CN102459629A - 用于体外抗原呈递、评估疫苗功效及评估生物制剂和药物的免疫毒性的组合物、试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了用于将抗原(肽、蛋白质)或编码抗原的核酸递送到专门的APC(PAPC)的组合物、测定、试剂盒、方法和平台,其用于评估疫苗(例如,对特定抗原的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答)或其它疗法或干预(基于细胞的疗法、辅助疗法等)的功效。所述组合物、试剂盒、测定和方法涉及与带电荷的(例如,带正电荷的)高度支化聚合的树状聚合物(例如,PAMAM和其它树状聚合物)的组合使用MHC靶向性、通用DR结合肽(例如,PADRE、HA)作为媒介物以将核酸、肽、生物制剂、药物、或多肽靶向递送到APC。
Description
发明领域
一般而言,本发明涉及化学、诊断学和免疫学领域。更具体而言,本发明涉及用于生成表达抗原和其它分子的细胞并用于评估免疫应答以及疫苗和其它治疗性干预的功效的基于毫微粒的组合物、试剂盒、测定和方法。
发明背景
与监测抗体应答不同,T细胞的免疫监测(例如,在疫苗接种后)目前是不精确的,没有与疫苗和其它干预的功效关联,需要昂贵的人工肽混合物(不确定的、MHC限制的和不完全的肽混合物),而且不会为做出正确决定以进展到II期或III期临床试验提供太多帮助,例如因为它们有时会让人误解。对特定抗原的细胞免疫应答的评估需要抗原在与主要组织相容性复合体(MHC)分子相关联的自体抗原呈递细胞(APC)上的表达以引发合适的T细胞介导的应答。呈递的抗原与特异T细胞克隆型的相互作用导致细胞因子的诱导、增殖和/或表达被MHC分子加标签的特定抗原的“自身”靶细胞的溶胞。MHC基因组区存在于所有APC中。MHC是免疫系统中在对病原体、肿瘤抗原的免疫应答中以及在自身免疫中起重要作用的一种至关重要的组分。由MHC基因编码的蛋白质在细胞表面上表达,所述细胞将来自细胞自身的自身抗原和来自病原体或肿瘤细胞的非自身抗原片段两者都呈递到各种T细胞,使它们能够i)为免疫应答的启动提供帮助,ii)帮助T细胞杀死侵入的病原体/肿瘤细胞/受病原体感染的细胞,并iii)协调针对非自身抗原的抗体的成熟。II类MHC分子主要在专门的APC,诸如巨噬细胞、单核细胞、树突细胞和B细胞上表达,并且由辅助T淋巴细胞识别。这继而诱导辅助T淋巴细胞的增殖和MHC抗原特异性免疫应答的放大。辅助T细胞的活化和增殖水平与免疫应答的强度成比例,并且形成用于测量对感染或治疗性干预,诸如疫苗接种或免疫疗法的细胞免疫应答的基础。例如,任何疫苗接种后的细胞免疫应答的免疫监测要求此类疫苗抗原在自身APC上表达,同时伴随着对于每个个体而言也是特定或独特的自身MHC分子。T细胞应答的免疫诊断学受到此类MHC/人白细胞抗原(HLA)限制的阻碍,其在于靶细胞(APC)必须具有与效应细胞(T细胞)相同的MHC/HLA。T细胞仅能在其自身MHC(同基因)的背景中看到抗原。实际上,必须鉴定对每种HLA单元型特异的每种抗原的T细胞表位。这实际上是一种非常困难且昂贵的方法。必须使用含有所有各种MHC的所有可能的表位的此类表位的混合物来为其T细胞应答刺激PBMC。挑战在于仅鉴定出有限数目的T细胞表位,而且它们不与宿主T细胞体内应答关联,例如此类应答与疫苗功效间不仅有较差的关联,而且此类技术也不能预测免疫系统对生物制剂的不利反应。例如,因为APC摄取的抗原如此之差,所以备选的方法受到阻碍。不幸的是,蛋白质、抗原和DNA质粒的APC摄取弱得可怜,而且没有转染自身APC的简单方法。
为了制备用于测量细胞免疫应答的靶物,调查人员已经尝试永生化自体B细胞的EBV感染或转染,以及通过CpG刺激外周血单核细胞(PBMC),或者将它们与表达CD40配体的细胞共培养,接着用表达疫苗抗原的载体转染。或者,已经使用重叠肽阵列,或来自疫苗抗原的选定的已知肽的混合物来靶向自身APC。或者,使用用荧光染料加标签的四聚体(其包含表位)来结合特异T细胞以将其量化。然而,肽的使用具有数项限制,包括:i)限于线性肽,ii)仅限于抗原的已知表位,和iii)MHCI或II类呈递的特异性基于大小。这些方法仅可以按小规模及在专门的实验室中使用,而且它们是昂贵的、复杂的且难以确认并标准化。
目前用于评估对感染或疫苗接种的免疫应答的方法受限于缺乏精确、快速且简单的细胞免疫应答的免疫监测方法。目前,临床研究中的客观应答率很少大于10%,这阻止T细胞应答率与临床应答的有意义的关联。免疫应答的精确测量是治疗性或预防性干预成功的指标,并且在评估疫苗功效中极为重要。目前的方法的主要限制包括i)在选择的方法上缺乏一致性,ii)较差的再现性,iii)要求专门的技术和仪器,iv)高成本,和v)与保护的关联低。重大的关注是,用于结合特异性抗体或由APC处理以询问细胞免疫应答的抗原可能不是感染期间在体内看到的形式的精确呈现,这限制这些测定提供个体中体液或细胞免疫的精确图像的能力。此外,利用肽(表位)混合物的办法可能是不适当靶向的,因为在大多数情况中,它们仅呈递由MHC约束限制的有限数目的已知线性表位。重组亚基抗原的使用不是一个选项,因为APC不摄取此类抗原(或者如此差地摄取),而且它们可能不是天然抗原构型的代表,特别地如由APC处理。因此,这些方法极大地限制了测量细胞免疫应答的精确性,而且限制了这些测定在预测临床功效中的有用性。
目前,没有用于评估疫苗接种后的或响应药物或生物制剂的细胞免疫应答的有效方法或试剂。因此,明显需要可以在任何临床背景中大规模使用并且容易产生的用于精确预测疫苗、药物或生物制剂的临床功效的方法和试剂。
发明概述
本文中描述了将抗原(肽、蛋白质)或编码抗原的核酸递送到专门的APC(PAPC)的基于毫微粒的组合物、测定、试剂盒、方法和平台,其用于评估疫苗(例如,对特定抗原的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答)或其它疗法或干预(基于细胞的疗法、辅助疗法等)的功效,所述递送导致呈递抗原的天然肽全集(repertoire)的自体APC的生成。还可以使用所述组合物、试剂盒、测定和方法来将药物或生物制剂或其部分递送到APC以评估药物和生物制剂的免疫原性。所述组合物、试剂盒、测定和方法涉及与带电荷的(例如,带正电荷的)高度支化聚合的树状聚合物(例如PAMAM和其它树状聚合物)的组合使用MHC靶向性、通用DR结合肽(例如,PADRE或流感HA T辅助表位:SFERFEIFPKEC(SEQ IDNO:28),即HA)作为媒介物以将核酸、肽、生物制剂、药物、或多肽靶向递送到APC,这引起一种用于评估对疫苗接种或其它疗法或干预的免疫应答(例如,CTL应答、B细胞应答),或用于评估生物制剂或药物的免疫原性的基于毫微粒的新方法。例如,为了有效表达和处理而将核酸、肽、生物制剂、药物或多肽靶向递送到APC会生成用于评估细胞介导的对疫苗接种的免疫应答的生理学更相关的靶抗原,而且提供了用于快速生成试剂及开发对感染、免疫和其它疗法或干预的免疫应答的更精确序型分析的测定系统的低成本方法。本文描述了使用基于靶向性毫微粒的抗原递送的免疫评估试剂盒。
本文中所描述的用于评估疫苗或其它疗法或干预的功效或者评估药物或生物制剂的免疫原性的典型组合物包括与MHC靶向的通用DR结合肽(例如,表位,诸如破伤风毒素582-599、PADRE或流感HAT辅助表位:SFERFEIFPKEC(SEQ ID NO:28))、至少一种多肽抗原或编码所述至少一种抗原的核酸、和任选地聚I-C缀合的带电荷的(例如带正电荷的)高度支化聚合的树状聚合物。本文中所描述的带正电荷的高度支化聚合的树状聚合物有效地结合带负电荷的生物分子,包括DNA、RNA等。与通用DR结合肽(例如,表位,诸如PADRE或流感HA T辅助表位:SFERFEIFPKEC(SEQ ID NO:28))缀合的带电荷的(例如带正电荷的)高度支化聚合的树状聚合物提供了对PAPC的特异性抗原递送。本文中所描述的试剂盒、测定、方法和组合物涵盖了所有MHC II类结合肽,并提供了对PAPC的特异且高效的转染,及用于评估任何疫苗或其它疗法或干预的功效以及用于评估药物、变应原或生物制剂的免疫原性的通用测定。
抗原或编码该抗原的核酸与肽衍生化的树状聚合物(在本文中称为“PDD”)复合,其中所述肽是结合大多数人的MHC II类的通用DR结合肽(例如,T辅助表位)。使用通用DR结合肽(例如,破伤风毒素的氨基酸582-599、PADRE等)衍生化的树状聚合物和抗原(或编码抗原的DNA或RNA)的复合物来将此类载物以某种方式递送到细胞中,使得它们在PBMC制备物的APC中特异地处理并呈递抗原,并将它们转化成抗原表达自体APC(本文中称为“靶细胞”)。因此,它们特别用于确定已经接受用于治疗或预防病理(例如,感染)的疗法或干预(例如,疫苗接种)的受试者是否已经启动对疗法或干预的免疫应答以及用于定量免疫应答。若受试者已经启动对疗法或干预的免疫应答,则该受试者将具有对疗法或干预特异的起反应的、引发的(致敏的)T细胞。例如,若受试者接受针对流感的疫苗接种(疫苗含有至少一种流感抗原),则若所述疫苗在受试者中成功促进对流感抗原的免疫应答的话,该受试者将形成对所述流感抗原特异的起反应的、引发的(致敏的)T细胞。确定受试者是否具有对疗法或干预特异的起反应的、引发的(致敏的)T细胞通常涉及对来自受试者的一份或多份样本检查指示对特定疗法或干预的免疫应答的细胞因子(例如,IFN-γ)、生长因子、细胞标志物、酶、趋化因子或任何其它分子或标志物的水平。为了将特异性免疫应答与疫苗或其它疗法或干预的功效相关联,可以使用测量T辅助细胞或B细胞活化和增殖和/或一种或多种指示对疫苗或其它疗法或干预的免疫应答的分子或标志物(例如细胞因子)的水平和表达的任何合适的测定。此类测定的例子包括CTL和细胞因子测定。自受试者获得以分析指示对特定疗法或干预的免疫应答的细胞因子(例如,IFN-γ、白介素、趋化因子)、生长因子、细胞标志物、酶、趋化因子或任何其它分子或标志物的水平的样本一般包括PBMC、血液、脾细胞或淋巴结细胞。如本文中所描述的疗法或干预包括例如任何辅助疗法、任何增强或降低免疫应答的免疫疗法、任何基于细胞的疗法等。
如本文中所描述的用于评估疫苗或其它疗法或干预的功效而将抗原或编码抗原的核酸对APC的特异性递送导致模拟天然的抗原呈递,并允许对抗原、感染、免疫以及其它疗法和干预的哺乳动物(例如人)免疫应答的更精确的相关测量。如本文中所描述的与抗原或编码抗原的核酸(例如,质粒)复合的通用DR结合肽衍生化的树状聚合物特异性靶向APC,并且将这些转化成呈递抗原的APC(本文中称为靶细胞)。本文中所描述的组合物、试剂盒、方法和测定的优点之一基于如下的实情,即仅当抗原以其天然构型呈递时才可以精确评估抗原特异性免疫应答。与抗体应答不同,T细胞的免疫监测(例如,在疫苗接种后)目前不是很精确,它与疫苗和其它干预的功效不关联,而且它需要昂贵的、不确定的且不完全的MHC限制性人工肽混合物。目前的方法不可用于做出正确的决定以进展到用特定药物或生物制剂的II期或III期试验,因为它们有时会让人误解,造成许多非常昂贵的临床试验失败。目前的测定经由测试对相关肽、重组抗原、蛋白质或无活性病毒的免疫应答的体外测定来测量CTL应答。相反,本文中所描述的组合物、试剂盒、测定和方法包括与树状聚合物复合的通用II类特异性肽(例如通用T辅助表位,诸如来自恶性疟原虫(plasmodium falciparum)的SSVFNVVNSSIGLIM(SEQ IDNO:29)、来自破伤风类毒素的FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ IDNO:30)或PADRE,即一种合成肽,仅列出少数例子)和抗原或编码抗原的核酸,若从其中吸出PBMC的宿主先前已经暴露于所述抗原(例如通过疫苗接种),则其在转染到哺乳动物PBMC中时导致对抗原的宽的代表性细胞应答。抗原或质粒DNA的特异性递送导致自身MHC背景中的抗原相关表位的处理和呈递,所述抗原相关表位应当代表可能的肽或者类似源自目标抗原的天然肽全集。此类自体APC(来自PBMC)充当靶标以评估效应器(T细胞)应答。可以使用标准的方法,包括例如TFNγELISpot测定,来评估总细胞介导的免疫应答。本文中所描述的组合物、试剂盒、测定和方法提供了一种用于快速生成试剂及对感染、免疫和其它治疗性干预的免疫应答的更精确序型分析的低成本方法。
除非另有定义,本文中所使用的所有技术术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。
如本文中所使用,“核酸”或“核酸分子”意指两个或多个核苷酸,诸如RNA(核糖核酸)和DNA(脱氧核糖核酸)和经化学修饰的核苷酸的链。“纯化的”核酸分子是基本上与天然存在核酸的细胞或生物体中的其它核酸序列分开的核酸分子(例如30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%无污染物)。该术语包括例如掺入载体、质粒、病毒或原核生物或真核生物基因组中的重组核酸分子。纯化的核酸的例子包括cDNA、基因组核酸的片段、聚合酶链式反应(PCR)生成的核酸、通过用限制酶处理基因组核酸形成的核酸、重组核酸和经化学合成的核酸分子。“重组”核酸分子是通过两个在其它情况中分开的序列部分的人工组合,例如,通过化学合成或通过遗传工程技术操作分离的核酸部分生成的核酸分子。
在提及肽、寡肽或蛋白质中的氨基酸残基时,术语“氨基酸残基”、“氨基酸”和“残基”可互换使用,并且如本文中所使用,意指经由酰胺键或酰胺键模拟物与至少一个其它氨基酸或氨基酸模拟物共价连接的氨基酸或氨基酸模拟物。
如本文中所使用,“蛋白质”和“多肽”同义使用,意指氨基酸的任何肽连接的链,不管长度或翻译后修饰,例如糖基化或磷酸化。
在提及核酸分子、多肽或传染性病原体时,术语“天然的”指天然存在的(例如野生型(WT))核酸、多肽或传染性病原体。
如本文中所使用,术语“抗原”或“免疫原”意指被抗体特异性识别并结合的分子。
在提及表位(例如T辅助表位)时,生物活性意指结合合适的MHC分子的能力。
术语“特异性结合”指诸如酶/底物、受体/激动剂、抗体/抗原等配对种类间发生,并且可以通过共价或非共价相互作用或共价和非共价相互作用的组合介导的结合。当两个种类的相互作用生成非共价结合的复合物时,发生的结合通常是静电的、氢键合或者亲脂性相互作用的结果。因而,在配对种类间发生“特异性结合”,其中在具有抗体/抗原或酶/底物相互作用特征的生成结合复合物的两者间存在相互作用。特别地,特异性结合的特征在于一对中的一个成员结合特定种类,而不与结合成员的对应成员所属的化合物家族内的其它种类结合。
如本文中所使用,术语“泛-DR表位”、“泛-HLA-DR-结合表位”、“PADRE”和“PADRE肽”意指能够以高亲和力结合12种最常见的DR等位基因(DR1、2w2b、2w2a、3、4w4、4w14、5、7、52a、52b、52c和53)中的至少约7种的约4和约20个残基间的肽。“高亲和力”在本文中定义为以小于200nm的IC50%结合。例如,高亲和力结合包括以小于3100nM的IC50%结合。对于结合II类MHC,1,000nm的结合亲和力阈值是典型的,并且一般认为小于100nm的结合亲和力是高亲和力结合。美国专利No.5,736,142中详细描述了PADRE肽的构建和使用,该专利通过引用方式并入本文。
如本文中所使用,短语“DR结合肽”意指结合MHC II类的肽,例如结合人MHC II类的肽。
短语“通用DR结合肽”意指结合MHC II类分子上的任何地方,例如结合人和/或小鼠和/或非人灵长类的大量MHC的肽。
如本文中所使用,“T辅助肽”指由T辅助细胞的T细胞受体识别的肽。例如,本文中所描述的PADRE肽是T辅助肽。T辅助肽是通用DR结合肽的一个例子。
