CN1630531A - 包含免疫原性微颗粒的组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种免疫原性的组合物，其包含至少一种结合于微颗粒(microparticle)的抗原，其中所述微颗粒有着和病毒一样的大小范围。另外，本发明也提供了疫苗组合物和在研究对象上引发免疫应答的方法。
Description
本发明涉及一种免疫原性组合物，疫苗组合物，在研究对象中引发免疫应答的方法和生产这些组合物的方法。
发明背景
调控人和动物的免疫系统是一种得到广泛认可的避免或治疗某些疾病或情况的手段。
免疫系统控制疾病的机理包括诱导中和抗体(一种体液免疫应答)和产生细胞或T细胞免疫应答。后者包括T辅助细胞(TH)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。在病毒感染例如脊髓灰质炎或肝炎，抗体通过阻止病毒感染细胞而提供保护。通过利用杀菌机制和中和细菌毒素，抗体也能抵抗细菌如肺炎链球菌和葡萄球菌。
当抗原的肽片段结合到称为MHC I或MHC II的分子(主要组织相容性复合物，I型或II型)并被呈递在专门的APC(抗原呈递细胞(antigen presenting cells))如DC(树突状细胞(dendritic cells))或巨噬细胞表面时，T细胞能被激活。T细胞含有的抗原受体能用于监视细胞表面的抗原肽片段的出现。TH细胞的抗原受体识别结合于MHC II分子的抗原肽。相反的，CTL的受体和呈现在I型分子的抗原反应。
激活的T细胞放大免疫应答，这是因为当T细胞识别被病原体感染或包含它能识别的抗原决定簇的目标细胞时，链式事件被触发，这些最终导致感染的细胞的死亡。另外，一些T细胞能刺激分泌细胞因子或淋巴因子，这些反过来可最终导致病原体的失活或消除。
尽管市场上有很多疫苗，但是对于大量的疾病或情况仍然需要生产更有效和广谱的疫苗。也仍然需要保护性对抗那些尚未获得疫苗或疫苗效果不佳的感染体或病原体。另外，需要一种有效的单剂量的疫苗，就经济、运输和患者或研究对象的顺从性等原因而言，它显得尤其需要。
大多数疫苗的缺点为不能诱导最佳的、不同类型的体液和细胞应答的组合，以达到免疫学有效性。例如，当抗体和细胞应答两者同时存在会更有效时，一些疫苗只能刺激抗体应答。其他例子中，需要多剂的疫苗注射如追加注射才能抵抗相关的感染体。
在一些其他的例子中，与所需要的免疫球蛋白如IgA、IgG和IgM一起被诱导产生的还有IgE。诱导IgE的疫苗是不利的，因该免疫球蛋白出现在过敏反应中。
刺激IgA的生成对于经黏膜位置或表面进入感染的病原体是“第一线”防御。因此，能产生高IgA分泌的免疫应答而不增加IgE生成的疫苗也将是有用的。
然而在其他例子中，尽管疫苗能刺激APC，免疫刺激的程度是不乐观的。例如，树突状细胞或DC被一系列的细胞亚群所特征化，它们能通过表面分子彼此区别开来，一些表面分子是能结合于T细胞受体的特异配体。因此，需要去生产一种疫苗能选择性地定向于DC的一类亚群，例如一类能有效地启动CD8 T细胞的亚群，因为这些T细胞在对抗许多细胞内病原体和肿瘤的保护性免疫中发挥重要作用，但其难于诱导是众所周知的。
进一步，对于疫苗，就大多数细胞而言，细胞外的抗原传统地不进入MHC I处理途径。通常，利用死疫苗产生CTL免疫是不太可能的，尽管有人认为存在APC通过摄取凋亡细胞、免疫复合物和颗粒[1]来进行处理和呈递的I型的选择性途径。乙型肝炎的表面蛋白或酵母逆转录蛋白颗粒构成的非感染性病毒样颗粒(VLP)已经显示能被巨噬细胞用于有效地加工以呈递MHC I来在体内和体外诱导CD8CTL细胞应答[2，3]。VLP是多亚基、包含脂质的蛋白颗粒，其中脂质成分构成超过干重的50％。
然而，因为乙型肝炎核心蛋白颗粒不具有免疫原性，并具有较低的脂质成分，推测VLP的免疫原性不是因为其大小而是在于其生物化学成分。这与关于当抗原表现为包含脂质或去污剂的形式时，它们可能通过损坏细胞膜而与APC融合，然后进入细胞浆的假说一致。
应用载有抗原的微球已经被试验作为一种可能的疫苗组合物。微球由可生物降解的乳酸和羟乙酸多酯(PLA和PLGA)构成。微球被构建成使得它们的大小和聚合物组合物能够控制其自身的降解速度。当微球降解后，其载有的抗原从中被释放，并提供了抗原的控释来刺激免疫应答。这些分子通过与蛋白颗粒一样的方式与免疫细胞接触和反应是不太可能的，蛋白颗粒的构造与细胞膜具有生物相容性。
然而，这种形式的疫苗组合物的难点还包括抗原稳定性、微球大小和抗原释放的动力学，所有的这些仍需要去解决以生产出具有好的抗原性和永久免疫原性的疫苗，以生产出能经济地生产和施用的疫苗[4]。
在美国专利No.4,225,581中，一种包含不同大小的异源性颗粒混合物的组合物被描述为对于将吸附于聚合物颗粒表面的抗原运输到体内是有用的。然而，这种疫苗的成功转运、抗原性和免疫原性没有被阐述或展示。特别的，没有证据显示诱导了CD8 T细胞应答，或甚至参与了MHC I型呈递途径。颗粒的聚合物材料认为和上面讨论的PLA或PLGA微颗粒具有相似的特性。
因此，在本发明之前还不清楚，作为疫苗的一部分而被施用的颗粒，其本身的大小是否能诱导免疫原性应答。
在形成本发明的工作中，发明者惊奇地发现结合于抗原的、与病毒大约一样大小的微颗粒能在研究对象上引起强烈的细胞和体液抗体应答。
发明概述
在本发明的第一部分提供了一种免疫原性组合物，其包含结合于微颗粒的至少一种抗原，其中微颗粒有着和病毒一样的大小范围。
涉及免疫原性组合物使用的术语“包含”意思是组合物中包括抗原和微颗粒。也可以包括其他成分。
术语“抗原”指的是任何能引起免疫应答的分子、成分或实体。免疫应答包括细胞和/或体液免疫应答。依赖于组合物设定的功能可以包含一种或多种抗原。
抗原可以是一种肽、蛋白质、脂质、碳水化合物、核酸或其他类型的分子或任何的这些分子的组合。
抗原可以来自病原体、组织、细胞、器官或分子，这依赖于组合物设定的功能。可以是纯化的抗原，或是重组来源的，生产于合适的载体如细菌、酵母菌或细胞培养。病原体例如可以是任何病原体、细胞内或细胞外的、抗原成分或它们的部分、病毒、细菌或原虫来源、如HIV、流感病毒、肝炎病毒、疟疾。特别的，本发明中采用的抗原例子如下：花粉、丙型肝炎病毒、(HIV)核心、E1、E2和NS2蛋白、来自疟原虫属的抗原、如间日疟原虫和其他疟原虫属包括恶性疟原虫的环孢子蛋白(CS)和人恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫和三日疟原虫、TRAP、MSP-1、MSP-2、MSP-3、MSP-4、MSP-5、AMA-1、RESA、SALSA、STARP、LSA1和LSA3、HIV-gp120/160包膜糖蛋白、链球菌表面蛋白抗原、流感核蛋白、血凝素-神经酰胺酶表面感染、TcpA菌毛蛋白亚基、VP1蛋白、LMCV核蛋白、硕大利什曼原虫表面糖化蛋白(gp63)、百日咳博德特氏菌表面蛋白、狂犬病病毒G蛋白、链球菌M蛋白、葡萄球菌蛋白或幽门螺旋杆菌蛋白、合胞体病毒(RSV)F或G蛋白、Epstein Barr virus(EBV)gp340或核抗原3A、血凝素、博氏疏螺旋体外表面蛋白(Osp)A、结核分支杆菌38kD脂蛋白或30kD蛋白(Ag85)、10kD或65kD蛋白、脑膜炎奈瑟菌I型外蛋白、水痘带状疱疹IE62和gp1、风疹病毒壳体蛋白、乙型肝炎病毒前S1抗原、疱疹单纯病I型糖化蛋白G或gp D或CP27、墨累灰牛流域脑炎病毒E糖蛋白、甲型肝炎病毒VP1、脊髓灰质炎病毒壳体蛋白VP1、VP2、VP3和VP6、沙眼衣原体表面蛋白、乙型肝炎病毒包膜前S2抗原、人鼻病毒(HRV)壳体、人乳头状瘤病毒来自癌基因E6和E7的肽、李斯特杆菌表面蛋白、水痘病毒壳体蛋白、牛痘病毒包膜蛋白、布氏杆菌表面蛋白、轮状病毒VP-3、VP-4、VP-5、VP-7和VP-8、上述一种或多种抗原的组合、上述抗原的长度上包含5个或更多氨基酸的氨基酸亚基或一个或多个上述亚基的组合。
上述例举的病原体的裂解物或培养的过滤物也可以作为抗原。这些片段可以是纯化的、浓缩的或稀释的形式、同样他们提供了抗原性和或免疫原性。因此，根据本发明，这使得为患者特制免疫原性组合物成为可能，通过将患者肿瘤裂解物或肿瘤蛋白的某一特定成分结合到微颗粒上。
抗原也可以来自任何肿瘤类型或恶性物。可以生成抗原的肿瘤类型的例子是乳腺癌、肺癌、胰腺癌和结肠癌和黑色素瘤。一些进一步来源于肿瘤的特异性抗原的例子是黑色素瘤特异抗原(例如，MAGE系列抗原)，来自结肠的癌胚胎抗原(CEA)，nm23癌抗原和其他癌抗原或任何肿瘤中提取的真抗原，如粘蛋白如MUC-1到MUC-7抗原。单独或组合的重组肽或蛋白也可以被利用。
