ES2731343T3 - Composiciones, kits y métodos para presentación de antígenos in vitro, evaluación de eficacia de vacunas y evaluación de la inmunotoxicidad de productos biológicos y fármacos - Google Patents

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Abstract

Método de evaluación de una respuesta de células T frente a una vacuna o un producto biológico, comprendiendo el método las etapas de: a) preparar o proporcionar una composición que comprende una pluralidad de dendrímeros poliméricos cargados altamente ramificados que tienen cada uno conjugados a los mismos al menos un péptido de unión a DR universal y al menos un antígeno peptídico o polipeptídico o un ácido nucleico que codifica para el al menos un antígeno, en el que el al menos un péptido de unión a DR universal y el ácido nucleico o al menos un antígeno peptídico o polipeptídico están conjugados a la superficie exterior de la pluralidad de dendrímeros poliméricos cargados altamente ramificados de tal manera que el al menos un péptido de unión a DR universal se une específicamente a células presentadoras de antígeno profesionales (PAPC), en el que la vacuna o el producto biológico comprende el antígeno; b) proporcionar una primera muestra que comprende PAPC, obtenida a partir del sujeto antes de la vacunación del sujeto o la administración del producto biológico al sujeto; c) dividir la primera muestra en una primera porción de la primera muestra y una segunda porción de la primera muestra; d) poner en contacto la primera porción de la primera muestra con la composición en condiciones de incubación de tal manera que la pluralidad de dendrímeros poliméricos cargados altamente ramificados se captan por las PAPC y de tal manera que el antígeno se procesa por las PAPC y se presenta por las PAPC en combinación con MHC de clase II; e) lavar la primera porción de la primera muestra y la segunda porción de la primera muestra; f) combinar la primera porción de la primera muestra y la segunda porción de la primera muestra a dos o más razones, dando como resultado una primera pluralidad de mezclas; g) incubar la primera pluralidad de mezclas durante una o más horas; h) examinar la pluralidad de mezclas para determinar la presencia de al menos una molécula o un marcador que es indicativo de una respuesta de células T frente a la vacuna o el producto biológico y determinar el nivel de la al menos una molécula o un marcador; i) proporcionar una segunda muestra que comprende PAPC, obtenida a partir del sujeto después de que el sujeto se haya vacunado o haya recibido el producto biológico; j) dividir la segunda muestra en una primera porción de la segunda muestra y una segunda porción de la segunda muestra; k) poner en contacto la primera porción de la segunda muestra con la composición en condiciones de incubación de tal manera que la pluralidad de dendrímeros poliméricos cargados altamente ramificados se captan por las PAPC en la primera porción de la segunda muestra y de tal manera que el antígeno se procesa por las PAPC en la primera porción de la segunda muestra y se presenta por las PAPC en la primera porción de la segunda muestra en combinación con MHC de clase II; l) lavar la primera porción de la segunda muestra y la segunda porción de la segunda muestra; m) combinar la primera porción de la segunda muestra y la segunda porción de la segunda muestra a dos o más razones, dando como resultado una segunda pluralidad de mezclas; n) incubar la segunda pluralidad de mezclas durante una o más horas; o) examinar la segunda pluralidad de mezclas para determinar la presencia de la al menos una molécula o un marcador y determinar el nivel de la al menos una molécula o un marcador; p) comparar el nivel de la al menos una molécula o un marcador en la primera pluralidad de mezclas con el nivel de la al menos una molécula o un marcador en la segunda pluralidad de mezclas; y q) correlacionar un nivel superior de la al menos una molécula o marcador en la segunda pluralidad de mezclas en comparación con la primera pluralidad de mezclas con una respuesta de células T frente a la vacuna o el producto biológico.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones, kits y métodos para presentación de antígenos in vitro, evaluación de eficacia de vacunas y evaluación de la inmunotoxicidad de productos biológicos y fármacos
Campo de la invención
La invención se refiere de manera general a los campos de la química, el diagnóstico y la inmunología. Más particularmente, la invención se refiere a la evaluación de respuestas inmunitarias, así como la eficacia de vacunas y otras intervenciones terapéuticas.
Antecedentes
A diferencia de la monitorización de respuestas de anticuerpos, la monitorización inmunológica de células T (por ejemplo tras la vacunación) es actualmente imprecisa, no se correlaciona con la eficacia de vacunas y otras intervenciones, requiere cócteles de péptidos artificiales y costosos (cócteles de péptidos inciertos, restringidos a MHC e incompletos) y no proporciona mucha ayuda para tomar las decisiones correctas para avanzar a ensayos clínicos de fase II o III, por ejemplo, ya que algunas veces son engañosos. La evaluación de respuestas inmunitarias celulares frente a antígenos específicos requiere la expresión de antígenos en células presentadoras de antígeno (APC) autólogas asociadas con moléculas de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) con el fin de provocar respuestas mediadas por células T apropiadas. La interacción de antígenos presentados con clonotipos de células T específicos da como resultado la inducción de citocinas, proliferación y/o lisis de células diana “propias” que expresan el antígeno específico marcado por moléculas de MHC. La región genómica de MHC está presente en todas las APC. MHC es un componente esencial del sistema inmunitario que desempeña papeles importantes en las respuestas inmunitarias frente a patógenos, antígenos tumorales, así como en la autoinmunidad. Las proteínas codificadas por los genes de MHC que se expresan sobre la superficie de células que presentan tanto autoantígenos, de la propia célula, como fragmentos de antígenos no propios de patógenos o células tumorales a diversas células T les permiten i) proporcionar ayuda para la iniciación de respuestas inmunitarias, ii) ayudar a células T a destruir patógenos invasores/células tumorales/células infectadas con patógenos, e iii) coordinar la maduración de anticuerpos frente a antígenos no propios. Las moléculas de MHC de clase II se expresan en gran medida en APC especializadas tales como macrófagos, monocitos, células dendríticas y células B y se reconocen por linfocitos T cooperadores. Esto induce a su vez la proliferación de linfocitos T cooperadores y la amplificación de la respuesta inmunitaria específica frente a MHC-antígeno. El nivel de activación y proliferación de las células T cooperadoras es proporcional a la intensidad de respuestas inmunitarias y forma la base para la medición de una respuesta inmunitaria celular frente a infección o intervención terapéutica tal como vacunación o inmunoterapia. Por ejemplo, la monitorización inmunológica de respuestas inmunitarias celulares tras cualquier vacunación requiere que tales antígenos de vacuna se expresen en APC propias mientras que están acompañados por moléculas de MHC propias, también específicas o únicas de cada individuo. Los inmunodiagnósticos de respuestas de células T se ven dificultados por tal restricción de MHC/antígeno de leucocito humano (HLA) en cuanto a que las células diana (APC) deben tener el mismo MHC/HLA que las células efectoras (células T). Las células T sólo pueden ver el antígeno en el contexto de su propio MHC (singénico). De hecho, deben identificarse epítopos de células T de todos y cada uno de los antígenos que son específicos para todos y cada uno de los haplotipos de HLA. De hecho, esto es un procedimiento muy difícil y costoso. Debe usarse una mezcla de tales epítopos que contiene todos los posibles epítopos para todos los diversos MHC para estimular PBMC para sus respuestas de células T. El desafío es que sólo se identifican números limitados de epítopos de células T y no se correlacionan con la respuesta de células T huéspedes in vivo, por ejemplo, no sólo una escasa correlación entre tales respuestas y la eficacia de una vacuna, sino que además tales técnicas no pueden predecir la reacción adversa del sistema inmunitario frente a un producto biológico. Métodos alternativos se ven dificultados, por ejemplo, porque la captación de antígeno por parte de las APC es muy escasa. Desafortunadamente, la captación por parte de APC de proteínas, antígenos y plásmidos de ADN es lamentablemente débil y no hay ningún método sencillo de transfectar APC propias.
Para preparar dianas para la medición de respuestas inmunitarias celulares, investigadores han intentado la infección por VEB o transfección de células B autólogas inmortalizadas, así como estimulación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediante CpG, o cultivo conjunto de las mismas con células que expresan ligando CD40 seguido por transfección con vectores que expresan antígenos de vacuna. Alternativamente, se han usado matrices de péptidos solapantes, o un cóctel de péptidos conocidos seleccionados a partir de los antígenos de vacuna, para seleccionar como diana APC propias. Alternativamente, se usan tetrámeros (que incluyen epítopos) marcados con fluorocromos para unirse a células T específicas para cuantificarlas. Sin embargo, el uso de péptidos tiene varias limitaciones, incluyendo: i) limitación a péptidos lineales, ii) limitación únicamente a epítopos conocidos de antígenos, e iii) especificidad por presentación de MHC de clase o bien I o bien II basándose en el tamaño. Estos métodos sólo pueden usarse a pequeña escala y en laboratorios especializados, y son caros, complicados y difíciles de validar y normalizar.
Los métodos actuales para la evaluación de una respuesta inmunitaria frente a infección o inmunización están limitados por la falta de métodos de monitorización inmunológica de respuestas inmunitarias celulares precisos, rápidos y sencillos. Actualmente, la tasa de respuesta objetivo en estudios clínicos rara vez es >10%, impidiendo correlaciones significativas de tasas de respuesta de células T con respuestas clínicas. La medición precisa de la respuesta inmunitaria es un indicador de éxito de una intervención terapéutica o profiláctica y es de importancia fundamental en la evaluación de la eficacia de vacunas. Las principales limitaciones de los métodos actuales incluyen i) una falta de consenso sobre el método de elección, ii) escasa reproducibilidad, iii) un requisito de instrumentación y habilidades especializadas, iv) altos costes, y v) una baja correlación con la protección. Resulta una preocupación significativa el hecho de que el antígeno usado para unión a un anticuerpo específico, o procesamiento por APC para interrogar respuestas inmunitarias celulares, puede no ser una representación precisa de formas vistas in vivo durante la infección, limitando la capacidad de estos ensayos para proporcionar una imagen precisa de inmunidad humoral o celular en un individuo. Además, pueden seleccionarse como diana de manera inapropiada enfoques que usan un cóctel de péptidos (epítopos), ya que en la mayoría de los casos sólo presentan un número limitado de epítopos lineales conocidos que están limitados por restricción de MHC. El uso de antígeno de subunidad recombinante no es una opción ya que las APC no captan tales antígenos (o lo hacen escasamente) y pueden no ser representativos de configuraciones de antígenos nativos, particularmente tal como se procesan por las APC. Por tanto, estos enfoques restringen en gran medida la precisión de las mediciones de respuestas inmunitarias celulares, y limitan la utilidad de estos ensayos en la predicción de la eficacia clínica.
La publicación científica de Agadjanyan et al., (J Immunol. 1 de febrero de 2005; 174(3):1580-6) da a conocer que la inmunización de ratones transgénicos para proteína precursora de amiloide con p-amiloide fibrilar (Ap) previene la neuropatología de tipo enfermedad de Alzheimer (AD). En particular, para reducir el riesgo de una respuesta inmunitaria mediada por células T adversa frente a inmunoterapia con Ap, los autores han diseñado una vacuna de epítopo prototipo que contiene el epítopo de Ap de células B inmunodominantes en tándem con el epítopo de pan DR de HLA de células Th universal sintético, péptido de unión a pan DR de HLA (PADRE). Los autores han considerado que la secuencia de PADRE-AP1-15 carece del epítopo de Ap de células T y han encontrado que la inmunización de ratones BALB/c con la vacuna de epítopo PADRE-Ap1-15 producía altos títulos de Ac anti-Ap. Además, esplenocitos a partir de ratones inmunizados mostraron una estimulación de células T robusta en respuesta a péptidos que contenían PADRE; sin embargo, los esplenocitos a partir de ratones inmunizados no se reactivaron mediante el péptido de Ap.
El documento WO 2010/115046 da a conocer unas vacunas basadas en nanopartículas, composiciones, kits y métodos usados para la administración eficaz de uno o más antígenos in vivo para la vacunación y la producción de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales) y para la administración eficaz de péptidos, proteínas, ARNip, ARN o ADN a PAPC o células positivas para MHC de clase II (por ejemplo, células tumorales). Los antígenos pueden ser, por ejemplo, ADN que da como resultado la expresión del gen de interés y la inducción de una respuesta inmunitaria robusta y específica frente a la proteína expresada en un sujeto (por ejemplo, mamífero) o péptidos o polipéptidos inmunogénicos que se procesan y se presentan. El método basado en nanopartículas descrito para administrar antígenos in vivo incluye la inyección de una vacuna compuesta por un ADN que codifica para al menos un antígeno, o al menos un péptido o polipéptido antigénico conjugado con un dendrímero cargado (por ejemplo, dendrímero derivatizado con PADRE) que también está conjugado a un epítopo de células T cooperadoras (por ejemplo, PADRE). Las composiciones, kits, vacunas y métodos descritos tienen aplicaciones tanto profilácticas como de tratamiento.
