MCP-1, MIP-la, MIP-ip, RANTES, eksotaksin og IL-8. Andre antiinflammatoriske midler omfatter NSAIDS, steroider og andre lavmolekylære inhibitorer av inflammasjon. Utforming, tilførselsveier og effektive konsentrasjoner av midler for kombinasjonsbehandling er som beskrevet ovenfor for de humaniserte antistoffene mot alfa-4-integrin.

Ytterligere midler for anvendelse i kombinasjon med midler som modifiserer alfa-4-integrin eller dimerer som omfatter alfa-4-integrin og behandler inflammatorisk tarmsykdom (IBD), Crohns sykdom (CD) og ulcerøs kolitt (UC) omfatter 5-aminosalicylater, glukokortikoider, tioguaninderivater, metotrexat (MTX), syklosporin, antibiotika og infliximab.

5-aminosalicylater omfatter sulfasalazin (også betegnet Azulfidine) som er et konjugat av mesalamin koblet til sulfapyridin via en diazobinding og tilføres vanligvis i en mengde på fra tilnærmet 500 mg/dag til tilnærmet 6 g/dag. 5-aminosalicylater kan også tilføres sammen med et glucokortikoid. Fortrinnsvis anvendes et 5-aminosalicylat i kombinasjonsbehandling med et av de andre midlene som diskuteres herfor behandling av ulcerøs kolitt, imidlertid kan midlet også anvendes for behandling av Crohns sykdom. Ikke-sulfonamidholdige preparater av mesalamin omfatter Asacol, Claversa, Salofalk, Pentasa, Dipentum, Colazide og Rowasa.

Glukokortikoider har vært en grunnpillar for behandling av akutte, alvorlige anfall av IBD siden 1955, da de først ble vist å være virkningsfulle ved UC. Oral prednison kan tilføres sammen med ethvert av midlene som beskrives her. Typisk tilføres 20 til 40 mg oralt prednison én gang daglig. Glukokortikoider kan også tilføres intravenøst og som klyster i kombinasjon med, samtidig med eller en kort tid før/etter tilførsel av et anti-alfa-4-integrinmiddel. For eksempel er hydrokortison tilgjengelig som et retensjonsklyster (100 mg/60 ml), og den vanlige dose er et klyster på 60 ml hver natt over 2 til 3 uker. Dosen kan endres ved anvendelse i kombinasjon med behandlingsformene og midlene som diskuteres her, noe som vil forstås av gjennomsnittsfagfolk. Andre steroider som kan anvendes, omfatter prednisolonmeta-sulfobenzoat, tixocortolpivalat, fluticasonpropionat, beclometasondipropionat og budesonid.

Tioguaninderivater er også anvendbare ved behandling av IBD, CD og UC. Disse omfatter 6-merkaptopurin (6-MP) og azatioprin (IMURAN). De to medikamentene kan benyttes om hverandre i kombinasjon med ethvert av de anti-alfa-4-integrinregulerende midlene som diskuteres her.

Metotrexat (MTX) tenkes også anvendt i kombinasjon med de alfa-4-integrin-regulerende midlene som diskuteres her. MTX tilføres fortrinnsvis ved intramuskulær injeksjon (i.m.) til pasienten i kombinasjon med et anti-alfa-4-integrinmiddel. MTX er effektivt ved steroidavhengig CD, men ikke like anvendbart ved UC. MTX kan tilføres i mengder på fra tilnærmet 15 til tilnærmet 25 mg ukentlig per individ eller etter behov, som fastslått av gjennomsnittsfagpersonen.

Syklosporiner (f.eks. Sandimmune, Neoral) kan også anvendes i kombinasjon med de alfa-4-integrinmodulerende midlene som diskuteres her, for behandling av patologisk tarm inflammasjon. Dette kan anvendes for behandling av akutt, alvorlig UC som ikke responderer på glukokortikoider.

Infliximab (dvs. Remicade) kan også anvendes for behandling av CD i kombi-nasjon med de alfa-4-integrinmodulerende midlene som beskrives her. Infliximab er et immunglobulin som bindes til TNF, og derved nøytraliserer aktiviteten av TNF. Andre anti-TNF-antistoffer, f.eks. CDP571, kan også anvendes i kombinasjon med de alfa-4-integrinmodulerende midlene som beskrives her.

Antibiotika tenkes også anvendt i kombinasjon med de alfa-4-integrinmoduler-ende midlene som beskrives her, for modulering av UC, IBD og CD. For eksempel kan pasienter behandles med metronidazol eller ciprofloxacin (eller farmakologiske ekviva-lenter derav) i kombinasjon med et alfa-4-integrinmodulerende middel eller i form av en blanding.

Videre omfattes anvendelse av understøttende behandling for IBD, CD og UC, sammen med midler som modulerer alfa-4-integriner eller dimerer som omfatter alfa-4-integrin, og behandler inflammatorisk tarmsykdom, Crohns sykdom og ulcerøs kolitt. Understøttende behandlingsformer omfatter analgetiske midler, anticholinerge midler og antidiaretiske midler. Kombinasjon med slik understøttende behandling kan være nyttig i begynnelsen av et behandlingsskjema for å redusere pasientens symptomer og forbedre livskvaliteten. Understøttende behandling omfatter tilførsel av oralt jern, folat og vitamin B12. Antidiaretiske midler omfatter difenoksylat, kodein, loperamid og anticholinerge midler (eller farmakolo-giske ekvivalenter derav), som kan tilføres til pasienter med en mild sykdom for reduksjon av hyppigheten av tarmbevegelser og lindre rektale smerter. Kolestyramin kan anvendes i pasienter for å forhindre gallesaltindusert kolonsekresjon hos pasienter som allerede har gjennomgått begrensede ileokoliske reseksjoner før behandling med vedvarende behandlingsregime som beskrives her. Anticholinerge midler omfatter klidiniumbromid, disyklominhydroklorid, tinkturer av belladonna og lignende, og er anvendbare for reduksjon av underlivskramper, smerte og rektalt trykk.

For behandling av MS kan anti-alfa-4-integrinmidlene (f.eks. anti-alfa-4-integrin-antistoffer, lavmolekylære alfa-4-integrinantagonister og lignende) kombineres med andre forbindelser eller preparater som anvendes for behandling, lindring eller døyving av symptomer forbundet med MS.

Andre midler som benyttes for behandling, lindring eller døyving av symptomer forbundet med MS, omfatter: muskelrelakserende midler (f.eks. diazepam, syklobenzaprin, clonazepam, klonidin, primidon og lignende), anticholinerge midler (f.eks. propantelin, disyklomin og lignende), sentralnervesystemstimulerende midler (f.eks. pemolin), ikke-steroide antiinflammatoriske midler (NS som i ibuprofen, naproxen og ketoprofen), interferoner, immunglobulin, glatiramer (Copaxone, mitoksantron (Novantrone), misoprostol, tumornekrose faktor-alfa-inhibitorer (f.eks. Pirfenidon, infliximab og lignende) og kortikosteroider (f.eks. glukokortikoider og mineralokortikoider).

Vanlige midler for behandling av multippel sklerose omfatter interferon beta-lb (Betaseron), interferon beta-la (Avonex), høydose interferon-la (Rebif), Glatiramer (Copaxone), immunglobulin, mitoksantron (Novatrone), kortikosteroider (f.eks. predni-son, metylprednisolon, dexametason og lignende). Andre kortikosteroider kan også anvendes og omfatter kortisol, kortison, fludrokortison, prednisolon, 6a-metylprednisolon, triamcinolon og betametason.

Doseringsformer for midlene som skal anvendes i kombinasjon med forbindel-sene og preparatene som beskrives her, vil variere avhengig av pasienten og den benyttede medikamentkombinasjon. For eksempel tilføres interferoner typisk som følger: Interferon beta-la (Avonex) tilføres med 30 ug en gang ukentlig, interferon beta-la tilføres i en dose på tilnærmet 22 ug eller 44 ug tre ganger ukentlig, og interferon beta-lb (Betaseron) tilføres i en dose på 250 ug annenhver dag (Durelli et al., Lancet 359: 1453-60, 2002). Interferonene tilføres typisk for tilbakevendende eller remitterende multippel sklerose. I kombinasjon med anti-alfa-4-integrinmidlene som beskrives her, kan således foretrukne områder for interferoner omfatte fra tilnærmet 0,1 ug til tilnærmet 250 ug, mer foretrukket fra tilnærmet 0,5 ug til tilnærmet 50 ug, avhengig av måten som midlet tilføres på, sammen med de andre anti-alfa-4-integrinforbindelsene og preparatene som beskrives her.