抗原也可以是合成的抗原决定簇，如基于上述提及的一种或多种抗原的模拟物或肽样模拟物。
术语“结合于”指的是微颗粒和抗原之间的连接。这可以是通过吸附、或通过结合或共价偶联。优选的抗原共价连接于微颗粒。甚至更优选的，抗原结合于微颗粒的表面。
术语微颗粒指的是小颗粒。它可以是珠样或球样或其他任何合适的形式。
术语“病毒大小颗粒”(VSP)在本文中用于描述本发明的免疫原性组合物的某个实施方案。应该明白术语VSP被采用仅仅是因为便利，并不将本发明限制在已知的病毒大小。例如，和未知病毒一样大小的颗粒也在本发明的预期之中。
优选的，微颗粒具有实心的核心，给结合的或相连的抗原提供了稳定性，区别于以往是空心或胶囊工艺的微球。方便起见，这里指的病毒大小实心颗粒(VSSP)，其抗原出现在颗粒外面。用于制造VSSP的颗粒可以从制造商得到且基本上是统一规格(也就是，在预定大小的10％以内)。
术语“实心的核心”指的是基本上实心(也就是颗粒不是空心的)。微颗粒可以由任何合适材料构成只要它不减弱免疫原性组合物的功能。因此微颗粒可以由乳胶、亚铁分子、金(如金的纳米颗粒)、玻璃、磷酸钙、聚苯乙烯或可生物降解的和生物相容性的聚合物如PLG(聚赖氨酸g)构成。优选的，微颗粒由聚苯乙烯、PLG或金构成。最优选的，微颗粒由聚苯乙烯构成。
微颗粒有着和已知的病毒相同的大小范围。这意味着微颗粒是优选的小于大约0.50μm。优选的如此大小的微颗粒适合于引起免疫应答。尤其它适合于被人体研究对象或动物中的抗原呈递细胞所摄取。更优选的，微颗粒在大约0.03和0.5μm之间，优选的在大约0.03和0.15μm之间，仍更优选的在0.03和0.10μm之间。甚至更优选的微颗粒在约0.03到0.05μm之间，更优选的，微颗粒在约0.03μm和0.049μm之间。仍更优选的微颗粒在约0.03和约0.04μm之间或约0.04和0.049μm之间。
在优选的实施方案中，根据本发明应用的微颗粒群体，如用于单次剂量免疫接种的微颗粒群体，是统一大小的。这意味着在约定群体中的绝大多数颗粒是所指定的大小。
优选的微颗粒/抗原组合物是特别适合于引起细胞和/或体液免疫应答。细胞应答优选的选自TH细胞尤其是生成IFN和IL-4的T细胞、CTL尤其是CD8 CTL和B细胞的活化、成熟或增殖。
优选的微颗粒/抗原组合物引发了MHC I型抗原呈递机制，抗原通过包括内凹(caveole)和/或网格蛋白凹(pit)的迄今未知的机制被摄取以通过Rab 4非依赖性和TAP依赖性过程来进一步处理，如在这里的实施例4和7中解释的一样。体液应答优选地选自IgA、IgD、IgG、IgM和它们的亚组。
这种组合物也可以刺激那些有助于增强或放大免疫应答的细胞。这些包括但不限制于APC如髓样或淋巴样两者来源的DC，和巨噬细胞。这些细胞的成熟、活化或增殖是预期之中的，这些细胞上和T细胞作用的共刺激配体或分子，如CD40、CD80和CD86也是如此。
本发明的免疫原性组合物可以用于治疗、预防或防治抗原引起的或与抗原接触相关的疾病或情况。例如，这种组合物可以用于特定的癌症的治疗或预防。
在本发明的另一部分提供了一种疫苗组合物，包括结合于微颗粒的至少一种抗原，其中所述微颗粒具有和病毒一样的大小范围。本发明的组合物尤其有用和有优点的是它是一种有效的单剂量疫苗，但是也可以用于多剂量方案。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种单剂量的疫苗组合物，包括结合于微颗粒的至少一种抗原，其中所述微颗粒具有和病毒一样的大小范围。
“单剂量”是指在一次给予该组合物或疫苗后，体液和/或细胞免疫应答被刺激或增强到最大水平(“最大”是指这种水平不能被重复接种进一步增强)，或提供给这种组合物的受者以保护。施用可以通过任何合适的方式，如通过经肌肉、经腹腔、经静脉注射、口服、吸入、或通过黏膜表面或位置施用。
优选的，抗原结合于微颗粒的表面。微颗粒的大小直径在约0.03和0.5μm之间，优选的在约0.03到0.15μm，更优选的在约0.03到0.1μm，甚至更优选的约0.03到0.05μm，甚至更优选的约在0.03到0.049μm。仍更优选的0.03到0.04μm或0.04到0.049μm。微颗粒最优选的由聚苯乙烯、PLG、玻璃、磷酸钙或金构成。在优选的实施方案中，本发明应用的每种抗原都结合于固定大小的微颗粒上。
在另一个实施方案，本发明提供了一种单剂量疫苗组合物，它能增强体液和细胞免疫应答，组合物包括结合于微颗粒的至少一种抗原，其中所述微颗粒具有和病毒一样的大小范围。
细胞应答优选的选自TH细胞、CTL和B细胞的刺激、成熟或增殖。体液应答是优选的选自IgA、IgG、IgM和它们的亚组。优选的，IgG、IgA和/或IgM应答被刺激。
这种组合物也可以刺激那些有助于增强或扩增免疫应答的细胞。这些包括但不限制于APC如髓样或淋巴样两者来源的DC、和巨噬细胞。这些细胞的成熟、活化或增殖是预期之中的。
术语“包含”有着和上面提及的相同的含义。
术语微颗粒有着和上面提及的含义。优选的微颗粒适合于被动物的抗原呈递细胞所摄取。优选的微颗粒在0.03和0.5μm之间，优选的在0.03和0.15μm之间。更优选的微颗粒在约0.03和0.10μm之间，更优选的微颗粒在约0.03μm和约0.05μm之间。仍更优选的微颗粒在约0.03到0.049或0.04和0.049μm。
术语“抗原”和“结合”有着上面提及的含义。可根据意欲进行预防接种的情况/疾病应用任何合适的抗原。
给予患者的本发明的疫苗组合物的量是非关键性的或非限制性的。疫苗组合物的有效量是能刺激对抗抗原成分的免疫应答，优选的在单剂量或给药后将引起强烈的细胞和体液应答。根据患者的免疫状态(依赖于患者是否是免疫抑制或免疫刺激)，主治医师或兽医的判断，是否该组合物被用作疫苗防治或治疗疾病状态，或作为防治肿瘤形成的疫苗，或是否疫苗被用做治疗已经存在的肿瘤，给予的组合物的量可以不同。例如，患者可以接受1μg到10,000μg的本发明的组合物，更优选的50μg到5,000μg，仍更优选的100μg到1,000μg和甚至更优选的100μg到500μg的本发明的组合物。佐剂通常是不需要的，然而，佐剂可以用于接种。合适的佐剂包括明矾，和任何其他佐剂或在应用于人的疫苗工艺中已经熟知的佐剂。
本发明的疫苗可以通过注射施用，通过口服给药，或通过黏膜表面或位置给药。在一个实施方案中，疫苗通过基因枪方式施用。根据本发明如果应用亚铁微颗粒和金微颗粒是特别适合于通过基因枪施用。然而，其他类型的抗原微颗粒可以按此方式给药。例如，来源于疟疾基因库的抗原，根据Smooker PM等(《疫苗》18(22)：2522-2540“表达基因库免疫保护小鼠对付毒性疟疾的挑战”)描述的方法，DNA或质粒已经显示是能被基因枪有效地施用。在此将其全文并入作为参考。接种可以通过单或多剂量施用或通过接触抗原一加强而进行。
在本发明的另一实施方案提供了一个在研究对象上引发免疫应答的方法，上述方法包括给予研究对象施用免疫有效量的包含至少一种结合于微颗粒的抗原的组合物，其中所述微颗粒具有和病毒一样的大小范围。
研究对象可以是任何被要求去引发免疫应答的人或动物。这包括家养动物、家畜(如牛、养、马、母牛、猪、山羊、美洲驼羊、家禽、鸵鸟、鸸鹋)和本土和外来动物，野生动物和凶猛动物。
术语“包含”有着和上面提及的相同的含义。
免疫有效量指的是能在研究对象中产生免疫应答的有效剂量，优选的在单次给予后产生免疫应答。免疫有效量的不同依赖于很多因素包括上面讨论的，和可能依赖于研究对象是否是人或动物，它们的年龄，体重等。
术语“抗原”和“结合”有着和和上面提及的相同的含义。
术语“免疫应答”指的是上面描述的细胞和体液应答，也是上面描述的辅助增强或扩增免疫应答的细胞的应答。特别的，免疫应答可以被树突状细胞的增殖和/或扩增来提供，尤其是DEC205+，CD40+和CD86+细胞，
术语微颗粒有着和上面提及的相同的含义。
优选的微颗粒在0.03和0.5μm之间，更优选的在0.03和0.1μm之间。仍更优选的在0.03和0.1μm之间，甚至更优选的微颗粒在约0.03μm和约0.05μm之间。甚至更优选的在约0.03和0.04或0.19和0.049μm。仍更优选的抗原/微颗粒组合物特别适合于引发强烈的细胞和或体液免疫应答。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了一个在研究对象上引发免疫应答的方法，上述方法包括给予研究对象一个免疫有效量的包含至少一种结合于微颗粒的抗原的组合物，其中所述微颗粒具有和病毒一样的大小范围，并且免疫应答包括刺激和/或扩增树突状细胞。优选的微颗粒是约40到50nm，最优选的是40到49nm大小。