El documento WO 00/17639 se refiere a un método in vitro para determinar la capacidad de una composición de vacuna que comprende uno o más antígenos o una molécula de ácido nucleico que codifica para uno o más antígenos para estimular una respuesta de células T. El método comprende las etapas de: (1) poner en contacto células presentadoras de antígeno en cultivo con una composición de vacuna seleccionada del grupo de composiciones de vacuna, de ese modo, si uno o más de los antígenos o moléculas de ácido nucleico pueden captarse y procesarse por las células presentadoras de antígeno, se producen uno o más antígenos procesados; (2) poner en contacto las células presentadoras de antígeno con células T en condiciones suficientes para que las células T respondan a uno o más de los antígenos procesados; (3) determinar si las células T responden a uno o más de los antígenos procesados; mediante lo cual si las células T responden a uno o más de los antígenos procesados, entonces la composición de vacuna estimula una respuesta de células T; y (4) repetir las etapas (1), (2) y (3) con cada composición de vacuna en el grupo, identificando así composiciones de vacuna que estimulan una respuesta de células T; y, si una o más de la composiciones de vacuna estimula una respuesta de células T, (5) seleccionar al menos una composición de vacuna que estimula una respuesta de células T para su evaluación en uno o más animales y/o sujetos humanos.
Actualmente, no hay ningún método o reactivo eficaz para evaluar la respuesta inmunitaria celular tras la vacunación o en respuesta a un fármaco o producto biológico. Por tanto, existe una necesidad significativa de métodos y reactivos para predecir con precisión la eficacia clínica de una vacuna, fármaco o producto biológico que puedan usarse a gran escala en cualquier entorno clínico y que sean fáciles de producir.
Sumario
En el presente documento se describen composiciones, ensayos, kits, métodos y plataformas basados en nanopartículas para administrar un antígeno (péptidos, proteínas) o un ácido nucleico que codifica para un antígeno a APC profesionales (PAPC) que dan como resultado la generación de APC autólogas que presentan un repertorio de péptidos naturales del antígeno para su uso en la evaluación de la eficacia de una vacuna (por ejemplo, una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) frente a un antígeno particular) u otra terapia o intervención (terapia basada en células, terapia adyuvante, etc.). Las composiciones, kits, ensayos y métodos también pueden usarse para administrar un fármaco o producto biológico o porción del mismo a a P c para evaluar la inmunogenicidad de fármacos y productos biológicos. La composición, kits, ensayos y métodos implican el uso combinado de péptidos de direccionamiento a MHC, de unión a DR universales (por ejemplo, PADRE o epítopo de células T cooperadoras de HA de influenza: SFERFEIFPKEC (SEQ ID NO: 28), h A ) con dendrímeros poliméricos altamente ramificados cargados (por ejemplo, cargados positivamente) (por ejemplo, PAMAM y otros dendrímeros) como vehículos para la administración dirigida de ácidos nucleicos, péptidos, productos biológicos, fármacos o polipéptidos a APC, dando lugar a un nuevo método basado en nanopartícula para evaluar la respuesta inmunitaria (por ejemplo, respuesta de CTL, respuesta de células B) frente a una vacunación u otra terapia o intervención, o para evaluar la inmunogenicidad de un producto biológico o fármaco. La administración dirigida de ácidos nucleicos, péptidos, productos biológicos, fármacos o polipéptidos a APC para la expresión y el procesamiento eficaces genera antígenos objetivo fisiológicamente más relevantes para la evaluación de respuestas inmunitarias mediadas por células frente a vacunación, por ejemplo, y proporciona un enfoque de bajo coste para la rápida generación de reactivos y desarrollo de sistemas de ensayo para una determinación de perfil más precisa de respuestas inmunológicas frente a infección, inmunización y otras terapias o intervenciones. En el presente documento se describen kits de evaluación inmunológica que usan la administración de antígeno basada en nanopartículas dirigida.
Una composición típica descrita en el presente documento para evaluar la eficacia de una vacuna u otra terapia o intervención o evaluar la inmunogenicidad de un fármaco o producto biológico incluye un dendrímero polimérico altamente ramificado cargado (por ejemplo, cargado positivamente) conjugado a un péptido de unión a DR universal y de direccionamiento a MHC (por ejemplo, un epítopo tal como la toxina del tétanos 582-599, el epítopo PADRE o de células T cooperadoras HA de influenza: SFERFEIFPKEC (SEQ ID NO: 28)), al menos un polipéptido antígeno o un ácido nucleico que codifica para el al menos un antígeno, y opcionalmente poli(I-C). Los dendrímeros poliméricos altamente ramificados cargados positivamente descritos en el presente documento se unen eficazmente a biomoléculas cargadas negativamente incluyendo ADN, ARN y otras. Los dendrímeros poliméricos altamente ramificados cargados (por ejemplo, cargados positivamente) conjugados a un péptido de unión a DR universal (por ejemplo, un epítopo tal como el epítopo PADRE o de células T cooperadoras HA de influenza: SFERFEIFPKEC (SEQ ID NO: 28)) proporcionan la administración de antígeno específica a PAPC. Los kits, ensayos, métodos y composiciones descritos en el presente documento abarcan todos los péptidos de unión a MHC de clase II, y proporcionan la transfección específica y eficaz de PAPC, y un ensayo universal para evaluar la eficacia de cualquier vacuna u otra terapia o intervención, así como evaluar la inmunogenicidad de un fármaco, alérgeno o producto biológico.
Los antígenos o ácidos nucleicos que codifican para los antígenos se complejan con un dendrímero derivatizado con péptido (denominado en el presente documento “PDD”) en el que el/los péptido(s) es/son un(os) péptido(s) de unión a D r universal(es) (por ejemplo, un(os) epítopo(s) de células T cooperadoras) que se une a MHC de clase II en la mayor parte de los seres humanos. El complejo de dendrímero derivatizado con péptido de unión a DR universal (por ejemplo, aminoácidos 582-599 de toxina del tétanos, PADRE, etc.) y antígeno (o ADN o ARN que codifica para el/los antígeno(s)) se usa para administrar tales cargas al interior de células de una manera que procesan y presentan el antígeno específicamente en las APC en preparaciones de PBMC, y las convierten en APC autólogas que expresan antígeno (denominadas en el presente documento “células diana”). Por tanto, son particularmente útiles para determinar si un sujeto que ha recibido una terapia o intervención (por ejemplo, vacunación) para tratar o prevenir una patología (por ejemplo, infección) ha montado una respuesta inmunitaria frente a la terapia o intervención, así como cuantificar la respuesta inmunitaria. Si el sujeto ha montado una respuesta inmunitaria frente a la terapia o intervención, el sujeto tendrá células T reactivas, cebadas (sensibilizadas) que son específicas para la terapia o intervención. Por ejemplo, si un sujeto recibe una vacunación para influenza, conteniendo la vacuna al menos un antígeno de influenza, el sujeto desarrollará células T reactivas, cebadas (sensibilizadas) que son específicas para el antígeno de influenza si la vacuna fue satisfactoria en fomentar una respuesta inmunitaria contra el antígeno de influenza en el sujeto. Determinar si un sujeto tiene células T reactivas, cebadas (sensibilizadas) que son específicas para la terapia o intervención implica normalmente examinar una o más muestras del sujeto para determinar los niveles de citocinas (por ejemplo, IFN-y), factores de crecimiento, marcadores celulares, enzimas, quimiocinas o cualquier otra molécula o marcador que es indicativo de una respuesta inmunitaria frente a una terapia o intervención particular. Para correlacionar una respuesta inmunitaria específica con la eficacia de una vacuna u otra terapia o intervención, puede usarse cualquier ensayo adecuado que mide la activación y proliferación de células T cooperadoras o células B y/o los niveles y la expresión de una o más moléculas o marcadores (por ejemplo, citocinas) que son indicativos de una respuesta inmunitaria frente a la vacuna u otra terapia o intervención. Los ejemplos de tales ensayos incluyen ensayos de CTL y de citocinas. Las muestras que se obtienen a partir de un sujeto para analizar los niveles de citocinas (por ejemplo, IFN-y, interleucinas, quimiocinas), factores de crecimiento, marcadores celulares, enzimas, quimiocinas o cualquier otra molécula o marcador que es indicativo de una respuesta inmunitaria frente a una terapia o intervención particular, incluyen generalmente PBMC, sangre, esplenocitos o células de ganglios linfáticos. Una terapia o intervención tal como se describe en el presente documento incluye, por ejemplo, cualquier terapia adyuvante, cualquier inmunoterapia para potenciar o reducir respuestas inmunitarias, cualquier terapia basada en células, etc.
La administración específica de antígeno o ácido nucleico que codifica para antígeno a APC para evaluar la eficacia de una vacuna u otra terapia o intervención tal como se describe en el presente documento da como resultado la imitación de la presentación de antígeno nativa y permite mediciones más precisas y relevantes de respuestas inmunitarias de mamíferos (por ejemplo, seres humanos) frente a antígenos, infecciones, inmunizaciones y otras terapias e intervenciones. Un dendrímero derivatizado con péptido de unión a DR universal complejado con antígenos o ácido nucleico (por ejemplo, plásmido) que codifica para un antígeno tal como se describe en el presente documento selecciona específicamente como diana APC, y las convierte en APC que presentan el antígeno (denominadas en el presente documento células diana). Una de las ventajas de las composiciones, kits, métodos y ensayos descritos en el presente documento se basa en el hecho de que una respuesta inmunitaria específica de antígeno únicamente puede evaluarse de manera precisa cuando el antígeno se presenta en su configuración nativa. A diferencia de las respuestas de anticuerpos, la monitorización inmunológica de células T (por ejemplo, tras la vacunación), actualmente, no es bastante precisa, no se correlaciona con la eficacia de vacunas y otras intervenciones, y requiere cócteles de péptidos artificiales restringidos a MHC costosos, inciertos e incompletos. Los métodos actuales no son útiles para tomar las decisiones correctas para avanzar a ensayos de fase II o III con un fármaco o producto biológico particular, ya que algunas veces son engañosos, contribuyendo al fallo de muchos ensayos clínicos altamente costosos. Los ensayos actuales miden respuestas de CTL mediante ensayos in vitro en los que se someten a prueba respuestas inmunitarias frente a péptidos relacionados, antígenos recombinantes, proteínas o virus inactivos. En cambio, las composiciones, kits, ensayos y métodos descritos en el presente documento incluyen un péptido específico de clase II universal (por ejemplo, epítopos de células T cooperadoras universales tales como SSVFNVVNSSIGLIM (SEQ ID NO: 29) de Plasmodium falciparum, FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 30) de toxoide del tétanos o PADRE, un péptido sintético, por indicar sólo unos pocos ejemplos) complejado con un dendrímero y un antígeno o un ácido nucleico que codifica para un antígeno que, cuando se transfecta a PBMC de mamífero, da como resultado una respuesta celular amplia y representativa frente al antígeno si el huésped del que se extraen las PBMC se había expuesto previamente al antígeno (por ejemplo, mediante vacunación). La administración específica de antígeno o ADN de plásmido da como resultado el procesamiento y la presentación de epítopos asociados a antígeno en el contexto de MHC propio que deben representar posibles péptidos o asemejarse a un repertorio de péptidos naturales derivado a partir de un antígeno de interés. Tales a Pc autólogas (a partir de PBMC) actúan como dianas para evaluar respuestas efectoras (de células T). Las respuestas inmunitarias mediadas por células totales pueden evaluarse usando métodos convencionales incluyendo, por ejemplo, un ensayo ELISpot de IFNy. Las composiciones, kits, ensayos y métodos descritos en el presente documento proporcionan un enfoque de bajo coste para la rápida generación de reactivos y la determinación de perfil más precisa de respuestas inmunológicas frente a infección, inmunización y otras intervenciones terapéuticas.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido habitualmente por un experto habitual en la técnica a la que pertenece esta invención.
