CN1634559A - 一种解酒防醉的药物 - Google Patents

Abstract

本发明是一种解酒的药物，其特征是：它将α－溶血链球菌33号菌种搭载往返式太空飞行器，在太空的特殊条件下使导致微生物细胞中的DNA双链断裂，在微重力、高真空环境下抑制损伤的DNA修复，使α－溶血链球菌33号菌种遗传性质发生变异，优选出其中的正变异遗传性质稳定的菌种，经培育发酵后生产成解酒的生化制剂，该菌种经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCCNo.1082。所述的解酒的生化制剂是口服液，1000ml中含太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽0.8g－15.0g。这种解酒防醉的药物，它采用生化制剂解酒防醉，具有无毒，副作用小，有效率高的特点。

Description

一种解酒防醉的药物

                            技术领域

本发明涉及一种药物，特别是关于用于解酒防醉和治疗酒精性肝损伤的药物。

                            背景技术

慢性酒精中毒引发的酒精性肝损伤和病毒性肝炎所引发的肝损伤是肝损伤疾病的两大主要起因。由此导致的肝硬化近年发病率明显升高。目前内科诊疗常规药物治疗方法归纳为以维生素类和保肝药以及胃粘膜保护剂为主的三联疗法。酒精性肝损伤经上述治疗用药时间较长，起效慢。因此寻找和制备具有能够解酒防醉和促进酒精中毒对肝功能损伤修复的药物十分必要。

                            发明内容

本发明的目的是提供一种解酒防醉的药物，它采用生化制剂解酒防醉，具有无毒，副作用小，有效率高的特点。

本发明的技术方案是：设计一种解酒防醉的药物，其特征是：它将α-溶血链球菌33号菌种搭载往返式太空飞行器，在太空的特殊条件下使导致微生物细胞中的DNA双链断裂，在微重力、高真空环境下抑制损伤的DNA修复，使α-溶血链球菌33号菌种遗传性质发生变异，优选出其中的正变异遗传性质稳定的菌种，经培育发酵后生产成解酒的生化制剂，该菌种经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCCNo.1082。

所述的解酒的生化制剂是口服液，1000ml中含太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽0.8g-15.0g。

所述的口服液是以α-溶血链球菌33号菌种搭载往返式太空飞行器、变异、优选后的菌种，它经培育发酵生产的原液，再加入其它辅料。

所述的口服液是以α-溶血链球菌33号菌种搭载往返式太空飞行器、变异、优选后的菌种，经培育发酵生产的甘露聚糖肽，加入辅料和纯化水溶解搅匀。

所述的辅料是香精和糖精钠、木糖醇、氯化钠。

所述甘露聚糖肽的制备方法是；①优选α-溶血性链球菌33菌种进行太空飞行器搭载，经过太空诱变精心选育的变异菌珠作为生产菌种，制备经一级发酵和二级发酵，将发酵液提纯，最终生产出太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽.②以太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽，加入辅料制成口服液。

所述的菌种制备；

A.斜面种子培养基：牛肉膏0.2-0.8％，酵母膏0.2-0.8％，蛋白胨0.3-0.8％，葡萄糖0.1-0.8％，氯化钠0.2-0.6％，琼脂1-5％，绵羊血5-10％；pH 7.2-7.4；

斜面种子培养基灭菌温度105-125℃，时间30分钟，蒸汽压力0.11-0.14Mpa；

启封菌种冷冻管，用无菌肉汤培养基稀释，在无菌条件下接入血斜面，接种后置25-40℃恒温培养24-30小时；

B.肉汤种子培养基：牛肉膏0.2-0.8％，酵母膏0.2-0.8％，蛋白胨0.3-0.8％，葡萄糖0.1-0.8％，氯化钠0.2-0.6％；pH 7.0-7.4；

肉汤种子培养基灭菌温度105-125℃，时间30分钟，蒸汽压力0.11-0.14Mpa；

将培养好的斜面菌种在无菌条件下按1-9％接种量接入肉汤种子培养基内，25-40℃恒温培养10-30小时。

所述的发酵过程是用发酵培养基，牛肉膏0.2-0.8％，酵母膏0.2-0.8％，蛋白胨0.3-0.8％，葡萄糖0.1-0.9％，氯化钠0.2-0.6％；

发酵培养基灭菌温度105-125℃，时间30分钟，蒸汽压力0.11-0.14Mpa；

A.一级种子罐：将优良的肉汤菌种在无菌条件下按1-10％接种量接入一级种子罐，在25-40℃恒温培养10-50小时。罐压不超过0.02Mpa，通气量以能翻动培养液为宜，连续充分搅拌；

B.二级发酵罐：将一级发酵培养液在无菌条件下按2-20％接种量接入发酵罐，在25-40℃恒温培养20-100小时，罐压不超过0.02Mpa；灭活放罐，灭活采用加温使发酵液温度达到70-120℃，保温20-60分钟，冷却静置。