在另一个实施方案中，本发明提供了一个通过单剂量引发对抗原的保护性免疫应答的方法，上述方法包括施用，仅是单次给予研究对象，免疫有效量的、包括至少一种结合于微颗粒的抗原的组合物，其中所述微颗粒具有和病毒一样的大小范围，并且免疫应答包括刺激和/或扩增树突状细胞。优选的所述微颗粒是约40到50nm，最优选的是40到49nm大小。
在另一部分本发明提供了一种为了引发免疫应答在体内将抗原转运入树突状细胞的方法，上述方法包括给予研究对象施用免疫有效量的、包括至少一种结合于微颗粒的抗原的组合物，其中所述微颗粒具有和病毒一样的大小范围，并且免疫应答包括刺激和/或扩增树突状细胞。优选的微颗粒是约40到50nm，最优选的是40到49nm大小。
本发明也扩展到一种制造免疫原性微颗粒/抗原组合物的方法，其包含将具有和病毒一样的大小范围的微颗粒与一种或多种抗原接触，以使得微颗粒和抗原相结合。本领域技术人员应熟知用于制造这种组合物的技术。
发明的详细阐述
本发明现在将参考下面的非限制性的实施例和图表来描述。
图1：组A-巨噬细胞与树突状细胞比较对不同大小微颗粒的不同摄取。每细胞1000个0.02，0.1或1微米的荧光珠与培养的、来自C57BL/B6小鼠的腹膜渗出液的巨噬细胞或骨髓来源的树突状细胞一起孵育过夜，FACSCan检测荧光细胞百分比。三个相似实验之一被显示。用10倍的珠浓度，与珠或Balb/c来源的抗原呈递细胞作用3小时，得到在摄取不同大小的珠上的类似的差异。组B-病毒大小的颗粒在体内淋巴结的细胞中被优先发现。左边在脚趾处用50微升的0.1％的不同大小(0.02、0.04、0.1、0.2、0.5、1和2微米)的荧光珠溶液皮内接种于C57BL/B6小鼠，10天后取走引流的腘淋巴结，用FACScan检测已摄取珠的细胞的百分比。数据用三次重复样本的平均荧光细胞百分比+/-标准误(SE)表示。0.04和0.1微米大小的颗粒有着比其他任何大小的显著更高的摄取(p＞0.001)。在仅用0.1或1微米珠的类似的实验中，0.1微米珠在接种后3，6，9天收集的淋巴结中比1微米珠有着显著更高的摄取。组C和D-病毒大小颗粒被淋巴结NLDC145+(也称为DEC205+)(组C)和F4/80+(组D)细胞优先摄取。用FACScan分析已摄取荧光颗粒的淋巴结细胞的树突状细胞标记NLDC145/DEC205或巨噬细胞/单核细胞标记F4/80的共表达。数据显示归结于珠摄取而发出荧光的NLDC145+或F4/80+细胞百分比。
图2：组A-用结合于不同大小珠的OVA通过接种诱导产生干扰素γ的CD8和CD4 T细胞。用100μg结合于0.02，0.04，0.1，0.2，0.5，1或2微米大小珠的OVA皮内接种C57BL/B6小鼠两次(间隔10天)，用IFNγ ELISPOT检测追加接种10天后的脾T细胞活性。测定对H-2Kb限制的CD8 T细胞抗原决定簇SIINFEKL或整个OVA的应答。对于检测对OVA的反应性，在检测前用磁珠(Dynabeads)先消除脾细胞中的CD8 T细胞再定量OVA反应性的CD4 T细胞。应用的SIINFEKL为2.5μg/ml和OVA为25μg/ml。三个相似实验之一被显示。对于每种大小的珠每组中接种2只小鼠。ELISPOT培养被重复两次，用每100万个被测定的细胞中的斑点形成单位(SFU)的平均值表示。标准差(SD)一直小于平均值的20％。组B-反应于SIINFEKL时通过ELISPOT检测的细胞毒活性的T细胞和分泌r干扰素的T细胞之间的相关性。用不同大小的OVA珠接种C57BL/B6小鼠，用上面描述的IFNγELISPOT检测对SIINFEKL的活性。此外，通过有限稀释分析平行检测SIINFEKL特异的细胞毒活性的T细胞数目。带铬的EL4细胞本身或用2.5μg/ml的SIINFEKL预处理的EL4细胞被用做靶细胞。显示的数据说明了两个检测之间的强相关性(R平方＝0.9254)。两个相似实验之一被显示。组C-用结合于不同大小的珠的OVA接种诱导抗体产生。从组A中描述的小鼠中收集血清，用ELISA检测稀释血清的OVA特异性IgG应答性。接受0.02，0.04，O.1，0.2，0.5，1或2微米大小的OVA珠接种的个体小鼠被标记。两个相似实验之一被显示。
图3：抗原共价结合于珠对于诱导理想的T细胞应答是必要的。组A-珠结合的OVA本身说明I型MHC限制性T细胞应答。用OVA共价结合的先前未透析的(对照)或用PBS通过300Kd分离膜透析的(透析)0.04微米珠接种C57BL/B6小鼠，用ELISPOT检测一次皮内接种10天后对生成干扰素γ的脾SIIFEKL特异性CD8 T细胞的诱导。用在两次重复实验中ELISPOT检测的每组4只小鼠的平均值+/-标准误表示。组B-合用珠和可溶性OVA不能诱导理想的MHC I型限制性的T细胞应答。用共价结合于0.1微米珠的OVA(珠结合的OVA)或注射前与OVA混合的珠(珠/OVA混合)接种C57BL/B6小鼠。用ELISPOT检测一次皮内接种10天后对生成干扰素γ的脾SIIFEKL特异性CD8 T细胞的诱导。两次重复实验中ELISPOT检测每组中两只小鼠的平均T细胞前体频率被显示。
图4：用病毒大小的珠-OVA的单次接种能有效地诱导持久的高水平的I型MHC限制性的T细胞。组A-用珠-OVA(0.1微米)皮内接种C57BL/B6小鼠1次，2次或3次，每次14天间隔，用ELISPOT检测每组最后一次接种10天后它们的干扰素γ对SIINEKL的应答。每组中有3只小鼠被接种，数据显示每个小鼠两次实验的平均值。两个相似实验之一被显示。组B-用珠-OVA(0.1微米)接种一次小鼠，并在12天或82天后通过ELISPOT测定干扰素γ对SIINFEKL或OVA的应答。如图2显示测定对OVA的抗体水平保持到第82天。
图5：检测皮内接种后引流淋巴结内摄取珠的细胞的CD40的表达。来自纯种C57BL/6小鼠(左)或用荧光0.04μm荧光珠皮内接种于脚趾的小鼠的腘淋巴结在注射后48小时被分离，用PE结合的对这些标记物特异的抗体的染色来分析CD40的表达。FL-1＝FITC阳性细胞(珠阳性)和FL-2＝PE阳性细胞(标记物阳性)。背景染色可以忽略(小于1％)。左边组表示来自非接种动物的腘淋巴结细胞，右边组表示来自VAP-OVA接种动物的相同类型细胞。
图6：0.1μm OVA-珠诱导成熟和不成熟小鼠DC的增殖。DC培养来自从C57BL/6小鼠后腿的胫骨和股骨提取的骨髓细胞，加有GM-CSF和IL-4。培养5天后，细胞按1.25×106细胞/1.25ml被分成实验条件和与每细胞1000珠的结合有OVA的珠(0.1μm)处理。4小时处理后，在培养物中加入LPS和a干扰素。细胞继续培养过夜，胸腺嘧啶核苷增殖分析设定在第二天，孵育过夜。每个数值代表三次的平均值+/-标准误(未处理的DC和实验组之间的*p＜0.00001，非配对t检验)。
图7：在脚趾处注射有50μl 0.04或1μm荧光珠-OVA的C57BL/6小鼠体内摄取0.04μm和1μm颗粒的APC表型特征的比较。48小时后分析引流的腘淋巴结的珠阳性细胞的活性与抗原呈递细胞系的细胞标记物的共染色。用3-14只小鼠/标记物的平均值+/-标准差表示。0.04和1μm荧光珠阳性细胞有着显著不同的DEC205、F4/80、CD40、CD80和CD86(p＜0.05)的表达。
图8A：DC摄取病毒大小的颗粒的机制。骨髓来源培养的DC与0(黑色)、5(白色)、10μM(灰色)的十四酸佛波酯乙酸盐(PMA)；0(黑色)、1(白色)、3mM(灰色)的阿米洛利(amiloride，AML)或0(黑色)、0.25(白色)或0.5μg/ml(灰色)的松胞菌素D(cytochalasinD，CCD)孵育30分钟，然后加入0.04μm的OVA荧光颗粒继续3小时。选择性抑制内凹、网格蛋白包被的小凹形成或吞噬已经在10μM PMA、3mM阿米洛利和0.5μg/ml CCD中被报道，相应的14，15。当同时使用时，PMA恒定在10μM，而加入AML 1(白色)或3mM(灰色)。用FACScan检测荧光细胞数目。数据用三次培养的平均值+/-标准误表示。