Tal como se usa en el presente documento, un “ácido nucleico” o una “molécula de ácido nucleico” significa una cadena de dos o más nucleótidos tal como ARN (ácido ribonucleico) y ADN (ácido desoxirribonucleico), y nucleótidos químicamente modificados. Una molécula de ácido nucleico “purificada” es una que está sustancialmente separada de otras secuencias de ácido nucleico en una célula u organismo en el que se produce de manera natural el ácido nucleico (por ejemplo, libre al 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 100% de contaminantes). Los términos incluyen, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico recombinante incorporada en un vector, un plásmido, un virus o un genoma de una procariota o eucariota. Los ejemplos de ácidos nucleicos purificados incluyen ADNc, fragmentos de ácidos nucleicos genómicos, ácidos nucleicos producidos mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), ácidos nucleicos formados mediante tratamiento con enzimas de restricción de ácidos nucleicos genómicos, ácidos nucleicos recombinantes y moléculas de ácido nucleico químicamente sintetizadas. Una molécula de ácido nucleico “recombinante” es una preparada mediante una combinación artificial de dos segmentos de secuencia de otro modo separados, por ejemplo, mediante síntesis química o mediante la manipulación de segmentos aislados de ácidos nucleicos mediante técnicas de ingeniería genética.
Cuando se hace referencia a un residuo de aminoácido en un péptido, oligopéptido o proteína, los términos “residuo de aminoácido”, “aminoácido” y “residuo” se usan de manera intercambiable y, tal como se usan en el presente documento, significan un aminoácido o mimético de aminoácido unido de manera covalente a al menos otro aminoácido o mimético de aminoácido mediante un enlace amida o mimético de enlace amida.
Tal como se usa en el presente documento, “proteína” y “polipéptido” se usan como sinónimos para querer decir cualquier cadena de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, independientemente de la longitud o modificación postraduccional, por ejemplo, glicosilación o fosforilación.
Cuando se hace referencia a una molécula de ácido nucleico, polipéptido o patógeno infeccioso, el término “nativo” se refiere a un ácido nucleico, polipéptido o patógeno infeccioso que se produce de manera natural (por ejemplo, uno de tipo natural (WT)).
Tal como se usa en el presente documento, el término “antígeno” o “inmunógeno” significa una molécula que se reconoce por y a la que se une específicamente un anticuerpo.
Cuando se hace referencia a un epítopo (por ejemplo, epítopo de células T cooperadoras), por actividad biológica quiere decirse la capacidad para unirse a una molécula de MHC apropiada.
Los términos “unión específica” y “se une específicamente” se refieren a la unión que se produce entre especies emparejadas tales como enzima/sustrato, receptor/agonista, anticuerpo/antígeno, etc., y que puede mediarse por interacciones covalentes o no covalentes o una combinación de interacciones covalentes y no covalentes. Cuando la interacción de las dos especies produce un complejo unido de manera no covalente, la unión que se produce es normalmente electrostática, por enlaces de hidrógeno o el resultado de interacciones lipófilas. Por consiguiente, la “unión específica” se produce entre unas especies emparejadas en las que hay una interacción entre las dos que produce un complejo unido que tiene las características de una interacción de anticuerpo/antígeno o enzima/sustrato. En particular, la unión específica se caracteriza por la unión de un miembro de un par a una especie particular y a ninguna otra especie dentro de la familia de compuestos a la que pertenece el miembro correspondiente del miembro de unión.
Tal como se usan en el presente documento, los términos “epítopos de pan-DR”, “epítopo de unión a pan-HLA-DR”, “PADRE” y “péptidos de PADRE” significan un péptido de entre aproximadamente 4 y aproximadamente 20 residuos que puede unirse a al menos aproximadamente 7 de los 12 alelos de DR más comunes (DR1, 2w2b, 2w2a, 3, 4w4, 4wd4, 5, 7, 52a, 52b, 52c y 53) con alta afinidad. “Alta afinidad” se define en el presente documento como unión con una CI50% de menos de 200 nm. Por ejemplo, la unión de alta afinidad incluye unión con una CI50% de menos de 3100 nM. Para la unión a MHC de clase II, un umbral de afinidad de unión de 1.000 nm es típico, y una afinidad de unión de menos de 100 nm se considera generalmente unión de alta afinidad. La construcción y el uso de péptidos de PADRE se describen en detalle en la patente estadounidense n.° 5.736.142 que se incorpora en el presente documento como referencia.
Tal como se usa en el presente documento, la frase “péptido de unión a DR” significa un péptido que se une a MHC de clase II, por ejemplo, un péptido que se une a MHC de clase II humano.
Mediante la frase “péptido de unión a DR universal” quiere decirse un péptido que se une a cualquier parte en moléculas de MHC de clase II, por ejemplo, a un gran número de MHC de seres humanos y/o ratones y/o primates no humanos.
Un “péptido de células T cooperadoras” tal como se usa en el presente documento se refiere a un péptido reconocido por el receptor de célula T de células T cooperadoras. Por ejemplo, los péptidos de PADRE descritos en el presente documento son péptidos de células T cooperadoras. Un péptido de células T cooperadoras es un ejemplo de un péptido de unión a DR universal.
Tal como se usa en el presente documento, el término “dendrímero” significa una macromolécula polimérica altamente ramificada, cargada (por ejemplo, cargada positivamente, cargada negativamente) con una forma aproximadamente esférica. Un ejemplo de un dendrímero polimérico altamente ramificado cargado positivamente es un dendrímero de PAMAM. Mediante los términos “dendrímero de PAMAM” y “dendrímero de poliamidoamina” quiere decirse un tipo de dendrímero en el que aminas terciarias están ubicadas en puntos de ramificación y se realizan conexiones entre capas estructurales mediante grupos funcionales amida.
Mediante los términos “dendrímero de PAMAM” y “dendrímero de poliamidoamina” quiere decirse un tipo de dendrímero en el que aminas terciarias están ubicadas en puntos de ramificación y se realizan conexiones entre capas estructurales mediante grupos funcionales amida. Los dendrímeros de PAMAM muestran muchas cargas positivas en sus superficies.
Mediante el término “dendrímero derivatizado” quiere decirse un dendrímero que tiene uno o más grupos funcionales conjugados a su superficie.
Un “dendrímero derivatizado con péptido de unión a DR universal” es un nanoconstructo en el que uno o más péptidos de unión a DR universales se unen de manera covalente a los grupos funcionales sobre la superficie de un dendrímero polimérico altamente ramificado cargado (por ejemplo, cargado positivamente) (por ejemplo, un dendrímero de PAMAM).
Un “dendrímero derivatizado con PADRE” o “PADRE-dendrímero” es un nanoconstructo en el que uno o más péptidos de PADRE están unidos de manera covalente a los grupos funcionales sobre la superficie de un dendrímero polimérico altamente ramificado cargado (por ejemplo, cargado positivamente) (por ejemplo, un dendrímero de PAMAM).
Mediante el término “conjugado” quiere decirse cuando una molécula o agente está física o químicamente acoplado o adherido a otra molécula o agente. Los ejemplos de conjugación incluyen unión covalente y complejación electrostática. Los términos “complejado”, “complejado con” y “conjugado” se usan de manera intercambiable en el presente documento.
Tal como se usa en el presente documento, la frase “identidad de secuencia” significa el porcentaje de subunidades idénticas en posiciones correspondientes en dos secuencias (por ejemplo, secuencias de ácido nucleico, secuencias de aminoácidos) cuando las dos secuencias se alinean para maximizar la coincidencia de subunidades, es decir, teniendo en cuenta huecos e inserciones. La identidad de secuencia puede medirse usando software de análisis de secuencias (por ejemplo, el paquete de software de análisis de secuencias de Accelrys CGC, San Diego, CA). Las frases “aislado” o “biológicamente puro” se refieren a material que está sustancial o esencialmente libre de componentes que normalmente lo acompañan tal como se encuentra en su estado nativo.
Tal como se usa en el presente documento, el término “nanopartícula” significa una partícula microscópica cuyo tamaño se mide en nanómetros. Por ejemplo, una nanopartícula es un conjugado de PADRE-dendrímero o una partícula que combina varios conjugados de PADRE-dendrímero y material de ácido nucleico o aminoácidos con un diámetro total en el intervalo de aproximadamente 2-500 nm.
Se pretende que el término “anticuerpo” incluya anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (AcM), anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id) frente a anticuerpos que pueden estar marcados en forma soluble o unida, así como fragmentos, regiones o derivados de los mismos, proporcionados mediante cualquier técnica conocida, tales como, pero sin limitarse a, escisión enzimática, síntesis peptídica o técnicas recombinantes.
Tal como se usa en el presente documento el término “adyuvante” significa cualquier material que modula para potenciar la respuesta inmunitaria humoral y/o celular.
Tal como se usan en el presente documento, se considera que los términos “presentado” o “expuesto en superficie” son sinónimos, y se refieren a antígenos u otras moléculas que están presentes (por ejemplo, accesibles para reconocimiento de sitio inmunitario) en la superficie externa de una estructura tal como una nanopartícula (por ejemplo, PADRE-dendrímero).
Mediante el término “multivalente” quiere decirse que se presenta más de una copia o tipo de antígeno o molécula sobre una nanopartícula.
Tal como se usa en el presente documento, “vacuna” incluye todas las vacunas profilácticas y terapéuticas.
Tal como se usa en el presente documento, el término “producto biológico” se refiere a una amplia gama de especialidades farmacéuticas tales como vacunas, sangre y hemoderivados, productos alergénicos, células somáticas, genes que expresan un producto en terapia génica, tejidos, y proteínas terapéuticas recombinantes creadas mediante tecnología de ADN recombinante, anticuerpos, fármacos sintéticos y péptidos largos (polipéptidos), compuestos sintéticos y (glicol)proteínas.
Mediante la frase “respuesta inmunitaria” quiere decirse inducción de respuestas mediadas por anticuerpos y/o células inmunitarias específicas contra un antígeno o antígenos o alérgeno(s) o fármaco o producto biológico. La inducción de una respuesta inmunitaria depende de muchos factores, incluyendo la constitución inmunogénica del organismo expuesto, la composición química y la configuración del antígeno o alérgeno o fármaco o producto biológico, y la manera y el periodo de administración del antígeno o alérgeno o fármaco o producto biológico. Una respuesta inmunitaria tiene muchas facetas, algunas de las cuales se muestran por las células del sistema inmunitario (por ejemplo, linfocitos B, linfocitos T, macrófagos y células plasmáticas). Las células del sistema inmunitario pueden participar en la respuesta inmunitaria mediante interacción con un antígeno o alérgeno u otras células del sistema inmunitario, la liberación de citocinas y la reactividad frente a esas citocinas. Las respuestas inmunitarias se dividen generalmente en dos categorías principales, humorales y mediadas por células. El componente humoral de la respuesta inmunitaria incluye la producción de anticuerpos específicos para un antígeno o alérgeno o fármaco o producto biológico. El componente mediado por célula incluye la generación de hipersensibilidad de tipo retardado y células efectoras citotóxicas frente al antígeno o alérgeno.
Tal como se usa en el presente documento, el término “tratamiento” se define como la aplicación o administración de un agente terapéutico a un paciente, o la aplicación o administración del agente terapéutico a un tejido o línea celular aislado a partir de un paciente, que tiene una enfermedad, un síntoma de enfermedad o una predisposición a una enfermedad, con el propósito de curar, sanar, aliviar, calmar, alterar, remediar, recuperar, mejorar o afectar a la enfermedad, los síntomas de enfermedad o la predisposición a la enfermedad.
Los términos “paciente”, “sujeto” e “individuo” se usan de manera intercambiable en el presente documento, y significan un sujeto mamífero que va a tratarse, que se ha tratado o que está considerándose para el tratamiento, prefiriéndose pacientes humanos. En algunos casos, los métodos, kits, composiciones y ensayos descritos en el presente documento encuentran uso en animales experimentales, en aplicaciones veterinarias y en el desarrollo de modelos de animales para enfermedad, incluyendo, pero sin limitarse a, roedores incluyendo ratones, ratas y hámsteres, así como primates no humanos.
Aunque composiciones, kits, ensayos y métodos similares o equivalentes a los descritos en el presente documento pueden usarse en la práctica o pruebas de la presente invención, a continuación, se describen composiciones, kits, ensayos y métodos adecuados.