如本文中所使用,术语“树状聚合物”意指具有近乎球形形状的带电荷的(例如,带正电荷的,带负电荷的)高度支化聚合大分子。带正电荷的高度支化聚合的树状聚合物的例子是PAMAM树状聚合物。术语“PAMAM树状聚合物”和“聚酰胺胺树状聚合物”意指叔胺位于分支点,并且结构层间的连接通过酰胺官能团产生的一类树状聚合物。
术语“PAMAM树状聚合物”和“聚酰胺胺树状聚合物”意指叔胺位于分支点,并且结构层间的连接通过酰胺官能团产生的一类树状聚合物。PAMAM树状聚合物在其表面上展现出许多正电荷。
术语“衍生化的树状聚合物”意指具有与其表面缀合的一个或多个官能团的树状聚合物。
“通用DR结合肽衍生化的树状聚合物”指其中的一个或多个通用DR结合肽与带电荷的(例如,带正电荷的)高度支化聚合的树状聚合物(例如,PAMAM树状聚合物)的表面上的官能团共价附接的纳米构建体。
“PADRE衍生化的树状聚合物”或“PADRE-树状聚合物”指其中的一个或多个PADRE肽与带电荷的(例如,带正电荷的)高度支化聚合的树状聚合物(例如,PAMAM树状聚合物)的表面上的官能团共价附接的纳米构建体。
术语“缀合”意指一个分子或一种试剂以物理或化学方式偶联或粘附至另一个分子或另一种试剂。缀合的例子包括共价连接和静电络合。术语“复合”、“与...复合”和“缀合”在本文中可互换使用。
如本文中所使用,短语“序列同一性”意指在比对两个序列以使亚单元匹配最大化,即考虑缺口和插入时,两个序列(例如核酸序列、氨基酸序列)中的相应位置处的相同亚单元的百分比。可以使用序列分析软件(例如来自Accelrys CGC,San Diego,CA的序列分析软件包)来测量序列同一性。
短语“分离的”或“生物学纯的”指基本上或实质上不含如在其天然状态中发现的通常伴随其的组分的物质。
如本文中所使用,术语“毫微粒”意指以纳米测量其大小的微观颗粒。例如,毫微粒是PADRE-树状聚合物缀合物或组合数个PADRE-树状聚合物缀合物和核酸或氨基酸物质的颗粒,具有范围为约2nm-500nm的总直径。
术语“抗体”意指包括多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、嵌合抗体、人源化抗体、可以以可溶或结合形式标记的针对抗体的抗独特型(抗-Id)抗体、以及其片段、区域或衍生物,其通过任何已知的技术,诸如但不限于酶切割、肽合成或重组技术来提供。
如本文中所使用,术语“佐剂”意指调控以增强体液和/或细胞免疫应答的任何物质。
如本文中所使用,认为术语“展示”或“表面暴露”是同义词,指存在于诸如毫微粒(例如,PADRE-树状聚合物)等结构的外部表面(例如易接近免疫位点识别)的抗原或其它分子。
术语“多价”意指毫微粒上展示超过一个拷贝或类型的抗原或分子。
如本文中所使用,“疫苗”包括所有预防性和治疗性疫苗。
如本文中所使用,术语“生物制剂”指一大批医学产品,诸如疫苗、血液和血液组分、变应原(allergenics)、体细胞、基因疗法中表达产物的基因、组织和通过重组DNA技术产生的重组治疗性蛋白、抗体、合成药物和长肽(多肽)、合成的化合物和(糖)蛋白。
短语“免疫应答”意指诱导对一种或多种抗原或变应原或药物或生物制剂特异的抗体和/或免疫细胞介导的应答。免疫应答的诱导取决于许多因素,包括激发的生物体的免疫原性构造、抗原或变应原或药物或生物制剂的化学组成和构型,和抗原或变应原或药物或生物制剂的施用方式和时段。免疫应答具有许多方面,其中一些是由免疫系统的细胞(例如,B淋巴细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞和浆细胞)展现的。免疫系统细胞可以经由与抗原或变应原或免疫系统的其它细胞的相互作用、释放细胞因子及与那些细胞因子的反应性而参与免疫应答。免疫应答一般分成两个主要种类:体液和细胞介导的免疫应答。免疫应答的体液部分包括生成对抗原或变应原或药物或生物制剂特异性的抗体。细胞介导的部分包括生成对抗原或变应原的延迟型超敏感性和细胞毒性效应细胞。
如本文中所使用,术语“处理/治疗”定义为以治愈、医治、缓和、减轻、改变、补救、好转、改善或影响疾病、疾病症状或疾病的素因为目的对患有疾病、具有疾病症状或疾病素因的患者应用或施用治疗剂,或者对来自患者的分离的组织或细胞系应用或施用治疗剂。
术语“患者”、“受试者”和“个体”在本文中可互换使用,意指将治疗的、已经治疗过的或者在考虑治疗的哺乳动物受试者,其中人患者是优选的。在一些情况中,本文中所描述的方法、试剂盒、组合物和测定在实验用动物中、在兽医应用中及在疾病的动物模型(包括但不限于啮齿类,包括小鼠、大鼠和仓鼠以及非人灵长类)开发中得到应用。
虽然可以在本发明的实践或测试中使用与本文中所描述的组合物、试剂盒、测定和方法相似或等同的组合物、试剂盒、测定和方法,但是下文描述了合适的组合物、试剂盒、测定和方法。本文中所提及的所有出版物、专利申请和专利都通过引用方式完整并入本文。在发生冲突的情况中,应当以本说明书(包括定义)为准。下文所讨论的具体实施方案仅仅是示例性的,而并不意图为限制性的。
附图简述
图1是显示可以与质粒混合或与肽或多肽抗原连接以靶向APC的PADRE-树状聚合物的一对示意图。图1显示了本文中所描述的PADRE-树状聚合物提供了可以掺入任何目标抗原或编码任何目标抗原的核酸的一种平台。专门的APC吸收本文中所描述的PADRE-树状聚合物。
图2是对人B细胞的分析的一系列点图(dot plot)式的流式细胞术图像,其显示了与用红色荧光染料加标签的短核酸序列复合的PADRE-树状聚合物的体外递送。此核酸是为了用于RNAi分析以便于评估和优化对哺乳动物细胞的dsRNA寡核苷酸递送而设计的经红色标记的dsRNA寡聚物。将细胞与PADRE-树状聚合物/多核苷酸复合物或对照物共培养4小时,之后除去培养基,并添加新鲜的培养基。该图像显示了用Alexa Fuor加标签的dsRNA寡聚物对纯化的人B细胞的递送。第四栏图像最下方的图像显示了寡聚物在约92%细胞中的递送。
图4是一系列流式细胞术的直方图,其显示了共培养与树状聚合物-PADRE复合的GFP质粒(5μg)后在人外周血单核细胞(PBMC)(下方小图)及人B细胞(上方小图)中的GFP表达。树状聚合物/GFP-质粒复合物作为对照使用(左侧直方图)。
图5是显示通过PDD将蛋白质,即清蛋白-FITC递送到人B细胞中的体外递送的一系列流式细胞术的点图。左图显示了对纯化的人B细胞递送PDD/清蛋白-FITC。将纯化的人B细胞收集,并与PDD/清蛋白-FITC共培养。左侧直方图显示了对人B细胞添加PDD/清蛋白-FITC后的次日早晨在人B细胞中递送清蛋白-FITC。顶部直方图显示了单独的B细胞,中间的直方图显示了树状聚体树状聚合物/清蛋白-FITC复合物加B细胞,而下方直方图描绘了对人B细胞添加的PDD/清蛋白-FTTC复合物的结果。右侧照片是添加PDD/清蛋白-FITC复合物后1小时由B细胞摄取的清蛋白的荧光显微镜的图像。
图6是显示体内靶向淋巴结中的DC的一系列流式细胞术的点图。左图描绘了注射及淋巴结取出和分析的时间线的示意图,而右图显示了关于对从与PDD/GFP-质粒或树状聚合物/GFP-质粒注射部位相邻的淋巴结对未免疫淋巴结的细胞获得的数据的分析的一对流式细胞术的点图。这些图像显示了在淋巴结相邻的注射部位中的小鼠DC和B细胞的体内PADRE-树状聚合物靶向的功效。用CD11c(DC标志物)、MHC II类和CD20(B细胞标志物)对淋巴细胞染色。右上侧的直方图显示了树状聚体树状聚合物/GFP-质粒注射导致GFP在约6%DC中的表达,而下方的点图清楚地显示了PDD/GFP-质粒注射导致GFP在大于70%DC中的表达。
图7是显示体内靶向淋巴结中的DC的DRHA,即一种用不同T辅助表位装饰的树状聚合物的一对图,其显示了DRHA便于GFP转染到DC。此实验与图6中所描述的实验相似,差别在于已经连同与Iad-限制性HA肽缀合的树状聚合物使用Balb/c小鼠。在注射DRHA/GFP-质粒或树状聚合物/GFP-质粒后第5天取出与DRHA/GFP-质粒或树状聚合物/GFP-质粒注射部位相邻的淋巴结和未免疫淋巴结。该图显示了对DC用CD11c(DC标志物)染色后从淋巴结细胞获得的数据的流式细胞术分析的结果。顶部小图显示了如指示的那样处理的小鼠的引流淋巴结发现的GFP呈阳性的DC数目。底部小图显示了DC内的均值GFP荧光强度。这些结果清楚地指示DRHA不仅增加体内转染的DC的数目,而且增加进入细胞中的质粒分子的数目。
图8是用与经红色(Alexa Fluor)标记的dsRNA寡聚体寡聚物复合的PADRE-树状聚合物转染的人B细胞的显微照片。
图9是来自用与经红色(Alexa Fluor)标记的dsRNA寡聚物复合的树状聚合物转染的狒狒的PBMC(左侧小图)和用与经红色(Alexa Fluor)标记的dsRNA寡聚物复合的PADRE-树状聚合物转染的细胞(右侧小图)的一对显微照片。对狒狒PBMC添加PDD/dsRNA-Alexa-Fluor或对照复合物后2小时拍摄荧光显微镜图像。该图像显示了经由PDD将多核苷酸靶向递送到猴的PBMC的高功效。
图10是用与GFP编码质粒复合的树状聚合物转染的狒狒PBMC(左侧小图)和用与GFP编码质粒复合的PADRE-树状聚合物转染的细胞(右侧小图)的一对显微照片。用与GFP-质粒复合的树状聚合物转染的狒狒的PBMC(左侧小图)和用与GFP-质粒复合的PADRE-树状聚合物转染的细胞(右侧小图)。对狒狒PBMC添加PDD/GFP-质粒或对照复合物后的第一天拍摄荧光显微镜图像。该图像显示了经由PDD靶向递送质粒及由质粒编码的基因的表达的高功效。
图11是用如本文中所描述的通用DR结合肽-衍生化的树状聚合物体外转染PBMC群间的人APC的方案的图示。这些转染导致T细胞表位在APC中的处理和呈递,从而将它们转化成表达目标抗原的同基因APC(本文中称为“靶细胞”)。
图12是显示使用信使RNA作为抗原来源以免疫监测免疫应答的可行性的一系列图。简言之,从表达血凝素抗原作为人工肿瘤相关抗原的Balb/c鼠类乳腺肿瘤4T1中分离信使RNA(mRNA)。将mRNA在缀合有HA的树状聚合物上或作为对照在未缀合的树状聚合物上加载。以不同浓度使用缀合有mRNA-HA的树状聚合物(A)、缀合有mRNA的树状聚合物(B)或单独的mRNA(C)来转染脾细胞。24小时后,将细胞清洗,并与针对MHC I类限制性血凝素表位的同基因CD8+T细胞一起温育。IFN-γELISA(酶联免疫吸附测定)用作读出CTL活性。数据清楚地显示了即使使用数量极低的RNA(4ng),使用缀合有HA的树状聚合物(A)也允许CTL活性的功能性检测,而在对照的情况中仅获得适度的结果(B和C)。图12D是评估免疫应答的实验的示意图。
图13是显示来自实验的结果的图,其中将脾细胞用4ng多聚A RNA转染,并用作克隆型T细胞的APC。
图14是电泳凝胶的照片,其显示了A)树状聚合物、PADRE和树状聚合物-PADRE的紫外光谱。通过标准的方法实施肽-树状聚合物的紫外光谱。对G5树状聚合物-PEDRE看到的苯丙氨酸峰显示了肽、PADRE被添加到树状聚合物。B)对树状聚合物/DNA复合物的琼脂糖凝胶电泳和电泳迁移率分析。通过检查琼脂糖凝胶电泳期间质粒DNA的迁移延迟来实施对PDD与DNA的复合物形成和结合的分析。在凝胶电泳中对肽衍生化的-树状聚合物(PDD)/质粒复合物测试其DNA保留。对PDD/质粒和对照:单独的DNA、单独的树状聚合物和不同比率1∶1、1∶2、1∶5、1∶10、1∶20(P∶N)的PDD/质粒样本实施凝胶电泳。PDD能够以大于(1∶2)的比率保留DNA质粒。
图15是显示蛋白质/抗原的细胞特异性递送的一系列流式细胞术点图式的图。将PDD/清蛋白-FITC递送到纯化的人B细胞中。将PBMC与单独的清蛋白-FITC、树状聚合物/清蛋白-FITC或树状聚合物-PADRE(PDD)/清蛋白-FITC共培养。在37℃/CO2培养箱中温育后24小时,通过流式细胞术分析每种处理情况下的细胞,并使用抗CD 19-APC来门控人B细胞。使用比率为1∶10(w∶w)的清蛋白-FITC和PDD或树状聚合物。PDD/清蛋白-FITC在人B细胞中的高水平递送(73%)清楚地显示了平台可以与蛋白质/多肽或其类似抗原一起使用。
图16是一系列流式细胞术直方图,其显示了用PDD PADRE-树状聚合物(PDD)/GFP-质粒体外转染人B细胞(CD19)(上方小图)和小鼠脾细胞群(下方小图)。在上方小图中,将纯化的人B细胞与单独的GFP质粒、树状聚合物/GFP质粒或指定P∶N比率的树状聚合物-PADRE(PDD)/GFP质粒共培养。在37℃/CO2培养箱中温育后24小时,通过流式细胞术来对每种处理情况下的细胞分析GFP蛋白表达。PDD/GFP质粒在人B细胞中的高水平递送(77%)清楚地显示了平台有效地将质粒递送到B细胞中,而且导致编码的蛋白质/抗原的表达。下方小图显示了在C57BL未免疫小鼠的脾细胞情况下实施相似实验时的流式细胞术点图式的图,而且类似地显示了CD-19阳性细胞(B细胞)的GFP转染。图17是显示表达抗原的APC的生成的图。用TiterMax(Sigma)中的OVA蛋白将5只组中的6-8周龄雌性C57BL小鼠免疫两次。最后一次免疫后10天,将经免疫小鼠的脾细胞收集,并以每孔一百万个细胞在含具有10%FBS的RPMI中的24孔板的4孔中分配,将孔标记为“单独的培养基”、“单独的PADRE-树状聚合物(PDD)”、“PADRE-树状聚合物(PDD)/对照质粒”和“PADRE-树状聚合物(PDD)/OVA质粒”。将5微克与PADRE-树状聚合物复合的质粒(以1∶10的比率)添加到合适的孔(靶细胞)。次日早晨,将每种经处理的/经转染的细胞添加到不同孔中的同一小鼠的未免疫脾细胞。刺激后24小时,使用ELISA(Thermo)在上清液中检测INF-γ的水平。IFN水平在含有用[PDD/QVA-质粒]处理的脾细胞的孔中显著(P值<0.006)高于所有对照,这显示了试剂盒可以用于评估疫苗接种后的T细胞应答。通过使用50,000次B16-OVA的考验实验以及通过OVA肽刺激(未显示)证实T细胞应答的诱导。图17显示了在小鼠中测量疫苗接种功效;注意接种疫苗的小鼠中的INF-γ水平的显著差异。
发明详述
本文中描述了基于靶向性毫微粒的方法、测定、试剂盒和组合物,其用于用人PBMC样本(或含有PBMC的人样本)中的抗原或编码抗原的核酸转染APC,导致宽全集的抗原表位在APC表面上的处理和呈递。这些APC(本文中称为“靶细胞”)提供了具有普遍适用性的正确构型的(即,天然的)病原体表位,以精确监测对任何疫苗或其它疗法或干预的细胞免疫应答。例如,毫微粒与抗原或编码抗原的核酸和通用DR结合肽(例如,T辅助表位)衍生化的树状聚合物复合,所述通用DR结合肽衍生化的树状聚合物特异性结合APC上表达的MHC II类分子以递送受试者接种的疫苗所针对抗原的特定表位。还可以使用基于靶向性毫微粒的方法、测定、试剂盒和组合物来检查生物制剂或药物在受试者或受试者群中的免疫毒性。本文中所描述的测定、试剂盒、组合物和方法提供了一种用于快速生成试剂及对感染、免疫或其它疗法或干预的免疫应答的精确序型分析的低成本方法,以及一种用于检查生物制剂或药物在受试者或受试者群中的免疫毒性的低成本且高效的方法。
在典型的组合物中,带电荷的(例如,带正电荷的)高度支化聚合的树状聚合物与MHC靶向性通用的泛DR结合肽或此类肽(例如,诸如PADRE或流感HA T辅助表位:SFERFEIFPKEC(SEQ ID NG:28)等表位)的组合缀合,并且与受试者将要或者已经针对其接种疫苗的特定抗原或变应原或编码抗原的核酸(例如,DNA、RNA)缀合或结合。抗原可以是任何病原起源,例如细菌、真菌、原生动物或病毒起源的蛋白质或肽,或源自这些抗原的片段,碳水化合物或碳水化合物模拟肽。带电荷的(例如,带正电荷的)高度支化聚合的树状聚合物可以与两种或多种不同抗原或变应原缀合,而且类似地可以与其各自编码不同抗原的两种或多种核酸缀合。基于树状聚合物(正)和抗原(负)的相反电荷,树状聚合物与抗原(核酸或蛋白质)生成复合物(缀合物),或者缀合可以是共价化学连接。