所述的提取过程；

a、发酵液进行浓缩，使浓缩液体积与发酵液体积比控制在1∶15-1∶20或酌情而定；

b、发酵液的浓缩液加入80-99％乙醇，体积量比控制在1∶1.5-1∶5.5或酌情而定；充分搅拌静置后，离心去除上清液，沉淀用蒸馏水溶解，调pH1.0-5.0，得到溶解液并将溶解液静置；

c、再将溶解液离心去除杂质得到上清液。准确量取上清液体积，按上清液体积计算出所需乙醇量，将乙醇缓慢加入到上清液中，并充分搅拌，静置后离心去除上清液得到沉淀物；

d、沉淀物再用蒸馏水溶解，调pH，离心。上清液再加乙醇沉淀。这样的工艺反复操作至含量检测合格为止，得到的沉淀物为太空诱变菌种所生产的甘露聚糖肽粗品。真空干燥3-8小时即得太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽产品。

本发明的特点是：由于本发明将α-溶血链球菌菌种搭载返回式太空飞行器(宇宙飞船或返回式卫星)，利用太空中微(零)重力、宇宙射线、交变磁场、高真空、高热深冷等因素的综合作用，使菌株的DNA双链结构断裂，基因组发生重排，从而产生新的菌株。返回地面后，对经过太空搭载的菌株进行培养和筛选，通过研究其形态特征、培养特征、生理生化反应、代谢产物、遗传性状及蛋白表达、遗传稳定性、中试生产指标等内容，优选出其中的正变异、遗传特性稳定的菌种，经培养发酵后得到治疗溃疡性结肠炎的药物。该菌种已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCCNo.1082。

特别是α-溶血链球菌D33菌株经太空搭载诱变，地面上的筛选、分离和纯化后，选育出发酵单位更高、所分泌的甘露聚糖肽含量更高的高产、优质菌株T33株。通过中国科学院微生物研究所对T33菌株及D33菌株的全细胞蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)分析和菌株的基因组DNA限制性酶切分析(RFLP/PFGE)比较，可以证明空间诱变及地面筛选出的T33菌株其基因有变异。该突变菌株在遗传上稳定，有较强的生产适应性，由其发酵产生的甘露聚糖肽含量提高，多肽含量比国家标准(80％)提高3至5倍，西安市药品检验所送样测定达到271.6％，发酵含量比对照组产物含量平均高出三倍以上。经太空菌种诱变后生产的甘露聚糖肽具有解酒防醉药效和动物体内自由基的清除能力，降低其脂质过氧化速度。经太空菌种诱变后生产的甘露聚糖肽具有促进酒精中毒对肝功能损伤修复的作用。(见附件：附件材料1：陕西省科学技术厅陕西省科学技术成果鉴定证书材料

附件材料2：太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽生产菌株经“神舟三号”飞船搭载公证书。

附件材料3：太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽生产菌株经“神舟三号”飞船搭载返回地面筛选报告

附件材料4：中国科学院微生物所关于“神舟三号”飞船搭载太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽生产菌株与地面对照菌的形态生理生化鉴定报告书

附件材料5：中国科学院微生物所关于“神舟三号”飞船搭载太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽生产菌株与地面对照菌的SDS-PAGE及RFLP/PFGE分析鉴定报告书

附件材料6：陕西省药品检验所“神舟三号”太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽口服液检测报告

附件材料7：科技查新报告复印件

附件材料8：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏菌种保藏受理通知书复印件)

新药理作用试验分析验证：治疗酒精性肝损伤甘露聚糖肽新的药理作用是解酒防醉和促进酒精中毒对肝功能损伤修复的作用，通过以下动物实验验证：

1.1材料动物：昆明种小白鼠，体重(20±2)g，雌雄兼用，第四军医大学实验动物中心提供.药剂：解酒防醉剂A(维生素C)，B(神舟三号甘露聚糖肽口服液)和C(牛磺酸)。实验用酒：53°泸州老窖二曲酒(市售，泸州老窖有限公司产品，ig给酒时蒸馏水稀释成40°)。

1.2方法：解酒防醉药效实验(用硫代巴比妥酸比色法测定血清过氧化脂质)：在进行动物酒精性肝损伤药效学的实验过程中，在第2、5、10和20d统计观察小鼠的翻正反谢消失情况，计算其醉倒率。

解剖时小鼠内脏器官形态观察：参照鼠重大小，从胆襄、胰脏和肝脏的肿大情况及腹下脂肪多寡4个方面进行综合测评。

小鼠肝匀浆LPO值采用TBA比色法测定：小鼠经连续28d的药效学实验后，禁食12h，于次日颈椎脱臼处死。解剖取右肝小叶部位的鼠肝0.18～0.20g，用生理盐水洗去血污后加入冷的1.15％KCl溶液，于10mL全玻璃研磨器中制成10％的肝匀浆。据文献方法测定LOP值。