En caso de conflicto, dominará la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Las realizaciones particulares comentadas a continuación sólo son ilustrativas y no se pretende que sean limitativas.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un par de esquemas que muestran el PADRE-dendrímero que puede mezclarse con plásmido o unirse a un antígeno peptídico o polipeptídico para seleccionar como diana A p C . La figura 1 ilustra que los PADRE-dendrímeros descritos en el presente documento proporcionan una plataforma en la que puede incorporarse cualquier antígeno de interés o ácido nucleico que codifica para cualquier antígeno de interés. Los PADRE-dendrímeros descritos en el presente documento se captan por APC profesionales.
La figura 2 es una serie de imágenes de citometría de flujo de gráfico de puntos de análisis de células B humanas que muestran la administración in vitro de PADRE-dendrímeros complejados con una secuencia de ácido nucleico corta marcada con un fluorocromo rojo. Este ácido nucleico es un oligómero de ARNbc marcado con rojo diseñado para su uso en análisis de iARN para facilitar la evaluación y optimización de administración de oligonucleótidos de ARNbc al interior de células de mamífero. Se cultivaron conjuntamente células con los complejos de PADRE-dendrímeros/multinucleótido o controles durante 4 horas tras lo cual se retiraron los medios y se añadieron medios recientes. Las imágenes muestran la administración de oligómero de ARNbc marcado con Alexa Fuor al interior de células B humanas purificadas. La imagen inferior en la cuarta columna de imágenes muestra la administración del oligómero en aproximadamente el 92% de las células.
La figura 4 es una serie de histogramas de citometría de flujo que muestran la expresión de GFP en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas, panel inferior, y en células B humanas, panel superior, tras el cultivo conjunto de plásmido de GFP (5 |ig) complejado con dendrímero-PADRE. El complejo de dendrímero/plásmido de GFP se usó como control, histogramas de la izquierda.
La figura 5 es una serie de gráficos de puntos de citometría de flujo que muestran la administración in vitro de una proteína, albúmina-FITC, al interior de células B humanas mediante PDD. Las imágenes de la izquierda muestran la administración de PDD/albúmina-FITC al interior de células B humanas purificadas. Se recogieron células B humanas purificadas y se cultivaron conjuntamente con PDD/albúmina-FITC. Los histogramas de la izquierda muestran la administración de albúmina-FITC en células B humanas la mañana siguiente a PDD/albúmina-FITC añadido a las células B humanas. El histograma superior muestra células B solas, el histograma en el centro muestra el complejo de dendrímero/albúmina-FITC más células B y el histograma inferior representa los resultados de complejo de PDD/albúmina-FITC añadido a células B humanas. La imagen de la derecha es la imagen de microscopio de fluorescencia de la captación de albúmina por células B una hora tras la adición de complejo de PDD/albúmina-FITC.
La figura 6 es una serie de gráficos de puntos de citometría de flujo que muestran la selección como diana in vivo de DC en el ganglio linfático. La imagen de la izquierda representa un esquema de una línea temporal para la inyección y extirpación y análisis de ganglios linfáticos y la imagen de la derecha muestra un par de gráficos de puntos de citometría de flujo tras el análisis de datos obtenidos a partir de células del ganglio linfático adyacente al sitio de inyección de PDD/plásmido de GFP o dendrímero/plásmido de GFP frente a ganglio linfático no expuesto. Estas imágenes muestran la eficacia de la selección como diana in vivo por PADRE-dendrímero de DC de ratón y células B en un sitio de inyección próximo al ganglio linfático. Se tiñeron células linfáticas con CD11c (marcador de DC), MHC de clase II y CD20 (marcador de células B). Los histogramas en la parte superior derecha muestran que la inyección de dendrímero/plásmido de GFP dio como resultado la expresión de GFP en aproximadamente el 6% de las DC mientras que el gráfico de puntos inferior muestra claramente que la inyección de PDD/plásmido de GFP dio como resultado la expresión de g F p en > 70% de las DC.
La figura 7 es un par de gráficos que muestran que DRHA, un dendrímero decorado con un epítopo de células T cooperadoras diferente, que selecciona como diana in vivo DC en el ganglio linfático muestra que DRHA facilita la transfección de GFP al interior de DC. Este experimento es similar al descrito en la figura 6 con la diferencia de que se usaron ratones Balb/c junto con dendrímero conjugado con péptido de HA restringido para Iad. El ganglio linfático adyacente al sitio de inyección de DRHA/plásmido de GFP o dendrímero/plásmido de GFP y un ganglio linfático no expuesto se extirparon en el día 5 tras la inyección de DRHA/plásmido de GFP o dendrímero/plásmido de GFP. Los diagramas muestran los resultados del análisis de citometría de flujo de datos obtenidos a partir de células del ganglio linfático tras teñir con CD11c (marcador de DC) para DC. El panel superior muestra el número de DC positivas para GFP encontradas drenando ganglios linfáticos de ratones tratados tal como se indica. El panel inferior muestra la intensidad de fluorescencia media de GFP dentro de las DC. Estos resultados indican claramente no sólo que DRHA aumenta el número de DC transfectadas in vivo, sino además el número de moléculas de plásmido que entran en las células.
La figura 8 es una microfotografía de células B humanas transfectadas con PADRE-dendrímero complejado con un oligómero de ARNbc marcado con rojo (Alexa Fluor).
La figura 9 es un par de microfotografías de PBMC de babuinos transfectadas con dendrímero complejado con un oligómero de ARNbc marcado con rojo (Alexa Fluor) (panel izquierdo) y células transfectadas con PADRE-dendrímero complejado con un oligómero de ARNbc marcado con rojo (Alexa Fluor) (panel derecho). Las imágenes de microscopio de fluorescencia se tomaron dos horas tras la adición de PDD/ARNbc-Alexa-Fluor o complejo de control a PBMC de babuino. La imagen muestra la alta eficacia de la administración dirigida de multinucleótidos a PBMC de mono mediante PDD.
La figura 10 es un par de microfotografías de PBMC de babuino transfectadas con dendrímero complejado con plásmido que codifica para GFP (panel izquierdo) y células transfectadas con PADRE-dendrímero complejado con plásmido que codifica para GFP (panel derecho). PBMC de babuino transfectadas con dendrímero complejado con plásmido de GFP (panel izquierdo) y células transfectadas con PADRE-dendrímero complejado con plásmido de GFP (panel derecho). Las imágenes de microscopio de fluorescencia se tomaron un día tras la adición de PDD/plásmido de GFP o complejo de control a PBMC de babuino. La imagen muestra la alta eficacia de la administración dirigida del plásmido y la expresión del gen codificado por el plásmido mediante PDD.
La figura 11 es una presentación esquemática de un protocolo para la transfección in vitro de APC humanas entre una población de PBMC con un dendrímero derivatizado con péptido de unión a DR universal tal como se describe en el presente documento. Estas transfecciones dan como resultado el procesamiento y la presentación de epítopos de células T en APC, convirtiéndolas en APC sinérgicas que expresan el antígeno de interés (denominadas en el presente documento “células diana”).
La figura 12 es una serie de gráficos que muestran la viabilidad de usar ARN mensajero como fuente de antígeno para la monitorización inmunológica de la respuesta inmunitaria. En resumen, se aisló ARN mensajero (ARNm) a partir del tumor de mama murino Balb/c 4T1 que expresaba el antígeno de hemaglutinina como antígeno asociado a tumor artificial. Se cargó ARNm en dendrímero conjugado con HA o, como control, en dendrímero sin conjugar. Los dendrímeros conjugados con ARNm-HA (A), los dendrímeros conjugados con ARNm (B) o el ARNm solo (C) se usaron para transfectar esplenocitos a diferentes concentraciones. 24 horas después, se lavaron las células y se incubaron con células T c D8+ singénicas frente al epítopo de hemaglutinina restringido a MHC de clase I. Se usó ELISA de IFN-gamma (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas) como lectura de la actividad de CTL. Los datos muestran claramente que incluso usando una cantidad extremadamente baja de ARN (4 ng), el uso de dendrímero conjugado con HA (A) permitió la detección funcional de la actividad de CTL mientras que sólo se obtienen resultados moderados con los controles (B y C). La figura 12D es un diagrama esquemático del experimento para evaluar la respuesta inmunitaria.
La figura 13 es un gráfico que muestra resultados de un experimento en el que se transfectaron esplenocitos con 4 ng de ARN poliA y se usaron como APC para células T clonotípicas.
La figura 14 es una fotografía de un gel electroforético que muestra A) espectros UV de dendrímero, PADRE y dendrímero-PADRE. Se realizaron espectros UV de péptido-dendrímero mediante métodos convencionales. El pico de fenilalanina observado para el dendrímero de G5-PADRE muestra que el péptido, PADRE, se añade al dendrímero. B) Análisis de movilidad electroforética y de electroforesis en gel de agarosa de complejo de dendrímero/ADN. El análisis de la formación de complejo y la unión de PDD a ADN se realizó examinando el retardo en la migración del ADN de plásmido durante la electroforesis en gel de agarosa. Se sometieron a prueba complejos de dendrímero derivatizado con péptido (PDD)/plásmido para determinar su retención de ADN en electroforesis en gel. Se realizó la electroforesis en gel para PDD/plásmido y controles: ADN solo, dendrímero solo y muestras de PDD/plásmido a diversas razones de (P:N), 1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 1:20. El PDD pudo retener plásmido de ADN en razones > (1:2).
La figura 15 es una serie de diagramas de gráficos de puntos de citometría de flujo que muestran la administración específica de células de proteínas/antígenos. Se administró PDD/albúmina-FlTC al interior de células B humanas purificadas. Se cultivaron conjuntamente PBMC con cualquiera de albúmina-FITC sola, dendrímero/albúmina-FITC o dendrímero-PADRE (PDD)/albúmina-FITC. Veinticuatro horas tras la incubación en una incubadora a 37°C/CÜ2, se analizaron las células con cada tratamiento mediante citometría de flujo y se controló para células B humanas usando anticuerpo anti-CD19-APC. Se usó una razón de 1:10 (p:p) de albúmina-FITC y PDD o dendrímero. Los altos niveles de administración (73%) de PDD/albúmina-FITC en células B humanas muestran claramente que la plataforma puede usarse con proteínas/polipéptidos o sus antígenos similares.
La figura 16 es una serie de histogramas de citometría de flujo que muestran la transfección in vitro de células B humanas (CD19), panel superior, y población de esplenocitos de ratón, panel inferior, con PDD PADRE-dendrímero (PDD)/GFP-plásmido. En el panel superior, se cultivaron conjuntamente células B humanas purificadas con cualquiera de plásmido de GFP solo, dendrímero/plásmido de GFP o dendrímero-PADRE (PDD)/plásmido de GFP a razones de P:N indicadas. Veinticuatro horas tras la incubación en una incubadora a 37°C/CO2, se analizaron células con cada tratamiento mediante citometría de flujo para determinar la expresión de proteína GFP. Los altos niveles de administración (77%) de PDD/plásmido de g Fp en células B humanas muestran claramente que la plataforma administra eficazmente plásmidos al interior de células B y da como resultado la expresión de proteína/antígeno codificado. El panel inferior muestra un diagrama de gráfico de puntos de citometría de flujo cuando se realizaron experimentos similares con esplenocitos de ratones C57BL no expuestos y muestra de manera similar la transfección con GFP de células positivas para CD-19 (células B).
La figura 17 es un gráfico que muestra la generación de APC que expresan antígeno. Se inmunizaron ratones C57BL hembra de seis a ocho semanas de edad, en grupos de cinco, dos veces con proteína OVA en TiterMax (Sigma). Diez días tras la última inmunización, se extrajeron los esplenocitos de ratones inmunizados y se sembraron en placa a 1 millón de células por pocillo en cuatro pocillos de una placa de 24 pocillos en RPMI con FBS al 10%, se marcaron los pocillos como “medios solos”, “PADRE-dendrímero (PDD) solo”, “PADRE-dendrímero (PDD)/plásmido de control” y “PADRE-dendrímero (PDD)/plásmido de OVA”. Se añadieron cinco microgramos de plásmidos complejados con PADRE-dendrímero (en una razón de 1:10) a pocillos apropiados (células diana). La mañana siguiente se añadió cada célula tratada/transfectada a esplenocitos sin tratar del mismo ratón en pocillos separados. Veinticuatro horas tras la estimulación, se detectaron los niveles de INF-y usando ELISA (Thermo) en los sobrenadantes. Los niveles de IFN fueron significativamente (valor de P < 0,006) superiores en pocillos que contenían esplenocitos tratados con [PDD/plásmido de OVA] en comparación con todos los controles, lo que muestra que el kit puede usarse para la evaluación de respuestas de células T tras la vacunación. Se verificó la inducción de respuestas de células T mediante experimentos de exposición usando 50.000 B16-OVA, así como mediante estimulación de péptido de OVA (no mostrado). La figura 17 muestra que se midió la eficacia de vacunación en ratones; obsérvense las diferencias significativas en los niveles de IFN-y en ratones vacunados.