在一个实施方案中,如本文中所描述的将抗原递送至APC以评估或监测受试者中的免疫应答(例如,对疫苗、对生物制剂或药物等的免疫应答)的基于毫微粒的方法包括将编码变应原、抗原或抗原肽或多肽的核酸(例如,DNA或RNA序列)与带电荷的(例如,带正电荷的)高度支化聚合的树状聚合物(例如,PADRE衍生化的树状聚合物(PDD))缀合,所述树状聚合物还与至少一种通用DR结合/MHC靶向肽诸如下文所列的通用DR结合/MHC靶向肽(例如表1中所列的)缀合。带负电荷的质粒通常结合带正电荷的通用DR结合肽-树状聚合物(例如,PADRE-树状聚合物),而若它们不是带负电荷,则变应原或肽或多肽抗原可与通用DR结合肽-树状聚合物化学连接。在其它实施方案中,树状聚合物是带负电荷,用于结合带正电荷的蛋白质和肽。可以通过本领域中已知的任何合适的方法来将表面暴露的变应原、抗原或编码抗原的核酸与树状聚合物缀合。缀合方法包括化学络合,其可以是本质上离子的或非离子的、静电结合或共价结合。
在检测受试者中对疗法或干预的免疫应答的典型方法中,在接受疗法或干预之前及之后自受试者获得样本。例如,若疗法或干预是疫苗接种,则在疫苗接种前自受试者获得样本,并且在已经对受试者接种疫苗后自受试者获得样本。在检测受试者中对包含至少一种抗原的疫苗的免疫应答的方法中,该方法包括以下数个步骤。在已经对受试者接种疫苗前自受试者获得免疫前PBMC制剂或样本(本文中称为“第一样本”)。将免疫前PBMC经由标准方法来获得,并在DMSO中以每小瓶约5百万个细胞的浓度冷藏。根据疫苗接种的持续时间,PBMC可以在液氮或-80℃冷冻箱中贮存。实验当天,将免疫前PBMC融化,并在标准条件下培养(例如,于37℃下快速融化,接着进行一个清洗步骤以通过以400g将细胞旋转5分钟来除去DMSO)。然后,如以下部分中所解释,用PDD/抗原处理免疫前细胞。将此第一样本分成至少两个部分,在本文中称为第一样本的第一部分(又称为“靶细胞”),和第一样本的第二部分(又称为“效应细胞”)。每部分通常包含约5百万个PBMC(例如,1百万、2百万、3百万、4百万、5百万、6百万个PBC等)。将第一样本的第一部分用如本文中所描述的与MHC靶向的通用DR结合肽缀合的高度支化聚合的树状聚合物处理(与其接触、混合)。树状聚合物还与至少一种抗原或编码该至少一种抗原的核酸缀合。如本文中所描述,制备与MHC靶向的通用DR结合肽和至少一种抗原或编码至少一种抗原的核酸缀合的树状聚合物。在添加到第一样本的第一部分后,树状聚合物进入APC,并且APC处理并与MHC II类分子结合在其表面上呈递抗原。所得的APC在本文中称为“靶细胞”。可以使用冷冻PBMC的标准方法来将PBMC在DMSO中冷冻,并且可以使用这些PBMC作为疫苗接种、免疫疗法或其它干预前的T细胞应答的参照(免疫应答的缺省水平的背景参照以进行比较)。可以将效应细胞和靶细胞在能生存的情况下以多个等分试样冷冻,以供未来使用。
将第一样本的第一部分和第二部分在37℃/5%CO2培养箱中温育过夜。在一些实施方案中,可以将丝裂霉素C添加到靶细胞,因为丝裂霉素C处理消除APC的增殖,而且降低细胞因子表达(背景)。在此类实施方案中,距开始温育24小时后,根据与树状聚合物缀合的核酸类型(此时间期间一般针对不同类型的核酸,例如不同质粒进行优化),将丝裂霉素C添加到第一样本的第一部分(靶细胞)达约30分钟。然后,例如用新鲜的培养基将第一样本的第一部分和第二部分(靶细胞和效应细胞)清洗,以400g持续10分钟。然后,以一种或多个比率混合第一样本的第一部分和第一样本的第二部分(在一个或多个不同容器、孔、管、平板等中),产生第一多个混合物(比率一般针对不同类型的核酸,例如不同质粒进行优化)。合适的温育期(通常为6-48小时,这取决于核酸的类型和其它条件)后,对混合物检查一种或多种指示对疗法或干预的免疫应答的分子或标志物的存在及水平。这通常通过检查第一多个混合物的上清液,例如检测并测量上清液中的所述分子或标志物的水平来完成。例如,可以对混合物检查一种或多种细胞因子的存在,并且可以测定(测量)每个混合物中的一种或多种细胞因子(例如,IFN-γ)的水平。可以使用测量T辅助细胞或B细胞活化和增殖和/或一种或多种指示对疫苗或其它疗法或干预的免疫应答的分子或标志物(例如,细胞因子)的水平和表达的任何合适的测定。此类测定的例子包括CTL测定和细胞因子测定。
在受试者已经接受疫苗接种后,自受试者获得PBMC,其在本文中称为“第二样本”。根据应答的类型(效应器或记忆),通常在疫苗接种或干预后7-30天自个体吸出第二样本以测量T细胞免疫应答,然而,可以在后来任何时间对T细胞应答测量其耐久性。将此第二样本分成至少两个部分,其在本文中称为第二样本的第一部分和第二样本的第二部分。每个部分通常包含约5百万个PBMC(例如,1百万、2百万、3百万、4百万、5百万、6百万个PBC等)。将第二样本的第一部分用上文所描述的树状聚合物(即,与MHC靶向的通用DR结合和至少一种抗原或编码至少一种抗原的核酸缀合的高度支化聚合的树状聚合物)处理(与其接触、混合)。在添加到第二样本的第一部分后,树状聚合物进入APC,并且APC处理并在其表面上与MHC II类分子结合呈递抗原。所得的APC在本文中称为“靶细胞”。将第二样本的第一部分和第二部分在37℃/5%CO2培养箱中温育过夜。距开始温育24小时后,根据与树状聚合物缀合的核酸类型(此时间期间一般针对不同类型的核酸,例如不同质粒进行优化),将丝裂霉素C添加到第二样本的第一部分(靶细胞)达约30分钟。然后,例如用新鲜的培养基将第二样本的第一部分和第二部分(分别为靶细胞和效应细胞)清洗,以400g持续10分钟。然后,以一种或多种的比率在如下条件下混合第二样本的第一部分和第二样本的第二部分(在一个或多个不同容器、孔、管、平板等中),产生第二多个混合物(比率一般针对不同类型的核酸,例如不同质粒进行优化),所述条件允许刺激个体的PBMC中现有的特异T细胞,若疫苗接种或其它干预或疗法有效促进对抗原的免疫应答,则这导致细胞因子生成以及对抗原特异性的T细胞增殖。在合适的温育期(通常为6-48小时,这取决于核酸的类型和其它条件)后,对混合物检查一种或多种指示对疗法或干预的免疫应答的分子或标志物的存在及水平。这通常通过检查第二多个混合物的上清液,例如检测并测量上清液中的所述分子或标志物的水平来完成。例如,可以对混合物检查一种或多种细胞因子的存在,并且可以测定(测量)每个混合物中的一种或多种细胞因子(例如,IFN-γ)的水平。如上文所提及,可以使用测量T辅助细胞或B细胞活化和增殖和/或一种或多种指示对疫苗或其它疗法或干预的免疫应答的分子或标志物(例如,细胞因子)的水平和表达的任何合适的测定。此类测定的例子包括CTL测定和细胞因子测定。
在此方法中,将至少一种指示免疫应答的分子或标志物在第一多个混合物中的水平和至少一种分子或标志物在第二多个混合物中的水平进行比较。若疫苗有效促进对至少一种抗原的免疫应答,则第二样本的第二部分将包括对抗原特异的起反应的、引发的、致敏的T细胞。因此,在第一多个混合物的上清液中与第二多个混合物的上清液中的一种或多种分子或标志物(例如,IFN-γ)的水平间做出比较,并且将在第二多个混合物中比在第一多个混合物中更高水平的至少一种分子或标志物与受试者中对疫苗的免疫应答相关联。例如,若疫苗有效促进对至少一种抗原的免疫应答,则IFN-γ的水平在第二多个混合物的上清液中将高于第一多个混合物中的IFN-γ水平。
细胞因子水平和/或T细胞增殖/活化程度与来自受试者的PBMC中的T细胞应答成比例地关联。因此,通过测量细胞因子水平和T细胞增殖/活化程度,可以确定疫苗是否有效启动对抗原的免疫应答及启动的免疫应答的程度。例如,若用抗原X对受试者接种疫苗,则与受试者的PBMC一起温育的与疫苗制备所针对的抗原(抗原X)或编码抗原(抗原X)的核酸缀合的毫微粒引起受试者的APC处理并呈递抗原X的天然T细胞表位全集,即一种将PBMC转化成表达抗原X的“靶细胞”的过程。在将效应细胞与靶细胞共培养后,若效应细胞包括对抗原特异的任何起反应的T细胞,则T细胞将增殖,并生成相关细胞因子。通过任何合适的方法,包括ELISA、ELISPOT或胞内细胞因子测定来评估细胞因子(诸如IFN-γ)的水平。通过任何增殖测定,诸如i)3H-胸苷测定,其基于放射性胸苷掺入,或者通过ii)基于5,6-羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)的T细胞增殖测定,其中在T细胞增殖测定中,用荧光染料(CFSE)来标记细胞。在后一种测定中,响应抗原而增殖的那些细胞显示CFSE荧光强度的降低,并例如可以使用流式细胞术来测定增殖的CD4+细胞百分比。
在评估药物或生物制剂的免疫原性的方法中,如上文所描述,制备毫微粒,变化在于它们与药物或其部分,或生物制剂或其部分复合或缀合。如上文所描述,将所得的毫微粒与至少一名受试者的PBMC(例如来自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、100、1000、10,000等名受试者的PBMC)接触并测定(“靶细胞”和“效应细胞”来自同一个体)。若在如本文所描述的测定中检出细胞因子水平升高和/或对药物或生物制剂特异的T细胞或B细胞活化或增殖水平升高,则药物或生物制剂确定为免疫毒性的,因为药物或生物制剂已经引起受试者中的T细胞或B细胞应答。此实施方案特别可用于帮助医学从业人员确定是否对一名受试者或多名受试者施用生物制剂或药物,以及帮助生物制剂或药物的生产商确定生物制剂或药物在一名受试者或受试者群中的功效。
如本文中所描述的与通用DR结合肽(例如,T辅助表位)缀合的树状聚合物可以是多价的;它可以在其表面上呈递超过一个拷贝或类型的抗原或核酸或药物或生物制剂或变应原肽(与其复合)。可以经由两个或更多个不同接头或间隔物,或者经由共同的接头或间隔物将一个或多个拷贝或类型的抗原或核酸或药物或生物制剂或变应原附接于树状聚合物。可以使用如本文中所描述的用于评估疫苗或其它疗法或干预的功效的毫微粒来评估任何疫苗或疗法或干预的功效。类似地,可以使用如本文中所描述的用于评估生物制剂或药物的功效(例如免疫毒性)的毫微粒来评估任何生物制剂或药物的功效(例如,免疫毒性)。
下文所描述的优选的实施方案示例了这些组合物、测定、试剂盒和方法的改型。然而,根据这些实施方案的描述,本发明的其它方面可以基于下文所提供的描述来进行和/或实践。
生物学方法
本文中描述了涉及常规分子生物学技术的方法。此类技术一般是本领域中已知的,并且在方法学论文诸如Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第3版,第1-3卷,Sambrook等编,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.,2001;及Current Protocols in MolecularBiology,Ausubel等编,Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York,1992(定期更新)中详细描述。免疫学技术一般是本领域中已知的,并且在方法学论文诸如Advances in Immunology,第93卷,Frederick W.Alt等编,Academic Press,Burlington,MA,2007;Making and Using Antibodies:APractical Handbook,Gary C.Howard和Matthew R.Kaser编,CRC Press,Boca Raton,Fl,2006;Medical Immunology,第6版,Gabriel Virella编,Informa Healthcare Press,London,England,2007;及Harlow and LaneANTIBODIES:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1988中详细描述。还可以改编基因转移和基因疗法的常规方法以用于本发明。参见例如Gene Therapy:Principles andApplications,T.Blackenstein编,Springer Verlag,1999;及Gene TherapyProtocols(Methods in Molecular Medicine),Robbins博士编,Humana Press,1997。例如在Arashkia等,Virus Genes 40(1):44-52,2010;Velders等,JImmunol.166:5366-5373,2001;及S.Chauhan,N.K.Jain,P.V.Diwan.(2009)Pre-clinical and behavioural toxicity profile of PAMAM dendrimers inmice.Proceedings of the Royal Society A:Mathematical,Physical andEngineering Sciences(在线发表日期:2009年12月3日)中也描述了疫苗及PAMAM树状聚合物的构建和使用。
与核酸、肽、多肽、药物或生物制剂缀合的树状聚合物的合成
带电荷的环形树样结构诸如树状聚合物充当浓缩DNA的支架,且完全带正电荷的树状聚合物对于与带负电荷的DNA或RNA形成强静电相互作用是优选的。例如,根据可调节的N/P比率(胺与磷酸根或电荷比),所得的树状聚合物/通用DR结合肽/DNA复合物具有净电荷。本文中描述了具有与其缀合的至少一种通用DR结合肽(例如,诸如PADRE或流感HA T辅助表位:SFERFEIFPKEC(SEQ ID NO:28)等表位)和变应原、抗原、编码抗原的核酸、药物、生物制剂或其部分的树状聚合物。至少一种通用DR结合肽与树状聚合物的外部表面缀合,使得至少一种通用DR结合肽特异性结合PAPC。在一个实施方案中,树状聚合物与这些肽:SSVFNVVNSSIGLIM(SEQ ID NO:29)、FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ ID NO:30)、QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO:31)、KLLSLIKGVIVHRLEGVE(SEQ ID NO:32)、LSEIKGVIVHRLEGV(SEQID NO:33)、DGVNYATGNLPGCSA(SEQ ID NO:34),ENDIEKKICKMEKCSSVFNV(SEQ ID NO:35).NLGKVIDTLTCGFA(SEQ ID NO:36)、GQIGNDPNRDIL (SEQ ID NO:37)、IDVVDSYIIKPIPALPVTPD(SEQ ID NO:38)、ALNNRFQIKGVELKS(SEQ ID NO:39)、AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO:2)、PRYISLIPVNVVAD(SEQ ID NO:40)和/或VATRAGLVMEAGGSKVT(SEQ ID NO:41)之任意至少一种或至少一种组合(例如,1、2、3、4、5等)和肽或多肽抗原或变应原缀合。在此实施方案中,树状聚合物通常与多种肽或多肽抗原或变应原缀合或结合(例如,经由静电结合)。