图8B：确认摄取的机制。DC在有或无1μg/ml CDD、1μg/ml非律平(FIL)或40mM氯化铵(AC)条件下孵育30分钟，加入0.04μm或1μm的荧光珠继续3小时。选择性抑制内凹或网格蛋白有被小凹形成在1μg/ml非律平和40mM氯化铵中被报道，相应的14-17，29。用FACScan检测荧光细胞数目。数据用三次培养的平均值+/-标准误表示。
图9：可溶性OVA和1μmOVA珠不能诱导与0.05μmOVA-珠能相比较的保护。C57/B6小鼠用结合于0.05μm或1μm珠的OVA、可溶性OVA接种或不处理，然后如上比较。数据用每组8个动物在第10天时个体肿瘤大小来表示。两次相似实验之一被显示。0.05μmOVA-珠组和其他任何一组的肿瘤频率的差异是显著的：P＝0.0001对未处理组；P＝0.0007对可溶性组和P＝0.0035对1μmOVA-珠组。
图10：病毒大小的颗粒不能和早期内体共存(左侧)。骨髓来源的DC和0.1微米珠-OVA(500珠/细胞)孵育过夜，轻轻洗涤以洗去游离珠，涂在玻璃载片上用于共聚焦显微镜。细胞然后用多聚甲醛固定，用triton增加通透性，用生物素结合的早期内体标记物Rab4的单克隆抗体染色，再加入抗生蛋白链霉素-Alexa。在未结合的0.04和0.1微米的珠中观察到了相似的结果，显示了三个实验之一。用DC和珠孵育30分钟或3小时，0.1微米珠同样不能和Rab4染色共存(右侧)。将0.1微米的珠-OVA皮内注射在小鼠的后脚趾，48小时后切除引流的腘淋巴结如上用于共聚焦分析。Rab4标记物和OVA结合或未结合的0.1微米或0.04微米珠没有发现有共存。显示了三个实验之一。相反的，在用1微米大小的荧光珠接种的阳性对照小鼠中确定有共存。
图11：保护性对抗肿瘤。组A用OVA-VSSP(接种)单次皮内接种或未处理(纯种)的C57/B6小鼠30天后用5×106EG7(肿瘤细胞)挑战。用测径器测定肿瘤大小。显示了每组10只动物个体的肿瘤生长曲线。组B肿瘤如上诱导，在第8天的肿瘤生长(第0天接种)，6只动物未处理(纯种)和6只用OVA-VSSP皮内接种(接种)显示了接种后3-13天个体的生长曲线。
图12：VSSP接种后小鼠经受致命疟疾挑战的生存率。用100μgVSSP-OVA、VSSP-裂解物或裂解物本身皮内接种C57/B6小鼠，再将之用500,000致命性约氏疟原虫17XL感染的C57/B6红细胞挑战。每天监测生存率。每组感染5只动物，六个代表性实验之一被显示。在相似实验中，纯种小鼠在2周后有40％生存率(8/20)。将约氏疟原虫17XL感染的红细胞反复冻融得到裂解物，超速离心，用标准方法结合到VSP上。
图13：按上面对抗原OVA描述的将抗原nm23被结合到0.05μm珠(VSP)，100μg/小鼠皮内注射到小鼠，10天后用ELISPOT检测接种动物脾中干扰素γ应答性。应答于nm23的前体细胞频率的数据用每100万脾细胞的斑点形成单位来表示，平均值的标准误。三只小鼠(m1-m3)的个体应答被显示。
图14：每方案中肿瘤抗原nm23或OVA被结合到VSP，100μg/小鼠皮内注射。10天后用ELISPOT检测白介素4分泌细胞的诱导。数据用每种免疫原接种的三只独立小鼠的斑点形成单位/百万细胞+/-标准误表示。
图15A：用结合有OVA的0.05μm珠(VSP-OVA)单次皮内接种小鼠血浆对OVA的抗体反应性，90天后用ELISA(B组)检测与未接种对照(A组)的比较。
图15B：用ELISA检测来自图15A中小鼠的相同血浆中的OVA特异IgE抗体，在两个纯种小鼠(A2和A3)和三个VSP-OVA小鼠(B2，3和5)。
图16：组A单次接种诱导持久的抗体应答。C57/B6小鼠用OVA结合的0.04μm珠单次接种，在不同的时间点收集血浆。显示了OVA特异的IgG的ELISA里，每组4个动物在405nm的平均光密度+/-平均差。未经免疫的血浆作为阴性对照。两次相似实验之一被显示。相似的ELISA结果在总Ig中得到，没有IgM或IgA被检测到(未显示)。OVA单独不能诱导PBS接种的动物的IgG应答，在完全Freund佐剂(CFA)中的OVA诱导的IgG应答比单剂量0.05μm珠-OVA对数级更高(未显示)。组B用0.04μm珠-OVA单次接种对持久的高水平的生成干扰素γ的T细胞的诱导。用结合于0.04μm珠的OVA(黑色或格子柱)，PBS中的可溶性OVA(白色柱)或用混合于0.04μm珠的OVA(灰色柱)皮内接种C57/B6小鼠。用IFNγELISPOT检测10天后(黑、白和灰色柱)或12月后(格子柱)的SIINFEKL活性脾T细胞的前体细胞频率。每组中有四只小鼠被测定，两次相似实验之一被显示。每组的每100万细胞的斑点形成单位(SFU)的平均值+/-标准差被显示。在相似实验中，用降低10倍的抗原(10μgVSP-OVA)单次接种诱导出每100万的102+/-56SIINFEKL特异性脾细胞(n＝4)。单次接种的10天后在标准的铬释放检测中也观察到了细胞毒T细胞应答(对于3/3动物大于50％特异性裂解在E∶T＝20∶1，没有显示)。
图17：初始/追加接种C57/B6动物分成未处理组或最初用100μg来自MUC1的肽cp13-32，其在完全Freunds佐剂(cp13)中结合到700μg的KLH，或用结合到重组MUC1-GST融合蛋白(MFP)的甘露聚糖，或用0.1μm结合到MUC1-GST融合蛋白的VSP(VSP)，进行皮内注射。10天后动物被用100万有传染性的表达MUC1蛋白的痘病毒再次加强接种，10天后用IFNγELISPOT检测对Cp13-32抗原簇的反应性。数据用每组2-3动物平均的每100万脾细胞中产生IFN-γ细胞的平均数目+/-平均差来表示。
图18：比较聚苯乙烯和玻璃的0.05μmVSP-OVA颗粒。聚苯乙烯0.05μm珠如上所述被结合到OVA(PS)并与以同样方式结合到玻璃珠的OVA(G1)作比较。另外，一种不同的化学操作比较于玻璃珠。简言之，玻璃珠被称量，悬浮在PBS中形成2.5％固体，洗涤2遍。在微量离心机中离心5分钟去除PBS。珠被重悬在8％戊二醛的pH值7.4的PBS溶液中，在室温下轻轻混合过夜。珠用PBS再洗涤3遍，重悬在PBS中。加入每毫升500ug的蛋白，轻轻混合5小时。珠被沉淀，将沉淀物重悬在0.5M的氨基乙醇中混合30分钟而终止反应。用PBS洗涤珠并用于接种(G2)。将聚苯乙烯(PS)或玻璃(G1或G2)的VSP-OVA按100μg/小鼠的量皮内接种，10天后ELISPOT定量化来源于脾的SIINFEKL特异性分泌干扰素γT细胞。数据用每组三只动物的个体平均值+/-标准差表示。
图19：珠结合形式和免疫原性。50mM MES缓冲液(pH 6.0)中的2mg/ml卵白蛋白与聚苯乙烯羟基修饰的0.05μm的珠(2％固体)混合15分钟。在每份制备物中加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)-碳二亚胺到4mg/ml(pH 6.5)，在室温下孵育2小时。标准(甘氨酸)用7mg/ml甘氨酸或20μl 1M pH 7.4的氨基乙醇(胺)，或20μl 1MpH 8.0的胺乙醛二甲基乙缩醛(醛)，或20μl 1M pH 7.4的乙二胺(醇)淬火。制备物在室温下孵育近16小时。所有的制备物在4℃下PBS中透析过夜。醛的制备物进一步用20μl 1M HCL淬火并孵育4小时，在4℃下PBS中透析过夜。用100μg每种VSSP-OVA颗粒皮内接种2-3只C57/B6小鼠，用干扰素γELISPOT检测脾中针对CD8 T细胞抗原决定簇SIINFEKL的免疫原性。结果用每只动物中每100万脾细胞中斑点形成单位的平均值+/-标准差来表示。
实施例1：使用的材料和方法
小鼠和接种：6-8周大小的C57BL/6和BALB/c小鼠都购自Walter和Eliza Hall。小鼠以100ul的抗原结合珠皮内(ID)接种在后脚趾。
试剂：所有试剂包括抗原卵白蛋白(OVA，III级)和1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳二亚胺(EDAC)，除非另外说明都购自Sigma公司。用于FACScan和共聚焦研究的单克隆抗体来自在蛋白G柱(Pharmacia)上自杂交瘤系自制(in house)纯化或购自Pharmigen。FITC结合的和羧化的0.02-2μm荧光球都购自Molecular Probes，非荧光的羧化微球购自Polysciences。使用了以下标记物的抗体：MHCII、MHC I、CD11c、CD11b、F4/80、NLD-145、CD8 alpha、CD40、CD80和CD86。共聚焦研究中使用的抗Rab4单克隆抗体是Dr.Russel(Peter McCallum Research Institute)的惠赠品。