NS eller NSAID som tenkes anvendt omfatter ikke-selektive COX-inhibitorer og selektive COX-2-inhibitorer. Ikke-selektive COX-inhibitorer omfatter salicyl-syrederivater (f.eks. aspirin, natriumsalicylater, cholinmagnesiumtrisalicylat, salsalat, diflunisal, sulfasalazin og olsalazin), para-aminofenolderivater (f.eks. acetaminofen), indol- og indeneddiksyrer (f.eks. tolmetin, diclofenac og ketorolac), heteroaryleddiksyrer (f.eks. abuprofen, naproxen, flurbiprofen, ketoprofen, fenprofen og oxaprozin), antranil-syrer eller fenamater (f.eks. mefenaminsyre og meclofenaminsyre), enolsyrer (f.eks. oxicamer som piroxicam og meloxicam) og alkanoner (f.eks. nabumeton). Selektive COX-2-inhibitorer omfatter diarylsubstituerte furanoner (f.eks. rofecoxib), diarylsubsti-tuerte pyrazoler (f.eks. celecoxib), indoleddiksyrer (f.eks. etodolac) og sulfonanilider (f.eks. nimesulid). NS tilføres ofte i kombinasjon med interferon for å redusere de influensa-lignende symptomene som oppleves av pasienter som f.eks. gis Avonex. Vanlige NS-midler omfatter naproxen, ibuprofen og ketoprofen. Paracetamol tilføres også ofte til pasienter. Se Reess et al., 2002 Mult. Seler. 8: 15-8.

Glatirameracetat (GA, Copaxone er et syntetisk molekyl som inhiberer aktive-ringen av myelin basisk protein-reaktive T-celler, og induserer et T-cellerepertoar som særpreges ved antiinflammatoriske virkninger. Videre kan Glatiramer nå sentralnerve-systemet (CNS), mens interferon-beta ikke kan dette (Dhib-Jalbut, 2002 Neurology 58: S3-9, Weinstock-Guttman et al., 2000 Drugs 59: 401-10).

Mitoxantron er et syntetisk antracendionmiddel som er blitt vist å være effektivt for behandling av sekundær, progressiv multippel sklerose (SP-MS). Anvendelse av dette medikament er imidlertid igjen begrenset grunnet midlets kumulative kardiotoksisitet (Weinstock-Guttman et al., 2000).

Tumornekrose faktor-alfa (TNF-a) kan være et nøkkeslcytokin i demyelinering (Walker et al., 2001 Mult. Seler. 7: 305-12). Således kan anvendelse av midler som antagoniserer TNF-a-funksjonen eller inhiberer syntesen, være anvendbare i kombinasjon med midlene og forbindelsene som beskrives her. Disse kan omfatte anti-TNF-a-antistoffer (f.eks. infliximab), så vel som midler som pirfenidon. Pirfenidon er et ikke-peptid medikament som har blitt vist å redusere syntesen av TNF-a og blokkere reseptorer for TNF-a. Id.

I lang tid har grunnpillaren i de fleste demyelineringstilstander og -sykdommer vært anvendelse av ACTH, glukokortikoider og kortikoide steroider. Disse midlene anvendes for deres anti-ødemvirkning og anti-inflammatoriske virkning. ACTH tilføres vanligvis til et individ i en mengde på 80 U tilført intravenøst i 500 ml 5 % dekstrose og vann over et tidsrom på 6-8 timer i 3 dager. Hormoner kan også tilføres intramuskulært i en konsentrasjon på 40 U/ml og en dose på 40 U hver 12. time i 7 dager, hvoretter dosen så reduseres hver 3. dag. Se S. Hauser, "Multiple Sclerosis and other demyelinating diseases", in Harrison's Principles of Internal Medicine 2287-95 (13. utgave, Isselbacher et al., red. 1994). Metylprednisolon tilføres typisk langsomt i 500 ml D5W over et tidsrom på 6 timer, fortrinnsvis om morgenen. Vanlige doser omfatter 1000 mg daglig i 3 dager, 500 mg daglig i 3 dager og 250 mg daglig i 3 dager. Id. En kombinasjon av metylprednisolon og prednison tilføres også ofte. Typisk tilføres tilnærmet 1000 mg metylprednisolon intravenøst over 3 dager, fulgt av oralt tilført prednison i en mengde på 1 mg/kg per dag i 14 dager. For anvendelse i kombinasjon med forbindelsene og preparatene som beskrives her, kan således steroidene tilføres i mengder som varierer fra tilnærmet 1 til tilnærmet 1000 mg/kg, over fra tilnærmet 1 til 14 dager etter behov.

En bivirkning ved demyelinerende tilstander som MS er tretthet og redusert kognitiv funksjon. Midler som amantadin-hydroklorid og pemolin har ofte blitt anvendt for behandling av tretthet forbundet med MS (Geisler et al., 1996 Arch. Neurol. 53: 185-8).

Fordelen ved slike kombinasjonsbehandlinger er at behandlingen kan redusere de klassespesifikke og middelsspesifikke bivirkningene som i dag oppleves med noen av medikamentene. Klassespesifikke bivirkninger forbundet med interferon-beta omfatter feber, frysninger, myalgier, artralgier og andre influensalignende symptomer som begynner 2-6 timer injeksjonen og som typisk forsvinner 24 timer etter injeksjonen. I blant induserer interferon-beta også en forbigående forverring av de foreliggende MS-symptomer. Middelsspesifikke bivirkninger omfatter reaksjoner på injeksjonssetet med interferon-beta-lb. Kontroll over disse virkningene kan oppnås ved å skreddersy dosen og tilførsels-tidspunktet og foreskrive egnede kombinasjoner av acetaminofen, ikke-steroide antiinflammatoriske medikamenter (NS eller NSAIDS) og steroider. Se Munschauer et al., 1997 Clin. Ther. 19:883-93.

Således kan kombinasjoner av medikamenter redusere mengden av et gitt medikament som tilføres og reduserer uønskede bivirkninger som oppleves av pasienten.

Ved tilførsel i kombinasjon kan de lavmolekylære alfa-4-integrinantagonistene tilføres i samme utforming som disse andre forbindelsene eller preparatene, eller i en separat utforming. Ved tilførsel i kombinasjon tilføres anti-alfa-4-antistoffene generelt i et preparat som er separat fra de andre forbindelsene og sammensetningene. Ved tilførsel i kombinasjoner kan anti-alfa-4-midlene tilføres før, etter eller samtidig med de andre forbindelsene og preparatene som anvendes for behandling, lindring eller døyving av symptomer.

EKSEMPLER

De påfølgende eksempler gis for å gi gjennomsnittsfagfolk en fullstendig redegjørelse for, og beskrivelse av, representative eksempler på hvordan utførelser av foreliggende oppfinnelse kan fremstilles og anvendes. Man har anstrengt seg for å sikre nøyaktighet når det gjelder anvendte tall (for eksempel mengder, temperatur osv. ), men en viss eksperimentell feil og visse avvik bør det tas høyde for. Dersom ikke annet er angitt, er deler vektsdeler, molekylvekt er vektsgjennomsnittlig molekylvekt, temperaturer er i grader celsius og trykket er atmosfærisk trykk eller nær dette.

Eksempel 1

Kontrollert utprøvning av natalizumab i tilbakevendende multippel sklerose

Pasientpopulasjon

26 kliniske sentere i de Forende Stater, Canada og det Forende Kongeriket rekrutterte 213 pasienter mellom september 1999 og mai 2000. Institusjonenes styre, eller sentrale og lokale etiske komité godkjente opplegget. Alle pasienter ga skriftlig, informert samtykke. En uavhengig sikkerhetskomité som fulgte resultatene, hadde oversyn over undersøkelsen.

Kvalifiserte individer måtte ha en alder på mellom 18 og 65 år, med Poser-kriterier klinisk definert eller laborieunderstøttet avgjort MS, enten tilbakevendende eller sekundært progressiv (Poser et al. 1983, Ann. Neurol. 13:227-31, Lublin et al. 1966 Neurology 46: 907-11) en historie med minst to tilbakefall i løpet av de siste to år, en basal Kurtzke utvidet uførhetsstatuspoengsum (EDSS) (Kurtzke, 1983 Neurology 33: 1444-52) på mellom 2 og 6,5, og minst tre lesjoner ved T2-veid hjerne-MRI. Pasienter ble ekskludert dersom de hadde fått immunsupprimerende eller immunmodulerende behandling i løpet av de siste 3 måneder, hadde opplevd et tilbakefall eller blitt gitt systemiske kortikosteroider i løpet av de siste 30 dager.