Descripción detallada
En el presente documento se describen métodos basados en nanopartículas dirigidos, ensayos, kits y composiciones para la transfección de APC con un antígeno o un ácido nucleico que codifica para un antígeno en una muestra de PBMC humanas (o una muestra de ser humano que contiene p Bm C) que da como resultado el procesamiento y la presentación de un amplio repertorio de epítopos de antígeno sobre la superficie de las APC. Estas APC (denominadas en el presente documento “células diana”) proporcionan epítopos de patógeno apropiadamente configurados (es decir, nativos) con aplicabilidad universal para la monitorización precisa de respuestas inmunitarias celulares frente a cualquier vacuna u otra terapia o intervención. Las nanopartículas se complejan con un antígeno o un ácido nucleico que codifica para un antígeno, y un dendrímero derivatizado con péptido de unión a DR universal (por ejemplo, un epítopo de células T cooperadoras) que se une específicamente a moléculas de MHC de clase II expresadas en APC para administrar epítopos específicos del antígeno frente al cual está vacunado un sujeto, por ejemplo. Los métodos basados en nanopartículas dirigidos, ensayos, kits y composiciones también pueden usarse para examinar la inmunotoxicidad de un producto biológico o fármaco en un sujeto o población de sujetos. Los ensayos, kits, composiciones y métodos descritos en el presente documento proporcionan un enfoque de bajo coste para la rápida generación de reactivos y la determinación de perfil precisa de respuestas inmunológicas frente a infecciones, inmunizaciones u otras terapias o intervenciones, así como un enfoque de bajo coste y eficaz para examinar la inmunotoxicidad de un producto biológico o fármaco en un sujeto o población de sujetos.
En una composición típica, un dendrímero polimérico altamente ramificado cargado (por ejemplo, cargado positivamente) se conjuga a un péptido de unión a Pan DR universal, de direccionamiento a MHC, o una combinación de tales péptidos (por ejemplo, un epítopo tal como el epítopo PADRE o de células T cooperadoras HA de influenza: SFERFEIFPKEC (SEQ ID NO: 28), etc.) y se conjuga o se une a un antígeno o alérgeno particular o un ácido nucleico (por ejemplo, ADN, ARN) que codifica para el antígeno frente al que va a vacunarse o se ha vacunado un sujeto. El antígeno puede ser una proteína o péptido de cualquier origen patógeno, por ejemplo, origen bacteriano, fúngico, protozoario o viral, o un fragmento derivado de estos antígenos, un hidrato de carbono, o un péptido mimético de hidrato de carbono. Un dendrímero polimérico altamente ramificado cargado (por ejemplo, cargado positivamente) puede conjugarse a dos o más antígenos o alérgenos diferentes y, de manera similar, puede conjugarse a dos o más ácidos nucleicos que codifican cada uno para un antígeno diferente. El dendrímero forma un complejo (conjugación) con antígenos (ácidos nucleicos o proteínas) basándose en la carga opuesta del dendrímero (positiva) y la del antígeno (negativa) o la conjugación puede ser una unión química covalente.
En una realización, un método basado en nanopartículas para administrar antígenos a APC para evaluar o monitorizar una respuesta inmunitaria en un sujeto (por ejemplo, una respuesta inmunitaria frente a una vacuna, frente a un producto biológico o fármaco, etc.) tal como se describe en el presente documento incluye conjugar un ácido nucleico (por ejemplo, una secuencia de ADN o ARN) que codifica para un alérgeno, antígeno o un péptido o polipéptido antigénico a un dendrímero polimérico altamente ramificado cargado (por ejemplo, cargado positivamente) (por ejemplo, dendrímero derivatizado con PADRE (PDD)) que también se conjuga a al menos un péptido de unión a DR universal/direccionamiento a MHC tal como los indicados a continuación (por ejemplo, en la tabla 1). Los plásmidos cargados negativamente se unen de manera natural al péptido de unión a DR universaldendrímeros (por ejemplo, PADRE-dendrímeros) cargados positivamente, mientras que el alérgeno o los antígenos peptídicos o polipeptídicos pueden unirse químicamente al péptido de unión a DR universal-dendrímeros si no están cargados negativamente. En otras realizaciones, un dendrímero está cargado negativamente para unirse a proteínas y péptidos cargados positivamente. Pueden conjugarse alérgeno(s), antígeno(s) o ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) para un(os) antígeno(s) expuesto(s) en superficie a los dendrímeros mediante cualquier medio adecuado conocido en la técnica. Los métodos de conjugación incluyen complejación química, que puede ser de naturaleza o bien iónica o bien no iónica, unión electrostática o unión covalente.
En un método típico de detección de una respuesta inmunitaria frente a una terapia o intervención en un sujeto, se obtienen muestras a partir del sujeto antes y después de recibir la terapia o intervención. Por ejemplo, si la terapia o intervención es vacunación, se obtiene una muestra a partir del sujeto antes de la vacunación, y se obtiene una muestra a partir del sujeto después de que el sujeto se haya vacunado. En un método de detección de una respuesta inmunitaria frente a una vacuna que incluye al menos un antígeno en un sujeto, el método incluye las siguientes diversas etapas. Se obtiene una muestra o preparación de PBMC preinmunitarias a partir del sujeto antes de que el sujeto se haya vacunado (denominada en el presente documento “una primera muestra”). La PBMC preinmunitarias se obtienen mediante métodos convencionales y somete a criconservación en DMSO a concentraciones de aproximadamente 5 millones de células por vial. Pueden almacenarse PBMC en nitrógeno líquido o congelador a -80°C dependiendo de la duración de la vacunación. En el día del experimento, se descongelan las PBMC preinmunitarias y se cultivan en condiciones convencionales (por ejemplo, descongelación rápida a 37°C seguido por una etapa de lavado para eliminar DMSO centrifugando las células a 400g durante 5 min). Después se tratan las células preinmunitarias con PDD/antígeno tal como se explica en las siguientes secciones. Se divide esta primera muestra en al menos dos porciones, denominadas en el presente documento una primera porción de la primera muestra (también denominada “células diana”), y una segunda porción de la primera muestra (también denominada “células efectoras”). Cada porción incluye normalmente aproximadamente 5 millones de PBMC (por ejemplo, 1 millón, 2 millones, 3 millones, 4 millones, 5 millones, 6 millones de PBC, etc.). La primera porción de la primera muestra se trata (se pone en contacto, se mezcla) con dendrímeros poliméricos altamente ramificados conjugados a un péptido de unión a DR universal y de direccionamiento a MHC tal como se describe en el presente documento. Los dendrímeros también se conjugan al al menos un antígeno o un ácido nucleico que codifica para el al menos un antígeno. Los dendrímeros conjugados a un péptido de unión a DR universal y de direccionamiento a MHC y al menos un antígeno o un ácido nucleico que codifica para el al menos un antígeno se preparan tal como se describe en el presente documento. Tras añadirse a la primera porción de la primera muestra, los dendrímeros entran en las APC, y las APC procesan y presentan el antígeno sobre sus superficies en combinación con moléculas de MHC de clase II. Las APC resultantes se denominan en el presente documento “células diana”. Las PBMC pueden congelarse en DMSO usando métodos convencionales de congelación de PBMC, y estas PBMC pueden usarse como referencia (referencia de fondo de niveles por defecto de respuestas inmunitarias para comparación) de respuestas de células T antes de la vacunación, inmunoterapia u otras intervenciones. Las células efectoras y células diana pueden congelarse de manera variable en múltiples alícuotas para su uso futuro.
Las porciones primera y segunda de la primera muestra se incuban en una incubadora a 37°C/CO2 al 5% durante la noche. En algunas realizaciones, puede añadirse mitomicina C a las células diana porque el tratamiento con mitomicina C elimina la proliferación de las APC, y reduce la expresión de citocinas (fondo). En tales realizaciones, tras 24 horas desde el comienzo de la incubación, dependiendo del tipo de ácido nucleico conjugado a los dendrímeros (este periodo de tiempo se optimiza generalmente para diferentes tipos de ácidos nucleicos, por ejemplo, diferentes plásmidos), se añade mitomicina C a la primera porción de la primera muestra (a las células diana) durante aproximadamente 30 minutos. Después, se lavan las porciones primera y segunda de la primera muestra (las células diana y las células efectoras), por ejemplo, con medios recientes, 10 minutos a 400 g. Después se mezclan la primera porción de la primera muestra y la segunda porción de la primera muestra a una o más razones (en uno o más recipientes, pocillos, tubos, placas, etc. diferentes) dando como resultado una primera pluralidad de mezclas (la razón o razones se optimizan generalmente para diferentes tipos de ácidos nucleicos, por ejemplo, diferentes plásmidos). Tras un periodo de incubación adecuado (normalmente 6-48 horas, dependiendo del tipo de ácido nucleico y otras condiciones), se examinan las mezclas para determinar la presencia y los niveles de una o más moléculas o marcadores que son indicativos de una respuesta inmunitaria frente a la terapia o intervención. Esto se realiza normalmente examinando los sobrenadantes de la primera pluralidad de mezclas, por ejemplo, detectando y midiendo el nivel de la molécula o marcador en los sobrenadantes. Por ejemplo, pueden examinarse las mezclas para determinar la presencia de una o más citocinas, y puede determinarse (medirse) el nivel de las una o más citocinas (por ejemplo, IFN-y) en cada mezcla. Puede usarse cualquier ensayo adecuado que mida la activación y proliferación de células T cooperadoras o células B y/o los niveles y la expresión de una o más moléculas o marcadores (por ejemplo, citocinas) que son indicativos de una respuesta inmunitaria frente a la vacuna u otra terapia o intervención. Los ejemplos de tales ensayos incluyen ensayos de CTL y de citocinas.
Después de que el sujeto haya recibido la vacunación, se obtienen PBMC a partir del sujeto, denominadas en el presente documento “segunda muestra”. Dependiendo del tipo de respuesta (efectora o de memoria), se extrae una segunda muestra a partir del individuo, normalmente 7-30 días tras la vacunación o intervención para medir respuestas inmunitarias de células T, sin embargo, las respuestas de células T pueden medirse en cualquier momento posterior para determinar su durabilidad. Se divide esta segunda muestra en al menos dos porciones, denominadas en el presente documento una primera porción de la segunda muestra, y una segunda porción de la segunda muestra. Cada porción incluye normalmente aproximadamente 5 millones de PBMC (por ejemplo, 1 millón, 2 millones, 3 millones, 4 millones, 5 millones, 6 millones de PBC, etc.). La primera porción de la segunda muestra se trata (se pone en contacto, se mezcla) con los dendrímeros descritos anteriormente (es decir, dendrímeros poliméricos altamente ramificados conjugados a un péptido de unión a DR universal y de direccionamiento a MHC y al menos un antígeno o un ácido nucleico que codifica para el al menos un antígeno). Tras añadirse a la primera porción de la segunda muestra, los dendrímeros entran en las APC, y las APC procesan y presentan el antígeno sobre sus superficies en combinación con moléculas de MHC de clase II. Las APC resultantes se denominan en el presente documento “células diana”. Las porciones primera y segunda de la segunda muestra se incuban en una incubadora a 37°C/CÜ2 al 5% durante la noche. Tras 24 horas desde el comienzo de la incubación, dependiendo del tipo de ácido nucleico conjugado a los dendrímeros (este periodo de tiempo se optimiza generalmente para diferentes tipos de ácidos nucleicos, por ejemplo, diferentes plásmidos), se añade mitomicina C a la primera porción de la segunda muestra (a las células diana) durante aproximadamente 30 minutos. Después, se lavan las porciones primera y segunda de la segunda muestra (las células diana y las células efectoras, respectivamente), por ejemplo, con medios recientes, 10 minutos a 400 g. Después se mezclan la primera porción de la segunda muestra y la segunda porción de la segunda muestra a una o más razones (en uno o más recipientes, pocillos, tubos, placas, etc. diferentes) dando como resultado una segunda pluralidad de mezclas (la razón o razones se optimizan generalmente para diferentes tipos de ácidos nucleicos, por ejemplo, diferentes plásmidos) en condiciones que permiten la estimulación de células T específicas existentes en las PBMC del individuo lo cual da como resultado la producción de citocinas así como la proliferación de células T que son específicas para el antígeno si la vacunación u otra intervención o terapia fue eficaz en fomentar una respuesta inmunitaria frente al antígeno. Tras un periodo de incubación adecuado (normalmente 6-48 horas, dependiendo del tipo de ácido nucleico y otras condiciones), se examinan las mezclas para determinar la presencia y el/los nivel(es) de una o más moléculas o marcadores que son indicativos de una respuesta inmunitaria frente a la terapia o intervención. Esto se realiza normalmente examinando los sobrenadantes de la segunda pluralidad de mezclas, por ejemplo, detectando y midiendo el nivel de la molécula o marcador en los sobrenadantes. Por ejemplo, pueden examinarse las mezclas para determinar la presencia de una o más citocinas, y puede determinarse (medirse) el nivel de las una o más citocinas (por ejemplo, IFN-y) en cada mezcla. Tal como se mencionó anteriormente, puede usarse cualquier ensayo adecuado que mida la activación y proliferación de células T cooperadoras o células B y/o los niveles y la expresión de una o más moléculas o marcadores (por ejemplo, citocinas) que son indicativos de una respuesta inmunitaria frente a la vacuna u otra terapia o intervención. Los ejemplos de tales ensayos incluyen ensayos de CTL y de citocinas.