编码抗原、亚基、疫苗和蛋白质/糖蛋白抗原的质粒由于其负净电荷或存在于其结构中的负电荷袋而容易与PDD生成复合物。然而,当抗原或化合物不含负“净电荷”或“其结构中的负电荷袋”时,它们可以与PDD共价缀合。例子是小粒径(small-size)防腐剂、提高药物和/或生物制剂的稳定性或者提高药物/生物制剂的组织渗透的化合物、诱导药物或生物制剂的贮积效应的化合物、改变药物或生物制剂的电荷或溶解度的化合物,或不容易与PDD生成复合物的任何化合物或抗原。多种抗原可以与本文中所描述的树状聚合物/通用DR结合肽/核酸复合物复合以经由评估对不同抗原或药物组分的T细胞应答来增强平台的免疫监测性能。在另一个实施方案中,树状聚合物与通用DR结合肽(例如,PADRE肽)缀合,并与编码抗原的核酸结合。在此实施方案中,可以使用任何合适的方法来制备树状聚合物,并将其与通用DR结合肽(例如,诸如PADRE或流感HA T辅助表位:SFERFEIFPKEC(SEQ ID NO:28)等表位)缀合,并与核酸(例如,DNA,RNA)结合。在又一个实施方案中,经由树状聚合物组分,组合物与药物或生物制剂或其部分复合或缀合。在此实施方案中,平台的树状聚合物部分(与抗原或DNA或RNA产生静电键的树状聚合物组分)通常与多种药物或生物制剂缀合或结合(例如,经由静电结合)。可以通过任何合适的方法来生成此类复合物,其由药物或生物制剂和“肽衍生化的树状聚合物,或PDD”组成,其中所述肽是通用DR结合肽(例如,诸如破伤风毒素582-599、PADRE肽或流感HAT辅助表位:SFERFEIFPKEC(SEQ ID NO:28)或此类肽的组合等表位)。整个药物、蛋白质、生物制剂或编码整个蛋白质或生物制剂的核酸可以与PDD结合(缀合)。或者,蛋白质、药物或生物制剂的部分或亚基,或编码蛋白质或生物制剂的核酸的截短形式可以与PDD结合(缀合)。在测定药物或生物制剂的免疫毒性的典型实施方案中,将此类复合物添加到个体的PBMC以评估/预测个体是否将启动对药物或生物制剂的T细胞免疫应答,之后对个体施用药物或生物制剂(例如,通过口服施用、注射或施用药物或生物制剂的任何其它形式进行)。
生成和使用树状聚合物的方法是本领域中公知的,并且例如在ZhangJ-T等Macromol.Biosci.2004,4,575-578,及美国专利No.4,216,171和5,795,582中被描述,上述两个专利均通过引用方式并入本文。还可参见:D.A.Tomalia,A.M.Naylor,and W.A.Goddard III,“Starburst Dendrimers:Molecular-Level Control of Size,Shape,Surface Chemistry,Topology,andFlexibility from Atoms to Macroscopic Matter”,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.29(1990),138-175。在本文中所描述的实验中,使用PAMAM树状聚合物。然而,可以使用任何合适的带电荷的(例如,带正电荷的)高度支化聚合的树状聚合物。其它带正电荷的高度支化聚合的树状聚合物的例子包括聚(丙烯亚胺)(PPI)树状聚合物,或更一般地,在其表面上具有伯胺基团的任何其它树状聚合物。
可以通过任何合适的方法来制备本文中所描述的PADRE-树状聚合物(PADRE衍生化的树状聚合物)。生成和使用PADRE的方法是本领域中已知的。参见例如美国专利No.5,736,142。为了生成美国专利No,5,736,142中所描述的PADRE肽,使用最初由Jardetzky等(EMBO J.9:1797-1083,1990)所描述的策略,其中将含有对于结合MHC至关重要的侧链的锚定残基插入13个残基的聚丙氨酸肽。例如,可以依照美国专利No.5,736,142中所描述的方法来制备PADRE肽,或者可以购买(例如购自Anaspec,Inc.,Fremont,CA)它们。由于其相对较短的大小,可以依照常规技术在溶液中或者在固体支持物上合成PADRE肽(或其它通用DR结合肽)。各种自动化合成仪可商购获得,并且可以依照已知的方案使用。或者,可以采用重组DNA技术,其中将编码通用DR结合肽(例如,T辅助表位)的核苷酸序列插入表达载体中,转化或转染到合适的宿主细胞中,并在适合于表达的条件下培养。如一般在Sambrook等,(见上文)(其通过引用方式并入本文)所描述,这些方法一般是本领域中已知的。如本文中所描述的PADRE肽可以包括对N和C端残基的修饰。如技术人员应当理解,可修饰N和C端以改变肽的物理或化学特性,诸如例如影响结合、稳定性、生物利用度、连接容易度等。可以多种方式修饰本文中所描述的通用DR结合肽(例如,PADRE肽)以提供期望的属性,例如改善的药理学特征,同时保留未修饰肽的基本上所有的生物活性。
在本文中所描述的实验中,通过PADRE肽的-COOH端与树状聚合物胺基之一间的简单胺偶联来生成PADRE-树状聚合物缀合物。PADRE肽
(Ac-D-Ala-Lys-Cha-Val-Ala-Ala-Trp-Thr-Leu-Lys-Ala-Ala-Ala-D-Ala-Ahx-Cys-OH)(SEQ ID NO:1,Ac=乙酰化的;D-Ala=D-丙氨酸;Cha=环己基丙氨酸;Ahx=氨基己酸)以其乙酰化形式购自Anaspec,Inc.,(Fremont,CA)以保护胺末端并阻止其反应。购买的肽具有95%的最小纯度。在标准条件(参见图1,底部示意图)下在DMF溶液中实施胺偶联反应。为了控制附接于每个树状聚合物表面的PADRE表位的数目,在反应中使用2∶1的肽/树状聚合物考验比率,寻求每个树状聚合物仅几个肽的附接以使大多数胺基保持游离,从而在树状聚合物上形成大的正电荷。在典型的实施方案中,如本文中所描述的多种PADRE-树状聚合物缀合物将是含有0、1、2、3个等与其附接的PADRE(或其它肽)的树状聚合物分布。预期相对群体遵循泊松分布。PADRE,即aKXVAAWTLKAAa(SEQ ID NO:2)以高或中等的亲和力(IC50<1,000nM)结合16种最普遍的HLA-DR分子中的15种((Kawashima等,Human Immunology 59:1-14(1998);Alexander等Immunity 1:751-761(1994))。然而,也可以使用也可以结合MHC II类并活化大多数人的CD4T辅助细胞的其它肽来为树状聚合物加标签。
肽的例子包括但不限于:来自破伤风类毒素(TT)的肽(例如,肽830-843);Panina-Bordignon等,(Eur.J.Immunology 19:2237-2242(1989))中所描述的“通用”表位;及与大多数人HLA和许多小鼠HLA的MHCII类起反应的以下肽:aKFVAAWTLKAAa(SEQ ID NO:3)、aKYVAAWTLKAAa(SEQ ID NO:4)、aKFVAAYTLKAAa(SEQ ID NO:5)、aKXVAAYTLKAAa(SEQ ID NO:6)、aKYVAAYTLKAAa(SEQ ID NO:7)、aKFVAAHTLKAAa(SEQ ID NO:8)、aKXVAAHTLKAAa(SEQ ID NO:9)、aKYVAAHTLKAAa(SEQ ID NO:10)、aKFVAANTLKAAa(SEQ ID NO:11)、aKXVAANTLKAAa(SEQ ID NO:12)、aKYVAANTLKAAa(SEQ IDNO:13)、AKXVAAWTLKAAA(SEQ ID NO:2)、AKFVAAWTLKAAA(SEQID NO:14)、AKYVAAWTLKAAA(SEQ ID NO:15)、AKFVAAYTLKAAA(SEQ ID NO:16)、AKXVAAYTLKAAA(SEQ ID NO:17)、AKYVAAYTLKAAA(SEQ ID NO:18)、AKFVAAHTLKAAA(SEQ ID NO:19)、AKXVAAHTLKAAA(SEQ ID NO:20)、AKYVAAHTLKAAA(SEQ IDNO:21)、AKFVAANTLKAAA(SEQ ID NO:22)、AKXVAANTLKAAA(SEQ ID NO:23)和AKYVAANTLKAAA(SEQ ID NO:24)(a=D-丙氨酸、X=环己基丙氨酸)。可以使用的表位的另一个例子是结合小鼠Balb/cMHC II类IaD的HA肽序列SFERFEIFPKE(SEQ ID NO:25)(来自原病毒PR8病毒HA)。通用DR结合肽的其它例子包括结合多种HLA单元型的超基序(supermotif)诸如II类相关恒定链肽(CLIP),特别是CLIP p88-99(SKMRMATPLLMQ(SEQ ID NO:42))。
通用DR结合肽(例如,T辅助表位)的其它例子列于表1中。此类表位结合大多数人HLA,例如VATRAGLVMEAGGSKVT(SEQ IDNO:41),即一种来自Mce2结核分枝杆菌(Mycobacleriumtubcrculosis)的T细胞表位,结合9种不同HLA DR:DRB1*0101(DR1)、DRB1*1501(DR2)、DRB1*0301(DR3)、DRB1*0401(DR4)、DRB1*1101(DR5)、DRB1*0701(DR7)、DRB1*0801(DR8)或泛D结合肽。PADRE能够结合6种选定的DRB1亚型(Alexander J,Immunity卷1:751-761,1994)和PBMC的APC(Neumann,Journal of Cancer卷112:661-668,2004),并且显示了结合人和鼠MHC II类两者(Kim,J.Immunol卷180:7013-7027,2008)。如上文所描述,典型的通用DR结合肽是PADRE肽(例如,aKXVAAWTLKAAaZC(SEQ ID NO:43),其中X=L-环己胺,Z=氨基己酸,而剩余的单字母符号代表通常的氨基酸)。如上文所提及,可以使用所有以下肽之一或组合:SSVFNVVNSSIGLIM(SEQ ID NO:29)、FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ ID NO:30)、QYIKANSKFIGITEL(SEQ ID NO:31)、KLLSLIKGVIVHRLEGVE(SEQ ID NO:32)、LSEIKGVIVHRLEGV(SEQ ID NO:33)、DGVNYATGNLPGC SA(SEQ IDNO:34)、ENDIEKKICKMEKCSSVFNV (SEQ ID NO:35)、NLGKVIDTLTCGFA(SEQ ID NO:36)、GQIGNDPNRDIL(SEQ IDNO:37)、IDVVDSYIIKPIPALPVTPD(SEQ ID NO:38)、ALNNRFQIKGVELKS(SEQ ID NO:39)、AKXVAAWTLKAAA(SEQ IDNO:2)、PRYISLIPVNVVAD(SEQ ID NO:40)和/或VATRAGLVMEAGGSKVT(SEQ ID NO:41)。
表1:通用DR结合肽的例子
将产物通过对纯水透析至少24小时来纯化,然后在真空下干燥。通过1H NMR、UV-Vis和MALDI-TOF质谱术来表征所收集的产物,即一种澄清的油。PADRE-树状聚合物缀合物的NMR谱显示了与树状聚合物质子对应的大峰和肽质子峰的小集合。PADRE-树状聚合物缀合物的MALDI-TOF质谱显示了比单独对树状聚合物观察到的峰高约3,000个单位的m/z比率的峰。超出的质量对应于约2个肽表位。缀合物的UV-Vis谱显示了色氨酸吸收的波长范围中的清楚吸收。
通过将两种组分在用PBS在生理学pH缓冲的水溶液中混合来完成质粒DNA与PADRE-树状聚合物缀合物的复合。用于生成PDD(肽衍生化的树状聚合物)和质粒或抗原的复合物的缓冲液或培养基含有生理缓冲液,通常pH为7.4。例子是i)基于水的盐溶液,其含有氯化钠、磷酸钠和(在一些配制剂中)氯化钾和磷酸钾诸如PBS(磷酸盐缓冲液盐水),或ii)含有Eagle氏最小必需培养基的培养基,其用HEPES和碳酸氢钠缓冲,并补充有次黄嘌呤、胸苷、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺和具有100mg/L CaCl2的小于10%牛血清白蛋白或个别血清蛋白(包括胰岛素和/或运铁蛋白),其中内毒素水平小于1.0EU/mL。
用于形成PDD(肽衍生化树状聚合物)和质粒或抗原的复合物的方案的例子包括以下步骤。第一,以每孔1ml、每ml 1百万将PBMC在24孔板的4孔中分配,将它们编号为1、2、3和4。第二,将5μg质粒或抗原在800μl上文所描述的缓冲液中稀释。第三,将35μg PDD在200μl缓冲液中稀释,逐滴添加到800μl上文所描述的缓冲液中的5μg质粒或抗原的溶液,期间摇动容器,并于室温温育10分钟。第四,将此混合物添加到4号孔中(来自步骤1)。接着,将35μg PDD添加到3号孔中,及任选地添加到2号孔中,若你希望使用无关质粒/抗原和单独的培养基的1号孔的话。
典型的N/P(胺与磷酸根)比率是10∶1。使用凝胶电泳来显示DNA的完全复合。在生理学pH值时,使氨基(-NH2)质子化,为树状聚合物提供高正电荷,并使它们特别良好地适合于将带负电荷的DNA或RNA递送到细胞中。在水溶液中,带正电荷的树状聚合物和带负电荷的核酸产生能相对容易地渗入并穿过生物膜的浓缩物或毫微粒。
通常通过与上文所描述的关于PADRE衍生化树状聚合物的方法类似的方法来制备与不同于PADRE的T辅助表位缀合的树状聚合物。例如,可以通过许多公知的合成方法,诸如使用碳二亚胺作为活化试剂的酰胺化来将肽的酸末端共价附接于树状聚体树状聚合物表面上的胺基之一。作为另一个例子,使用两种合成路径来实施这些肽与以氨基为末端的树状聚合物的附接。通过乙酰化保护肽表位的氨基末端。第一种路径使用末端半胱氨酸残基的羧酸以经由标准的酰胺化化学实现附接。第二种路径利用半胱氨酸的硫醇(若存在于肽上的话,否则可以添加)以将其与通过用马来酰亚胺的先前处理对树状聚合物表面添加的烯基起反应。这两种路径都允许用表位功能化树状聚合物。每个树状聚合物达数个肽表位(例如,2、3、4、5、6等)将增强DNA递送剂的靶向特性,从而改善其疫苗接种目的的特性。然而,重要的是,留下大量未起反应的胺基,从而经由在生理学pH值下的质子化,树状聚合物将获得大的正电荷。如本文中所描述的树状聚合物可以与任何T辅助表位缀合。另一种通用DR结合肽的例子是流感HA。
一般地,在本文中所描述的组合物、试剂盒、测定和方法中使用第5代(G5)树状聚合物。然而,也可以使用其它代树状聚合物(参见表2)。
表2PAMAM树状聚合物
代 | 分子量 | 直径(nm) | 表面基团 |
0 | 517 | 1.5 | 4 |
1 | 1,430 | 2.2 | 8 |
2 | 3,256 | 2.9 | 16 |
3 | 6,909 | 3.6 | 32 |
4 | 14,215 | 4.5 | 64 |
5 | 28,826 | 5.4 | 128 |
6 | 58,0548 | 6.7 | 256 |
带电荷的聚合载体及包含其的组合物