Undersøkelsens utforming oa randomisering

Pasientene ble tilfeldig fordelt på én av tre behandlingsgrupper: 3 mg/kg natalizumab, 6 mg/kg natalizumab eller placebo, ut fra et datamaskinfrembrakt blokkrandomiseringsskjema. Pasientene ble gitt seks intravenøse infusjoner med 28-dagers mellomrom og hadde så seks måneder med oppfølging vedrørende sikkerheten. Verken undersøkeren, annet personell som inngikk i undersøkelsen, eller pasientene, hadde kjennskap til gruppefordelingen.

Fremgangsmåter og avslutningspunkter i undersøkelsen

Ikke-forsterkede protontetthet-T2-veide og Gd-forsterkede, Ti-veide MRI-hjerneskan ble erholdt under utsilingsfasen (måned-1), umiddelbart før hver behandling (måned 0-5) og en måned etter siste behandling (måned 6). Oppfølgende MRI-scan ble erholdt i måned 9 og måned 12. Førtiseks kontinuerlige, 3 mm tykke, aksiale snitt gjennom hjernen ble erholdt. MRI-analysen ble utført av et enkelt senter som ikke hadde kjennskap til pasientbehand-lingen og pasientenes historie. Lesjoner ble identifisert på utskrifter av bildene av to erfarne klinikere som var enige.

Det prospektive primære utfallsmål var antall nye Gd-forsterkende lesjoner i løpet av behandlingstiden på 6 måneder, definert som tidsrommet fra etter første infusjon til en måned etter siste infusjon. Andre MRI-parametere som ble evaluert omfattet: antall vedvarende, Gd-forsterkende lesjoner (forsterkende lesjoner som også hadde forsterket på forrige måneds scan), volumet av Gd-forsterkende lesjoner målt ved en halvautomatisk, lokal terskelfremgangsmåte, Grimaud et al., 1996 Magn. Reson. Imaging 14: 495-505), antall nye, aktive lesjoner (dvs. nye Gd-forsterkende lesjoner samt nye eller voksende, ikke-forsterkende T2-lesjoner), og antall aktive scan (dvs. scan som inneholdt én eller flere nye Gd-forsterkende lesjoner).

Kliniske avslutningspunkter omfattet hyppighet av tilbakefall og endringer i EDSS, samt en selvrapportert, global vurdering ved anvendelse av en visuell-analog skala (VAS). Alle ugunstige begivenheter ble notert. Pasientene ble undersøkt hvert kvartal ifølge avtale og ved ikke-avtalte besøk for mistenkte tilbakefall av de behandlende og evaluerende nevrologene, som ikke kjente til hvilken behandlingsgruppe pasienten inngikk i. Den behandlende nevrolog utførte en medisinsk historie og undersøkelse og noterte ugunstige begivenheter. Den evaluerende nevrolog anslo den nevrologiske status og beregnet en EDSS-poengsum uten kjennskap til pasientens historie eller tidligere EDSS-poengssummer.

Et objektivt tilbakefall ble definert som forekomst av en akutt episode med nye eller forverrede MS-symptomer som varte i minst 48 timer, etter en stabil periode på minst 30 dager. Tilbakefallet var også ledsaget av en økning på minst ett poeng i EDSS-poeng-summen, en økning på minst ett poeng i to funksjonelle systempoengsummer (FSS) eller en økning på minst to poeng i én FSS sammenlignet med utgangspunktet, bestemt av den evaluerende nevrolog. Nevrologiske symptomer som ikke oppfylte kriteriene ovenfor for tilbakefall, men som av den behandlende nevrolog ble anslått til å utgjøre et tilbakefall, ble også notert (totalt antall tilbakefall).

På en visuell, analog skala (VAS), avmerket pasientene en plassering langs en

10 cm linje som gjenspeilet deres vurdering av deres totale velvære i utgangspunktet, og etter 3 og 6 måneders behandling, hvor høyere poeng gjenspeiler større grad av velvære.

Pasientene ble oppfulgt klinisk til måned 12. Pasienter som avbrøt behandlingen, men som ikke nådde avslutningspunktet, ble oppmuntret til å komme tilbake for opp-følgende vurderinger.

Statistisk analyse

Prøvestørrelsesestimatene var basert på antall nye Gd-forsterkende lesjoner observert i løpet av de første 12 uker etter første infusjon i en tidligere klinisk utprøving av natalizumab (Tubridy et al., 1999 Neurology 53: 466-72). Basert på resultatene fra denne foregående utprøvingen og ved anvendelse av prøvestørrelsesmetodologi egnet for en tosidig, to gruppers sammenligning ved et signifikansnivå på 5 prosent, basert på Wilcoxon-Mann-Whitney-statistikk (Noether, 1987 J. Amer. Stat. Assoc. 82: 645-7) ble det beregnet at det var nødvendig med tilnærmet 73 pasienter i hver gruppe for 80 prosent kraft.

Den primære sammenligning av antall Gd-forsterkende lesjoner mellom 6 mg/kg natalizumab og placebo, så vel som Gd-forsterkende volumer ble evaluert med Wilcoxon-

Mann-Whitney rangeringssum-analyse. Manglende verdier grunnet at ett eller flere MRI-scan ikke ble uført, ble estimert ved å erstatte den manglende verdi med det gjennomsnittlige antall lesjoner i tilgjengelige scan for den angjeldende pasient. MRI-scan erholdt fra pasienter som hadde blitt gitt systemiske kortikosteroider i løpet av de foregående 30 dager, ble fjernet og behandlet som manglende verdier. (Cochran-Mantel-Haenszel korrelasjonsstatistikk ved anvendelse av poengsum med samme avstand for gruppene og rangeringspoeng for primærutfallsvariabelen, ble anvendt for å analysere for et dose-responsforhold ved anvendelse av resultater fra alle tre grupper.

Pearsons chi-kvadratanalyse ble anvendt for å sammenligne pasientandeler med tilbakefall. Endringer fra utgangspunktet i EDSS og VAS ble analysert ved anvendelse av en toveiers ANOVA med undersøkelsessenter og behandlingsgrupper som uavhengige variabler.

Alle analyser omfattet alle randomiserte pasienter og fulgte formål-å-behandle-prinsippet. Alle angitte P-verdier er tohalede. Det var ingen signifikante forskjeller når det gjelder demografiske egenskaper, MS-sykdomshistorie, EDSS ved inntak i undersøkelsen og MRI-parametere mellom de tre gruppene ved undersøkelsens begynnelse (tabell 1).

Primærutfall

Pasientene i placebo-gruppen viste gjennomsnittlig 9,6 nye Gd-forsterkende lesjoner i løpet av behandlingstiden på seks måneder. De tilsvarende verdier i gruppene som ble gitt natalizumab var 0,7 for 3 mg/kg-gruppen (p<0,0001) og 1,1 for 6 mg/kg-gruppen (p<0,0001) (se tabell 2). Denne forskjellen utgjorde en reduksjon på 93 %, henholdsvis 88 % i antall nye Gd-forsterkende lesjoner i 3 mg/kg-gruppen, henholdsvis 6 mg/kg-gruppen. En forskjell mellom behandlingsgruppene, sammenlignet med placebo-gruppen, var åpenbar etter første infusjon (fig. 1).

<*>(i) sammenligning mellom placebo og 3 mg/kg natalizumab, (ii) sammenligning mellom placebo og 6 mg/kg natalizumab

Sekundære MPJ- utfall

Det var en signifikant og markant reduksjon av det kumulative antall vedvarende forsterkende lesjoner, nye aktive lesjoner, totalvolumet av forsterkende lesjoner og prosentandelen av aktive scan fra måned 1-6 (tabell 2, fig. 2).

Utfall for klinisk virkning

I løpet av behandlingsperioden på seks måneder ble i alt 35 tilbakefall rapportert hos 26 av de 71 placebo-pasientene, 18 tilbakefall ble rapportert hos 13 av de 68 pasientene som ble gitt 3 mg/kg natalizumab, og 15 tilbakefall ble rapportert hos 14 av de 74 pasientene som ble gitt 6 mg/kg (P=0,05 for placebo sammenlignet med alle natalizumab-behandlede pasienter). Ved anvendelse av de mer stringente kriteriene for objektivt tilbakefall, var virkningen like kraftig: 18 tilbakefall hos 15 placebo-pasienter, 3 tilbakefall hos 3 pasienter som ble gitt 3 mg/kg natalizumab, 8 tilbakefall hos 8 pasienter som ble gitt 6 mg/kg natalizumab (P=0,05). Flere tilbakefall i placebo-gruppen krevde behandling med steroider enn i behandlingsgruppene (22 i placebo-gruppen, 5 i gruppen med 3 mg/kg natalizumab og 7 i gruppen med 6 mg/kg natalizumab, P=0,007 for placebo sammenlignet med alle natalizumab-behandlede pasienter).