小鼠肝切片显微观察：小鼠经连续28d的实验后，禁食12h，于次日颈椎脱臼处死。解剖取右肝小叶，中心部分切成1cm2大小的组织块。按常规方法用甲醛固定，石腊包埋，制成普通切片，苏木素-伊红(HE)染色，在显微镜下观察肝细胞脂肪变性程度。

1.3实验的组织：昆明种小白鼠，体重(20±2)g，经过3d的环境适应后，80只小鼠按体重随机分成8组(模型对照组、正常对照组、A低剂量、A高剂量、B低剂量、B高剂量、C低剂量和C高剂量)后，每组均为雌雄各5只.除正常对照组正常饲养外，其余各实验组待试小鼠禁食过夜，次日各实验组均先ig给药，20min后各实验组再ig给酒。按每20g鼠重计算，模型对照组ig给药量为0.60mL生理盐水，低剂量组ig的给药量为0.30mL解酒防醉剂，高剂量组ig的给药量为0.60mL解酒防醉剂，各实验组ig给酒量为0.37mL，经过连续28d的药效学实验，禁食12h后，解剖，进行内脏器官观察及肝匀浆LPO值测定和肝切片显微观察肝细胞变性情况。

2结果：表1解酒防醉剂A、B和C的解酒防醉药效

项目醉倒数/只醉倒率/％

模型对照22 55.0

A低     10 25.0

A高     7  17.5

B低     3  7.5

B高     4  10.0

C低     5  12.5

C高     4  10.0

注：各组有效动物数均为40只，在相同条件下对解酒防醉剂A、B和C进行解酒防醉药效、肝匀浆LPO值测定、解剖时内脏器官观察和肝切片电镜观察的综合实验。

2.1解酒防醉药效情况

实验结果示于表1(表中“A低”表示低剂量，下同)。与模型对照组比较，各给药组小鼠给酒后的醉倒率明显降低，解酒防醉剂A、B和C具有明显的解酒防醉药效，其中B和C的解酒防醉作用更加显著，

2.2解剖时小鼠内脏器官形态观察

实验结果(表2)显示，正常对照组小鼠在正常饲养28d后其胆襄、胰脏、肝脏均正常，其腹下脂肪很少.模型对照组小鼠在连续ig给酒28d后肉眼可见其胆襄、胰、肝出现肿大现象且腹下脂肪层肥厚堆积。各给药组小鼠内脏大小适度，未观察到异常现象，同时肉眼可见各给药组小鼠体内腹下脂肪少于模型对照组小鼠，其中A高，B低，B高和C高的效果更佳。实验结果表明，长期大量摄入酒精，对动物的内脏器官会造成一定的损伤，使胆襄、胰脏和肝脏肿大，解酒防醉剂A、B和C具有一定的减轻动物酒后内脏器官损伤的作用；长期摄入酒精易造成动物外形肥胖，腹下脂肪堆积的现象，解酒防醉剂A、B和C具有一定防止因饮酒造成体内脂肪沉积的作用。

表2解剖时小鼠内脏器官情况

项目 胆囊 胰脏 肝脏 腹下脂肪

正常对照 正常 正常 正常 较少

模型对照 肿大 肿大 明显肿大 堆积

A低 正常 正常 正常 中等

A高 正常 正常 正常 较少

B低 正常 正常 正常 较少

B高 正常 正常 正常 较少

C低 正常 正常 正常 中等

C高 正常 正常 正常 较少

表3小鼠肝匀浆LPO值(±S)

项目LPO值/nmol.L-1

正常对照0.725+0.313

模型对照9.682+1.002

A低7.165+1.1901)

A高9.358+0.901

B低3.718+1.0341)

B高6.201+0.8491)

C低8.567+0.6571)

C高7.430+1.0371)

1)经t检验与模型对照相比P＜0.01

2.3药解酒防醉剂对慢性酒精中毒小鼠肝匀浆LPO值的影响，长期摄入大量乙醇可引起脂肪肝，动物肝脏中的脂质过氧化物值显著升高，动物酒精中毒时可检测出丙二醛(MDA)含量的升高。脂质过氧化物(Lipidperoxides LPO)是活性氧等自由基不饱和脂肪酸经酶促或非酶促途径生成的一类过氧化物，LPO又可代谢成丙二酸。通过检测肝匀浆的LPO含量可间接反映酒精中毒小鼠肝脏自由基水平，是动物体内脂质过氧化的指标。实验结果(表3)显示，正常对照组小鼠的肝匀浆LPO值较低，表明其体内自由基清除能力较高，脂质过氧化程度较轻。与正常对照组比较，不论是否ig给解酒防醉剂，在长期大量摄入乙醇条件下，小鼠肝匀浆的LPO值均显著升高，表明尽管B低，B高，A高，C高对于降低LPO有一定的功效，但长期大量摄入酒精将造成酒精性肝损伤。