实施靶向转染表达MHC II类的细胞(特别是APC)以评估疫苗或其它疗法或干预的功效或评估药物或生物制剂的免疫原性的如本文中所描述的组合物包含至少一种带电荷的(例如,带正电荷的)聚合载体,诸如树状聚合物,其具有与其缀合或结合的MHC靶向性分子,诸如通用DR结合肽(例如,诸如破伤风毒素582-599、PADRE或流感HAT辅助表位:SFERFEIFPKEC(SEQ ID NO:28)等表位)和至少一种肽、多肽或蛋白质抗原、至少一种变应原、至少一种编码至少一种抗原的核酸、至少一种生物制剂或至少一种药物,使得至少一种MHC靶向性分子和至少一种肽或多肽抗原、至少一种变应原、至少一种编码至少一种抗原的核酸、至少一种生物制剂或至少一种药物与带电荷的(例如带正电荷的)聚合载体(例如树状聚合物)的外部表面缀合,并且MHC靶向性分子特异性结合PAPC。在评估疫苗功效的实施方案中,至少一种通用DR结合肽、至少一种树状聚合物和至少一种肽或多肽抗原或至少一种编码至少一种抗原的核酸的组合能够诱导APC中的抗原呈递,这导致刺激来自已经接受疫苗的个体的PBMC中对制备疫苗所针对的抗原特异的T细胞(仅在存在对抗原特异的引发的T细胞时)。通过诱导对抗原和细胞因子表达特异的辅助T细胞的活化,可以证明疫苗的功效。如上文所描述,细胞因子的水平和/或T细胞增殖/活化的程度与来自个体的PBMC中的T细胞应答成比例地关联。因此,通过测量细胞因子水平和T细胞增殖/活化的程度,可以确定疫苗是否有效启动对抗原的免疫应答及启动的免疫应答的程度。具有阳性应答的受试者的ELISA、ELISpot和ICS一般在导致T细胞应答的免疫后高5倍。在胞内细胞因子测定(ICS)中,阳性应答的范围可以为约0.02%至约4%以上(例如,0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%等)。响应者(即,已经启动对疫苗的免疫应答的受试者)的ELISA或Luminex/多重测定的IFNγ水平可以高于200皮可克。阳性斑点数目的范围可以为例如在ELISpot测定中每一百万50至几千个斑点。
在评估药物或生物制剂或变应原的免疫原性的实施方案中,至少一种通用DR结合肽(例如,T辅助肽)、至少一种树状聚合物和至少一种药物或变应原或生物制剂的组合能够诱导细胞因子生成和对药物、变应原或生物制剂特异的T细胞的增殖和活化。如上文所描述,在评估药物、变应原或生物制剂的免疫原性的方法中,若在如上文所描述的测定中检出细胞因子水平升高和/或对药物、变应原或生物制剂特异的T细胞或B细胞活化水平升高,则药物、变应原或生物制剂确定为免疫毒性的,因为药物、变应原或生物制剂已经引起受试者中的T细胞或B细胞应答。
使用展示于树状聚合物之上或之内的导致T辅助细胞活化和增殖的如本文中所描述的一种或多种抗原来检测由于对来自任何病原体的抗原的疫苗接种启动的免疫应答。在一个实施方案中,抗原可以源自但不限于病原性细菌、真菌或病毒生物体、链球菌属(Streptococcus species)、念珠菌属(Candida species)、布鲁氏菌属(Brucella species)、沙门氏菌属(Salmonella species)、志贺氏菌属(Shigella species)、假单胞菌属(Pseudomonas species)、博德特氏菌属(Bordetella species)、梭菌属(Clostridium species)、诺瓦克病毒(Norwalk virus)、炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)、结核分枝杆菌、人体免疫缺陷病毒(HIV)、衣原体属(Chlamydiaspecies)、人乳头瘤病毒、流感病毒、副粘病毒属、疱疹病毒、巨细胞病毒、水痘-带状疱疹病毒、爱泼斯坦巴尔病毒、肝炎病毒、疟原虫属(Plasmodium species)、毛滴虫属(Trichomonas species)、性传播疾病媒介物、病毒性脑炎媒介物、原生动物性疾病媒介物、真菌性疾病媒介物、细菌性疾病媒介物、癌细胞或其混合物。
在一个实施方案中,至少一种通用DR结合肽是两种(例如,2、3、4、5等)通用DR结合肽,每种含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在另一个实施方案中,至少一种通用DR结合肽是流感HA T辅助表位(SFERFEIFPKEC)(SEQ ID NO:28)或本文中所提及的任何肽,例如表1中的那些肽。通用DR结合肽(MHC II类结合配体)是特异性结合MHC II类的任何表位或小分子。与MHC II类结合是本文中所描述的组合物的APC靶向能力,实现抗原的递送、表达、处理和呈递所需要的,这继而是评估疫苗对特定病原体或抗原的功效或评估对药物和/或生物制剂和/或细胞的不必要的T细胞应答所需要的。在树状聚合物与编码抗原的核酸缀合的实施方案中,核酸一般是表达载体。表达载体通常包含与编码抗原的基因可操作连接的真核启动子、克隆位点、多聚腺苷酸化序列、选择标志物和细菌复制起点。此类质粒在自然条件下结合本文中所描述的带正电荷的衍生化树状聚合物。一般地,抗原通常是癌症抗原或来自传染性病原体的抗原。至少一种树状聚合物一般是G5树状聚合物。树状聚合物是有效伴随DNA(和其它核酸,包括DNA、RNA、siRNA、微小RNA、RNAi等)进入细胞中的媒介物。类似地,在树状聚合物与肽或多肽抗原缀合的实施方案中,抗原一般是癌症抗原或来自传染性病原体的抗原,并且至少一种树状聚合物是G5树状聚合物。在用于评估疫苗的功效或者用于评估药物或生物制剂(例如,抗体、细胞等)的免疫原性的组合物的一个实施方案中,通用DR结合肽是PADRE表位,并且树状聚合物是PADRE衍生化的。PADRE是一种人工设计的肽,其结合大多数MHC II类,并且将PADRE肽与树状聚合物缀合(例如,PADRE衍生化的树状聚合物)使所得的复合物或缀合物成为表达高水平MHC II类的PAPC的配体。因此,此复合物变为一种对表达MHC II类的细胞或PAPC具有高亲和力的通用靶向抗原递送系统。PADRE是结合许多鼠、非人灵长类和人的MHC II类分子的通用DR结合肽。它是一种合成的、非天然的T辅助表位[AKchxAVAAWTLKAAA(SEQ ID NO:26)(chxA=环己基丙氨酸)]。当与树状聚合物的表面融合时,PADRE主要将结合并活化具有MHC II类的细胞(包括所有PAPC)。数种PADRE表位(例如,2、3、4、5等)可以附接于每个树状聚合物。用合适的间隔物完成附接以保留引起其MHC结合特性的肽的结合特性。可以在将抗原或其它分子与本文中所描述的树状聚合物缀合物缀合时使用接头或间隔物分子。间隔物可以是包括AAA、KK、GS、GSGGGGS (SEQ ID NO:27)、RS或AAY的氨基酸的任何组合。如本文中所使用,术语“接头”或“间隔物”意指插入树状聚合物与表面暴露分子诸如MHC II类配体、CD4+T辅助表位、多肽,或治疗剂间的化学基团,所述治疗剂与树状聚合物(例如,PADRE-树状聚合物)和表面暴露分子缀合或结合。优选地,接头在一端与表面分子缀合而在其另一端与毫微粒(例如,PADRE-树状聚合物)缀合。连接可以用同或异双功能剂,即SPDP、DS、SIAB来实施。用于连接的方法披露于deJongh等的PCT/DK00/00531(WO 01/22995)中,该专利的全文通过引用方式并入本文。
如本文中所描述的编码抗原的核酸分子可以为RNA形式(例如,mRNA、微小RNA、siRNA、shRNA或合成的经化学修饰的RNA)或者为DNA形式(例如,cDNA、基因组DNA和合成的DNA)。DNA可以是双链或单链,并且若为单链,可以是编码(有义)链或非编码(反义)链。在一个实施方案中,核酸可以是自永生化或原代肿瘤细胞系分离或扩增的RNA分子。
如上文所描述,在一个实施方案中,用于评估疫苗的功效(对疫苗或抗原启动的免疫应答)的组合物包括至少一种树状聚合物,其具有与其缀合的至少一种通用DR结合肽和编码抗原的核酸。使用DNA引入抗原以评估疫苗的功效或评估药物或生物制剂的免疫原性具有数个优点。第一,DNA的使用提供了全谱的未免疫(天然)处理的表位。此外,与通用DR结合肽和编码抗原的核酸缀合的树状聚合物提供了对占所有人MHC(AKA,HLA)大于95%的APC的靶向递送,并且消除了对于纯化而言有挑战的蛋白质纯化的需要。此类蛋白质可以是多蛋白质复合物的一部分,可以是膜蛋白,并且可以是不正确折叠的且不可溶的。本文中所描述的树状聚合物缀合物不需要对蛋白质的糖基化或翻译后修饰,它们为干扰蛋白质结构或折叠加标签,并且提供显著的成本和时间节约。PADRE-树状聚合物将核酸靶向并递送到来自小鼠、狒狒和人的PBMC的实情使此平台成为一种用于从小鼠到非人灵长类和人的快速翻译研究的理想候选。
还如上文所描述,在另一个实施方案中,用于评估疫苗(免疫应答)或其它疗法或干预的功效的组合物包括至少一种树状聚合物,其具有与其缀合物的至少一种通用DR结合肽(例如,诸如PADRE或流感HA T辅助表位:SFERFEIFPKEC(SEQ ID NO:28)等表位)和肽或多肽抗原,其中所述至少一种通用DR结合肽和肽或多肽抗原与树状聚合物的外部表面缀合,而且能够被APC吸收。具有负净电荷的多肽和肽可以与例如PADRE-树状聚合物复合,不需要共价缀合。
如上文所提及,可以使用本文中所描述的组合物、试剂盒、测定和方法来评估对在治疗任何传染性病原体或癌症的受试者施用疫苗或其它疗法或干预的功效。传染性病原体的例子包括病毒诸如但不限于流感、HIV、登革病毒、轮状病毒、HPV、HBV、HCV、CMV、HSV、HZV和EBV,病原性媒介包括疟疾的致病因子,即恶性疟原虫、三日疟原虫(P.malariae)、卵形疟原虫(P.ovale)、间日疟原虫(P.vivax)和诺尔斯氏疟原虫(P.knowlesi);利什曼原虫(Leishtnania,L)的致病因子,即硕大利什曼原虫(L.major)、热带利什曼原虫(L tropica)、埃塞俄比亚利什曼原虫(L.aethiopica)、墨西哥利什曼原虫(L.mexicana)、杜诺凡利什曼原虫(L.donovani)、婴儿利什曼原虫(L.infantum),同物异名恰加斯氏利什曼原虫(syn.L.chagasi),病原性细菌,包括炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumonia)和脑膜炎球菌(meningococcus)。
可以使用如本文中所描述的与通用DR结合肽和抗原或编码抗原的核酸缀合的树状聚合物来评估对任何癌症的疫苗或用于癌症的任何其它疗法或干预的功效。癌症的例子包括HPV诱导的宫颈癌(例如,E7/E7肿瘤相关抗原(TAA)或者编码这些抗原的质粒可以与所描述的通用DR结合肽/树状聚合物(例如,PADRE-树状聚合物)复合)、人黑素瘤(例如,可以使用TRP-1、TRP-2、gp-100、MAGE-1、MAGE-3和/或p53作为TAA,并且将其与本文中所描述的通用DR结合肽/树状聚合物(例如,PADRE-树状聚合物)复合)和前列腺癌(例如,可以使用TSA作为TAA,并将其与与本文中所描述的通用DR结合肽/树状聚合物(例如,PADRE-树状聚合物)复合)。对于肺癌、乳腺癌和白血病类似地,可以使用任何合适的TAA,并且许多已经被描述过。许多此类TAA在多种癌症是共同的(例如,CEA、MUC-1、Her2、CD20)。
用于检测对疫苗或其它疗法或干预的免疫应答的方法和测定
本文中描述了用于确定已经接受用于治疗或预防病理(例如,感染)的疗法或干预(例如,疫苗接种)的受试者是否已经启动对疗法或干预的免疫应答以及定量免疫应答的测定、试剂、试剂盒和方法。例如,这些方法、试剂、试剂盒和测定可用于评估疫苗的功效。图11显示了用于检测对疫苗或其它疗法或干预的免疫应答的典型方法、试剂盒和测定。抗原或编码抗原的核酸与肽(例如,PADRE)衍生化树状聚合物复合,并用于转染PBMC制备物中的APC,并且将它们转化成抗原表达自体APC(在本文中称为“靶细胞”)。
在用于检测对疫苗或其它疗法或干预的免疫应答的方法和测定的一个例子中,在受试者接受疫苗或其它疗法或干预前自受试者获得第一样本,其中所述疫苗或其它疗法或干预包括抗原、药物或生物制剂;在受试者已经接受疫苗或其它疗法或干预后自受试者获得第二样本;使第一样本和第二样本各自与高度支化聚合的树状聚合物接触,所述树状聚合物与MHC靶向的通用DR结合肽和抗原、药物或生物制剂缀合;测量第一样本中的免疫应答,并测量第二样本中的免疫应答;将比第一样本中的免疫应答高的第二样本中的免疫应答与对疫苗或其它疗法或干预的免疫应答相关联。在此方法和测定中,测量免疫应答通常包括测量或检测以下一项或多项:T细胞活化、T细胞增殖、B细胞活化、B细胞增殖和细胞因子表达。
在另一个实施方案中,确定已经接受用于治疗或预防病理(例如,感染)的疗法或干预(例如,疫苗接种)的受试者是否已经启动对疗法或干预的免疫应答以及定量免疫应答不涉及在接受疗法或干预(例如,疫苗接种)前自受试者获得第一样本。例如,此类方法和测定在对尚未接受任何疫苗接种的患者中的肿瘤抗原(有时,甚至在没有疫苗的情况下自发引发免疫)的免疫监测技术中可以是有用的。在此实施方案中,使用预期尚未使个体暴露的一种或多种无关抗原(即,疫苗中不包含的或者与疗法或干预无关的抗原)作为阴性对照。用于测定疫苗的功效的此类方法的例子包括以下步骤。将已经对受试者接种疫苗后自受试者获得的PBMC(例如,自受试者获得包含PBMC的样本)分成至少三部分(技术人员可以想要具有更多阳性对照和阴性对照),并放置在不同孔中(例如,在多孔板上)。每部分包含约五百万个细胞。一部分,即“效应细胞”未接受处理,并且在惯常的培养基中在培养箱(37℃/5%CO2)中温育。此部分在此例子中称作标本A。向在此例子中称作标本B的另一部分中添加与疫苗抗原或者与编码疫苗抗原的核酸复合的PDD。向在此例子中称作标本C的第三部分中添加与无关蛋白质或肽(或编码无关蛋白质或肽的核酸)复合的PDD。这些PDD充当阴性对照。无关(对照)蛋白质的例子包括清蛋白和萤火虫荧光素酶蛋白。作为另一个阴性对照,可以将不与无关蛋白质或肽或抗原复合的PDD添加到PBMC。作为另一个阴性对照,可以将与PDD复合的没有插入物的质粒(空载体)添加到PBMC。还可以在其它孔中使用任选的阳性对照,诸如与如本文中所描述的树状聚合物复合的回忆抗原,诸如那些对破伤风类毒素或流感抗原的回忆抗原(蛋白质或编码蛋白质的质粒)。在培养箱(37℃/5%CO2)中温育过夜(或其它合适的时间量)后,将标本A分别与标本B和标本C混合。将经由测量测试(A和B的混合物)和阴性对照(A和C的混合物)的上清液中的IFN-γ的任选方法(诸如ELISA)在12-48小时后测量T细胞应答。统计学差异(通常为5倍差异)证明相对于阴性对照的对所测试抗原的阳性T细胞应答。
在此实施方案中,检测对疫苗或其它疗法或干预的免疫应答的典型方法包括以下步骤。制备或提供包含多个带电荷的高度支化聚合的树状聚合物的第一组合物,每个所述树状聚合物具有与其缀合的至少一种通用DR结合肽和至少一种肽或多肽抗原或编码至少一种抗原的核酸,所述至少一种通用DR结合肽和核酸或至少一种肽或多肽抗原与多个带电荷的高度支化聚合的树状聚合物的外部表面缀合,使得至少一种通用DR结合肽特异性结合PAPC。在此实施方案中,疫苗或其它治疗性干预包括抗原或其部分。在已经对受试者接种疫苗后获得来自受试者的包含PAPC的第一样本,并将第一样本分成至少第一部分和第二部分。在温育条件下使至少第一部分与第一组合物接触,使得多个带电荷的高度支化聚合的树状聚合物被PAPC吸收,并且使得抗原由PAPC处理,并由PAPC与MHC II类结合呈递。使第二部分与第二组合物接触,所述第二组合包含多个带电荷的高度支化聚合的树状聚合物,每个所述树状聚合物具有与其缀合的至少一种通用DR结合肽和至少一种阴性对照肽或多肽或编码至少一种阴性对照肽或多肽的核酸,所述至少一种通用DR结合肽和至少一种对照肽或多肽抗原或编码至少一种阴性对照肽或多肽的核酸与多个带电荷的高度支化聚合的树状聚合物的外部表面缀合,使得至少一种通用DR结合肽特异性结合PAPC。对与第一组合物接触的至少第一部分检查至少一种指示对疫苗或其它治疗性干预的免疫应答的分子或标志物的存在,并测定至少一种分子或标志物的水平。类似地,对与第二组合物接触的至少第二部分检查至少一种分子或标志物的存在,并测定至少一种分子或标志物的水平。将与第一组合物接触的至少第一部分中的至少一种分子或标志物的水平和与第二组合物接触的至少第二部分中的至少一种分子或标志物的水平进行比较,并且将在与第一组合物接触的至少第一部分中比在与第二组合物接触的至少第二部分中更高水平的至少一种分子或标志物与对所述疫苗的免疫应答相关联。如果相对于与第二组合物接触的至少第二部分中的水平,没有在与第一组合物接触的至少第一部分中检出或测量到更高水平的至少一种分子或标志物,那么不应推断出对疫苗或其它治疗性干预启动了免疫应答。至少一种对照肽或多肽抗原可以是任何合适的阴性对照,诸如例如清蛋白或荧光素酶。例如,至少一种指示对疫苗或其它治疗性干预的免疫应答的分子或标志物可以是T细胞或B细胞活化或增殖,或细胞因子(例如,IFN-γ)。可以使用任何合适的测定,诸如细胞因子测定和/或CTL测定来对与第一组合物接触的至少第一部分和与第二组合物接触的至少第二部分检查至少一种分子或标志物的存在,并测定与第一组合物接触的至少第一部分和与第二组合物接触的至少第二部分中的至少一种分子或标志物的水平。