I VAS-evalueringen rapporterte pasientene i placebo-gruppen ingen endring, mens pasientene i natalizumab-gruppene rapporterte forbedret velvære i måned 6, på et tidspunkt hvor forskjellen mellom gruppene var signifikant (P=0,033 for placebo sammenlignet med alle natalizumab-behandlede pasienter). Ingen signifikante endringer i EDSS ble observert i noen av gruppene under behandlingen.

Antistoffkonsentrasion og reseptormetning

Serumprøver ble oppsamlet fra pasienter for hvert besøk og analysert kvantitativt for antistoffer rettet spesifikt mot natalizumab ved anvendelse av en enzymkoblet immunabsorpsjonsanalyse (ELISA). Serumnivået av natalizumab og binding av natalizumab til reseptoren ble også målt i en undergruppe på 12 til 14 pasienter pr. behandlingsgruppe før hver infusjon og 2 timer, 24 timer, 1, 2 og 3 uker etter første og siste infusjon.

Antistoffkonsentrasjonen i serum ble bestemt ved anvendelse av en ELISA-analyse. Kort beskrevet ble en 2,0 \ ig/ m\ løsning av et innfangingsantistoff som bindes spesifikt til natalizumab fremstilt i en løsning som inneholdt natriumbikarbonat til pH 8,3. 100^1 av antistoffløsningen ble tilsatt til hver brønn i en Costar 96-brønners mikrotiterplate. Platen ble forseglet med tape og inkubert ved romtemperatur i 12-26 timer. Væsken ble avsugd, og 200^1 blokkeringsbuffer (0,25 % kasein i PBS pH 7,4) ble tilsatt til hver brønn og inkubert i ytterligere en time ved romtemperatur. Platene ble så enten tørket og lagret for senere anvendelse eller vasket én gang med 300^1 vaskebuffer (TBS, pH 7,5 tilsatt 0,05 % Tween-20). Dersom platene ble tørket ble de rehydrert like før anvendelsen ved tilsetning av 300^1 vaskebuffer til hver brønn og inkubering i 1-2 minutter. Væske ble sugd ut av platene, som så ble satt opp ned på papirlommetørklær for absorpsjon av overskudd av væske.

Analyseprøvene ble fortynnet i kaseinfortynningsmiddel før ELISA (0,25 % kasein i PBS, med 0,05 % Tween 20, pH 7,4). Typisk analyseres to eller tre fortynninger av hver prøve for å sikre at natalizumab-verdiene var nøyaktige. Fortynningskontrollprøver ble også fremstilt ved anvendelse av kjente mengder natalizumab for å bestemme nøyaktigheten av de gjenværende trinn.

100^1 referansestandard, analyseprøve eller fortynningskontrollprøve ble tilsatt til hver brønn, og platen ble inkubert i 60-75 minutter ved romtemperatur. Platene ble vasket tre ganger med vaskebuffer og gjenværende fuktighet fjernet. 100^1 nyfortynnet anti-humant IgG4 fra mus-alkalisk fosfatase-konjugat ble tilsatt til hver brønn, og platene ble inkubert i ytterligere 60 minutter ved romtemperatur. Etter inkuberingen ble platene vasket fire ganger med vaskebuffer og gjenværende fuktighet fjernet. 100^1 fluorescenssubstrat A ble tilsatt ved anvendelse av en kalibrert flerkanalpipette, og platene ble inkubert i 45-60 minutter ved romtemperatur. Nivået i hver brønn ble bestemt ved anvendelse av en fmaks fluorescens-mikroplateleser ved anvendelse av programvaren SOFTmax Pro versjon 1.3.1 og fremgangsmåtefil conc 102.ppr.

Resultatene er som vist i Fig. 3 og 4. Som vist i disse figurene avtok natalizumab-nivået mellom doseringene, og i måned 7 eller 8 (dvs. 2 til 3 måneder etter siste dosering) kunne antistoffet ikke påvises hos de fleste pasienter.

I tillegg til at antistoffkonsentrasjonen i serum ble målt ble reseptormetningsnivået, og spesielt VLA-4-metningsnivået, bestemt under doseringsundersøkelsen ved anvendelse av FACS-analyse. VLA-4-metningsnivået ble bestemt ved en indirekte immunanalyse og anvendelse av "flow"-cytometri.

Tilnærmet 1 ml av en blodprøve fra en pasient ble utporsjonert i to 15 ml polypropylenrør, og kald vaskebuffer (humant serum [Scantibodies Laboratory, Inc. del 3SH341] fortynnet til 3 % i PBS) ble tilsatt til rørets 14 ml-merke. Rørene sentrifugeres ved 2200 rpm i 5 minutter ved 10-15 °C, og væsken avsuges og kastes. De nedsentrifugerte cellene resuspenderes i kald vaskebuffer til et totalvolum på 1 ml.

En referansestandardløsning med 500^g natalizumab/ml fremstilles i vaskebuffer. 20^1 av den fortynnede natalizumab-referanseløsning ble tilsatt til det første rør, og 20^1 vaskebuffer ble tilsatt til det andre rør. Begge rør ble inkubert på is i 30 minutter i mørke. Etter inkuberingen ble rørene fylt opp til 14 ml-merket med vaskebuffer og sentrifugert ved 2200 rpm i 5 minutter under avkjøling. Supernatanten ble avsugd og vasketrinnet gjentatt nok en gang. Etter andre gangs vask ble cellene resuspendert i vaskebuffer til 1 ml-merket. 10^1 R-fykoerytrin (PE)-konjugert anti-humant CDw49d-antistoff (Pharmingen, Kat. nr. 31475X) ble tilsatt til hvert rør, og rørene ble forsiktig vorteksbehandlet. Rørene ble inkubert ved 2-8 °C i 10-15 minutter i mørke. Etter inkuberingen ble 2 ml IX lyserings-løsning pH 7,4 tilsatt, og hvert rør ble forsiktig vorteksbehandlet. Rørene ble inkubert på is i 10-15 minutter ved 2-8 °C og sentrifugert i 5 minutter under avkjøling, og supernatanten ble sugd bort fra de nedsentrifugerte cellene. Nedsentrifugerte celler ble resuspendert i 4 ml kald fargebuffer, og rørene ble igjen sentrifugert ved 2200 rpm under avkjøling. Supernatanten ble så svært forsiktig fjernet, og 0,5 ml av en fikseringsløsning (Ortho's Fixative pH 7,6) ble tilsatt og rørene umiddelbart vorteksbehandlet for å sikre resuspendering av cellene i fikseringsmiddelet. Rørene ble dekket med aluminiumsfolie inntil FACS-analysen.

Prøvene ble så analysert for VLA-4-reseptormetning i prøver med og uten analysert natalizumab ved anvendelse av et FACS Calibur flow-cytometer og programvaren "CellQuest". Programvaren "CellQuest" tillater oppsamling og analyse av verdier fra "flow"-cytometeret.

Reseptormetningsnivåene er vist i Fig. 5. Reseptormetningsnivået for måned 1-4 ble bestemt før den månedlige dosering. Reseptormetningsnivået som ble oppnådd med doseringsmellomrom på 1 måned var vedvarende temmelig høyt, og dette kroniske nivå var tilstrekkelig til å oppnå en undertrykkelse av den patologiske inflammasjon og tilhørende fysiologiske kjennetegn på sykdommen. Gjennomsnittlig ble metningsnivået holdt i én måned med en middelverdi på minst 67 % og en medianverdi på minst 75 %. Disse nivåene var tilstrekkelige for undertrykkelse av hjernelesjoner hos de behandlede pasientene (se Fig. 1). Det minimale metningsnivå som ble påvist i undersøkelsen før infusjonen fra måned 2 til måned 5 (og uke 21 etter tilførselen i måned 5) er spesielt lav sammenlignet med middelverdien og medianverdien, grunnet én enkelt pasient med en antistoffrespons mot natalizumab.

Etter hvert som reseptormetningsnivået avtok i pasientene avtok virkningen av behandlingen. Et gjennomsnittlig reseptormetningsnivå på 42 % og et mediant reseptormetningsnivå på 41 % reseptormetning i den behandlede populasjon var ikke forbundet med undertrykkelse av hjernelesjoner i pasientpopulasjonen (se Fig. 2 og 5), og det er således nødvendig med et kronisk reseptormetningsnivå som er høyere enn dette for effektiv undertrykkelse av patologisk inflammasjon ved anvendelse av midler, for eksempel alfa-4-inhibitorer.

Sikkerhet oa tolererbarhet

Gjentatt natalizumab-behandling i en dose på enten 3 eller 6 mg/kg så ut til å tåles godt av pasienter med MS over et behandlingstidsrom på seks måneder. Et tilsvarende antall pasienter fra hver gruppe opplevde ugunstige begivenheter grunnet behandlingen. Om enn ikke i signifikant grad opptrådte visse ugunstige begivenheter hyppigere hos natalizumab-pasientene, sammenlignet med placebo-gruppen (Tabell 3). En vedvarende, mild lymfocytose ble observert i natalizumab-gruppene over behandlingstidsrommet på seks måneder.