抗原呈递细胞：树突状细胞制备于骨髓单核细胞按以前发表的方法稍加改动[5]。简要的，通过用培养基将细胞从后肢的胫骨和长骨的骨腔中冲洗出来，收集后接着裂解红细胞。细胞按1×106/ml种植在RPMI(CSL、AUST)中，其中含有10％热灭活的胎牛血清(FCS)，4mM L-谷酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素、100μM巯基乙醇、1000U/ml GM-CSF和0.2ng/ml的白细胞介素-4。在直径100mm的petri-dishes中的10ml培养基在潮湿的CO2孵箱中37℃下生长5-6天。在腹膜内注射硫胶质3天后从小鼠的腹膜腔内获得巨噬细胞，如所述方法培养3天来富集粘附细胞组分。
珠-抗体结合按生产商说明进行。简要的，OVA在0.05M MES缓冲液pH6.0中稀释为2.0mg/ml，和2％固体/体积的珠按体积比1∶1混合。轻轻摇动混合液15分钟，然后加入4mg/ml EDTA。用稀释的NaOH将混合液pH值调整为6.5。轻轻摇动混合液2到3小时。加入甘氨酸使得其终浓度为100mM以终止反应。混合30分钟后，制备物在冷PBS中透析过夜。制备物可以马上使用或与0.01％叠氮化物储存在4℃备用。
细胞毒检测：按[3]描述的方法进行。简要的，用于细胞毒检测的效应细胞为脾细胞，在2ml培养皿按2.5×106/ml在37℃、潮湿的CO2孵箱，和含10μg/ml肽抗原的RPMI(CSL、AUST)培养基中培养7天，其中含有10％热灭活的胎牛血清(FCS)，4mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素和100μmβ-巯基乙醇。白介素2(10U/ml，重组人白介素2，Lymphocult HT、Biotest、UK)在第三天加入。靶细胞是51Cr标记的EL4细胞，单独(背景)或在37℃下和10μg/ml SIINFEKL肽预处理1小时，或EG7，一种卵白蛋白转化的EL4细胞株。除非另外说明，检测在效应细胞∶靶细胞比为20∶1下重复2次。在四次重复实验中对所有靶细胞都设定了自发裂解(仅有培养基)和最大裂解(有5％triton)。4小时后收集上清。裂解％计算为100×(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)。特异裂解％(SL％)为肽裂解％-无肽裂解％。
细胞毒T细胞前体(CTLp)检测：CTLp检测按以前描述的[7]进行。对于至少6个效应细胞数目(1×103-1.28×105)，要至少32次重复以得到CTLp频率。5×105丝裂霉素C处理过的同源脾细胞被培养在U底的微量滴定盘上的含有10％胎牛血清、5μM SIINFEKL或OVA和10U/ml重组人白介素2的DMEM中。7天后，用以含有104 51Cr标记的EL4或EG7细胞为靶细胞的100μl靶细胞悬液取代100ml的培养基来检测每个微培养的细胞毒性。如果发现每个盘中Cr的释放在仅和刺激物共培养的104个效应细胞或仅和肽或仅和重组人白介素2的刺激细胞中的平均同位素释放值的3个标准误之上，那么认为存在细胞毒活性。在应答细胞数目之间存在着线性关系(0.987≤r2≤1)，表现为线性曲线，阴性细胞频率为对数曲线。CTLp频率用达到产生37％阴性孔的应答细胞剂量的倒数表示。CTLp频率检测进行3次，每次频率差异不超过平均值的20％。
ELISPOT IFNγ检测：按[3]描述的进行。简要的，100μl的5×106/ml新近分离的脾细胞和设定的刺激物在预包被抗小鼠IFNγ单克隆抗体(R4)的乙酸板(MAHA Millipore)上培养18小时(EACC)。每个条件都设置复孔。应用的培养基为RPMI1640(CSL)，附加物同上描述。过夜培养后，细胞被洗涤，板和第二种生物素结合的抗小鼠IFNγ单克隆抗体(XMG.21-生物素、Pharmigen、CA、USA)孵育，之后结合1μg/ml的extravidin碱性磷酸酶(A-AP)(Sigma)。用比色法AP检测试剂盒((Biorad、Hercules、CA、USA)检测碱性磷酸酶活性斑点，利用解剖显微镜计数。数据用每百万细胞的斑点形成单位表示。使用的SIINFEKL肽为2.5μg/ml。
统计分析：在保护性研究中，每组受保护的小鼠数目的比较用Epilnfo Version 5.0的STAT程序的卡方检验。在免疫原性研究中，组间的ELISPOT和Cr释放应答的比较用Microsof Excel Version 5.0a中的Student′s t检验。线性回归用于检测免疫原性和保护性之间的相关性用SPSS for Windows统计软件包，
树突状细胞和巨噬细胞摄取珠：在显微镜玻片上的生长3天的巨噬细胞培养物和5天的树突状细胞培养物用不同大小的荧光微珠孵育5分钟到24小时。培养物被洗涤以去除游离的珠和准备用于FACScan或共聚焦分析。
体内摄取珠的细胞分析：从珠接种的小鼠中从接种后12小时直到12天间隔不同时间收集其引流的淋巴结和脾。收集细胞，裂解红细胞后洗涤，准备用于FACScan或共聚焦分析。
细胞表面标记物染色和流式细胞分析：对于表面染色，5×105细胞与PE标记的抗表面标记物F4/80和NLD-145、CD的单克隆抗体孵育。对于那些不能被直接标记的抗体，两步洗涤后，细胞和对第一种抗体特异的第二种PE标记的抗体孵育。在和第二种抗体孵育之前的封闭步骤中使用生产第二种抗体的物种的天然血清。两次洗涤后，细胞用PBS/0.2％多聚甲醛洗涤，用FACScan流式细胞仪(Becton-Dickinson)和CeIlQuest软件分析。设定光栅门以去除死细胞和非淋系细胞。来自珠接种的未经任何表面标记染色的细胞和来自天然小鼠经对表面标记的PE标记抗体染色的细胞用于确定FITC和PE发射谱之间重叠的校正。
吞噬FITC标记的珠的共聚焦显微镜检测：使用Olympus镜头的共聚焦显微镜，带有Krypton-Argon激光光源，装备有双重的荧光和发射检测来确定是否不同大小的荧光珠被巨噬细胞或树突状细胞吞噬。将标本制成0.5-1.0微米尺寸的的系列切片以确定吞噬作用和用Optiscan分析仪分析。细胞在488nm和568nm被激活相应荧光素和Alexa594，相应的通过530nm和610nm区带滤过片来检测。所有的采集中，激光能保持在饱和水平以下，增益和补偿参数在单一实验中固定。
ELISA检测：用ELISA测定反应于OVA的抗体。聚氯乙烯板用OVA(10μg/ml在0.2M NaHC03缓冲液、pH 9.6)4℃包埋过夜。板用PBS/0.05％Tween20洗涤4遍和PBS洗涤4遍，利用2％小牛血清白蛋白非特异性结合在室温下封闭1小时。如上洗涤后，加入小鼠血清的系列稀释液，室温下孵育1小时。非免疫小鼠的血清作为阴性对照。板被洗涤，用辣根过氧化物酶结合的羊抗小鼠Ig(Selinus、AUS)和显色底物2，2’-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉)磺酸(Amersham、UK)检测结合的抗体。用EL 312e微量反应板读取器记录在405nm的吸光度。
实施例2：体内和体外抗原呈递细胞对VSSP的优选摄取。
大量利用来自巨噬细胞/单核细胞系的研究已经显示颗粒大小依赖性的吞噬作用，理想的摄取是1微米直径[10，11]。在树突状细胞中也观察到了摄取，然而，颗粒大小的综合范围还没有被测定。发明者尤其感兴趣于是否病毒大小的蛋白包被的颗粒(0.03-0.1μm)也能被树突状细胞或巨噬细胞有效地摄取。图1a显示硫胶质引发的腹膜渗出液的巨噬细胞内吞了1μm和0.1μm的荧光素标记的颗粒(荧光素珠)。相反的，发现未成熟的骨髓来源的树突状细胞优先摄取0.1μm大小的荧光素珠。共聚焦显微镜用于确认颗粒在细胞内(未显示)。这体内数据提示病毒大小的实心颗粒(VSSP)在体内也能被抗原呈递细胞优先摄取。一组不同大小(0.02、0.04、0.1、0.2、0.5、1和2μm)的荧光素聚苯乙烯蛋白结合的颗粒被皮内注射到C57/B6小鼠的脚趾中。10天后收集引流淋巴结的细胞用于FACScan分析。0.04-0.1μm大小的颗粒被淋巴结细胞优先摄取(图1b)。分析颗粒注射后的第1、3、6和10天的淋巴结细胞和未结合的颗粒取得了相同的结果。VSSP被同时表达巨噬细胞和树突状细胞表面标记物的抗原呈递细胞有效摄取(图1b)。骨髓来源的树突状细胞体外也摄取VSSP。和预想的一样，这些细胞主要是髓系表型的[12]。