En este método, se compara el nivel de la al menos una molécula o un marcador que es indicativo de una respuesta inmunitaria en la primera pluralidad de mezclas con el nivel de la al menos una molécula o un marcador en la segunda pluralidad de mezclas. Si la vacuna fue eficaz en fomentar una respuesta inmunitaria frente al al menos un antígeno, la segunda porción de la segunda muestra incluirá células T reactivas, cebadas, sensibilizadas específicas para el antígeno. Por tanto, se realiza una comparación entre los niveles de las una o más moléculas o marcadores (por ejemplo, IPN-y) en los sobrenadantes de la primera pluralidad de mezclas, y los sobrenadantes de la segunda pluralidad de mezclas, y se correlacionan niveles superiores de la al menos una molécula o un marcador en la segunda pluralidad de mezclas en comparación con la primera pluralidad de mezclas con una respuesta inmunitaria frente a la vacuna en el sujeto. Por ejemplo, si la vacuna fue eficaz en fomentar una respuesta inmunitaria frente al al menos un antígeno, los niveles de IFN-y serán superiores en los sobrenadantes de la segunda pluralidad de mezclas en comparación con los niveles de IFN-y en la primera pluralidad de mezclas.
Los niveles de las citocinas y/o el grado de proliferación/activación de células T se correlacionan proporcionalmente con las respuestas de células T en las PBMc a partir del sujeto. Por tanto, midiendo los niveles de citocinas y el grado de proliferación/activación de células T, puede determinarse si una vacuna fue o no eficaz en montar una respuesta inmunitaria frente al antígeno, y el grado de la respuesta inmunitaria montada. Por ejemplo, si un sujeto está vacunado con antígeno X, las nanopartículas conjugadas al antígeno frente al cual se preparó la vacuna (antígeno X), o un ácido nucleico que codifica para el antígeno (antígeno X) incubado con PBMC del sujeto provocan que las APC del sujeto procesen y presenten un repertorio de epítopos de células T naturales del antígeno X, un proceso que convierte las PBMC en “células diana” que expresan antígeno X. Tras el cultivo conjunto de las células efectoras con las células diana, si las células efectoras incluyen cualquier célula T reactiva específica para el antígeno, las células T proliferarán y producirán citocinas relacionadas. Los niveles de citocinas (tales como IFN-y) se evalúan mediante cualquier método adecuado, incluyendo ELISA, ELISPOT o ensayo de citocinas intracelulares. El grado de proliferación de células T se cuantifica mediante cualquier ensayo de proliferación tal como i) el ensayo de 3H-timidina que se basa en la incorporación de timidina radiactiva, o mediante ii) ensayos de proliferación de células T basados en éster succinimidílico de diacetato de 5,6-carboxifluoresceína (CFSE) en los que se marcan células con el colorante fluorescente (CFSE). En este último ensayo, las células que proliferan en respuesta al antígeno muestran una reducción en la intensidad de fluorescencia de CFSE, y el porcentaje de células T CD4+ proliferantes puede determinarse usando citometría de flujo, por ejemplo.
En un método de evaluación de la inmunogenicidad de un fármaco o producto biológico, se preparan nanopartículas tal como se describió anteriormente, con la variación de que se complejan con o se conjugan al fármaco, o una porción del mismo, o el producto biológico, o una porción del mismo. Las nanopartículas resultantes se ponen en contacto con las PBMC de al menos un sujeto (por ejemplo, PBMC de 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 100, 1000, 10.000, etc. sujetos) y se someten a ensayo tal como se describió anteriormente (las “células diana” y las “células efectoras” son del mismo individuo). Si se detectan niveles elevados de citocinas y/o niveles elevados o activación de células T o células B o proliferación específicos para el fármaco o producto biológico en un ensayo tal como se describe en el presente documento, se determina que el fármaco o producto biológico es inmunotóxico, porque el fármaco o producto biológico ha provocado una respuesta de células T o células B en el/los sujeto(s). Esta realización es particularmente útil para ayudar a profesionales médicos a determinar si administrar o no el producto biológico o fármaco a un sujeto o una pluralidad de sujetos, así como para ayudar al fabricante del producto biológico o fármaco a determinar la eficacia del producto biológico o fármaco en un sujeto o una población de sujetos.
Un dendrímero conjugado a un péptido de unión a DR universal (por ejemplo, epítopo de células T cooperadoras) tal como se describe en el presente documento puede ser multivalente; puede presentar (complejarse con) más de una copia o tipo de antígeno o ácido nucleico o fármaco o producto biológico o alérgeno sobre su superficie. Las una o más copias o tipos de antígenos o ácidos nucleicos o fármacos o productos biológicos o alérgenos pueden unirse al dendrímero mediante dos o más ligadores o espaciadores independientes, o mediante un ligador o espaciador común. Una nanopartícula para evaluar la eficacia de una vacuna u otra terapia o intervención tal como se describe en el presente documento puede usarse para evaluar la eficacia de cualquier vacuna o terapia o intervención. De manera similar, una nanopartícula para evaluar la eficacia (por ejemplo, la inmunotoxicidad) de un producto biológico o fármaco tal como se describe en el presente documento puede usarse para evaluar la eficacia (por ejemplo, la inmunotoxicidad) de cualquier producto biológico o fármaco.
Las realizaciones preferidas descritas a continuación ilustran adaptaciones de estas composiciones, ensayos, kits y métodos. No obstante, a partir de la descripción de estas realizaciones, pueden realizarse y/o ponerse en práctica otros aspectos de la invención basándose en la descripción proporcionada a continuación.
Métodos biológicos
En el presente documento se describen métodos que implican técnicas de biología molecular convencionales. Tales técnicas se conocen generalmente en la técnica y se describen en detalle en tratados de metodología tales como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001; y Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing y Wiley-Interscience, Nueva York, 1992 (con actualizaciones periódicas). Las técnicas de inmunología se conocen generalmente en la técnica y se describen en detalle en tratados de metodología tales como Advances in Immunology, volumen 93, ed. Frederick W. Alt, Academic Press, Burlington, MA, 2007; Making and Using Antibodies: A Practical Handbook, eds. Gary C. Howard and Matthew R. Kaser, CRC Press, Boca Raton, Fl, 2006; Medical Immunology, 6a ed., editado por Gabriel Virella, Informa Healthcare Press, Londres, Inglaterra, 2007; y Harlow y Lane ANTIBODIES: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988. También pueden adaptarse métodos convencionales de transferencia génica y terapia génica para su uso en la presente invención. Véase, por ejemplo, Gene Therapy: Principles and Applications, ed. T. Blackenstein, Springer Verlag, 1999; y Gene Therapy Protocols (Methods in Molecular Medicine), ed. P.D. Robbins, Humana Press, 1997. También se describe la construcción y el uso de vacunas, así como dendrímeros de PAMAM, por ejemplo, en Arashkia et al., Virus Genes 40 (1): 44-52, 2010; Velders et al., J Immunol. 166:5366-5373, 2001; y S. Chauhan, N. K. Jain, P. V. Diwan. (2009) Preclinical and behavioural toxicity profile of PAMAM dendrimers in mice. Proceedings of the Royal Society A: Mathematical, Physical and Engineering Sciences (fecha de publicación en línea: 3 de diciembre de 2009).
Síntesis de dendrímeros conjugados a ácidos nucleicos, péptidos, polipéptidos, fármacos o productos biológicos
Las estructuras de tipo árbol circulares, cargadas, tales como dendrímeros, actúan como andamiajes para condensar ADN, y un dendrímero totalmente cargado de manera positiva es preferible para desarrollar fuertes interacciones electrostáticas con un ADN o ARN cargado negativamente. Un complejo de dendrímero/péptido de unión a DR universal/ADN resultante, por ejemplo, tiene una carga neta que depende de la razón de N/P ajustable (razón de amina con respecto a fosfato o de carga). En el presente documento se describen dendrímeros que tienen conjugados a los mismos al menos un péptido de unión a DR universal (por ejemplo, un epítopo tal como el epítopo Pa Dr E o de células T cooperadoras HA de influenza: SFERFEIFp KeC (SeQ ID NO: 28)) y un alérgeno, un antígeno, un ácido nucleico que codifica para un antígeno, un fármaco, un producto biológico, o una porción de los mismos. El al menos un péptido de unión a DR universal se conjuga a la superficie exterior del dendrímero de tal manera que el al menos un péptido de unión a DR universal se une específicamente a PAPC. En una realización, se conjugan dendrímeros a al menos uno de cualquiera o una combinación (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, etc.) de estos péptidos: SSVFNVVNSSIGLIM (SEQ ID NO: 29), FNNFTVSFWLRVPKYSASHLE (SEQ ID NO: 30), QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 31), KLLSLIKGVIVHRLEGVE (SEQ ID NO: 32), LSEIKGVIVHRLEGV (SEQ ID NO: 33), DGVNYATGNLPGCSA (SEQ ID NO: 34), ENDIEKKICKMEKCSSVFNV (SEQ ID NO: 35), NLGKVIDTLTCGFA (SEQ ID NO: 36), GQIGNDPNRDIL (SEQ ID NO: 37), IDVVDSYIIKPIPALPVTPD (SEQ ID NO: 38), ALNNRFQIKGVELKS (SEQ ID NO: 39), AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 2), PRYISLIPVNVVAD (SEQ ID NO: 40), y/o VATRAGLVMEAGGSKVT (SEQ iD NO: 41) y un antígeno peptídico o polipeptídico, o alérgeno. En esta realización, un dendrímero se conjuga o se une normalmente (por ejemplo, mediante una unión electrostática) a una pluralidad del antígeno peptídico o polipeptídico o alérgeno.