Det var ingen signifikante forskjeller i antall alvorlige ugunstige begivenheter (SAE) rapportert i placebo-gruppen og behandlingsgruppene (dvs. at 7 placebo-behandlede pasienter rapporterte 11 SAE, 5 pasienter som ble gitt 3 mg natalizumab/kg rapporterte 5 SAE og 3 pasienter som ble gitt 6 mg natalizumab/kg rapporterte 4 SAE). Av disse ble fire ansett for å være immunformidlede og forbundet med analysemedikament. Det var én anafylaktisk reaksjon med urticaria og bronkospasmer i 3 mg/kg-gruppen, og dette ble hurtig reversert ved behandling med antihistaminer og steroider. Det var tre rapporter vedrørende serumsyke, én i hver gruppe, innbefattet placebo-gruppen. Kun én begivenhet var ledsaget av endret komplementnivå, og alle opptrådte på det samme undersøkelsessete. I alt kompliserte disse begivenhetene færre enn én av 250 infusjoner.

Det var ingen forskjeller mellom gruppene i antall pasienter som avbrøt behandlingen grunnet en ugunstig begivenhet (dvs. 3 i placebo-gruppen, 4 i 3 mg/kg- gruppen og 3 i 6 mg/kg-gruppen). Det var ett dødsfall i undersøkelsen, som følge av pleural karsinomatose komplisert av hemotoraks hos en placebo-pasient.

Hastigheten for dannelse av antistoff ble også anslått. I alt utviklet 15 natalizumab-behandlede pasienter (11 prosent) anti-natalizumab-antistoffer: 13 i løpet av behandlingen og 2 i oppfølgingstidsrommet etter behandlingen. Den kliniske betydning, om noen, av nærvær av anti-natalizumab-antistoffer er for tiden ikke kjent.

Den maksimale serumkonsentrasjon av natalizumab var doseavhengig, og det ble ikke observert signifikant akkumulering ved gjentatt dosering. Pasientene som ble gitt 3 mg natalizumab/kg viste mer enn 80 % metning av VLA-4-reseptoren under behandlingstidsrommet, reseptorbindingen var høyere (tilnærmet 90 %) og mer langvarig hos pasienter som ble gitt 6 mg natalizumab/kg.

Oppfølging etter behandlingen: måned 6- 12

Det kumulative antall nye forsterkende lesjoner og aktive skanninger (måned 9 og 12 sett under ett) var tilsvarende i alle tre grupper (Tabell 2). Det var en tendens mot mindre aktivitet i 6 mg/kg-gruppen i måned 9. Det var ingen signifikant forskjell i det totale antall rapporterte kliniske tilbakefall mellom de tre gruppene: 24 i placebo-gruppen, 24 i 3 mg/kg-gruppen og 26 i 6 mg/kg gruppen, eller i antall tilbakefall bestemt ut fra de på forhånd definerte, objektive kriterier.

Denne undersøkelsen er den første som tilveiebringer kraftige MRI-bevis og klinisk bevis hos mennesker for at selektiv inhibering av alfa-4-integrinformiddelet leukocytt-adhesjon og leukocyttrafikkering er en effektiv tilnærming for kronisk behandling av MS. Både dosenivået av det alfa-4-integrinspesifikke, humaniserte monoklonale antistoff natalizumab viste statistisk sett svært signifikante virkninger sammenlignet med placebo når det gjelder undertrykkelse av nye Gd-forsterkende inflammatoriske hjernelesjoner hos pasienter med MS over behandlingstidsrommet på seks måneder. En reduksjon av disse lesjonene hos natalizumab-behandlede pasienter ble observert én måned etter første infusjon, og reduksjonen holdt seg gjennom behandlingstidsrommet. For begge dosenivåer var reduksjonen tilnærmet 90 %, en virkning som er høyere enn reduksjonen på 50 til 70 % som er rapportert for beta-interferoner (MS/MRI Analysis Group, 1995 Neurology 4: 1277-1285; Jacobs et al., 1996 Ann. Neurol. 39: 285-294; og PRISMS (Prevention of Relapses and Disability by Interferon beta-la Subcutaneously in Multiple Sclerosis) Study Group, 1998 Lancet 352: 1498-1504).

Videre understøttes virkningene av natalizumab på MRI-utfall i denne undersøkelsen av kliniske observasjoner. Denne undersøkelsen var ikke prospektivt drevet for å vise virkninger på klinisk utfall. Ikke desto mindre førte behandling med natalizumab til en signifikant reduksjon av tilbakefallsfrekvensen og en opplevelse av forbedret velvære blant pasientene. Dersom alle rapporterte kliniske tilbakefall tas i betraktning opplevde de to natalizumab-gruppene signifikant færre tilbakefall enn placebo-gruppen i løpet av seks måneders behandling. En signifikant reduksjon av disse episodene ble også observert ved anvendelse av på forhånd definerte tilbakefallskriterier, et mer stringent mål siden det krever en endring i objektive tegn. Virkningen av natalizumab på tilbakefall er høyere enn virkningen av dagens godkjente behandlingsformer for MS, som viser tilnærmet 30 % virkning (MS/MRI Analysis Group, supra; Jacobs et al., supra; PRISMS Study Group, supra; Johnson et al., 1995 Neurology 45: 1268-76).

Det er viktig at ingen tilbakeslagsvirkninger vedrørende nye MRI-lesjoner eller tilbakefall ble observert i natalizumab-gruppene etter avsluttet behandling. Videre ble månedlige infusjoner av natalizumab i seks måneder godt tolerert og forbundet med en sikkerhetsprofil som ligner på placebo-profilen og som er akseptabel for kronisk behandling av MS.

Resultatene fra denne undersøkelsen gir ytterligere støtte for en rolle for alfa-4-integrin og immunceller som uttrykker integrinet i patogenesen for akutte inflammatoriske hjernelesjoner hos pasienter med MS. Reduksjonen av antall nye Gd-forsterkende lesjoner var åpenbar etter én måneds behandling. Denne observasjon tyder på at natalizumab virker tidlig i lesjonsutviklingen ved å forhindre forekomsten av nye lesjoner.

I oppsummering har natalizumab vist kraftige virkninger på klinisk meningsfulle parametre i denne placebo-kontrollerte utprøving hos pasienter med tilbakevendende MS. Behandlingen ble godt tolerert i løpet av denne utprøvingen over seks måneder. De gunstige virkningene av natalizumab på forekomsten av nye inflammatoriske CNS-lesjoner, forekomsten av kliniske tilbakefall og forbedringen av pasientenes velvære som ble observert i denne undersøkelsen viser potensialet for å observere virkninger på uførheten i de mer langvarige undersøkelsene som nå er i gang.

Eksempel 2

Kontrollert utprøving av natalizumab ved crohns sykdom

Fremgangsmåter

I en dobbelt blind, placebo-kontrollert utprøving ble 248 pasienter med moderat til alvorlig aktiv Crohns sykdom (CD) randomisert for å motta to infusjoner av placebo, én infusjon av 3 mg/kg natalizumab fulgt av placebo eller to infusjoner med 3 eller 6 mg natalizumab/kg med 4 ukers mellomrom. Utfallsmålene omfattet Crohns sykdom aktivitets-indeks (CDAI), helseforbundet livskvalitet (QOL) og serumnivået av C-reaktivt protein.

Natalizumab forhøyet frekvensen av klinisk remisjon og klinisk respons og forbedret QOL hos pasienter med aktiv CD, samtidig som forbindelsen viste en sikkerhetsprofil som er akseptabel for behandling av denne sykdom.

Pasientpopulasjon

Etter godkjenning av den lokale etikkomité gjennomsøkte hvert senter menn og kvinner på minst 18 år som hadde kliniske tegn på moderat til alvorlig aktiv CD, definert som en CDAI på minst 220, men lavere enn eller lik 450. Av 311 undersøkte pasienter ble 248 randomisert i 35 undersøkelsessentre i Belgia, Tsjekkia, Danmark, Tyskland, Israel, Nederland, Sverige og Det Forente Kongerike fra september 1999 til august 2000. Alle pasienter gav informert, skriftlig samtykke. Pasienter som hadde blitt gitt metotrexat syklosporin eller et utprøvingsmiddel i løpet av de siste 3 månedene ble ekskludert, for pasienter ble gitt azatioprin eller 6-merkaptopurin ble det krevd at de hadde vært på en stabil dose i minst 4 måneder. Andre eksklusjonskriterier omfattet tidligere antistoff-behandling, pågående bruk av oral prednisolon i en dose høyere enn 25 mg/dag, pågående bruk av et elementært kosthold eller parenteral næringstilførsel, infeksiøse eller neoplastiske sykdommer i tarmen, kirurgiske tarminngrep i løpet av de siste 3 månedene, forekomst av en kolostomi, ileostomi eller kolorektostomi med ileorektal anastomose, symptomer hovedsakelig grunne nærvær av fibrotiske strikturer og et klinisk inntrykk av at pasienten sannsynligvis var nær ved å ha behov for øyeblikkelig kirurgisk behandling av bukområdet.