实施例3：VSSP诱导高的细胞毒和IFNγ分泌T细胞的前体频率和
抗体
体内树突状细胞对VSSP的有效摄取提示它们可以用作靶抗原的转运和新疫苗的潜能。用卵白蛋白(OVA)包被的0.02、0.04、0.1、0.2、0.5、1或2μm颗粒接种C57/B6小鼠，15天后追加接种，10天后收集血清或脾细胞。图2a显示用0.04μm大小的颗粒获得了对MHC I型限制性SIINFEKL抗原决定簇诱导的IFNγ分泌CD8 T细胞的满意诱导。应答于OVA的CD4 T细胞发现有着于OVA结合的范围在0.04-1微米的颗粒相似的前体频率。VSSP诱导的对SIINFEKL的细胞毒T细胞和IFNγ分泌T细胞的前体频率相关(R2＝0.92)(图2b)。OVA特异IgG在用0.04μm接种的小鼠具有最高的前体频率，其次为用1μm颗粒接种的小鼠中。用无荧光素的VSSP也发现了相似的结果。因此，与许多免疫原和佐剂优选地启动细胞或体液应答不同，VSSP对两者都能诱导出高水平的应答。
图2显示的结果是基于注射相同总量的结合抗原，但未消除残留的可溶性抗原。图3a显示在可溶性抗原被透析或超速离心去除后，用0.04微米VSSP获得了相似的T细胞应答。因此，可溶性抗原对于观察到的T细胞应答没有显著的作用。这也被结合和未结合OVA和VSSP混合物的比较所支持。图3b显示只有共价结合的VSSP能诱导高水平的SIINFEKL特异性T细胞。因此，共价结合到VSSP对于在体内将OVA导入I型呈递途径和诱导I型限制性的T细胞是必要的。能推测更大量的结合蛋白在更小的颗粒比在更大的颗粒能产生更高的VSSP免疫原性。然而，不是这样，因为：1)0.04μm为免疫原性高峰，而0.02μm大小的珠诱导出的反应性极低(图2)；2)0.04-0.1微米的VSSP比1μm颗粒一直具有更高的免疫原性，而不论结合抗原的水平；3)将1μm颗粒的接种浓度增加到所用VSSP的浓度的100倍(到1mg/小鼠)也不能将免疫原性增强到在结合于VSSP的一定浓度范围的抗原上看到的水平；4)用等效价量的不同大小的珠上的结合蛋白，或用相同数目的不同大小的珠接种，一直显示VSSP比浓度范围广泛(0.5-1000μg总OVA、0.5-50μg结合的OVAand 103-108珠/动物)的更大的颗粒有着更高的免疫原性。
实施例4：颗粒摄取和加工的新途径
已经显示：通过II型MHC加工途径消化形成的肽能被返流并最终结合到细胞表面空置的I型MHC分子[1，10]。I型呈递的不同机制是独立于TAP(抗原加工相关转运子)介导的进入内质网(ER)的转运。乙型肝炎病毒表面蛋白VLP在巨噬细胞内通过非TAP依赖性机制被加工成I型呈递[2]。发明者用OVA-结合的VSSP接种敲除TAP的C57/B6小鼠，在TAP敲除动物中没有检测到对SIINFEKL或OVA的上述背景水平的T细胞应答，这提示对VSSP的I型呈递相反的是TAP依赖的。对于吸收进1μm颗粒的蛋白，外源性抗原的I型呈递的TAP依赖性机制已经被描述成基于内饮囊泡的“渗漏”和抗原偶然地释放到细胞浆内[1，10]。被吞噬作用摄取的如此大的颗粒的加工包括了与表达Rab4衔接子蛋白的溶酶体早期结合的步骤[13]。本发明者用共聚焦显微镜确定是否VSSP将按这个途径进行。图4显示Rab4和含VSSP荧光珠的囊泡在骨髓来源的培养的树突状细胞和皮内注射VSSP 24小时后体内的淋巴结细胞中都没有共存。因此，VSSP可能利用一种不同于VLP和更大颗粒的加工途径，它是Rab4非依赖性和TAP依赖性的。机制在实施例7中进一步研究。
实施例5：VSSP在体内和体外诱导抗原呈递细胞扩增。
C57/B6或不处理或用荧光素0.1μm荧光珠在脚趾皮内接种。在注射48小时后切除腘淋巴结(LN)，通过用PE结合的CD40特异性抗体染色分析该标记物的表达。
结果(图5)显示：0.04，0.05，0.1μm聚苯乙烯珠单独或结合到OVA能增加皮内接种后来自引流淋巴结的细胞总数达4倍。此外，它们能引起NLDC145+(树突状细胞标记物)细胞的比例增加1.5倍，但对F4/80+(单核细胞/巨噬细胞标记物)细胞则不能。它们也增加表达活性分子CD40和CD86的淋巴结细胞的比例大于1.5倍。图5显示用FACScan观察到接种后增加CD40+细胞的例子(33％到66％)。也显示这些细胞中的许多已经摄取0.04μm珠，在这里我们使用的绿色荧光素核心的0.04μm珠。
0.04，0.05和0.1μm的聚苯乙烯珠本身或结合到OVA能诱导纯化于小鼠骨髓的树突状细胞在体外的扩增。不成熟的，而非成熟(LPS和alpha肿瘤坏死因子活化后)的树突状细胞对于VSSP的激活效应是敏感的(图6)。
这些数据综合提示，0.04-0.1μm大小的颗粒(VSSP)有着不可质疑的、前所未知的刺激抗原呈递细胞的能力，包括树突状细胞，和表达象CD40和CD86的有效共刺激分子的特殊细胞的增殖和扩增。另外，这提示VSSP对于免疫应答可能有佐剂效应的机制，甚至是对于那些非化学性地与其结合的抗原所引起的应答。
实施例6：注射后快速摄取VSSP的细胞的扩展表型
为了进一步评价哪类细胞在皮内脚趾注射后快速地摄取VSSP(因此可能有关于随后的免疫激活)，切除了引流的腘引流淋巴结。FACScan分析摄取了带有荧光素核心的0.04μmVSSP-OVA的细胞表型，并与相同的但为1μm大小的颗粒比较。图7显示表达每种表型标记物的0.04μm珠阳性或1μm珠阳性细胞比例。摄取0.04μm珠的细胞最大多数是NLDC145+，CD40+和CD86+。另外，更多的CD11c+、CD4+和CD8+细胞是0.04μm珠阳性多于1μm珠阳性。这种已经摄取了0.04μm珠的细胞的高度激活的DC表型可能进一步解释我们观察到的免疫应答是如此有效的原因，尤其是CD8 T细胞应答。
实施例7：微颗粒的摄取和加工
为了明确树突状细胞摄取0.04μm珠-OVA的机制，将骨髓来源的DC和吞噬作用的抑制物(松胞菌素D，CCD)，网格蛋白小凹的抑制物(阿米洛利，AML)或内凹介导的内饮作用的抑制物(十四酸佛波酯乙酸盐，PMA)一起孵育。将DC分别和设定浓度的PMA、AML、CDD、非律平(FIL)或氯化铵(AM)(都来自Sigma)在三个复孔中培养30分钟。加入OVA-荧光素0.04μm珠继续3小时，用FACScan检测摄取。
PMA和AML都减少了DC对0.04μm珠-OVA的摄取，但是CCD不能造成任何的抑制(图8a)。PMA和AML的抑制具有相加作用(图8a)。这提示网格蛋白小凹和内凹都参与了VSSP的摄取。
阿米洛利作用是抑制对于受体介导的内饮所必要的Na+-H+交换[14]。本发明者另外试验了通过干扰细胞浆酸化作用而抑制网格蛋白小凹装配的氯化铵，氯化铵抑制了0.04μm而不是1μm大小的珠的摄取(图8b)，确认了网格蛋白小凹在VSSP摄取上的作用。内凹也被提示是介导了DC摄取病毒颗粒的新的机制[15]。本发明者用PMA的结果提示内凹参与了DC摄取VSSP(图8a)。为了确认这点，本发明者使用了另一种内凹的抑制物，非律平。非律平通过降解胆固醇起作用，PMA影响了磷酸化作用而调节内凹内饮作用[14，15，16，17]。与PMA类似，非律平阻断了0.04μm而不是1μm珠的摄取，确认了本发明者的假设(图8b)。
内凹和网格蛋白小凹能将分子转送到内体和溶酶体的区域[14，16]。或者，内凹可以将抗原直接转运到细胞浆[17]导致细胞浆的加工和ATP依赖的转运进内质网以用于I型MHC的呈递。
这些结果，和实施例4中显示的结果一起，说明了根据本发明所表现的一种新的加工抗原的途径。本发明的免疫原性组合物表现为被抗原呈递细胞通过内凹和或网格蛋白小凹摄取，之后抗原被Rab4非依赖性和TAP依赖性的途径加工用于I型MHC的呈递。本发明关于内凹诱导TAP依赖性的抗原呈递途径和CD8细胞的能力是新颖的，以前没有报道过。
实施例8保护效应的比较
将50nm(也就是0.05μm)(VSSP)的OVA结合颗粒与OVA单独或1000nm(也就是1μm)OVA结合颗粒进行对照，以直接比较其在小鼠保护性对抗随后皮下注射100,000表达OVA的肿瘤细胞(EL4)挑战的能力。所有的小鼠用100μg上述的一种(或没有＝未处理)皮内接种一次，然后在30天后用肿瘤挑战。图9a显示VSSP-OVA完全阻止了表达OVA的肿瘤的生长，OVA单独或1000nm珠的保护效应不显著。