此实施方案可以是特别有用的应用的例子涉及检测和/或区别活动性对潜伏性结核(TB)的不成功研究。T SPOT.TB测试是测量对结核分枝杆菌(MTB)抗原特异的T细胞的体外诊断测试。此测试涉及使用肽表位混合物,并且由于测试中使用的免疫优势肽的记忆T细胞,其即使在处理后也是阳性的。为了区别活动性对潜伏性TB,使用本文中所描述的方法、试剂盒、试剂和测定,技术人员可以如本文所描述的在PDD的情况下使用编码对潜伏性TB感染特异的抗原的质粒,并测量IFN水平。
在所述方法中,使用任何合适量的组合物,其包括有效诱导MHC II类介导的辅助T细胞活化的如上文所描述的那样获得的自体APC。一个例子是使用24孔板的孔中的2ml(相关)培养基中的1百万个PBMC、1-5ug质粒DNA或抗原或0.5ug以(4-10):1的比率与PDD混合的siRNA,其中使用4-10倍PDD。至少一种通用DR结合肽可以是两种泛-DR表位,其中每种泛-DR表位具有SEQ ID NQ:1的氨基酸序列。或者,至少一种通用DR结合肽可以不同于泛-DR表位(PADRE表位),例如流感HA。一般地,至少一种树状聚合物是G5树状聚合物。作为接受特定生物制剂或药物的候选者,或者已经接种疫苗或者接受另一种疗法或干预,或者将接种疫苗或接受另一种疗法或干预,或在考虑接种疫苗或其它疗法或干预的人患者是典型的受试者。
用于评估药物或生物制剂的免疫原性的方法和测定
本文中进一步描述了用于评估药物或生物制剂的免疫原性的方法、试剂、试剂盒和测定。可以使用这些方法、试剂和测定来评估任何药物或生物制剂的免疫原性(或其缺乏)。评估药物或生物制剂在受试者或受试者群中是否为免疫原性的典型方法包括以下步骤:自受试者获得包含PBMC的样本;将样本分成至少第一部分、第二部分和第三部分;向第二部分中添加包含多个带电荷的高度支化聚合的树状聚合物的组合物,每个所述树状聚合物具有与其缀合的至少一种通用DR结合肽和至少一种药物或生物制剂,其中至少一种通用DR结合肽和药物或生物制剂与多个带电荷的高度支化聚合的树状聚合物的外部表面缀合,使得至少一种通用DR结合肽特异性结合PAPC;向第三部分中添加包含多个带电荷的高度支化聚合的树状聚合物的组合物,每个所述树状聚合物具有与其缀合的至少一种通用DR结合肽和至少一种阴性对照多肽或编码阴性对照多肽的核酸,其中至少一种通用DR结合肽和阴性对照多肽或编码阴性对照多肽的核酸与多个带电荷的高度支化聚合的树状聚合物的外部表面缀合,使得至少一种通用DR结合肽特异性结合PAPC;温育至少第一部分、第二部分和第三部分;将第一部分的第一等分试样与第二部分或其等分试样混合,将第一部分的第二等分试样与第三部分或其等分试样混合,并在让T细胞增殖和活化的条件下温育混合物;测量第一部分的第一等分试样与第二部分的混合物中的T细胞增殖或活化;测量第一部分的第二等分试样与第三部分的混合物中的T细胞增殖或活化;及将比第一部分的第二等分试样与第三部分的混合物中的T细胞增殖或活化高的第一部分的第一等分试样与第二部分的混合物中的T细胞增殖或活化与对所述药物或生物制剂的免疫应答相关联。在该方法中,测量T细胞增殖或活化包括测量IFN-γ水平,或任何其它细胞因子的水平。还是在该方法中,通常将对药物或生物制剂的免疫应答与药物或生物制剂的免疫原性相关联。
用于评估药物或生物制剂的免疫原性的方法和测定的一个例子包括以下步骤。将自待测试不利免疫反应的受试者或群体获得的PBMC分成至少三部分(技术人员可以想要具有更多阳性对照和阴性对照),并放置在不同孔中(例如,在多孔板上)。每部分包含约五百万个细胞。一部分,即“效应细胞”未接受处理,并且在惯常的培养基中在培养箱(37℃/5%CO2)中温育。此部分在此例子中称作标本A。向第二部分,即标本B中添加与生物制剂/药物/化合物或自身抗原或者与编码生物制剂或自身抗原的核酸复合的PDD。向称作标本C的第三部分中添加与无关蛋白质或肽(或编码无关蛋白质或肽的核酸,或空质粒)复合的PDD。这些PDD充当阴性对照。无关(对照)蛋白质的例子包括清蛋白和萤火虫荧光素酶蛋白。作为另一个阴性对照,可以将不与无关蛋白质或肽或抗原复合的PDD添加到PBMC。作为另一个阴性对照,可以将与PDD复合的没有插入物的质粒(空载体)添加到PBMC。还可以在其它孔中使用任选的阳性对照,诸如与如本文中所描述的树状聚合物复合的回忆抗原,诸如那些对破伤风类毒素或流感抗原的回忆抗原(蛋白质或编码蛋白质的质粒)。在培养箱(37℃/5%CO2)中温育过夜(或合适的时间)后,将标本A分别与标本B和标本C混合。将经由测量测试(A和B的混合物)和阴性对照(A和C的混合物)的上清液中的IFN-γ的任选方法(诸如ELISA)在12-48小时后测量T细胞应答。统计学差异(通常为5倍差异)证明相对于阴性对照的对所测试抗原的阳性T细胞应答。关于PDD/抗原/药物复合物的制备,如本文中所描述,制备此类树状聚合物/DNA质粒复合物或树状聚合物/生物制剂或药物复合物。测试PDD与DNA质粒或生物制剂或药物的不同比率。可以实施凝胶电泳作为标准测定以测定导致载物在凝胶中保留的最好比率。比率的一个例子是7倍(按重量计)PDD和1倍药物/蛋白质、生物制剂、RNA或质粒DNA。可以使用PBS或OptiMem中终体积为100μl的2-5μg药物、蛋白质、生物制剂或RNA或质粒DNA。为了生成复合物,每次反应使用100μl。这通常于室温保留约10分钟。将100μl复合物添加到2ml RPMI培养基中的一百万个PBMC中。将此混合物在37℃/5%CO2培养箱中培养过夜。添加相同个体或动物的一百万个PBMC,并将其在37℃/5%CO2培养箱中温育24小时。通过任何期望的方法测量细胞因子水平和/或T细胞增殖。
用于将核酸递送到细胞的组合物和方法
在本文中所描述的实验中,观察到了将编码GFP的基因特异性递送到MHC II类细胞(表达MHC II类的细胞)的递送以及基因表达。因此,本文中所描述的组合物和方法可以在任何基因疗法应用中得到应用。用于将核酸递送到细胞的组合物通常包括至少一种带正电荷的高度支化聚合的树状聚合物,所述树状聚合物具有与其缀合的至少一种通用DR结合肽(例如,T辅助肽)和至少一种编码肽或蛋白质的核酸,其中所述至少一种通用DR结合肽和核酸与至少一种带正电荷的高度支化聚合的树状聚合物的外部表面缀合,使得至少一种通用DR结合肽特异性结合细胞,并且由细胞内在化至少一种通用DR结合肽、至少一种带正电荷的高度支化聚合的树状聚合物和核酸的组合。将核酸递送到细胞的方法通常包括使细胞与包含至少一种带正电荷的高度支化聚合的树状聚合物的组合物接触,所述树状聚合物具有与其缀合的至少一种通用DR结合肽和至少一种编码肽或蛋白质的核酸,其中所述至少一种通用DR结合肽和核酸与至少一种带正电荷的高度支化聚合的树状聚合物的外部表面缀合,使得至少一种通用DR结合肽特异性结合细胞,并且由细胞内在化至少一种通用DR结合肽、至少一种带正电荷的高度支化聚合的树状聚合物和核酸的组合。在一个典型的实施方案中,肽或蛋白质在细胞内表达。
将核酸递送到专门的抗原呈递细胞中的方法的一个例子包括以下步骤:提供包含至少一种带电荷的高度支化聚合的树状聚合物的组合物,所述树状聚合物具有与其缀合的至少一种II类相关恒定链肽(CLIP),其中至少一种CLIP与带电荷的高度支化聚合的树状聚合物的外部表面缀合,使得至少一种CLIP特异性结合专门的抗原呈递细胞;并在具有与其缀合的至少一种CLIP的至少一种带电荷的高度支化聚合的树状聚合物结合多种细胞内的专门的抗原呈递细胞的条件下使组合物与来自哺乳动物受试者(例如人)的多种细胞接触。在一些实施方案中,带电荷的高度支化聚合的树状聚合物是PAMAM树状聚合物,且至少一种CLIP是CLIP p88-99。带电荷的高度支化聚合的树状聚合物可以进一步与至少一种核酸(例如siRNA、微小RNA、RNAi、RNA或DNA)缀合,并且核酸进入专门的抗原呈递细胞。至少一种带电荷的高度支化聚合的树状聚合物可以包括药物(例如,携带并递送药物)。
用于评估疫苗或其它疗法或干预的功效及用于评估药物或生物制剂的免疫原性的试剂盒
本文中还描述了用于评估疫苗或其它疗法或干预的功效及用于评估药物或生物制剂的免疫原性的试剂盒。图11显示了如何使用典型的试剂盒来评估疫苗或其它疗法或干预的功效或评估药物或生物制剂的免疫原性。典型的试剂盒包括包含如本文中所描述的多种树状聚合物/通用DR结合肽复合物(缀合物)(例如,PADRE衍生化的树状聚合物,与流感HA缀合的树状聚合物等)的容器、生理缓冲液和使用说明。根据预期用途,树状聚合物/通用DR结合肽复合物可以与核酸、肽、蛋白质、药物或生物制剂缀合。由于试剂盒的通用性质,所以可以购买该试剂盒,并将其用于评估任何疫苗或其它疗法或干预的功效,和/或评估任何生物制剂或药物的免疫原性。通常,使用pH为7.4的缓冲液来稀释PDD、DNA、RNA或抗原。在缓冲液或培养基的一个例子中,缓冲液或培养基包括Eagle氏最小必需培养基,其用HEPES和碳酸氢钠缓冲,并补充有次黄嘌呤、胸苷、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺和具有100mg/L CaCl2的小于10%牛血清白蛋白或个别血清蛋白(包括胰岛素和/或运铁蛋白),其中内毒素水平小于1.0EU/mL。在其它实施方案中,用于生成PDD(肽衍生化的树状聚合物)的复合物的缓冲液或培养基是基于水的盐溶液,其含有氯化钠、磷酸钠和(在一些配制剂中)氯化钾和磷酸钾,诸如PBS(磷酸盐缓冲液盐水)。
在核酸将与树状聚合物/通用DR结合肽复合物复合的实施方案中,试剂盒的用户用100-200μg/ml缓冲液稀释至少一种编码一种抗原的核酸(例如,DNA质粒),并且在温和摇动的情况下,将组合物(通用DR结合肽-树状聚合物)添加到稀释的质粒DNA。在一个典型的实施方案中,使用10∶1的通用DR结合肽-树状聚合物与质粒DNA的比率(N∶P),其是约7倍(重量)组合物与1倍(重量)DNA质粒。
在树状聚合物/通用DR结合肽复合物与蛋白质或多肽或变应原缀合的实施方案中,10∶1的树状聚合物/通用DR结合肽复合物与蛋白质或变应原的相同比率通常导致复合物形成。如本文中所描述的试剂盒中包含的使用说明描述了产生正确比率的方案、缓冲液及需要时的优化和疑难解答。质粒DNA、蛋白质/抗原、变应原、药物或生物制剂与本文中所描述的通用DR结合肽-树状聚合物(例如,PADRE-树状聚合物缀合物)的复合一般通过将两种组分在用生理缓冲液(包括PBS)在生理学pH下缓冲的水溶液中混合来完成。典型的N/P(胺与磷酸根)的比率是10∶1。可以使用凝胶电泳或其它合适的测定来证明DNA与通用DR结合肽-树状聚合物(例如,PADRE-树状聚合物缀合物)的完全复合。
在一些实施方案中,可以使用如本文中所描述的试剂盒来预测对在药物、生物制剂或其它消费品中使用或构成用作防腐剂的试剂的所有种类的化学品和化合物的不想要的(不期望的)T细胞和/或B细胞应答,来增强稳定性,或者来提高在T细胞和/或B细胞应答可以负责或部分牵涉的地方的递送。例如,延迟型超敏感性(DTM)是一种细胞介导的免疫记忆应答,或4型超敏感性,其中涉及致敏T细胞的免疫学介导的反应介导延迟型超敏感性反应,导致变应性接触性皮炎。1型(IgE相关)和4型反应(T细胞相关)可以在同一个体中发生。接触性皮炎可以在IgE介导的症状发作前形成。DTH反应可以是非常严重的,而且与显著的发病率有关。
如本文中所描述的试剂盒可以与任何抗原、变应原、药物、生物制剂、核酸序列、编码目标抗原的载体或质粒一起使用。一般包括用于制备和使用本文中所描述的树状聚合物/通用DR结合肽复合物(缀合物)的说明材料。虽然说明材料通常包含书面或印刷材料,但是它们不限于此。能够存储此类说明并将它们传达至最终用户的任何媒介物是本文中试剂盒和方法所涵盖的。此类媒体包括但不限于电子存储媒体(例如,磺盘、磁带、盒式磁带、芯片)、光学媒体(例如,CD ROM)等。此类媒体可以包括提供此类说明材料的因特网站地址。
实施例
本发明通过以下具体实施例进一步示例。实施例仅提供示例,而不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
实施例1:用于生成呈递抗原的自体APC的基于辅助/靶向性毫微粒的平台
通常通过两种反应物:第五代以氨基为末端的PAMAM树状聚合物和靶向性/免疫增强肽,或通用DR结合肽(例如,PADRE)的缀合来制备本文中所描述的基于树状聚合物的毫微粒。下文所描述的数据显示了此平台将在小鼠和人APC两者中的转染效率提高了2至3倍。此外,使用与PADRE-树状聚合物缀合的GFP编码质粒的体内实验显示了GFP是在引流淋巴结中生成的。
材料和方法
在具有以下修饰的情况下如上文所描述,生成PADRE衍生化的PAMAM树状聚合物。通过以适当的N/P比率于室温温育10分钟来生成PADRE-树状聚合物/DNA或siRNA复合物。将此类复合物添加到原代PBMC或脾细胞以进行体外研究或者出于疫苗接种目而进行皮下注射。图1显示了第五代PAMAM树状聚合物的PADRE装饰(与第五代PAMAM树状聚合物缀合)。
为了保持高度带正电荷的表面以结合多个核酸,一个树状聚合物分子通常具有两个与其表面缀合的PADRE肽,从而它仍将保持其正净电荷。对树状聚合物添加PADRE导致APC的特异性靶向及强的CD4辅助。
结果
表征制备的PADRE-树状聚合物。通过肽的-COOH端与树状聚合物胺基间的简单酰胺偶联来生成肽-树状聚合物缀合物。在反应中使用2∶1肽/树状聚合物考验比率,寻求每个树状聚合物仅几个肽的附接,以使大多数胺基保持游离,从而在树状聚合物上形成大的正电荷。将产物通过对纯水透析至少24小时来纯化,然后在真空下干燥。通过1H NMR、UV-Vis和MALDI-TOF质谱术来表征所收集的产物,即一种澄清的油。NMR显示了与树状聚合物质子对应的大峰和肽质子峰的小集合。PADRE-树状聚合物缀合物的MALDI-TOF质谱显示了比单独对树状聚合物观察到的峰高约3,000个单位的m/z比率的峰。超出的质量对应于约2个肽表位。
数据建立了每个树状聚合物上存在平均两个PADRE。显示了多种核酸对自体APC的体外递送。以1∶5和1∶10的电荷比率最好地实现人原代外周单核细胞的体外多核苷酸递送/转染。图2显示了经由PADRE-树状聚合物对纯化的人B细胞的dsRNA递送(约%86),其中将与PADRE-树状聚合物复合的(缀合的)的加有Alexa Fluor标签的dsRNA与B细胞一起温育4小时。用CD19/FITC染色细胞,并且红色通道(PE)代表具有dsRNA/Alexa Fluor.man的细胞。