Undersøkelsens utforming og randomisering

Pasienter som oppfylte opptakskravene ble tilfeldig fordelt på fire behandlingsgrupper ut fra et datamaskinfrembrakt blokkrandomiseringsskjema. Hver gruppe ble gitt to intravenøse infusjoner med 4 ukers mellomrom. De fire behandlingsskjemaene var to infusjoner av placebo, én infusjon av 3 mg/kg natalizumab fulgt av placeboinfusjon og to infusjoner av 3 eller 6 mg/kg natalizumab. Undersøkeren, alt annet personell som inngikk i undersøkelsen og pasientene var uvitende om fordelingen på behandlingsgruppene.

Fremgangsmåter og avslutningspunker i undersøkelsen

Det primære virkningsavslutningspunkt var andelen av pasienter i remisjon (CDAI < 150) i uke 6. CDAI omfatter åtte beslektede variabler: antall flytende eller svært myke avføringer pr. dag, omfanget av buksmerter eller bukkramper, generelt velvære, forekomst av ekstraintestinale sykdomstegn, forekomst av en abdominalmasse, anvendelse av antidiarétiske midler, hematokritt og kroppsvekt, (Best et al., 1976 Gastroenterology 70: 439-441: og Summers et al., 1979 Gastroenterology 77: 847-69). Poengsummer som var lavere enn 150 indikerte remisjon, poengsummer på mellom 150 og 219 viste en svakt aktiv sykdom, mellom 220 og 450 indikerte moderat aktiv sykdom og poengsummer høyere enn 450 indikerte alvorlig aktivitet. Ytterligere prospektive avslutningspunkter var andelen av pasienter som viste klinisk respons (dvs. minst 70 poengs reduksjon i CDAI), helseforbundet livskvalitet, målt ved et spørreskjema spesifikt for inflammatorisk tarmsykdom, IBDQ (Irvine et al., 1994 Gastroenterolgoy 106: 287-96), og serumnivået av C-reaktivt protein.

Sikkerhetsevalueringer, innbefattet notering av uønskede begivenheter og måling i kliniske laboratorier, ble utført gjennom hele undersøkelsen. En uavhengig komité som fulgte sikkerhetsresultatene gav ytterligere et oppfølgingsnivå. Serumprøver ble oppsamlet ved hvert besøk og analysert for antistoffer mot natalizumab ved en enzymkoblet immunabsorbsjonsanalyse (ELISA).

Statistisk analyse

Alle virkningsanalyser benyttet "intent-to-treat" (ITT) "last observation carried forward (LOCF)"-populasjonen, som omfattet alle randomiserte pasienter (n = 248). Pasienter som benyttet redningsmedikamenter ble klassifisert som mislykkede behandlinger. Sikkerhetspopulasjonen (n = 244) omfattet randomiserte og doserte pasienter. Fire pasienter ble ikke dosert siden de ikke oppfylte kravene for opptak i undersøkelsen.

Alle statistiske analyser var tosidede og ved 5 prosentsnivået for statistisk signifikans. Tre parvise analyser for hver aktive behandling sammenlignet med placebo ble utført. Remisjonsfrekvens og res po nsf re kvens ble analysert ved Cochran Mantel-Haenszel-chi-kvadratanalyse (generell assosiasjon) (Landis et al., 1978 Int'1. Stat. Rev. 46: 237-54) ved anvendelse av land som strata. Virkningen av kovariater på remisjon og respons (ja eller nei) ble analysert i uke 6 ved anvendelse logistisk regresjon.

Prøvestørrelsen på 60 individer pr. gruppe ble beregnet å gi 80 % kraft ved et signifikansnivå på 5 % for påvisning av en forskjell i responsfrekvens, ved antagelse av en 40 prosents responsfrekvens i natalizumab-gruppene og 15 % responsfrekvens i placebo-gruppen.

Toveisanalyse av variansmodeller med faste virkninger for land og behandlingsgruppe ble anvendt for sammenligning av gjennomsnittlig CDAI-reduksjon fra utgangspunktet. Kontraster som sammenlignet de aktive behandlingsgruppene med placebogruppen ble analysert.

Verdier for C-reaktivt protein og IBDQ ble analysert ved anvendelse av Wilcoxon-Mann-Whitney-analysen for sammenligning av endringen relativt til utgangsnivået mellom hver av de tre aktive behandlingsgruppene og placebo-gruppen. I en prospektiv, planlagt analyse ble nivået av C-reaktivt protein sammenlignet for pasienter med en verdi som lå over den øvre grense for det normale område på 8 mg/l ved undersøkelsens begynnelse (uke 0).

Resultater

Demografiske egenskaper, CDAI-poeng, sykdomssete og medikasjoner var alle sammenlignbare mellom gruppene i utgangspunktet (tabell 4). På tidspunktet for uke 0-vurderingen mottok de fleste pasienter annen medikasjon for CD, innbefattet 5-ASA-forbindelser (48 til 64 %), orale steroider (46 til 63 %) eller azatioprin/6-merkaptopurin (18 til 37 %), med eller uten andre midler. 27 pasienter trakk seg fra undersøkelsen før fullføring av de 12 ukene: 10 i placebo-gruppen og 6, 5 og 6 i 3+0, 3+3 og 6+6 mg/kg natalizumab-gruppene.

Klinisk respons, remisjon og gjennomsnittlige CDAI- poeng

Andelen av pasienter som oppnådde en klinisk respons (dvs. minst 70 % reduksjon av CDAI fra utgangsverdien) var statistisk signifikant høyere enn for placebogruppen i alle tre natalizumab-gruppene i uke 4, 6 og 8 (tabell 5 og fig. 6), og denne virkningen vedvarte frem til og med uke 12 i de to gruppene som ble gitt 2 infusjoner med natalizumab. Tendenser for forbedret klinisk responsfrekvens ble observert så tidlig som 2 uker etter første behandling og gruppen med 3+3 mg/kg natalizumab viste en statistisk signifikant forskjell fra placebogruppen på dette tidspunkt. Resultatene for reduksjonen av utgangsverdien for gjennomsnittlig CDAI-poeng (tabell 6) stemmer med responsfrekvens-funnene.

Fire uker etter første behandling og før pasientene ble gitt den andre behandling, hadde alle de tre natalizumab-gruppene en statistisk signifikant høyere remisjonsfrekvens enn pasientene i placebo-gruppen (tabell 5 og fig.7). I uke 6, det prospektivt definerte primære avslutningspunkt, var andelen av pasienter i klinisk remisjon statistisk signifikant høyere enn kun i 3+3 mg/kg natalizumab-gruppen sammenlignet med placebo-gruppen. I uke 8 viste begge grupper som hadde blitt gitt to infusjoner natalizumab (enten 3 eller 6 mg/kg) statistisk signifikant høyere remisjonsfrekvens enn placebo-gruppen. I uke 12 fortsatte 3+3 mg/kg natalizumab-gruppen å vise en statistisk signifikant bedring relativt til placebo-gruppen for klinisk remisjon, mens 6+6 mg/kg-gruppen viste en kraftig tendens til bedring sammenlignet med placebo-gruppen for dette utfall.

Prediktive tegn på remisjon eller respons

Ved anvendelse av resultatene fra uke 6 ble det utført en analyse for å påvise basallinjevariabler som kan prediktere remisjon eller klinisk respons. De undersøkte variablene omfattet sykdomssete, sykdommens varighet, CDAI-poeng ved undersøkelsens begynnelse, samtidig anvendelse av orale steroider, samtidig anvendelse av azatioprin eller 6-merkaptopurin og ekstraintestinale symptomer. CDAI-poengsum ved forsøkets begynnelse varen signifikant prediktorfor remisjon (P < 0,001), pasienter med høy CDAI-poengsum i utgangspunktet hadde mindre sannsynlighet for å oppnå remisjon. CDAI-utgangsverdien predikterte imidlertid ikke sannsynligheten for respons. Alle andre analyserte variabler var ikke signifikante prediktorer for remisjon eller respons.