实施例9：单次VSSP免疫诱导了高水平的免疫力和对保护性对
抗肿瘤的挑战
用OVA结合的VSSP皮内接种诱导了产生IFNγ干扰素的细胞毒性SIINFEKL特异性T细胞(图10a和1a和b)。在接种82天后T细胞能保持高的前体频率(图10d)。抗体应答同样被保持着(图16)。单次VSSP接种获得的CD8 T细胞前体频率比单次甚至多次VLP颗粒接种观察到的更高，唯与高效异源的初始/追加方案相当[1，2，3，19，20]。高的产生IFNγ和细胞毒T细胞前体频率与保护性对抗许多细胞内病原体和肿瘤相关[21，22，23]。本发明者用单一皮内剂量的OVA结合的VSSP接种C57/B6小鼠，然后用EG7肿瘤细胞株挑战它们，EG7细胞株表达细胞浆内的OVA并是细胞毒SIINFEKL特异性T细胞的体外靶细胞。结果显示VSSP接种的小鼠完全保护性对抗了肿瘤的挑战，而所有的未处理对照组都出现了肿瘤。另外，随着抗原结合VSSP的单次注射，抗体水平也增加，和在图2c中观察到的相似。
关于VSSP疫苗进一步的工作。
下面描述的实施例10到13正式示范了VSSP能和不同的抗原一起使用并诱导广泛的免疫力，包括生成干扰素和白介素4的T细胞。单次剂量后被诱导的是高水平的IgG，而不是有潜在的过敏性的IgE。
VSSP对于治疗的有效性还表现在另外两个模式上。1)100％清除存在的肿瘤(见实施例10)和2)在单次疫苗注射后对致命性疟疾的保护性对抗(见实施例11)。这进一步确定了VSSP做为一种具有不同寻常的效果和可变通的免疫接种方案，可以发展为对抗不同疾病的单剂量疫苗。此外，基于这些发现，本发明者相信VSSP可以被用于肿瘤的治疗和预防。
实施例10：清除已存在的肿瘤
本发明者已经观察到用珠-OVA单次接种完全保护性对抗了随后表达OVA的肿瘤的挑战。
C57/B6小鼠用100μg珠(0.05μm)-OVA(皮内注射)单次接种或不处理。30天后，用5×106EG7肿瘤细胞株挑战小鼠。在接种的3-13天后用测径器测定肿瘤大小。为回顾性研究，用EG7细胞种植小鼠，8天后分为相同肿瘤大小分布的组。一组不处理，另一组3天后(也就是在注射肿瘤细胞株11天后)用珠-OVA接种。
本发明者现在表明对存在肿瘤负荷的小鼠进行单次接种能治愈已经存在的肿瘤。在单次注射的2周后，肿瘤已被从接种的小鼠上清除。这个治疗能力对于任何肿瘤疫苗都是极其不寻常的，这使得这个疫苗载体对于发展治疗性疫苗是有很大希望的(图11B)。
粘蛋白-1或Muc1是乳腺癌相关抗原。用VSSP-Muc1蛋白单次接种能抑制用表达乳腺癌抗原的肿瘤细胞株挑战的小鼠的肿瘤形成(见图11A)。
实施例11：保护性对抗疟疾
本发明者证明直径0.05μm的聚苯乙烯珠可以用做载体在小鼠中诱导对疟疾的保护性对抗。来自约氏疟原虫感染的红细胞的裂解物被结合到珠上，用于接种小鼠，然后用致死剂量的寄生虫挑战小鼠。
在50％寄生虫血症时收集感染了约氏疟原虫17XL的C57BL/6小鼠的血液。离心800g 15分钟获得的红细胞被冻融3次和超声裂解。裂解物如上所述被结合到0.05μm颗粒上。珠-裂解物，珠-OVA或裂解物本身被皮内注射。在两周后用1,000,000个约氏疟原虫感染的红细胞腹腔内注射，挑战接种的或未处理的C57BL/6小鼠。
所有经上述处理的动物均在挑战中存活下来，而60％的仅用裂解物(没有珠结合)接种的动物不能控制感染而死亡(图12)。这是单剂量疫苗能用于实现对血液阶段疟疾的保护性对抗的第一个证明。单剂量疫苗对于在第三世界广泛存在的疟疾和其他疾病是特别有吸引力的，因为它简化了疫苗的注射和分发，可以保证覆盖广泛的人群。
实施例12：细胞免疫
1)直径0.05μm的聚苯乙烯珠结合了不同于OVA的抗原，如肿瘤抗原nm23，也能诱导强烈的细胞免疫，如对分泌干扰素γ的T细胞的高水平的诱导(图13)。
2)和诱导细胞免疫一样，珠-OVA或珠-nm23诱导了高水平的IL4(图14)。这个淋巴因子启动了抗体的生成，这可以解释为什么我们观察到了良好的抗体诱导以及细胞免疫(需要干扰素γ)。
实施例13：抗体免疫
1)直径0.05μm的聚苯乙烯珠结合到OVA在单次皮内(ID)注射后诱导了高滴度的IgG抗体(图15A)。
2)除了高IgG水平，没有出现可测定的IgE水平。因此，这个疫苗形式上证明没有诱导潜在的有害的IgE应答(因为它们参与过敏)的危险。
实施例14：通过不同途径施用并诱导IgG与IgA抗体
为了确定将疫苗施用于人的有用途径，如上面描述的皮内给药、小鼠被通过腹膜内、皮下、鼻内和直肠内给予VSSP结合的OVA(100ug/小鼠)。在单次接种30天后测定每组中的3-4只小鼠。与皮内相似，ELISPOT检测到了所有途径均诱导了对于SIINFEKL或OVA的分泌γ干扰素的T细胞(1/50,000到1/2,000脾细胞)。令人惊讶的是，与用皮内注射的最初观察到的诱导了高水平的IgG但是很少或没有IgA相反，这些途径给予的VSSP-OVA诱导了血清IgA应答，直肠内和鼻内途径没有诱导可检测的IgG(滴度小于1/100)(表1)。因此，通过直肠内、腹膜内、鼻内和皮下途径，VSSP能用于诱导对疾病的保护性免疫，其中IgA扮演着保护作用，如粘膜感染(如肺内，宫颈或肠道)。
表1
| 途径 | 血清IgG滴度 | 血清IgA滴度 |
| 直肠内 | ＜1/100、＜1/100、＜1/100 | 1/1280、1/640、1/1280 |
| 腹膜内 | 1/1640、1/100、1/400 | ＞1/5120、＞1/5120、＞1/5120 |
| 鼻内 | ＜1/100、＜1/100、＜1/100、＜1/100、 | 1/160、1/320、1/320、1/640 |
| 皮下 | 1/800、1/200、1/6560 | ＞1/5120、＞1/5120、＞1/5120 |
在两次剂量后的不同寻常的高IgG应答：
用VSSP-OVA(100μg/小鼠，14天间隔)接种两次，引起了如ELISA所检测到的令人惊异的滴度超过1/500,000的高水平血清Ig和IgG抗体生成。用乳腺癌抗原nm23和疟疾抗原MSP4/5结合到VSSP接种后，所得到的特异性IgG抗体的结果与此相似。
实施例15：持久的免疫应答
VSSP-OVA引起的应答出乎意料的长久。图16显示在单次皮内接种(100μg/小鼠)1年后仍存在ELISA可测定的强OVA特异性IgG抗体(组A)和干扰素γELISPOT可测定的应答于SIINFEKL的CD8T细胞(组B)。组B还表明为了得到理想的免疫原性，抗原必须是共价结合在实心颗粒上。
实施例16：异源性初始/追加接种
在未用，或用来自完全Freund佐剂的MUC1的肽cp13-32(cp13)，结合有MUC1的甘露聚糖(重组MUC1-GST融合蛋白)(M-FP)或0.1μmVSSP-MUCI(重组MUC1-GST融合蛋白)(VSSP)初始接种的动物上追加接种牛痘-MUC1。图17显示比较于那些单独接受牛痘-MUC1的动物(未处理/V比较VSSP/V)，对于MUC1的肽13-32区段的应答在VSSP-MUC1初始，牛痘-MUC1追加组中增强。因此VSSP抗原对于用于异源性初始-追加免疫方案是适合使用的。
实施例17：VSSP实心核心的材料构成
本发明者的假设是：0.04-0.05μm大小的实心核心是VSSP免疫原性的首要决定因素，推测在这个大小范围内由除聚苯乙烯外的其他材料构成的颗粒也将是高度免疫原性的。因此，她比较了给小鼠单次皮内接种由聚苯乙烯(PS)或玻璃(G1或G2)构成的0.05μm的颗粒的免疫原性，所述颗粒用相同的化学操作(G1)结合到OVA或用戊二醛(G2)结合。图18表明聚苯乙烯和玻璃构成的VSSP都有相似的高的免疫原性，包括ELISPOT检测到的、对SIINFEKL产生干扰素γ的T细胞的高前体频率。因此，对于蛋白结合的VSSP的实心核心能用玻璃和聚苯乙烯提供，预测其他用于实心核心的材料也是有功能的，例如PLG。
实施例18：抗原和VSSP的结合