参考图3,显示了PADRE-树状聚合物的体内DNA递送。注射单独的或与PADRE-树状聚合物复合的编码GFP或TRP-2的质粒或树状聚合物(即,不与PADRE复合的树状聚合物)。该图显示了注射后24小时和16小时的皮肤(左)和角膜(右)中的GFP表达。证明了在注射PADRE-树状聚合物复合物后24小时和16小时,在皮肤和角膜两者中的GFP的有效表达。证明了体内淋巴结靶向。皮下注射PADRE-树状聚合物/GFP-质粒复合物(5μg总质粒)后8天,将相邻的淋巴结取出,并与仅注射GFP-DNA的小鼠的淋巴结比较。在免疫后第8天对网状淋巴结拍摄荧光显微镜图像。看到与注射部位相邻的淋巴结中的抗原表达,但是没有看到对照淋巴结中的抗原表达。
证明了体内淋巴结靶向。皮下注射PADRE-树状聚合物/GFP-质粒复合物(5μg总质粒)后8天,将相邻的淋巴结取出,并与仅注射GFP-DNA的小鼠的淋巴结比较。在免疫后第8天对网状淋巴结拍摄荧光显微镜图像。看到与注射部位相邻的淋巴结中的抗原表达,但是没有看到对照淋巴结中的抗原表达。
这些数据清楚地证明,本文中所描述的靶向性辅助毫微粒平台导致基因递送、编码的抗原的稳健表达和抗原呈递。因此,本文中所描述的PADRE-树状聚合物毫微粒是一种用于递送dsRNA的新的有力的辅助/靶向性递送工具和平台。
实施例2:体外靶向性递送和转染效率
参考图4,PBMC的体外靶向递送导致77%的B细胞转染效率。获得来自健康供体的人PBMC。以每ml具有10%胎牛血清的RPMI培养基6百万个细胞来培养PBMC。将5μg编码GFP的质粒在100ul生理缓冲液PBS中稀释,并在摇动的情况下将50ul PBS中的5μg PADRE-树状聚合物添加到DNA。在于室温温育10分钟后,然后,将GFP质粒和PADRE-树状聚合物的混合物/复合物添加到PBMC,在37℃/5%CO2培养箱中温育后24小时,用CD 19PE染色PBMC,并通过流式细胞术分析细胞。在占总PBMC的43%中观察到GFP的表达,而在对B细胞门控时,77%B细胞表达GFP。对照组,即与相同比率的树状聚合物和GFP质粒一起温育的PBMC显示在总PBMC或B细胞中的约11%和7%GFP表达。在与仅培养基情况下的PBMC相比时,没有观察到主要的存活力变化。这是数项中的代表性实验。这些实验证明i)GFP质粒对PBMC且特别是对MHC II类表达细胞(B细胞)的递送,和ii)PBMC且特别是B细胞的GFP表达。
实施例3:在体内对小鼠DC及在体外对人B细胞的肽/蛋白质递送
将PDD/清蛋白-FITC递送到纯化的人B细胞中(图5)。参考图6,此图显示了在体内在小鼠DC中的PADRE-树状聚合物靶向和功效及注射和淋巴结分析的时间线。对此实验的分析显示为i)(图5)将与PADRE-树状聚合物混合的清蛋白-FITC,即一种蛋白质在小于2小时内在人B细胞中递送,ii)(图6)在皮下注射后第5天内,将与树状聚合物缀合的PADRE,即一种表位在体内递送到淋巴结的B细胞和DC中(PADRE-树状聚合物与GFP-质粒复合以显现复合物对淋巴结/B细胞/DC的递送),iii)(图7)在皮下注射后第5天内,将与树状聚合物缀合的流感HA辅助表位,即一种表位在体内递送到淋巴结的DC中(PADRE-树状聚合物与GFP-质粒复合以显现复合物对淋巴结DC的递送)。这些数据代表了数项实验,并且在一些中,在皮下注射各与GFP质粒复合的PADRE-树状聚合物或HA-树状聚合物后第3天取出淋巴结。这些结果建立经由FITC的FITC显现对APC(包括B细胞和DC)递送与FITC缀合的蛋白质以及递送两种肽,即与树状聚合物缀合的PADRE和HA辅助表位(其中GFP质粒与肽-树状聚合物复合以便于显现并分析淋巴结细胞中的复合物(与具有GFP编码质粒的树状聚合物复合物连接的肽))的例子。
通过在注射毫微粒(PADRE-树状聚合物/GFP编码质粒)对对照后5天的关于靶向并扩充相邻淋巴结中的DC的体内流式细胞术数据(78%对约7%GFP表达)显示DC的特异性体外和体内转染。PADRE衍生化的树状聚合物(PDD)由于其PADRE的辅助调理效应而增强递送,所述PADRE以高亲和力结合APC上表达的MHC II类。类似地,在皮下注射时,在相邻的淋巴结中体内递送HA-树状聚合物(DRHA)/GFP-质粒(图7)。注意,在小鼠中,PADRE结合IAb的MHC II类(C57BL小鼠)(图6),而选定的HA表位结合IAd的MHC II类(Balb/c小鼠)(图7)。已经显示了用两种不同表位在两种不同小鼠品系中的体内递送具有相似结果的可行性。通过PADRE-树状聚合物/GFP-质粒对人PBMC(图4)、纯化的人B细胞(图4),及在C57BL小鼠的脾细胞中导致GFP表达的APC靶向性递送,及PADRE-树状聚合物/dsRNA对人B细胞(图8)和猴PBMC(图9)的递送是通过本文中所描述的组合物将肽递送到PAPC的另外的体内证据。因为两种不同靶向肽(其独特的特征是结合MHC II类)的使用如在本文中所描述的实验中所显示的那样起作用,所以本文中所描述的方法、试剂盒、测定和组合物涵盖了所有MHC II类结合肽。参考图7,还制备了与流感HA辅助表位(HDD)缀合的树状聚合物。
实施例4:PADRE-树状聚合物将dsRNA递送到人B细胞和非人灵长类PBMC中及PADRE-树状聚合物将质粒递送到非人灵长类PBMC中
参考图8,与dsRNA(核酸)复合的PADRE-树状聚合物在体外展现出靶向性递送。将0.1μg dsRNA在100ul PBS中稀释,并在摇动情况下将20ul中的0.7μg PADRE-树状聚合物添加到加有Alexa Fluor标签的dsRNA。在于室温温育10分钟后,将复合物添加到24孔板的孔中的一百万个纯化的B细胞(在RPMI加10%胎牛血清中)。于37℃/5%CO2培养箱温育后约1小时,将细胞清洗,并放回孔中(在1ml新鲜的RPMI加10%胎牛血清),并在荧光显微镜下在红色通道中分析。在明视野和红色通道下的细胞的重叠图像证明加有Alexa Fluor标签的dsRNA被人B细胞摄取(图8)。在将细胞用CD19(B细胞标志物)染色时,将它们于37℃/5%CO2培养箱温育过夜,并通过流式细胞术分析(图2)。如图2中所显示,相对于对照的约6%,对于树状聚合物/dsRNA-Alexa Fluor,大于80%的B细胞在Alexa Fluor(对dsRNA加标签)方面呈阳性。这些结果清楚地证明PADRE-树状聚合物将核酸稳健地递送到PAPC。
测试PBMC,即来自狒狒(狒狒(papio hamadryas))的一份样本和来自猕猴(食蟹猴(macaca fascicularis))的两份不同样本。图9中所显示的荧光显微镜图像是代表性的,在添加各自与dsRNA/Alexa Fluor复合的PADRE-树状聚合物或树状聚合物后2小时拍摄。类似地,将与GFP-质粒复合的PADRE-树状聚合物或树状聚合物添加到PBMC,并温育后24小时分析(图10)。结果显示了,在小于2小时内,PADRE-树状聚合物将核酸递送到猴的PBMC中,而树状聚合物仅显示适度的递送。这些结果有力地表明,PADRE-树状聚合物对非人灵长类起作用。
实施例5:评估细胞介导的对疫苗接种的免疫应答
本文中所描述的测定、试剂盒、组合物和方法提供了数个优点。这些优点包括:天然的/天然处理的表位的全谱可用于对来自同一个体的细胞进行免疫评估;PBMC的EBV感染、病毒载体感染刺激的细胞、使用CD40表达细胞、细胞的肽加载是劳动密集的/昂贵的,而且对于所有地方的非专业化实验室是不可行的;与目前不是有效的并且诱导较差的免疫应答的DNA递送方法不同,本文中所描述的方法导致暗示高表达的强抗体应答;而且本文中所描述的方法是快速的。另外,基因对PBMC的病毒递送导致对病毒载体的强免疫应答,并且处理病毒载体与安全性顾虑有关。
在评估疫苗功效的方法中,用PADRE加标签的树状聚合物在10分钟内与抗原、编码疫苗抗原的DNA或RNA生成复合物(此类复合物通过电泳来证明)。将此复合物与预先接种疫苗的PBMC共培养(过夜),并用于转染APC。用丝裂霉素-C处理此类细胞,并用作表达在疫苗接种中使用的抗原的靶细胞(自体APC)。树状聚合物表面上的PADRE靶向APC上的MHC II类。
证明了对人PBMC中的原代CD3T细胞的转染。将10ug GFP-质粒与如本文中所描述的毫微粒复合10分钟。将毫微粒和DNA的复合物与PBMC共培养过夜。在转染后第3天和第7天实施FACS分析。还证明了对原代纯化的CD19B细胞的转染,建立了经由与毫微粒/GFP-质粒共培养来转染APC的可行性。将10ug GFP-质粒与毫微粒复合10分钟。将毫微粒和DNA的复合物与纯化的人B细胞共培养过夜,并在转染后第2天实施FACS分析。
参考图15-17,这些图中所显示的实验结果表明本文中所描述的树状聚合物用于递送核酸和肽/多肽及用于评估在哺乳动物中的疫苗功效的有用性。在图15中,PDD/清蛋白-FITC在人B细胞中的高水平递送(73%)清楚地显示,平台可以与蛋白质/多肽或其类似的抗原一起使用。在图16中,PDD/GFP质粒在人B细胞中的高水平递送(77%)清楚地显示,平台有效地将质粒递送到B细胞中,并且导致编码的蛋白质/抗原的表达。图17显示了在小鼠中测量疫苗接种功效;注意接种疫苗的小鼠中的IFN-γ水平的显著差异。
图14是以下结果的照片,其显示了A)树状聚合物、PADRE和树状聚合物-PADRE的紫外光谱。通过标准的方法来实施肽-树状聚合物的紫外光谱。对G5树状聚合物-PEDRE看到的苯丙氨酸峰显示了肽-PADRE被添加到树状聚合物。B)对树状聚合物/DNA复合物的琼脂糖凝胶电泳和电泳迁移率分析。通过检查琼脂糖凝胶电泳期间的质粒DNA的迁移延迟来实施对PDD与DNA的复合物形成和结合的分析。对肽衍生化的树状聚合物(PDD)/质粒复合物测试其在凝胶电泳中的DNA保留。对PDD/质粒和对照:单独的DNA、单独的树状聚合物及多个比率1∶1、1∶2、1∶5、1∶10、1∶20(P∶N)的[PDD/质粒]样本实施凝胶电泳。PDD能够以大于(1∶2)的比率保留DNA质粒。图15是显示蛋白质/抗原的细胞特异性递送的一系列流式细胞术点图式的图。将PDD/清蛋白-FITC递送到纯化的人B细胞中。将PBMC与单独的清蛋白-FITC、[树状聚合物/清蛋白-FITC]或[树状聚合物-PADRE(PDD)/清蛋白-FITC]之任一种共培养。在37℃/CO2培养箱中温育后24小时,在流式细胞术中分析每种处理情况下的细胞,并使用抗CD 19-APC来门控人B细胞。使用比率为1∶10(w∶w)的清蛋白-FITC和PDD或树状聚合物。PDD/清蛋白-FITC在人B细胞中的高水平递送(73%)清楚地显示了平台可以与蛋白质/多肽或其类似抗原一起使用。图16是一系列流式细胞术直方图,其显示了用PDD(PADRE-树状聚合物(PDD)/GFP-质粒)体外转染人B细胞(CD19)(上方小图)和小鼠脾细胞群(下方小图)。上方小图:将纯化的人B细胞与单独的GFP质粒、[树状聚合物/GFP质粒]或指定P:N比率的[树状聚合物-PADRE(PDD)/GFP质粒]共培养。在37℃/CO2培养箱中温育后24小时,在流式细胞术中来对每种处理情况下的细胞分析GFP蛋白表达。PDD/GFP质粒在人B细胞中的高水平递送(77%)清楚地显示了平台有效地将质粒递送到B细胞中,而且导致编码的蛋白质/抗原的表达。下方小图显示了在C57BL未免疫小鼠的脾细胞情况下实施相似实验时的流式细胞术点图式的图,而且类似地显示了CD-19阳性细胞(B细胞)的GFP转染。图17是显示表达抗原的APC的生成的图。用TiterMax(Sigma)中的OVA蛋白将5只组中的6-8周龄雌性C57BL小鼠免疫两次。最后一次免疫后10天,将经免疫小鼠的脾细胞收集,并以每孔一百万个细胞在含具有10%FBS的RPMI中的24孔板的4孔中分配,将孔标记为“单独的培养基”、“单独的PADRE-树状聚合物(PDD)”、“PADRE-树状聚合物(PDD)/对照质粒”和“PADRE-树状聚合物(PDD)/OVA质粒”。将5微克与PADRE-树状聚合物复合的质粒(以1∶10的比率)添加到合适的孔(靶细胞)。次日早晨,将每种经处理的/经转染的细胞添加到不同孔中的同一小鼠的未免疫脾细胞。刺激后24小时,使用ELISA(Thermo)在上清液中检测INF-γ的水平。IFN水平在含有用[PDD/QVA-质粒]处理的脾细胞的孔中显著(P值<0.006)高于所有对照,这显示了试剂盒可以用于评估疫苗接种后的T细胞应答。通过使用50,000个B16-OVA的考验实验以及通过OVA肽刺激(未显示)证实T细胞应答的诱导。
实施例6:制备通用DR结合肽-树状聚合物以用于评估疫苗功效及评估药物或生物制剂的免疫原性
通用DR结合肽(包括表1中所提及的那些通用DR结合肽)可以购自任何商业来源或者可合成,并且一般以95%的最小纯度购自商业供应商。使用标准方法来将肽附接于以氨基为末端的树状聚合物。例如,使用两种合成路径来调查PADRE肽对以氨基为末端的树状聚合物的附接。肽表位的氨基端受到乙酰化保护。一种路径使用末端半胱氨酸残基的羧酸以经由标准的酰胺化化学实现附接。第二种路径利用肽半胱氨酸的硫醇(若肽没有此氨基酸,则将其添加)以将其与通过用溴己酰氯的先前处理对树状聚合物表面添加的溴化物基团起反应。这两种路径都允许用肽表位功能化树状聚合物,但是第二种路径提供了树状聚合物与表位间的5-亚甲基间隔物。每个树状聚合物已经附接不同数目的表位。每个树状聚合物的平均2至6个表位增强DNA递送剂的靶向特性。然而,它留下大量未起反应的胺基,从而经由在生理学pH值下的质子化,树状聚合物将获得大的正电荷。通过紫外-可见和荧光光谱学、元素分析和MALDI-TOF质谱术来完成肽衍生化的树状聚合物的表征。将肽-树状聚合物与DNA的比率优化以促进肽-树状聚合物表面上的表位的呈递以及允许DNA复合物形成。使用人PBMC进行有效基因递送和由DNA编码的抗原的呈递的最佳比率测定为5∶1、10∶1、20∶1的变化的平台与质粒比率。
实施例7:用于免疫评估的简单且快速的方法
通过将PBMC的第一部分或样本添加到含有与肽衍生化的树状聚合物(例如,G5树状聚合物)复合的靶基因(即,编码目标抗原的基因)的质粒混合物来实施转染。将所得的经转染的APC和PBMC在DMSO中冷冻,并在与来自同一个体的PBMC的第二样本或部分共培养时作为自体APC使用。会将每个个体的PBMC的一部分与由毫微粒加质粒构成的复合物温育过夜,所述质粒含有编码目标抗原的基因。次日,将经PDD/抗原处理的表达个体MHC背景中的抗原的PBMC(靶细胞:在用PDD/质粒或抗原处理时的PBMC变为表达抗原的APC)与来自个体的PBMC(效应细胞)的第二样本共培养。
毫微粒复合物上的通用DR结合肽充当APC上存在的MHC II类分子的配体。本文中描述了一种使用具有结合MHC II类能力的通用DR结合肽作为APC的归巢标志物的新方法。通常用丝裂霉素C处理充当靶细胞的经转染的APC。在用疫苗抗原转染APC后的此丝裂霉素C处理导致消除其增殖,而且降低细胞因子表达,由此导致对靶标APC的干扰的消除以及CTL测定中可能的PADRE诱导的背景的降低。
实施例8:呈递由与树状聚合物缀合的RNA编码的抗原的APC的生成
图11和图12显示了来自涉及经流感血凝素(HA)SFERFEIFPKEC(SEQ ID NO:28)T辅助表位装饰的树状聚合物(DRHA)、同基因小鼠脾细胞(靶细胞)、同基因小鼠的MHC 1类-HA反应性CD8+T细胞(效应细胞)的实验的结果。在该实验中,将源自血凝素表达肿瘤的mRNA(包括血凝素RNA)的混合物与DRHA混合,然后添加到识别MHC I类限制性血凝素肽的T细胞。测量IFN-γ。图12和图13显示了仅DRHA能够诱导可察觉水平的IFN-γ。因为血凝素特异性CD8+T细胞仅在将该蛋白质翻译、处理并与MHC I类复合时才能识别血凝素,但是它们不能识别树状聚合物上缀合的或MHC II类上暴露的MHC II类限制性HA肽,这些结果清楚地显示了,缀合有MHC II类限制性肽的树状聚合物在mRNA的情况下可以有效地转染APC。将包含目标抗原的这些mRNA翻译成蛋白质、处理并在MHC分子上暴露。此实验有力地表明,可以通过使用通过用还含有目标mRNA的RNA混合物加载的肽树状聚合物转染的APC来检出对任何肿瘤相关抗原的免疫应答。这在需要评估来自肿瘤表达的未知肿瘤相关抗原的免疫应答时是特别重要的。