Los plásmidos que codifican para antígenos, subunidades, vacunas y antígenos de proteína/glicoproteína producen fácilmente un complejo con PDD debido a su carga neta negativa o cavidades de carga negativa presentes en su estructura. Sin embargo, cuando el antígeno o compuesto no contiene una “carga neta” negativa o “cavidades cargadas negativamente en su estructura”, pueden conjugarse de manera covalente al PDD. Los ejemplos son conservantes de pequeño tamaño, compuestos para aumentar la estabilidad de fármacos y/o productos biológicos o para aumentar la penetración tisular de fármacos/productos biológicos, compuestos para inducir efectos de depósito de fármacos o productos biológicos, compuestos para cambiar la carga o la solubilidad de fármacos o productos biológicos, o cualquier compuesto o antígeno que no produce fácilmente un complejo con PDD. Pueden complejarse múltiples antígenos con los complejos de dendrímero/péptido de unión a DR universal/ácido nucleico descritos en el presente documento para potenciar la capacidad de monitorización inmunológica de la plataforma mediante la evaluación de respuestas de células T frente a diferentes antígenos o componentes de un fármaco. En otra realización, se conjugan dendrímeros a péptidos de unión a DR universales (por ejemplo, péptidos de PADRE) y se unen a un ácido nucleico que codifica para un antígeno. En esta realización, los dendrímeros pueden prepararse y conjugarse a un péptido de unión a DR universal (por ejemplo, un epítopo tal como el epítopo PADRE o de células T cooperadoras h A de influenza: SFERFEIFPKEC ( S e Q ID NO: 28) y unirse al ácido nucleico (por ejemplo, ADN, ARN) usando cualquier método adecuado. En una realización adicional, mediante el componente de dendrímero, la composición se compleja con o se conjuga a un fármaco o producto biológico o una porción del mismo. En esta realización, un resto de dendrímero (el componente de dendrímero que produce uniones electrostáticas con el antígeno o ADN o ARN) de la plataforma se conjuga o se une normalmente (por ejemplo, mediante una unión electrostática) a una pluralidad del fármaco o producto biológico. Tales complejos compuestos por el/los fármaco(s) o producto(s) biológico(s) y el “dendrímero derivatizado con péptido, o PDD”, en los que el péptido es un péptido de unión a DR universal (por ejemplo, un epítopo tal como toxina del tétanos 582-599, PADRE, péptido o epítopo de células T cooperadoras de HA de influenza: SFERFEIFPKEC (SEQ ID NO: 28) o una combinación de tales péptidos) pueden producirse mediante cualquier método adecuado. Un fármaco, proteína, producto biológico entero, o ácido nucleico que codifica para la proteína o producto biológico entero puede unirse (conjugarse) al PDD. Alternativamente, una porción o subunidad de la proteína, fármaco o producto biológico, o una forma truncada de un ácido nucleico que codifica para la proteína o producto biológico puede unirse (conjugarse) al PDD. En una realización típica de determinación de la inmunotoxicidad de un fármaco o producto biológico, tales complejos se añaden a las PBMC de un(os) individuo(s) para evaluar/predecir si el individuo montará o no una respuesta inmunitaria de células T frente al fármaco o producto biológico antes de la administración del fármaco o producto biológico al/a el/los individuo(s) (por ejemplo, mediante administración oral, inyección o cualquier otra forma de administración de fármacos o productos biológicos).
En la técnica se conocen bien métodos de producción y uso de dendrímeros y se describen, por ejemplo, en Zhang J-T et al. Macromol. Biosci. 2004, 4, 575-578, y las patentes estadounidenses n.° 4.216.171 y 5.795.582, ambas incorporadas en el presente documento como referencia. Véase también: D.A. Tomalia, A.M. Nailor, y W.A. Goddard III, “Starburst Dendrimers: Molecular-Level Control of Size, Shape, Surface Chemistry, Topology, and Flexibility from Atoms to Macroscopic Matter”, Angew, Chem. Int. Ed. Engl. 29 (1990), 138-175. En los experimentos descritos en el presente documento, se usan dendrímeros de PAMAM. Sin embargo, puede usarse cualquier dendrímero polimérico altamente ramificado cargado (por ejemplo, cargado positivamente) adecuado. Los ejemplos de dendrímeros poliméricos altamente ramificados cargados positivamente adicionales incluyen dendrímeros de polipropilenimina (PPI) o, más generalmente, cualquier otro dendrímero con grupos amina primaria sobre sus superficies.
Los PADRE-dendrímeros (dendrímeros derivatizados con PADRE) descritos en el presente documento pueden prepararse mediante cualquier método adecuado. En la técnica se conocen métodos de producción y uso de PADRE. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.736.142. Para producir los péptidos de PADRE descritos en la patente estadounidense n.° 5.736.142, se usó una estrategia descrita inicialmente por Jardetzky et al. (EMBO J. 9:1797-1083, 1990), en la que se insertan residuos de anclaje que contienen cadenas laterales críticas para la unión a MHC en un péptido de poli-alanina de 13 residuos. Pueden prepararse péptidos de PADRE según los métodos descritos en la patente estadounidense n.° 5.736.142, por ejemplo, o pueden adquirirse (por ejemplo, de Anaspec, Inc., Fremont, CA). Debido a su tamaño relativamente corto, los péptidos de PADRE (u otro péptido de unión a DR universal) pueden sintetizarse en disolución o sobre un soporte sólido según técnicas convencionales. Hay diversos sintetizadores automáticos comercialmente disponibles y pueden usarse según protocolos conocidos. Alternativamente, puede empelarse tecnología de ADN recombinante en la que una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido de unión a DR universal (por ejemplo, epítopo de células T cooperadoras) se inserta en un vector de expresión, se transforma o se transfecta al interior de una célula huésped apropiada y se cultiva en condiciones adecuadas para su expresión. Estos procedimientos se conocen generalmente en la técnica, tal como se describe generalmente en Sambrook et al., (citado anteriormente), que se incorpora en el presente documento como referencia. Los péptidos de PADRE tal como se describen en el presente documento pueden incluir modificaciones en los residuos N y C-terminales. Tal como entenderá bien el experto, los extremos N y C-terminales pueden modificarse para alterar propiedades físicas o químicas del péptido, tal como, por ejemplo, para afectar a la unión, estabilidad, biodisponibilidad, facilidad de acoplamiento y similares. Los péptidos de unión a DR universales (por ejemplo, péptidos de PADRE) descritos en el presente documento pueden modificarse de cualquiera de varias maneras para proporcionar atributos deseados, por ejemplo, características farmacológicas mejoradas, al tiempo que se conserva sustancialmente toda la actividad biológica del péptido sin modificar.
En los experimentos descritos en el presente documento, el conjugado de PADRE-dendrímero se preparó mediante simple acoplamiento de amida entre el extremo terminal de -COOH del péptido de PADRE y uno de los grupos amina de dendrímero. El péptido de PADRE (Ac-D-Ala-Lys-Cha-Val-Ala-Ala-Trp-Thr-Leu-Lys-Ala-Ala-Ala-D-Ala-Ahx-Cys-OH) (SEQ ID NO: 1, Ac= acetilado; D-Ala = D-alanina; Cha = ciclohexilalanina; Ahx = ácido aminohexanoico) se adquirió de Anaspec, Inc., (Fremont, CA) en su forma acetilada con el fin de proteger el extremo terminal de amina y prevenir su reacción. El péptido adquirido tenía una pureza mínima del 95%. La reacción de acoplamiento de amida se llevó a cabo en condiciones convencionales (véase la figura 1, esquema inferior) en disolución en DMF. Con el fin de controlar el número de epítopos PADRE unidos a la superficie de cada dendrímero, se usó una razón de exposición de péptido/dendrímero de 2:1 en la reacción, buscando la unión de tan sólo unos pocos péptidos por dendrímero con el fin de mantener la mayor parte de los grupos amina libre para desarrollar cargas positivas grandes en el dendrímero. En una realización típica, una pluralidad de conjugados de PADRE-dendrímero tal como se describen en el presente documento será una distribución de dendrímeros que contienen 0, 1, 2, 3, etc., péptidos de PADRE (u otro péptido) unidos a los mismos. Se espera que las poblaciones relativas sigan la distribución de Poisson. El péptido de PADRE, aKXVAAWTLKAAa (SEQ ID NO: 2) se une con afinidad alta o intermedia (Cl5o<1,000 nM) a 15 de 16 de las moléculas de HLA-DR más prevalentes ((Kawashima et al., Human Immunology 59:1-14 (1998); Alexander et al., Immunity 1:751-761 (1994)). Sin embargo, para etiquetar el dendrímero pueden usarse otros péptidos que también pueden unirse a MHC de clase II y células T cooperadoras CD4 activas en la mayor parte de los seres humanos.
Los ejemplos de péptidos incluyen, pero no se limitan a: péptidos de toxoide del tétanos (TT) (por ejemplo, péptido 830-843); el epítopo “universal” descrito en Panina-Bordignon et al., (Eur. J. Immunology 19:2237-2242 (1989)); y los siguientes péptidos que reaccionan con MHC de clase II de la mayor parte de HLA humano, y muchos de ratones: aKFVAAWTLKAAa (SEQ ID NO: 3), aKYVAAWTLKAAa (SEQ ID NO: 4), aKFVAAYTLKAAa (SEQ ID NO: 5), aKXVAAYTLKAAa (SEQ ID NO: 6), aKYVAAYTLKAAa (SEQ ID NO: 7), aKFVAAHTLKAAa (SEQ ID NO: 8), aKXVAAHTLKAAa (SEQ ID NO: 9), aKYVAAHTLKAAa (SEQ ID NO: 10), aKFVAANTLKAAa (SEQ ID NO: 11), aKXVAANTLKAAa (SEQ ID NO: 12), aKYVAANTLKAAa (SEQ ID NO: 13), AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 2), AKFVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 14), AKYVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 15), AKFVAAYTLKAAA (SEQ ID NO: 16), AKXVAAYTLKAAA(SEQ ID NO: 17), AKYVAAYTLKAAA (SEQ ID NO: 18), AKFVAAHTLKAAA (SEQ ID NO: 19), AKXVAAHTLKAAA (SEQ ID NO: 20), AKYVAAHTLKAAA (SEQ ID NO: 21), AKFVAANTLKAAA (SEQ ID NO: 22), AKXVAANTLKAAA (SEQ ID NO: 23), y AKYVAANTLKAAA (SEQ ID NO: 24) (a = D-alanina, X = ciclohexilalanina). Otro ejemplo de un epítopo que puede usarse es la secuencia de péptido de HA SFERFEIFPKE (SEQ ID NO: 25) (de hA de virus provirus PR8) que se une a IaD de MHC de clase II de ratón Balb/c. Los ejemplos adicionales de péptidos de unión a DR universales incluyen supermotivos tales como péptidos de cadena invariable asociados a clase II (CLIP), en particular CLIP p88-99 (SKMRMATPLLMQ (SEQ ID NO: 42)), que se unen a múltiples haplotipos de HLA.
En la tabla 1 hay ejemplos adicionales de péptidos de unión a DR universales (por ejemplo, epítopos de células T cooperadoras). Tales epítopos se unen a la mayor parte de HLA humano, por ejemplo, VATRAGLVMEAGGSKVT (SEQ ID NO: 41), un epítopo de células T de Mycobacterium tuberculosis Mce2, se une a 9 DR de HLA diferentes: DRB1*0101 (DR1), DRB1*1501 (DR2), DRB1*0301 (DR3), DRB1*0401 (DR4), DRB1*1101 (DR5), DRB1*0701 (DR7), DRB1*0801 (DR8), o un péptido de unión a pan D. PADRE puede unirse a 6 subtipos de DRB1 seleccionados (Alexander J, Immunity vol. 1:751-761, 1994), y a APC de PBMC (Neumann, Journal of Cancer vol.
112:661-668, 2004) y se mostró que se unía a MHC de clase II tanto humano como murino (Kim, J. Immunol. Vol.
180:7019-7027, 2008). Tal como se describe en el presente documento, un péptido de unión a DR universal típico es péptido de PADRE (por ejemplo, aKXVAAWTLKAAaZC (SEQ ID NO: 43), con X = L-ciclohexilamina, Z = ácido aminocaproico, y representando el resto de los símbolos de una letra los aminoácidos habituales). Tal como se mencionó anteriormente, puede usarse uno o una combinación de la totalidad de los siguientes péptidos: SSVFNVVNSSIGLIM (SEQ ID NO: 29), FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 30), QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 31), KLLSLIKGVIVHRLEGVE (SEQ ID NO: 32), LSEIKGVIVHRLEGV (SEQ ID NO: 33), DGVNYATGNLPGCSA (SEQ ID NO: 34), ENDIEKKICKMEKCSSVFNV (SEQ ID NO: 35), NLGKVIDTLTCGFA (SEQ ID NO: 36), GQIGNDPNRDIL (SEQ ID NO: 37), IDVVDSYIIKPIPALPVTPD (SEQ ID NO: 38), ALNNRFQIKGVELKS (SEQ ID NO: 39), AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 2), PRYISLIPVNVVAD (SEQ ID NO: 40), y/o VATRAGLVMEAGGSKVT (SEQ ID NO: 41).
Tabla 1. Ejemplos de péptidos de unión a DR universales
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Se purificó el producto mediante diálisis frente a agua pura durante al menos 24 h y después se secó a vacío. Se caracterizó el producto recogido, un aceite transparente, mediante 1H-RMN, UV-Vis y espectroscopía de masas de MALDI-TOF. Los espectros de RMN del conjugado de PADRE-dendrímero muestran grandes picos correspondientes a los protones del dendrímero y un pequeño conjunto de picos para los protones del péptido. El espectro de masas de MALDI-TOF del conjugado de PADRE-dendrímero muestra un pico a una razón de m/z aproximadamente 3.000 unidades superior al pico observado para el dendrímero por sí solo. El exceso de masa corresponde a aproximadamente 2 epítopos peptídicos. El espectro de UV-Vis del conjugado muestra una clara absorción en el intervalo de longitud de onda en el que absorbe el triptófano.