结果显示将抗原和0.05μm的颗粒混合使之比抗原本身具有更多的免疫原性，但是共价结合对于理想的免疫原性是必要的。因此用于将抗原结合到VSSP的化学操作理论上是免疫原性的决定因素。特别的，颗粒的整体电荷将促进与特异血清或其他内源蛋白的反应。这些反过来理论上能促进树突状细胞的摄取和引起高免疫原性。为了对此进行测定，小鼠用具有不同表面电荷的50nm(也就是0.05μm)的颗粒接种。OVA-VSSP有整体负电荷归结于使用了羧化修饰的纳米颗粒和在OVA与甘氨酸结合后对活性羧酸基团的猝灭(甘氨酸，图19)。通过与氨基乙醇猝灭反应，除结合后的OVA的净电荷以外的电荷能被中和(乙醇，图19)。通过乙二胺的猝灭引进了阳性电荷(胺，图19)。通过氨基乙醛二甲基乙缩醛(醛，图19)的猝灭引入潜在有用的醛基团。所有对结合方案的三种修饰形成高免疫原性的颗粒，与甘氨酸和醛比较，胺和乙醇修饰是稍小的免疫原性。由于在颗粒中引入相反的电荷仍产生相同的免疫原性，因此不大可能由非特异性吸附血清蛋白产生免疫原性。另外，可以采用一些对于结合过程作出的选择性修饰和改变电荷，且不改变免疫原性。
讨论
考虑到上面的结果，本发明的组合物提供了一种进一步提高或改良用于不同的感染，癌或其他疾病的疫苗或接种策略的方法。
VSSP的理想大小和大多数已知病毒相同(30-150nm)。使用VSSP具有生物学的重要意义是具有吸引力的设想。从上述观察，本发明者相信免疫系统可以被启动去完全应答于VSSP大小范围内的颗粒。在本发明之前，不知道或不了解免疫应答的刺激很大程度上依赖于那些在病毒范围内的免疫刺激物的大小，尤其当来自其他病原体如细菌，真菌的抗原决定簇是非常的大。的确，通过这途径的靶抗原不可思议地引发了广泛的(包括免疫系统的体液和细胞两方面)和强烈的应答(诱导快速持久的高效应T细胞前体频率)，提示免疫系统可以被启动完全应答于病毒大小的颗粒。以往利用VLP(也就是没有连接于颗粒的纯抗原)包括HepB表面蛋白或酵母菌逆转录蛋白(Ty)的研究也已经显示单次接种剂量诱导了广泛和持久的免疫，尽管应答是比用VSSP低10-100倍[1，2，3，19，20]。然而已经假设除了大小外的其他的特性，如其脂质或甘露聚糖成分，或膜结合蛋白形成了VLP诱导I型限制性T细胞应答的能力[1]。不希望被理论所限制，本发明者认为在体内通过VSSP将有效的靶抗原合并于抗原呈递细胞如树突状细胞，之后通过VSSP上的蛋白裂解造成的抗原缓慢潜在的释放可能形成特别有力的免疫原。
在OVA模型中单次接种剂量保护性对抗了随后的肿瘤细胞的挑战的能力证实了利用VSSP做为新疫苗。本发明者也已经观察到对乳腺癌表达抗原，粘蛋白1(MUC1)的广泛和强烈的免疫原性和保护。在它们的动物研究中利用的注射的皮内途径在人类中可以容易实现。VSSP因此可以提供了一种特别具有吸引力并简单的人类疫苗发展的策略，尤其对那些体液和细胞免疫参与产生保护的疾病，如疟疾、癌和病毒疾病，特别的，AIDS和肝炎[10，12，21，25-28]。靶向于I型呈递途径的重组抗原也提供了诱导针对多种抗原决定簇的T细胞应答的可能性，因此将扩展这些疫苗在MHC多变的靶向人群中的使用。
目前，有效的CTL刺激物激活DC是通过离体处理DC，但是这是昂贵的和相当困难的。本发明提供了一种在体内将抗原有效地传递给DC的不同方法，导致随后的高数目的抗原特异性CD8T细胞和免疫保护的诱导。在0.04-0.05μm狭窄大小范围内的VSSP可诱导不可思议的高水平的CD8 T细胞的能力是抗原呈递细胞或有效亚群的有效摄取的结果，靶向于I型加工途径和/或直接的刺激APC功能。在淋巴结中发现比较于其他大小，VSSP的摄取被增强了。这种增强归功于增加的颗粒阳性的DEC205+细胞(一种DC的标记物)的频率。树突状细胞是一种强有力的抗原呈递细胞，且CD60与CD80的表达进一步确定可能有效的启动CD8 T细胞的亚群。这些标记物在高比例的VSSP阳性细胞被发现。因此，在体内在这个潜在的DC亚群摄取和选择性定位VSSP可以解释根据本发明的微颗粒的免疫原性。
本发明的VSSP的其他优点包括诱导免疫应答，包括通过多种途径注射后IgA的生成的能力，和它们对于初始/追加免疫策略的合适性。
进一步的研究将包括利用VSSP确定使得它们引发获得的独特免疫应答的生理机制。
需要理解的是，本领域技术人员在不脱离于本发明的核心概念下，可以获得这里描述的本发明的其他不同的实施方案。
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Claims (18)
1.一种免疫原性组合物，其包含至少一种结合于微颗粒的抗原，其中所述微颗粒具有和病毒一样的大小范围。
2.一种疫苗组合物，其包含至少一种结合于微颗粒的抗原，其中所述微颗粒具有和病毒一样的大小范围。
3.权利要求1或2的组合物，其中所述微颗粒的大小基本上是均一的。
4.权利要求1到3中任一项的组合物，其中所述微颗粒包含一实心的核心。
5.权利要求1到4中任一项的组合物，其中所述微颗粒直径是大约0.03-0.05μm。
6.权利要求1到5中任一项的组合物，其中所述微颗粒由乳胶、亚铁分子、金、玻璃、磷酸钙、聚苯乙烯、聚赖氨酸G或其他可生物降解的和生物相容性的聚合物构成。
7.权利要求1到6中任一项的组合物，其中所述抗原被吸附于、结合于、或共价偶联于所述微颗粒。
8.权利要求1到7中任一项的组合物，其中所述抗原可以是一种肽、蛋白质、重组的肽或蛋白质、脂质、碳水化合物、核酸或其他类型的分子或这些物质的任意组合。
9.权利要求1到8中任一项的组合物，其中所述抗原来源于病原体、组织、细胞器或分子并选自：
花粉、丙型肝炎病毒、(HIV)核心、E1、E2和NS2蛋白、来自疟原虫属如间日疟原虫和其他疟原虫属的抗原，包括恶性疟原虫的环孢子蛋白(CS)和人恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫和三日疟原虫的TRAP、MSP-1、MSP-2、MSP-3、MSP-4、MSP-5、AMA-1、RESA、SALSA、STARP、LSA1和LSA3、HIV-gp120/160包膜糖蛋白、链球菌表面蛋白抗原、流感核蛋白、血凝素-神经酰胺酶表面感染、TcpA菌毛蛋白亚基、VP1蛋白、LMCV核蛋白、硕大利什曼原虫表面糖化蛋白(gp63)、百日咳博德特氏菌表面蛋白、狂犬病病毒G蛋白、链球菌M蛋白、葡萄球菌蛋白或幽门螺旋杆菌蛋白、合胞体病毒(RSV)F或G蛋白、Epstein Barr virus(EBV)gp340或核抗原3A、血凝素、博氏疏螺旋体外表面蛋白(Osp)A、结核分支杆菌38kD脂蛋白或30kD蛋白(Ag85)、10kD或65kD蛋白、脑膜炎奈瑟菌1型外蛋白、水痘带状疱疹IE62和gp1、风疹病毒壳体蛋白、乙型肝炎病毒前-S1抗原、单纯疱疹病毒I型糖化蛋白G或gpD或CP27、墨累灰牛流域脑炎病毒E糖蛋白、甲型肝炎病毒VP1、脊髓灰质炎病毒壳体蛋白VP1、VP2、和VP3、沙眼衣原体表面蛋白、乙型肝炎病毒包膜前-S2抗原、人鼻病毒(HRV)壳体、人乳头状瘤病毒来自癌基因E6和E7的多肽、李斯特杆菌表面蛋白、水痘病毒壳体蛋白、牛痘病毒包膜蛋白、布氏杆菌表面蛋白、轮状病毒、VP-3、VP-4、VP-5、VP-7和VP-8、所述一种或多种抗原的组合、所述抗原的长度上包含5个或更多氨基酸的氨基酸亚基或一个或多个所述亚基的组合。
10.权利要求1到8中任一项的组合物，其中所述抗原来源于肿瘤如乳腺癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌或黑色素瘤。
11.权利要求10的组合物，其中所述抗原是重组的肽或蛋白。
12.一种在研究对象上引发免疫应答的方法，所述方法包含给研究对象施用免疫有效量的、包含至少一种结合于微颗粒的抗原的组合物，其中所述微颗粒具有和病毒一样的大小范围。
13.权利要求11的方法，其中所述免疫应答选自CD8细胞应答和抗体应答，其中所述抗体是IgG、IgM或IgA。
14.权利要求11的方法，其中所述免疫应答是树突状细胞的增殖和/或扩增。
15.一种通过单剂量引发针对一种抗原的保护性免疫应答的方法，所述方法包含单次给研究对象施用免疫有效量的、包含至少一种结合于微颗粒的抗原的组合物，其中所述微颗粒具有和病毒一样的大小范围，并且所述免疫应答包含树突状细胞的刺激和/或增殖。
16.一种为了引发免疫应答而在体内将抗原转运至树突状细胞的方法，所述方法包含给研究对象施用免疫有效量的、包含至少一种结合于微颗粒的抗原的组合物，其中所述微颗粒具有和病毒一样的大小范围。
17.权利要求15或16的方法，其中所述免疫应答包含引发机制为MHC I型的抗原呈递，其中所述抗原被内凹或网格蛋白小凹摄取用于通过Rab4非依赖性和TAP依赖性的过程进行进一步加工。
18.一种产生免疫原性微颗粒/抗原组合物的方法，其包含将和病毒一样大小范围的微颗粒与一种或多种抗原进行接触以使得所述微颗粒和抗原相结合。
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