Livskvalitet

En statistisk signifikant forbedring av gjennomsnittlig IBDQ-poengsum ble observert i alle natalizumab-behandlingsgrupper i uke 6 ved sammenligning med placebo-gruppen. I uke 12 hadde bare behandlingsgruppene som ble gitt to infusjoner med natalizumab fortsatt i IBDQ-poeng som var signifikant høyere enn for placebo-gruppen (tabell 7).

C- reaktivt protein

For pasienter som hadde forhøyet serumnivå av C-reaktivt protein ved under-søkelsens begynnelse ble det utført regelmessig vurdering av nivået i løpet av under-søkelsen. Pasienter som ble gitt to infusjoner med natalizumab viste en signifikant reduksjon sammenlignet med utgangsnivået av gjennomsnittlig serumnivå av C-reaktivt protein, sammenlignet med pasienter i placebo-gruppen (fig. 8). Forbedringen vedvarte gjennom uke 12 for pasienter som ble gitt to infusjoner på 3 mg/kg natalizumab.

Sikkerhet og tolererbarhet

Natalizumab-behandling ble godt tolerert i alle dosenivåer gjennom undersøkelsens 12 uker. Et tilsvarende antall fra hver gruppe trakk seg fra undersøkelsen grunnet uønskede begivenheter (dvs. 2 i placebo-gruppen, 1 i 3 mg/kg natalizumab-gruppen, 2 i 3+3 mg/kg natalizumab-gruppen og 3 i 6+6 mg/kg natalizumab-gruppen). I alt rapporterte 31 pasienter en alvorlig uønsket begivenhet i løpet av undersøkelsens hovedfase (dvs. 9 i placebo-gruppen, 8 i 3 mg/kg natalizumab-gruppen, 8 i 3+3 mg/kg natalizumab-gruppen og 6 i 6+6 mg/kg natalizumab-gruppen). Ingen alvorlige uønskede begivenheter ble ansett å være forbundet med det undersøkte medikament, og ingen var dødelige, de fleste var innlegning på sykehus for komplikasjoner eller symptomer forbundet med CD. Antall pasienter som opplevde uønskede reaksjoner som krevde øyeblikkelig behandling var omtrent de samme i de forskjellige behandlingsgruppene: 52 (83 %) i placebo-gruppen, 51 (78 %) i 3 mg/kg natalizumab-gruppen, 57 (88 %) i 3+3 mg/kg natalizumab-gruppen og 41 (80 %) i 6+6 mg/kg natalizumab-gruppen. Tabell 8 viser uønskede begivenheter som ikke var forbundet med CD med en forekomst på minst 5 prosent høyere i en natalizumab-gruppe enn i placebo-gruppen. Ingen av disse forskjellige typene av uønskede begivenheter var statistisk signifikant forskjellig fra placebo-gruppen, og ingen anses å utgjøre en uakseptabel sikkerhetsprofil for anvendelse av natalizumab i pasienter med moderat til alvorlig CD.

Anti-natalizumab-antistoffer ble påvist hos 13 natalizumab-behandlede pasienter (7 prosent) i uke 12. I alt hadde pasienter med påvisbare anti-natalizumab-antistoffer ikke større sannsynlighet for å oppleve en uønsket begivenhet eller en alvorlig uønsket begivenhet enn pasienter uten påvisbare anti-natalizumab-antistoffer.

To pasienter opplevde infusjonsreaksjoner, hos begge opptrådte dette i løpet av den andre infusjon. En pasient i 3+3 mg/kg natalizumab-gruppen opplevde symptomer på mild kløe og erytem og ble senere funnet å være positiv for anti-natalizumab-antistoffer. En pasient i 6+6 mg/kg natalizumab-gruppen opplevde symptomer på mild kløe og hoste. Disse symptomene forsvant uten behandling, og pasienten ble senere funnet å være negativ for påvisbare anti-natalizumab-antistoffer.

Selv om det prospektivt definerte primære virkningsavslutningspunkt (klinisk remisjon, definert som CDAI < 150 i uke 6) var statistisk signifikant bedre enn i placebo-gruppen kun for 3+3 mg/kg natalizumab-gruppen ble en signifikant bedring sammenlignet med placebo-gruppen observert for dette utfall på 4 forskjellige tidspunkter for 3+3 mg/kg-gruppen (uke 4, 6, 8 og 12) og to tidspunkter for 6+6 mg/kg-gruppen (uke 4 og 8, med en tendens til bedring i uke 12). Kombinert med det funn at andelen av pasienter som opplevde en klinisk respons (definert som en reduksjon av CDAI fra utgangspunktet på minst 70 poeng) var signifikant bedre enn for placebo-gruppen for alle tre natalizumab-grupper i uke 4, 6 og 8 og i uke 12 for de to behandlingsgruppene som ble gitt to natalizumab-infusjoner gir disse resultatene kraftig bevis for at natalizumab er effektivt i behandling av moderat til alvorlig aktiv CD. Videre understøttes de gunstige virkningene av natalizumab på klinisk respons og remisjonsfrekvens basert på forbedret CDAI av signifikante forbedringer i helseforbundet QOL, målt ved IBDQ, og forbedret serumnivå av C-reaktivt protein, en akutt fase-reaktant som anvendes for kvantifisering av generell inflammasjon.

Doseringsnivået for reseptormetning i CD-undersøkelsen kan sammenlignes med nivåene i MS-undersøkelsen, og reseptormetningsnivået bør således være sammenlignbart i CD-utprøvningen. Reseptormetningsnivået i CD-utprøvningen er således forbundet med redusert inflammasjonsnivå, vist ved nivået av C-reaktivt protein og forbedringen i pasientenes generelle velvære, vist ved CDAI.

Ingen alvorlige grunner til bekymring ble påvist for noen av natalizumab-behandlingsgruppene. Prosentandelen av pasienter som utviklet påvisbare anti-natalizumab-antistoffer var lav, og det var ingen alvorlige uønskede begivenheter forbundet med påvisbare anti-natalizumab-antistoffer. Den foreliggende undersøkelsen gir sterke indisier for effektivitet og tolererbarhet av alfa-4-integrinantagonisme ved natalizumab i behandling av de kliniske tegn og symptomer på aktiv moderat til alvorlig CD. I tillegg øker det bevis disse resultater gir for at alfa-4-integrinantagonisme er en effektiv mekanisme for behandling av CD muligheten foråt denne modalitet kan ha en bredere anvendbarhet for behandling av kroniske autoimmune og inflammatoriske sykdommer.

Eksempel 3

Virkningen av natalizumab på aktiverte leukocytter i sirkulasjonen ved aktiv inflammatorisk tarmsykdom

Trafikkering av undergrupper av leukocytter inngår i patogenesen for inflammatorisk tarmsykdom (IBD). Siden alfa-4-integriner er nøkkelmediatorer i leukocyttmigrering over det vaskulære endotel, siden de uttrykkes på alle leukocytter bortsett fra neutrofile celler, ble virkningene av én enkelt infusjon av 3 mg/kg natalizumab ("Antegren") på de basale sirkulatoriske leukocyttundergruppene, naturlige dreperceller (NK-celler) og aktiverte T-celler undersøkt hos pasienter med inflammatorisk tarmsykdom (IBD). Det hadde også tidligere blitt vist at én enkelt infusjon på 3 mg/kg av natalizumab ga en vedvarende økning av antall leukocytter i perifert blod hos dyr og friske, frivillige forsøkspersoner. ("A six-month weekly intravenous toxicity study with Antegren™ in cynomolgous monkeys with a six-week recovery," Athena Report 1998, nr. 723-013-098). Det var imidlertid ukjent hvorvidt natalizumab kunne ha forskjellige virkninger på forskjellige undergrupper av leukocytter, tatt i betraktning at alle leukocytter bortsett fra neutrofile celler uttrykker alfa-4-integriner.

Fremgangsmåter. Leukocytter ekstrahert fra perifert blod fra 30 pasienter med Crohns sykdom (CD, 18 natalizumab, 12 placebo) og 10 pasienter med ulcerøs kolitt (UC, alle ble gitt natalizumab - ingen placebo) før infusjonen og 1, 2, 4, 8 og 12 uker etter infusjonen ble analysert ved fluorescensaktivert cellesortering (FACS). Natalizumab-nivået i blodet og sykdomsaktiviteten ble målt for hvert tidspunkt.

Signifikante endringer sammenlignet med utgangsverdien (p < 0,05) og korrelasjoner ble analysert ved Wilcoxons analyse henholdsvis Spearmans analyse. Wilcoxon rangeringsanalyse med fortegn for analyse av endringer i leukocyttundergrupper ble sammenlignet med utgangspunktet i behandlingsgruppene (p < 0,05) angir signifikansen). Spearmans rangeringskorrelasjonsanalyse ble anvendt for å vurdere korrelasjonen mellom sykdomsaktivitetsparametere, natalizumabnivåer og leukocyttundergrupper hos pasienter som ble gitt natalizumab.