与模型对照组比较，各给药组小鼠肝匀浆LPO均明显降低，表明解酒防醉剂A、B和C均具有较好的抗氧化和保肝功能，除A低外，各给药组均有极显著性，尤以B低的效果最佳.这说明神舟三号甘露聚糖肽具有提高动物体内自由基的清除能力，降低其脂质过氧化速度，从而减轻长期大量饮酒造成的酒精性肝损伤。

2.4小鼠肝组织切片显微观察，长期大量饮酒可诱导肝线粒体中细胞色素P450酶引起肝线粒体电子传递系统被激活而脂质过氧化亢进，肝中的还原型谷胱甘肽(GSH)浓度减少，自由基大量生成，导致肝损伤。同时，由于肝线粒体机能障碍，使乙醛分解成乙酸的能力降低，乙醛与肝细胞内参与蛋白转运的分泌和微管蛋白的结合，引起肝内蛋白蓄积，伴有水贮留的肝细胞呈气球样肿胀＝，由于肝细胞线粒体呼吸链功能亢进，致使醇脱氢酶(ADH)所处的区带处于\哦；组小鼠肝切片显微观察项目：浊肿、水样变性、点状坏死、充血、管区浸润肝硬化

正常对照 - - - - - -

模型对照 ++ +++ + + ± +

A低 + + ± + - -

A高 ++ ± - - - -

B低 ± - - - - -

B高 + + - ± - -

C低 + + ± - - -

C高 + + - - - -

模型对照组小鼠肝切片显微观察发现，核周围均出现明显的浊肿和水样变性现象，门管区发生浸润，胞内脂肪滴很多，细胞间充血和肿胀造成窦周间隙模糊或消失，肝血窦连成一片；中央静脉边缘疏松，肝细胞排列杂乱无章，肝细胞索模糊，细胞边界消失，核仁肿大松散，着色较深，肝细胞出现点状坏死和局部肝硬化现象。

与模型对照组比较，各给药组肝小叶水样变性和浊肿现象均明显较轻，肝细胞亦未出现点状坏死和肝硬化现象；中央静脉边缘较为紧密，肝细胞多呈放射状排列，肝细胞索基本上较清楚，细胞分界较清楚，核仁略见肿大和松散，着色深浅不一，肝血窦间隙略为明显，胞内脂肪滴也少了很多，而且远离中央静脉的地方肝损伤情况较轻。表明解酒防醉剂A、B和C对于减轻长期大量饮酒造成的酒精性肝损伤有一定的保护作用，尤以B低的保肝功能最好.综合实验结果可以看出，B低的药效较好。经过进一步实验测算神舟三号甘露聚糖肽最佳剂量是0.5mg/ml/kg。

3结论：

1)经太空菌种诱变后生产的甘露聚糖肽具有解酒防醉药效和动物体内自由基的清除能力，降低其脂质过氧化速度。

2)长期大量摄入酒精对动物的内脏器官会造成一定的损伤，解酒防醉剂A、B和C具有一定的减轻动物酒后内脏器官损伤的作用和防止因饮酒造成体内脂肪沉积的作用。

B经太空菌种诱变后生产的甘露聚糖肽作用最明显。

3)酒精中毒会导致肝脏损坏，经太空菌种诱变后生产的甘露聚糖肽具有促进酒精中毒对肝功能损伤修复的作用，最佳剂量是0.5mg/ml/kg。

(4)新用途验证：经过对一千例使用经太空菌种诱变后生产的甘露聚糖肽口服液患者的调查发现75例长期饮酒，酒精性肝损伤，脂肪肝患者，在饮酒前服药10-20ml按普通习惯量饮酒后无上腹痛不适恶心或呕吐，自我控制能力减退，言语增多，情绪兴奋，动作增多，行为轻浮，困倦。步态不稳，颜面和全身皮肤潮红，嗜睡等症状。坚持服药三个月者回访39例复查肝脏B超脂肪肝指征消失。总有效率98％

(5)新疗效验证：

李健，男，32岁。西安北关振华路。两年前因工作应酬饮酒较多，平均每天饮白酒3-4两，在医院年终体检时发现脂肪肝，既往有慢性胃炎病史。饮酒后常感头痛乏力，恶心呕吐，嗜睡。长期食欲不振，不饮酒则夜间入睡困难。2003年9月5日开始服用经太空菌种诱变后生产的甘露聚糖肽口服液到17日停药上述症状全部消失。同年12月回访症状无反复，11月复查肝脏B超脂肪肝指征消失。