实施例9:其它通用DR结合肽-树状聚合物的制备
用两种MHC II类结合肽装饰树状聚合物,每种所述MHC II类结合肽覆盖大量MHC等位基因。或者,为了具有不太复杂的合成选项,生成各具有这些肽之一的两组树状聚合物,并且在使用点将它们以1∶1混合。
第一平台由用肽FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ ID NO:30)装饰的树状聚合物和树状聚合物与肽FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQID NO:30)的缀合物组成。平均2个肽在每个树状聚合物上。此肽衍生化的树状聚合物称为“FNN-DR”。报道了此通用MHC结合肽结合非人灵长类、Balb/c、C57B1以及人的以下等位基因:DRB1*1101、DRB1*1104、HLA-DPB1*0402、HLA-DRB1*1101和HLA-DPB1*0401。
第二平台由用肽SSVFNVVNSSIGLIM(SEQ ID NO:29)装饰的树状聚合物和树状聚合物与肽SSVFNVVNSSIGLIM(SEQ ID NO:29)的缀合物组成。平均2个肽在每个树状聚合物上。此肽衍生化的树状聚合物称为“SSV-DR”。此通用DR结合肽结合以下等位基因:DRB1*0401(15%)、DRB1*0405、DRB1*1101、DRB1*1302、DRB1*0701、DRB1*0802、DRB1*0901、DRB1*1501、DRB1*0101(24%)和DRB5*0101。
实施例10:用于靶向APC的超基序-树状聚合物平台
超基序靶向MHC II类,并且与通用的T辅助表位不同,II类相关恒定链肽(CLIP)没有T辅助活性,因此使它们成为一种用于MHC II类的通用靶向,特别是用于免疫监测应用及不期望免疫增强的递送的良好候选物。还可以使用与CLIP缀合的树状聚合物来递送例如FoxP3siRNA或质粒以抑制或诱导T调节细胞(TReg细胞)增殖或活性,因为Treg细胞表达MHC II类。可以使用此平台来靶向APC以i)将抗微生物或抗寄生物药物特异性递送到巨噬细胞,ii)将细胞特异性siRNA或DNA递送到Treg细胞中,及iii)生成T细胞免疫监测试剂盒(需要较少的活化或不需要活化)。例如,可以使用平台来将药物(例如,抗利什曼原虫药物)靶向以预防或治疗存活于巨噬细胞和/或树状细胞中的寄生物(例如,利什曼原虫)或病原性微生物的感染。通过使用所述平台,可以降低此类药物的剂量和毒性。
实施例11:测量T和B细胞应答以评估对疫苗或其它干预的总免疫应答
抗原对PBMC的合适的体外呈递也可以揭示关于B细胞应答的重要信息,所述B细胞应答可用于预测或评估对疫苗的总体免疫应答,特别是在诸如非常期望快速的B细胞应答的流感等情况中。可以经由测量疫苗抗原诱导的B细胞IgG或酶AID(活化诱导的细胞因子脱氨酶)的诱导来测量此类应答,其使用与同一个体的PBMC共培养的本文中所描述的PDD/PBMC用上文对T细胞应答所描述的相同方案,只是测量的细胞因子或其它标志物/分析物为B细胞特异的来进行。
其它实施方案
可以在部分或所有组合物、试剂盒、测定和方法步骤中进行任何改善。通过引用方式将本文中所引用的所有参考文献(包括出版物、专利申请和专利)并入本文。本文中所提供的任何及所有例子或示例性语言(例如“诸如”)的使用意图阐明本发明,而并不对本发明的范围造成限制,除非另外要求保护。例如,可以使用本文中所描述的测定、方法、试剂和试剂盒来测量未接种疫苗的受试者中对病原体或肿瘤的免疫应答。本文中关于本发明或优选实施方案的性质或益处的任何叙述并不意图为限制性的,并且所附权利要求书不应视为由此类叙述限制。更一般地,说明书中的文字不应解释为将任何不要求保护的要素指示为对于本发明的实践是必要的。如适用法律允许,本发明包括其所附权利要求书中所叙述的主题的所有修改和等同方案。此外,除非本文中另有指明或者上下文另有明确禁忌,本发明涵盖了其所有可能的变化的上文所描述的要素的任意组合。
Claims (26)
1.一种检测对疫苗的免疫应答的方法,该方法包括以下步骤:
a)制备或提供包含多个带电荷的高度支化聚合的树状聚合物的组合物,每个所述树状聚合物具有与其缀合的至少一种通用DR结合肽和至少一种肽或多肽抗原或编码所述至少一种抗原的核酸,其中所述至少一种通用DR结合肽和所述核酸或至少一种肽或多肽抗原与所述多个带电荷的高度支化聚合的树状聚合物的外部表面缀合,使得所述至少一种通用DR结合肽特异性结合专门的抗原呈递细胞(PAPC),
其中所述疫苗包含所述抗原;
b)在对受试者接种疫苗前自所述受试者获得包含PAPC的第一样本;
c)将所述第一样本分成所述第一样本的第一部分和所述第一样本的第二部分;
d)在温育条件下使所述第一样本的第一部分与所述组合物接触,使得所述多个带电荷的高度支化聚合的树状聚合物被所述PAPC吸收,并且使得所述抗原由所述PAPC处理,并且由与MHC II类结合的所述PAPC呈递;
e)清洗所述第一样本的第一部分和所述第一样本的第二部分;
f)以两种或更多种的比率组合所述第一样本的第一部分和所述第一样本的第二部分,从而得到第一多个混合物;
g)将所述第一多个混合物温育1个或多个小时;
h)对所述多个混合物检查至少一种指示对所述疫苗的免疫应答的分子或标志物的存在,并测定所述至少一种分子或标志物的水平;
i)在已经对所述受试者接种疫苗后自所述受试者获得包含PAPC的第二样本;
j)将所述第二样本分成所述第二样本的第一部分和所述第二样本的第二部分;
k)在温育条件下使所述第二样本的第一部分与所述组合物接触,使得所述多个带电荷的高度支化聚合的树状聚合物被所述第二样本的第一部分中的所述PAPC吸收,并且使得所述抗原由所述第二样本的第一部分中的所述PAPC处理,并且由所述第二样本的第一部分中与MHC II类结合的所述PAPC呈递;
l)清洗所述第二样本的第一部分和所述第二样本的第二部分;
m)以两种或更多种的比率组合所述第二样本的第一部分和所述第二样本的第二部分,从而得到第二多个混合物;
将所述第一多个混合物温育1个或多个小时;
n)对所述第二多个混合物检查所述至少一种分子或标志物的存在,并测定所述至少一种分子或标志物的水平;
o)将所述第一多个混合物中的所述至少一种分子或标志物的水平和所述第二多个混合物中的所述至少一种分子或标志物的水平进行比较;及
p)将在所述第二多个混合物中比在所述第一多个混合物中更高水平的所述至少一种分子或标志物与对所述疫苗的免疫应答相关联。
2.根据权利要求1所述的方法,其中使所述第一样本的第一部分与所述组合物接触的步骤d)包括添加丝裂霉素C达约30分钟。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述至少一种指示对所述疫苗的免疫应答的分子或标志物包含细胞因子。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述细胞因子是IFN-γ。
5.根据权利要求1所述的方法,其中所述至少一种指示对所述疫苗的免疫应答的分子或标志物包含T细胞活化或增殖。
6.根据权利要求1所述的方法,其中使用细胞因子测定或CTL测定来对所述第一多个混合物和第二多个混合物检查所述至少一种分子或标志物的存在及测定所述至少一种分子或标志物的水平。
7.根据权利要求1所述的方法,其中所述至少一种通用DR结合肽是PADRE表位。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述至少一种通用DR结合肽是两种PADRE表位,每种所述PADRE表位具有SEQ ID NQ:1的氨基酸序列。
9.根据权利要求1所述的方法,其中所述至少一个带电荷的高度支化聚合的树状聚合物是PAMAM树状聚合物。
10.一种检测对疫苗或其它治疗性干预的免疫应答的方法,该方法包括以下步骤:
a)制备或提供包含多个带电荷的高度支化聚合的树状聚合物的第一组合物,每个所述树状聚合物具有与其缀合的至少一种通用DR结合肽和至少一种肽或多肽抗原或编码所述至少一种抗原的核酸,其中所述至少一种通用DR结合肽和所述核酸或至少一种肽或多肽抗原与所述多个带电荷的高度支化聚合的树状聚合物的外部表面缀合,使得所述至少一种通用DR结合肽特异性结合专门的抗原呈递细胞(PAPC),
其中所述疫苗或其它治疗性干预包含所述抗原;
b)在已经对受试者接种疫苗后自所述受试者获得包含PAPC的第一样本;
c)将所述第一样本分成至少第一部分和第二部分;
d)在温育条件下使所述至少第一部分与所述第一组合物接触,使得所述多个带电荷的高度支化聚合的树状聚合物被所述PAPC吸收,并且使得所述抗原由所述PAPC处理,并且由与MHC II类结合的所述PAPC呈递;
e)使所述第二部分与包含多个带电荷的高度支化聚合的树状聚合物的第二组合物接触,每个所述树状聚合物具有与其缀合的至少一种通用DR结合肽和至少一种阴性对照肽或多肽或编码所述至少一种阴性对照肽或多肽的核酸,其中所述至少一种通用DR结合肽和所述至少一种对照肽或多肽抗原或编码所述至少一种阴性对照肽或多肽的核酸与所述多个带电荷的高度支化聚合的树状聚合物的外部表面缀合,使得所述至少一种通用DR结合肽特异性结合PAPC;
f)对与所述第一组合物接触的所述至少第一部分检查至少一种指示对所述疫苗或其它治疗性干预的免疫应答的分子或标志物的存在,并测定所述至少一种分子或标志物的水平;
g)对与所述第二组合物接触的所述至少第二部分检查所述至少一种分子或标志物的存在,并测定所述至少一种分子或标志物的水平;
h)将与所述第一组合物接触的所述至少第一部分中的所述至少一种分子或标志物的水平和与所述第二组合物接触的所述至少第二部分中的所述至少一种分子或标志物的水平进行比较;及
i)将在与所述第一组合物接触的所述至少第一部分中比在与所述第二组合物接触的所述至少第二部分中更高水平的所述至少一种分子或标志物与对所述疫苗的免疫应答相关联。
11.权利要求10的方法,其中所述至少一种对照肽或多肽抗原是清蛋白或荧光素酶。
12.根据权利要求10所述的方法,其中所述至少一种指示对所述疫苗或其它治疗性干预的免疫应答的分子或标志物包含细胞因子。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述细胞因子是IFN-γ。
14.根据权利要求10所述的方法,其中所述至少一种指示对所述疫苗或其它治疗性干预的免疫应答的分子或标志物包含T细胞活化或增殖。
15.根据权利要求10所述的方法,其中使用细胞因子测定或CTL测定来对与所述第一组合物接触的所述至少第一部分和与所述第二组合物接触的所述至少第二部分检查所述至少一种分子或标志物的存在,及测定与所述第一组合物接触的所述至少第一部分和与所述第二组合物接触的所述至少第二部分中的至少一种分子或标志物的水平。
16.一种用于评估药物或生物制剂的免疫原性的方法,该方法包括以下步骤:
a)自受试者获得包含PBMC的样本;
b)将所述样本分成至少第一部分、第二部分和第三部分;
c)将包含多个带电荷的高度支化聚合的树状聚合物的组合物添加到所述第二部分,每个所述树状聚合物具有与其缀合的至少一种通用DR结合肽和至少一种药物或生物制剂,其中所述至少一种通用DR结合肽和所述药物或生物制剂与所述多个带电荷的高度支化聚合的树状聚合物的外部表面缀合,使得所述至少一种通用DR结合肽特异性结合PAPC;
d)将包含多个带电荷的高度支化聚合的树状聚合物的组合物添加到所述第三部分,每个所述树状聚合物具有与其缀合的至少一种通用DR结合肽和至少一种阴性对照多肽或编码所述阴性对照多肽的核酸,其中所述至少一种通用DR结合肽和所述阴性对照多肽或编码所述阴性对照多肽的核酸与所述多个带电荷的高度支化聚合的树状聚合物的外部表面缀合,使得所述至少一种通用DR结合肽特异性结合PAPC;
e)温育所述至少第一部分、第二部分和第三部分;
f)将所述第一部分的第一等分试样与所述第二部分或其等分试样混合,将所述第一部分的第二等分试样与所述第三部分或其等分试样混合,并在让T细胞增殖和活化的条件下温育所述混合物;
g)测量所述第一部分的第一等分试样与所述第二部分的混合物中的T细胞增殖或活化;
h)测量所述第一部分的第二等分试样与所述第三部分的混合物中的T细胞增殖或活化;及
i)将比所述第一部分的第二等分试样与所述第三部分的混合物中的T细胞增殖或活化高的所述第一部分的第一等分试样与所述第二部分的混合物中的T细胞增殖或活化与对所述药物或生物制剂的免疫应答相关联。
17.根据权利要求16所述的方法,其中测量T细胞增殖或活化包括测量IFN-γ水平。
18.根据权利要求16所述的方法,其进一步包括将对所述药物或生物制剂的免疫应答与所述药物或生物制剂的免疫原性相关联。
19.一种用于评估疫苗的功效或药物或生物制剂的免疫原性的试剂盒,该试剂盒包含:
a)多个带电荷的高度支化聚合的树状聚合物,每个所述树状聚合物具有与其缀合的至少一种T辅助肽和至少一种选自下列项的制剂:肽或多肽抗原、编码至少一种抗原的核酸、药物、阴性对照多肽、编码对照多肽的核酸和生物制剂,其中所述至少一种T辅助肽和所述至少一种制剂与所述多个带电荷的高度支化聚合的树状聚合物的外部表面缀合,使得所述至少一种T辅助肽特异性结合专门的抗原呈递细胞;
b)至少一种缓冲液;
c)固体基质;和
d)使用说明。
20.一种将核酸递送到专门的抗原呈递细胞中的方法,该方法包括以下步骤:
(a)提供包含至少一种带电荷的高度支化聚合的树状聚合物的组合物,所述树状聚合物具有与其缀合的至少一种II类相关恒定链肽(CLIP),其中所述至少一种CLIP与所述带电荷的高度支化聚合的树状聚合物的外部表面缀合,使得所述至少一种CLIP特异性结合专门的抗原呈递细胞;及
(b)在某些条件下使所述组合物与来自哺乳动物受试者的多个细胞接触,其中所述具有与其缀合的至少一种CLIP的至少一种带电荷的高度支化聚合的树状聚合物结合所述多个细胞内的专门的抗原呈递细胞。
21.根据权利要求20所述的方法,其中所述带电荷的高度支化聚合的树状聚合物是PAMAM树状聚合物,且所述至少一种CLIP是CLIP p88-99。
22.根据权利要求21所述的方法,其中所述带电荷的高度支化聚合的树状聚合物与至少一种核酸进一步缀合,且所述核酸进入所述专门的抗原呈递细胞。
23.根据权利要求22所述的方法,其中所述至少一种核酸是siRNA、微小RNA、RNAi、RNA或DNA。
24.根据权利要求20所述的方法,其中所述至少一种带电荷的高度支化聚合的树状聚合物包含药物。
25.一种用于检测对疫苗或其它疗法或干预的免疫应答的测定,该方法包括以下步骤:
a)在受试者接受所述疫苗或其它疗法或干预前自所述受试者获得第一样本,其中所述疫苗或其它疗法或干预包含抗原、药物或生物制剂;
b)在所述受试者已经接受所述疫苗或其它疗法或干预后自所述受试者获得第二样本;
c)使所述第一样本和第二样本与高度支化聚合的树状聚合物接触,所述树状聚合物与以下制剂缀合:
i)MHC靶向且通用DR结合肽,和
ii)所述抗原、药物或生物制剂
d)测量所述第一样本中的免疫应答,并测量所述第二样本中的免疫应答;
e)将比所述第一样本中的免疫应答高的所述第二样本中的免疫应答与对所述疫苗或其它疗法或干预的免疫应答相关联。
26.根据权利要求25所述的测定,其中测量免疫应答包括测量或检测选自下列项的至少一项:T细胞活化、T细胞增殖、B细胞活化、B细胞增殖、和细胞因子表达。
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