Veneblod ble tappet umiddelbart før infusjon av natalizumab/placebo og igjen én, to, fire, åtte og tolv uker etter infusjonen. "Lymphoprep"-fremgangsmåten (Nycomed, Danmark) ble anvendt for isolering av lymfocytter fra perifert blod (PBL) før analyse ved flerfarget fluorescensaktivert cellesortering (FACS, Becton Dickenson, Oxford, UK) ved anvendelse av programvaren Consort 30 (Amlot et al., 1996 Clin. Exp. Immunol. 105: 176-82). Prosentandelen av PBL som uttrykte de påfølgende markører ble målt ved anvendelse av FACS-analyse: CD19 (B-celler), TCRocp (T-celler), CD3 (pan-T-celler), TCRy8 (T-celler), CD4 (hjelper/Th-1 T-celler), CD8 (cytotoksiske/suppressor-T-celler) og CD16 (NK-celler).

Prosentandelen av TCRap-celler som uttrykte aktiveringsantigenene CD38, CD25 (a-kjeden i interleukin-2-reseptor), CD26, CD69 og HLA-DR ble målt, i tillegg til T-celleundergruppene naive celler (CD45RA) og hukommelsesceller (CD45RO), samt "NK-T-celler" (CD57<+>/ CD3<+>). Prosentandelen av cytotoksiske T-celler/suppressor-T-celler (CD8<+>) som uttrykte aktiveringsantigenene CD28 og HLA-DR ble også målt.

Resultater. Antallet eosinofile celler, monocytter, B-celler og T-celler var signifikant forhøyet > 1 uke etter natalizumab. Det totale lymfocyttall, både B- og T-celler, var signifikant forhøyet sammenlignet med utgangsnivået. Antall neutrofile og basofile celler var uendret. T-celler som uttrykte aktiveringsmarkørene CD25, CD26, HLA-DR, CD8DR, CD8, CD28, CD45RO og CD45RA var signifikant forhøyet sammenlignet med utgangspunktet > 4 og 1 uke hos UC-pasienter henholdsvis CD-pasienter. Antall CD38<+->og CD69<+->T-celler var forhøyet etter > 1 uke, kun hos UC-pasienter. Antall NK-celler var uendret etter infusjonen hos alle pasienter, og antall T-celler av NK-type (CD57<+>) var kun forhøyet etter 1 uke hos CD-pasienter. Ingen signifikante endringer av antall gamma-delta (y8)-T-celler ble observert hos CD/UC-pasienter. Endringer i T-celleundergruppene korrelerte ikke med sykdomsaktivitet eller serumnivået av natalizumab. Endringer i leukocyttall observert etter natalizumab ble ikke påvist etter placebo.

Lymfocyttallene forble forhøyede 4 uker etter infusjonen, både hos pasienter med Crohns sykdom (p = 0,002) og hos pasienter med ulcerøs kolitt (p = 0,02), før nivået vendte tilbake til nivået før behandlingen i uke 8 (Gordon et al., 2002, Aliment. Pharm. & Ther. 16: 699-706, og Gordon et al., 2001 Gastroenterology 121: 268-74).

Virkningen av natalizumab på nøytrofile celler og monocytter i sirkulasjonen er vist i figurene 9A og 9B. Antall nøytrofile og basofile celler ble observert og forbli uendret hos alle undersøkte pasientgrupper. Figurene 10 og 11 viser virkningen av natalizumab-tilførsel på spesifikke T-celleundergrupper og naturlige dreperceller i sirkulasjonen hos pasienter med Crohns sykdom og ulcerøs kolitt. Feilstolpene angir standardavvik i alle figurer.

Ingen signifikante endringer i celletallet i de basale leukocyttundergruppene ble påvist etter placebo-infusjon. Tilførsel av placebo til de 11 placebo-pasientene er vist i tabell 9. Noen endringer i lymfocytter som uttrykte aktiveringsantigener ble påvist på isolerte tidspunkter, men kun for pasienter med Crohns sykdom (tabell 10).

Det var ingen signifikant korrelasjon mellom det totale antall lymfocytter og sykdomsaktivitetsmålene, verken hos pasienter med Crohns sykdom eller pasienter med ulcerøs kolitt (tabell 11 og 12), heller ikke ble det funnet signifikante korrelasjoner mellom de enkelte lymfocyttundergruppene og sykdomsaktivitet. Ingen signifikant korrelasjon ble påvist mellom serumnivået av natalizumab og endringer i leukocyttundergruppene 1, 2 eller 4 uker etter infusjonen. Natalizumab kunne ikke påvises hos nær sagt alle pasienter etter åtte uker. Korrelasjoner ble følgelig ikke beregnet for dette tidspunkt.

Basert på resultatene ovenfor ga en enkelt infusjon på 3 mg/kg natalizumab forhøyet nivå i sirkulasjonen av de fleste, men ikke alle leukocyttundergrupper hos pasienter med aktiv IBD. Antall eosinofile celler, monocytter og lymfocytter i sirkulasjonen var signifikant forhøyet relativt til utgangsverdien i minst fire uker etter infusjonen hos de fleste pasienter. Ett bredt utvalg av T-celleundergrupper i sirkulasjonen hadde et signifikant forhøyet celletall sammenlignet med verdiene før behandlingen, særlig for celler som uttrykte aktiveringsantigener. Imidlertid ble NK-celletallet (CD16<+>/CD3~) ikke påvirket av natalizumab, og CD57<+->T-cellene ble påvirket i mye mindre grad av natalizumab enn andre T-celleundergrupper. Lymfocytter som uttrykte yS-T-cellereseptoren ble heller ikke påvirket av natalizumab, noe som tyder på at alfa-4-integriner enten ikke uttrykkes eller uttrykkes i lavere nivå på disse cellene.

Hos aktive IBD-pasienter kan således natalizumab begrense trafikken ngen og opprettholde mange leukocyttundergrupper og grupper av aktiverte lymfocytter i sirkulasjonen. NK-celler, y8-celler og nøytrofile og basofile celler ser ut til ikke å påvirkes av tilførsel av natalizumab, noe som kan tyde på at disse er mindre viktige formidlere i disse celletypenes trafikkering.

Claims (14)

1. Anvendelse av et middel hvor middelet er det monoklonale antistoffet natalizu-mab eller et immunologisk aktivt fragment derav som inhiberer alfa-4-integrin eller en dimer som omfatter alfa-4-integrinen i fremstillingen av et medikament for anvendelse ved terapeutisk behandling av patologisk inflammasjon forårsaket av multippel sklerose eller en inflammatorisk sykdom i magetarmkanalen hvor den omfatter administrering av middelet til pasienten annenhver uke eller månedlig over et tidsrom på minst 6 måneder.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor middelet administreres månedlig

3. Anvendelse ifølge krav 1, hvor tilførsel skjer over et tidsrom på minst 12 måneder.

4. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1 til 3, hvor middelet bindes til alfa-4-integrindimerer.

5. Anvendelse ifølge krav 1, hvor alfa-4-integrindimeren er alfa-4-beta-l eller alfa-4-beta-7.

6. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1-5, hvor patologiske inflammasjon skyldes en inflammasjonssykdom i mage-tarmkanalen.

7. Anvendelse ifølge krav 6, hvor inflammasjonssykdommen i mage-tarmkanalen er Crohns sykdom, ulcerøs kolitt eller inflammatorisk tarmsykdom.

8. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1-5, hvor den patologiske inflammasjon skyldes multippel sklerose.

9. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1-8, hvor natalizumab tilføres ved infusjon hver fjerde uke i minst 6 måneder i en mengde på fra 1 mg/kg til 20 mg/kg kroppsvekt.

10. Anvendelse ifølge ethvert av krav 9, hvor natalizumab tilføres i en mengde på fra 2 mg/kg til 8 mg/kg kroppsvekt.

11. Anvendelse i følge krav 1, hvor den terapeutiske behandlingen også omfatter en aktiv forbindelse som lindrer den patologiske inflammasjonen.

12. Anvendelse ifølge krav 11, hvor den patologiske inflammasjon skyldes en inflammasjonssykdom i mage-tarmkanalen.

13. Anvendelse ifølge krav 12, hvor inflammasjonssykdommen i mage-tarmkanalen er ulcerøs kolitt, inflammatorisk tarmsykdom eller Crohns sykdom og forbindelsen som er i stand til å lindre den patologiske inflammasjonen er et 5-aminosalicylat, et glukokortikoid, et tioguaninderivat, metotrexat, et syklosporin, et monoklonalt antistoff som bindes til TNF, eller et antibiotikum.

14. Anvendelse ifølge krav 11, hvor den patologiske inflammasjon skyldes multippel sklerose.