                    具体实施方案

菌种选育：在α-溶血链球菌生长规律的基础上，选定较合适生长时期的菌种，采用平皿生长的菌落、浸入其它物质中的菌悬液、带菌的砂土等方法，于2002年3月25日搭载“神舟三号”宇宙飞船。在太空轨道(近地点高度200公里、远地点高度350公里)进行了6天零18小时的在轨飞行。太空的特殊条件主要体现为微重力、高真空、高辐射、交变磁场等特殊环境。在外层空间飞行的菌种被置于一个与地球上的生态环境完全不同的环境中，主要包括来自磁场俘获的电子、质子及低能重粒子；来自银河系的宇宙射线如质子、粒子及更重的高能重粒子；来自太阳磁暴的质子及重粒子等。这些粒子作用于微生物细胞核中的DNA双链结构，可导致双链断裂。微重力、高真空环境可使DNA的碱基序列发生重组，即基因组的重组和变异。变异后产生的新菌株，其形态特征、培养特征、生理生化反应、代谢产物、遗传性状及蛋白表达、中试生产指标等均会发生不同程度的变化。在宇宙飞船返回地面后，经过进一步筛选，仅优选出其中0.2％的正变异且遗传特性稳定的菌株，经培育制成生产菌种。这种经航天搭载诱变后选育出的菌种已经在在2003年12月29日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCCNo.1082。

实验及中试生产结果表明，经空间诱变后的新型太空菌种在遗传特性上稳定，有较强的生产适应性，由其发酵产生的甘露聚糖肽含量提高，多肽含量比国家标准(80％)提高3至5倍，西安市药品检验所送样测定达到271.6％，发酵含量比对照组产物含量平均高出三倍以上，发酵周期大大缩短。

制备方法：

太空诱变菌种生产甘露聚糖肽的制备过程：

本发明所述的太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽是由以下方法制备：太空菌种制备---一级发酵---二级发酵----发酵液提纯，最终生产出甘露聚糖肽。

①太空菌种制备：

以经过空间诱变育种精心选育的α-溶血链球菌作为生产菌种。

A.斜面种子培养基：牛肉膏0.5％，酵母膏0.6％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.4％，氯化钠0.5％，琼脂3％，绵羊血8％；pH 7.4。

斜面种子培养基灭菌温度121℃，时间30分钟，蒸汽压力0.12Mpa。

启封菌种冷冻管，用无菌肉汤培养基稀释，在无菌条件下接入血斜面，接种后置38℃恒温培养30小时。

B.肉汤种子培养基：牛肉膏0.5％，酵母膏0.6％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.4％，氯化钠0.5％；pH 7.4。

肉汤种子培养基灭菌温度121℃，时间30分钟，蒸汽压力0.12Mpa。

将培养好的斜面菌种在无菌条件下按9％接种量，接入肉汤种子培养基内，38℃恒温培养30小时。

②发酵过程：

发酵培养基：牛肉膏0.4％，酵母膏0.5％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.4％，氯化钠0.5％。

发酵培养基灭菌温度121℃，时间30分钟，蒸汽压力0.12Mpa。

A.一级发酵罐：将优良的肉汤菌种在无菌条件下按10％接种量，接入一级种子罐，在29℃恒温培养30小时，罐压不超过0.02Mpa，通气量以能翻动培养液为宜，连续充分搅拌。

B.二级发酵罐：将一级发酵培养液在无菌条件下按20％接种量，接入发酵罐，在29℃恒温培养70小时，罐压不0.02Mpa，灭活放罐。灭活采用加温使发酵液温度达到100℃，保温60分钟，冷却静置。

③提取过程：

a、发酵液进行浓缩，使浓缩液体积与发酵液体积比控制在1∶15-1∶20或酌情而定。

b、发酵液的浓缩液加入80-99％乙醇，体积量比控制在1∶1.5-1∶5.5或酌情而定。充分搅拌静置后，离心去除上清液，沉淀用蒸馏水溶解，调pH5.0，得到溶解液并将溶解液静置。

c、再将溶解液离心去除杂质得到上清液，准确量取清液体积，按上清液体积计算出所需乙醇量，调pH值，将乙醇缓慢加入到上清液中，并充分搅拌，静置后离心去除上清液得到沉淀物。

d、沉淀物再用蒸馏水溶解，调pH，离心，上清液再加乙醇沉淀。这样的工艺反复操作至中间检测合格为止，得到的沉淀物为太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽粗品。真空干燥3-8小时，即得到太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽产品。

上述方法得到的产品的检验：

[性状]本品为白色或微黄色无定形粉末；无臭、无味。

本品在水中易溶，在乙醇、氯仿及丙酮中不溶。

比旋度：取本品，精密称定，加水溶解并稀释成每1ml中约含10mg的溶液，依法测定(中国药典2000年版二部附录vIE)，比旋度为+70℃至+80℃。

[鉴别]1、取本品10mg，加水0.5ml使溶解，加a-萘酚乙醇溶液(5-100)1ml，摇匀，沿管壁缓缓加硫酸0.5ml，数分钟后，界面呈紫红色。

2、取本品，加水制成每1ml中含1mg的溶液，取约10ul点于滤纸上，晾干，用无水乙醇固定，置高硝酸溶液(取高碘酸1.2g，加水30ml溶解后.加0.2mol/L醋酸钠溶液1.5ml与乙醇100ml，混匀即得。置暗处保存，可使用数月)中浸泡5分钟，取出，用70％乙醇溶液冲洗，置还原液(取碘化钾5g，硫代硫酸钠5g，加水100ml使溶解，再加乙醇150ml、2mol/L盐酸液2.5ml，随加随搅拌，临用时配)中浸泡5分钟，取出，用70％乙醇溶液冲洗，置品红业硫酸试液中浸泡约30分钟，取出，用焦亚硫酸钠溶液(取焦亚硫酸钠0.4g，加盐酸1ml，加水溶解使成100ml，即得)，冲洗，晾干，在滤纸片点样处应呈紫红色。

3、取供试品和对照品适量，分别加氯化钠注射液制成每1ml中含1mg的溶液作为供试品溶液和对照品溶液，按甘露聚糖肽免疫原性测定法试验，供试品和对照品管应均无溶血发生。

[检查]1、酸度：取本品，加水制成每1ml中含I0mg的溶液，依法测定(中国药典2000年版二部附录VIH)，pH值应为3.0-5.0。

2、吸收度：取本品，加水制成每1ml中含0.4mg的溶液，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录VIA)，在260nm的波长处，其吸收度不得大于0.25，在280nm的波长处，其吸收度不得大于0.20。

3、总氮量：取本品，照氮测定法(中国药典2000年版二部附录VIID第二法)测定。按干燥品计算，含总氮量应为0.8-2.0％。

4、免疫原性：取供试品和对照品适量，分别加氯化钠注射液制成每1ml中含10mg的溶液，再分别用磷酸盐缓冲液制成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256的稀释液作为供试品溶液和对照品溶液，依法检查(附甘露聚糖肽免疫原性测定法)，供试品不溶血管的最低浓度应不得高于对照品相应浓度的一倍以上。

5、干燥失重  取本品，在105℃干燥至恒重，减失重量不得过5.0％(中国药典2000年版二部附录VIIIL)。

6、重金属  取本品，在1.0g，依法检查(中国药典2000年版VIIIH)含重金属不得过百万分之二十。

7、异常毒性  取本品，加氯化钠注射液制成每1ml中含0.5mg的溶液，依法检查(中国药典2000年版附录XIC)。按静脉注射法给药，应符合规定(供注射用)。

[含量测定]

1.对照品溶液的制备

精密称取经105℃干燥至恒重的D-甘露糖对照品0.1g置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度。摇匀；精密量取5ml，置100ml的量瓶中，加水至刻度，摇匀。每1ml中含甘露糖50ug。

2.供试品溶液备

取本品适量，精密称定，加水溶解制成每1ml中含40ug的溶液。

3.标准曲线的制备

精密称取对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分别置具塞试管中，各加水至1.0ml，再加3％苯酚溶液1.0ml，摇匀，冲入硫酸4.5ml，摇匀，放置于室温，以0管为空白。照分光光度法(中国药典2000年版二部附录IVA)在490nm的波长处测定吸收度。以甘露糖ug数对相应的吸收度，计算回归方程。

4.测定法

精密量取供试品溶液1.0ml，照标准曲线制备项下自“再加3％苯酚溶液1.0ml”起，依法操作，测定吸收度，由回归方程计算甘露糖的含量。

甘露聚糖肽免疫原性测定法(补体结合法)；

1、试液

A.酸盐缓冲液(pH7.2)

取氯化钠8.5g、磷酸氢二钠0.565g及磷酸二氢钾0.135g，加水至1000ml使其溶解，加10％硫酸镁溶液1ml，摇匀。

B.1％羊红细胞悬液

羊血红细胞的制备：由绵羊颈静脉无菌采血于盛有等量阿氏液(取葡萄糖20.5g、枸椽酸钠8.0g、氯化钠4.2g，枸椽酸5.5g，加水至1000mI使溶解，100℃灭菌30分钟)的无菌容器中，4℃保存。

1％羊血红细胞悬液的制备：取上述羊血红细胞适量，用氯化钠注射液洗涤三次，每次离心5分钟(2000转/分)，取压积羊血红细胞，用氯化钠注射液制成1％羊血红细胞悬液。取悬液，用氯化钠注射液稀释20倍制成供试品溶液，另取等量悬液加水稀释20倍作为空白溶液，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录IVA)，在541nm的波长处测定，其吸收度应为0.65-0.70，如超出限度应调节1％羊红细胞悬液的浓度。

C.溶血素及致敏羊血红细胞

溶血素的制备：取上述压积羊血红细胞，用氯化钠注射液制成25％羊血红细胞悬液。取家兔1只，静脉注射上述羊血红细胞悬液，每日一次，共七次，前三次3ml，后三次5ml，末次注射后七日采血。分离血清，56℃。30分钟灭活，分装，0℃以下保存。

溶血素单位的测定：取溶血素适量，加磷酸盐缓冲液分别制成1∶1000、1∶2000、1∶3000、1∶4000、1∶5000、1∶6000、1∶7000、1∶8000、1∶9000、1∶10000的稀释液，各取0.1ml置试管中，加1％羊血细胞悬液0.1ml，摇匀，加稀释度为1∶30的豚鼠血清(补体)0.2ml及磷酸盐缓冲液0.2ml，摇匀，37℃保温30分钟，完全溶血管的最高稀释度为1单位溶血素。

致敏羊血红细胞的制备：临用前，将2％的羊血红细胞悬液与2单位溶血索等体积混合，37℃保温15分钟即得。

补体：取三只以上的豚鼠，心脏采血，离心分离血清，0℃以下保存。

补体单位的测定：取补体适量，加磷酸盐缓冲液，分别制成1∶40、1∶60、1∶80、1∶100、1∶120、1∶140、1∶160、1∶180的稀释液，各取0.2ml置试管中，加0.2ml磷酸盐缓冲液，摇匀，37℃保温30分钟后，分别加致敏羊血红细胞0.2ml，摇匀，37℃再保温30分钟。完全溶血管的最高稀释度为1单位的补体。

抗体：取甘露聚糖肽对照品适量，加氯化钠注射液制成每1ml中含10mg的对照品溶液免疫家兔，隔日采用耳静脉注射对照品溶液一次。第一次注射0.2ml，第二次至第五次各注射0.5ml，第六次至第十次各注射1.0ml，第十一次至第十五次各注射2.0ml，末次注射后三日采血，离心分离血清，56℃下30分钟灭活，分装，0℃以下保存(临用前，需56℃30分钟再次灭活)。

抗体单位的测定：取抗体适量，加磷酸盐缓冲液分别制成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32。1∶64、1∶128的稀释液，各取0.1ml置试管中，加甘露聚糖肽对照品溶液0.1ml及2单位补体0.2m]，摇匀，于4-8℃放置4小时以上，置37℃保温30分钟，不溶血管的最高稀释度为1单位抗体。同时设抗原(不加抗体，以0.1ml磷酸盐缓冲液代替)、抗体(不加抗原，以0.1ml磷酸盐缓冲液代替)、补体(不加抗原，抗体，以0.2ml磷酸盐缓冲液代替)对照管，以上三种对照管应全溶血；另设的致敏羊血红细胞(不加抗原、抗体和补体，以0.4ml磷酸盐缓冲液代替)对照管应不溶血。

2、免疫原性测定法

取甘露骤糖肽对照品与供试品适量，照药品项下的规定制成不同浓度的对照品溶液和供试品溶液，各取0.1ml置试管中，加入2单位抗体0.1ml及2单位补体0.2ml。摇匀，于4-8℃放置4小时以上，置37℃保温30分钟，加入致敏羊血红细胞0.2ml，摇匀，37℃再保温30分钟。观察各管的溶血情况，不溶血管的最低浓度代表甘露聚糖肽的免疫原性。同时设抗原(不加抗体，以0.1ml磷酸盐缓冲液代替)、抗体(不加抗原，以0.1ml磷酸盐缓冲液代替)、补体(不加抗原、抗体、以0.2ml磷酸盐缓冲液代替)对照管，以上三种对照管应全溶血：另设的致敏羊血红细胞(不加抗原、抗体和补体，以0.4ml磷酸盐缓冲液代替)对照管应不溶血。

太空诱变菌种生产“神舟三号”甘露聚糖肽口服液的制备方法：

取太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽，加适量香精、矫味剂溶解，加纯化水到全量，搅拌均匀后过滤，灌装，热压灭菌105-121℃，20-30分钟，经灯检合格后包装入库。

实施例1：

取太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽1克；甜味剂适量和香精适量氯化钠适量；制成1000ml。

太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽1g，糖精钠0.15g，氯化钠1.0g用少量纯化水溶解，加入香精0.1ml、加纯化水至1000ml搅匀，过滤，化验合格后，灌封，蒸汽灭菌121℃，30分钟。

实施例2：

太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽原料液1000ml，活性炭0.25g，木糖醇1.0g，氯化钠1.0g，香精0.1ml，制成1000ml。

取太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽原料1000ml，加入活性炭0.25g，搅匀，过滤，加入木糖醇1.0g，氯化钠1.0g，加入香精0.1ml、搅匀，化验合格后，灌封，蒸汽灭菌121℃，30分钟。

Claims (9)

1、一种解酒的药物，其特征是：它将α-溶血链球菌33号菌种搭载往返式太空飞行器，在太空的特殊条件下使导致微生物细胞中的DNA双链断裂，在微重力、高真空环境下抑制损伤的DNA修复，使α-溶血链球菌33号菌种遗传性质发生变异，优选出其中的正变异遗传性质稳定的菌种，经培育发酵后生产成解酒的生化制剂，该菌种经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCCNo.1082。

2、根据权利要求1所述的一种解酒的药物，其特征是：所述的解酒的生化制剂是口服液，1000ml中含太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽0.8g-15.0g。

3、根据权利要求1所述的一种解酒的药物，其特征是：所述的口服液是以α-溶血链球菌33号菌种搭载往返式太空飞行器、变异、优选后的菌种，它经培育发酵生产的原液，再加入其它辅料。

4、根据权利要求1所述的一种解酒的药物，其特征是：所述的口服液是以α-溶血链球菌33号菌种搭载往返式太空飞行器、变异、优选后的菌种，经培育发酵生产的甘露聚糖肽，加入辅料和纯化水溶解搅匀。

5、根据权利要求1所述的一种解酒的药物，其特征是：所述的辅料是香精和糖精钠、木糖醇、氯化钠。

6、根据权利要求2所述的一种解酒的药物，其特征是：所述甘露聚糖肽的制备方法是；①优选α-溶血性链球菌33菌种进行太空飞行器搭载，经过太空诱变精心选育的变异菌珠作为生产菌种，制备经一级发酵和二级发酵，将发酵液提纯，最终生产出太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽.②以太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽，加入辅料制成口服液。

7、根据权利要求1所述的一种解酒的药物，其特征是：所述的菌种制备；

A.斜面种子培养基：牛肉膏0.2-0.8％，酵母膏0.2-0.8％，蛋白胨0.3-0.8％，葡萄糖0.1-0.8％，氯化钠0.2-0.6％，琼脂1-5％，绵羊血5-10％；pH7.2-7.4；

斜面种子培养基灭菌温度105-125℃，时间30分钟，蒸汽压力0.11-0.14Mpa；

启封菌种冷冻管，用无菌肉汤培养基稀释，在无菌条件下接入血斜面，接种后置25-40℃恒温培养24-30小时；

B.肉汤种子培养基：牛肉膏0.2-0.8％，酵母膏0.2-0.8％，蛋白胨0.3-0.8％，葡萄糖0.1-0.8％，氯化钠0.2-0.6％；pH7.0-7.4；

肉汤种子培养基灭菌温度105-125℃，时间30分钟，蒸汽压力0.11-0.14Mpa；

将培养好的斜面菌种在无菌条件下按1-9％接种量接入肉汤种子培养基内，25-40℃恒温培养10-30小时。

8、根据权利要求1所述的一种解酒的药物，其特征是：所述的发酵过程是用发酵培养基，牛肉膏0.2-0.8％，酵母膏0.2-0.8％，蛋白胨0.3-0.8％，葡萄糖0.1-0.9％，氯化钠0.2-0.6％；

发酵培养基灭菌温度105-125℃，时间30分钟，蒸汽压力0.11-0.14Mpa；

A.一级种子罐：将优良的肉汤菌种在无菌条件下按1-10％接种量接入一级种子罐，在25-40℃恒温培养10-50小时。罐压不超过0.02Mpa，通气量以能翻动培养液为宜，连续充分搅拌；

B.二级发酵罐：将一级发酵培养液在无菌条件下按2-20％接种量接入发酵罐，在25-40℃恒温培养20-100小时，罐压不超过0.02Mpa；灭活放罐，灭活采用加温使发酵液温度达到70-120℃，保温20-60分钟，冷却静置。

9、根据权利要求1所述的一种解酒的药物，其特征是：所述的提取过程；a、发酵液进行浓缩，使浓缩液体积与发酵液体积比控制在1∶15-1∶20或酌情而定；

b、发酵液的浓缩液加入80-99％乙醇，体积量比控制在1∶1.5-1∶5.5或酌情而定；充分搅拌静置后，离心去除上清液，沉淀用蒸馏水溶解，调pH1.0-5.0，得到溶解液并将溶解液静置；

c、再将溶解液离心去除杂质得到上清液。准确量取上清液体积，按上清液体积计算出所需乙醇量，将乙醇缓慢加入到上清液中，并充分搅拌，静置后离心去除上清液得到沉淀物；

d、沉淀物再用蒸馏水溶解，调pH，离心。上清液再加乙醇沉淀。这样的工艺反复操作至含量检测合格为止，得到的沉淀物为太空诱变菌种所生产的甘露聚糖肽粗品。真空干燥3-8小时即得太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽产品。