La complejación de ADN de plásmido con el conjugado de PADRE-dendrímero se realizó mezclando los dos componentes en disolución acuosa tamponada a pH fisiológico con PBS. El tampón o los medios para preparar el complejo de PDD (dendrímero derivatizado con péptido) y plásmido o antígeno contiene tampón fisiológico, normalmente con un pH de 7,4. Ejemplos son i) una solución salina a base de agua que contiene cloruro de sodio, fosfato de sodio y (en algunas formulaciones) cloruro de potasio y fosfato de potasio tal como PBS (solución salina tamponada con fosfato), o ii) unos medios que contienen medio esencial mínimo de Eagle, tamponado con HEPES y bicarbonato de sodio y complementado con hipoxantina, timidina, piruvato de sodio, L-glutamina y menos del 10% de albúmina sérica bovina o proteínas séricas individuales incluyendo insulina y/o transferrina con CaCl2100 mg/l en el que el nivel de endotoxinas es inferior a 1,0 UE/ml.
Un ejemplo de un protocolo para formar el complejo de PDD (dendrímero derivatizado con péptido) y plásmido o antígeno incluye las siguientes etapas. En primer lugar, se siembran en placa PBMC en 4 pocillos de una placa de 24 pocillos a 1 millón por ml, 1 ml por pocillo, numerándolos como 1, 2, 3 y 4. En segundo lugar, se diluyen 5 pg de plásmido(s) o antígeno(s) en 800 pl del tampón anteriormente descrito. En tercer lugar, se diluyen 35 pg de PDD en 200 pl del tampón, se añaden gota a gota a la disolución de 5 pg de plásmido(s) o antígeno(s) en 800 pl del tampón anteriormente descrito, mientras se agita el recipiente, y se incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos. En cuarto lugar, se añade esta mezcla al pocillo número 4 (de la etapa 1). A continuación, se añaden 35 pg de PDD al pocillo número 3, y opcionalmente al pocillo número 2 si se desea usar plásmido/antígeno irrelevante y el pocillo número 1 para los medios solos.
Razones de N/P (amina con respecto a fosfato) típicas son de 10:1. Se usa electroforesis en gel para mostrar la complejación completa del ADN. A valores de pH fisiológico, los grupos amino (-NH2) se protonan, proporcionando una alta carga positiva a los dendrímeros y haciendo que sean particularmente adecuados para la administración de ADN o ARN cargado negativamente al interior de células. En disolución acuosa, los dendrímeros argados positivamente y los ácidos nucleicos cargados negativamente dan lugar a condensados o nanopartículas que pueden penetrar y atravesar membranas biológicas con relativa facilidad.
Los dendrímeros que se conjugan a epítopos de células T cooperadoras distintos de PADRE se preparan normalmente mediante un método similar al descrito anteriormente para dendrímeros derivatizados con P A D r E . Por ejemplo, el extremo terminal ácido del péptido puede unirse de manera covalente a uno de los grupos amina en la superficie de dendrímero mediante varios métodos de síntesis bien conocidos, tales como amidación usando carbodiimidas como reactivos activantes. Como otro ejemplo, la unión de estos péptidos a dendrímeros terminados en amino se realiza usando dos rutas de síntesis. El extremo amino-terminal del epítopo peptídico se protege mediante acetilación. La primera ruta usa el ácido carboxílico del residuo de cisteína terminal para lograr la unión mediante química de amidación convencional. La segunda ruta aprovecha el tiol de la cisteína (si está presente en el péptido, de lo contrario puede añadirse) para hacerlo reaccionar con los grupos alqueno añadidos a la superficie de dendrímero mediante tratamiento previo con maleimida. Ambas rutas permiten la funcionalización de dendrímeros con epítopos. Hasta varios epítopos peptídicos (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6 , etc.) por dendrímero potenciarán la propiedad de direccionamiento de los agentes de administración de ADN, mejorando sus propiedades para fines de vacunación. Sin embargo, es importante dejar un gran número de grupos amina sin reaccionar de modo que el dendrímero adquiera una gran carga positiva mediante protonación a valores de pH fisiológico. Los dendrímeros tal como se describen en el presente documento pueden conjugarse a cualquier epítopo de células T cooperadoras. Un ejemplo de un péptido de unión a DR universal adicional es HA de influenza.
Generalmente, se usan dendrímeros de generación 5 (G5) en las composiciones, kits, ensayos y métodos descritos en el presente documento. Sin embargo, pueden usarse dendrímeros de otra generación (véase la tabla 2).
Tabla 2. Dendrímeros de PAMAM
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Portadores poliméricos cargados y composiciones que incluyen los mismos
Una composición tal como se describe en el presente documento que realiza la transfección dirigida de células que expresan MHC de clase II (en particular APC) para evaluar la eficacia de una vacuna u otra terapia o intervención o evaluar la inmunogenicidad de un fármaco o producto biológico incluye al menos un portador polimérico cargado (por ejemplo, cargado positivamente) tal como un dendrímero que tiene conjugada o unida al mismo una molécula de direccionamiento a MHC tal como un péptido de unión a DR universal (por ejemplo, un epítopo tal como toxina del tétanos 582-599, el epítopo PADRE o de células T cooperadoras HA de influenza: SFERfEiFPKEC (SEQ ID NO: 28)) y al menos un antígeno peptídico, polipeptídico o de proteína, al menos un alérgeno, al menos un ácido nucleico que codifica para el al menos un antígeno, al menos un producto biológico, o al menos un fármaco de tal manera que la al menos una molécula de direccionamiento a MHC y el al menos un antígeno peptídico o polipeptídico, al menos un alérgeno, al menos un ácido nucleico que codifica para el al menos un antígeno, al menos un producto biológico, o al menos un fármaco están conjugados a la superficie exterior del portador polimérico (por ejemplo, dendrímero) cargado (por ejemplo, cargado positivamente) y la molécula de direccionamiento a MHC se une específicamente a PAPC. En una realización en la que está evaluándose la eficacia de una vacuna, la combinación del al menos un péptido de unión a DR universal, al menos un dendrímero y al menos un antígeno peptídico o polipeptídico o al menos un ácido nucleico que codifica para el al menos un antígeno, pueden inducir presentación de antígeno en APC que da como resultado la estimulación de células T específicas para el antígeno frente al cual se preparó la vacuna en PBMC a partir de un individuo que ha recibido la vacuna únicamente si están presentes células T cebadas específicas para el antígeno. Induciendo la activación de células T cooperadoras específicas para el antígeno y la expresión de citocinas, puede demostrarse la eficacia de vacunas. Tal como se describió anteriormente, los niveles de las citocinas y/o el grado de proliferación/activación de células T se correlaciona proporcionalmente con las respuestas de células T en las PBMC a partir del individuo. Por tanto, midiendo los niveles de citocinas y el grado de proliferación/activación de células T, puede determinarse si una vacuna fue o no eficaz en montar una respuesta inmunitaria frente al antígeno, y el grado de la respuesta inmunitaria montada. ELISA, ELISpot e ICS en sujetos con respuestas positivas son generalmente 5 veces superiores tras la inmunización que dio como resultado respuestas de células T. En ensayos de citocinas intracelulares (ICS), las respuestas positivas pueden oscilar entre aproximadamente el 0,02 y aproximadamente el 4% o más (por ejemplo, el 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5%, etc.). Los niveles de IFNy en un ensayo ELISA o Luminex/Multiplex en pacientes que responden (es decir, un sujeto que ha montado una respuesta inmunitaria frente a una vacuna) pueden ser superiores a 200 picogramos. El número de puntos positivos puede oscilar, por ejemplo, entre 50 y unos pocos miles de puntos por millón en un ensayo ELISpot.
En una realización en la que está evaluándose la inmunogenicidad de un fármaco o producto biológico o alérgeno, la combinación del al menos un péptido de unión a DR universal (por ejemplo, péptido de células T cooperadoras), al menos un dendrímero y al menos un fármaco o alérgeno o producto biológico pueden inducir la producción de citocinas y la proliferación y activación de células T específicas para el fármaco, alérgeno o producto biológico. Tal como se describió anteriormente, en un método de evaluación de la inmunogenicidad de un fármaco, alérgeno o producto biológico, si se detectan niveles de citocinas elevados y/o niveles elevados o activación de células T o células B específicas para el fármaco, alérgeno o producto biológico en un ensayo tal como se describe en el presente documento, se determina que el fármaco, alérgeno o producto biológico es inmunotóxico, porque el fármaco, alérgeno o producto biológico ha provocado una respuesta de células T o células B en el/los sujeto(s).
El antígeno o los antígenos tal como se describen en el presente documento que se presentan sobre o dentro de los dendrímeros que dan como resultado la activación y proliferación de células T cooperadoras se usan para detectar una respuesta inmunitaria montada como resultado de vacunación frente a antígeno a partir de cualquier patógeno. En una realización, el antígeno puede derivarse de, pero sin limitarse a, organismos patógenos bacterianos, fúngicos o virales, especies de Streptococcus, especies de Candida, especies de Brucella, especies de Salmonella, especies de Shigella, especies de Pseudomonas, especies de Bordetella, especies de Clostridium, virus Norwalk, Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis, virus de inmunodeficiencia humano (VIH), especies de Chlamydia, virus del papiloma humano, virus influenza, especies de Paramyxovirus, virus del herpes, citomegalovirus, virus de varicela-Zoster, virus de Epstein-Barr, virus de la hepatitis, especies de Plasmodium, especies de Trichomonas, agentes de enfermedades de transmisión sexual, agentes de encefalitis viral, agentes de enfermedad protozoaria, agentes de enfermedad fúngica, agentes de enfermedad bacteriana, células cancerosas o mezclas de los mismos.
En una realización, el al menos un péptido de unión a DR universal son dos (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, etc.) péptidos de unión a DR universales, que tienen cada uno la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En otra realización, el al menos un péptido de unión a DR universal es epítopo de células T cooperadoras de HA de influenza (SFERFEIFPKEC) (SEQ ID NO: 28) o cualquiera de los péptidos mencionados en el presente documento, por ejemplo, los de la tabla 1. El péptido de unión a Dr universal (ligando de unión a MHC de clase II) es cualquier epítopo o molécula pequeña que se une específicamente a MHC de clase II. La unión a MHC de clase II se requiere para la capacidad de selección como diana de APC de las composiciones descritas en el presente documento, permitiendo la administración, expresión, procesamiento y presentación del antígeno lo que a su vez se necesita para la evaluación de la eficacia de una vacuna frente a un patógeno o antígeno particular o para la evaluación de respuestas de células T no deseadas frente a fármacos y/o productos biológicos y/o células. En una realización en la que el dendrímero se conjuga a un ácido nucleico que codifica para un antígeno, el ácido nucleico es generalmente un vector de expresión. El vector de expresión incluye normalmente un promotor eucariota operativamente unido a un gen que codifica para el antígeno, un sitio de clonación, una secuencia de poliadenilación, un marcador seleccionable y un origen de replicación bacteriano. Tales plásmidos se unen de manera natural a los dendrímeros derivatizados cargados positivamente descritos en el presente documento. Generalmente, el antígeno es normalmente un antígeno canceroso o un antígeno de un patógeno infeccioso. El al menos un dendrímero es generalmente un dendrímero de G5. Los dendrímeros son vehículos eficaces para acompañar a ADN (y otros ácidos nucleicos incluyendo ADN, ARN, ARNip, microARN, iARN, etc.) al interior de células. De manera similar, en realizaciones en las que el dendrímero se conjuga a un antígeno peptídico o polipeptídico, el antígeno es generalmente un antígeno canceroso o un antígeno de un patógeno infeccioso, y el al menos un dendrímero es un dendrímero de G5. En una realización de una composición para evaluar la eficacia de una vacuna o para evaluar la inmunogenicidad de un fármaco o producto biológico (por ejemplo, anticuerpo, células, etc.), el péptido de unión a DR universal es un epítopo PADRE y el dendrímero se derivatiza con PADRE. PADRE es un péptido diseñado de manera artificial que se une a la mayor parte del MHC de clase II, y conjugar péptidos de PADRE a dendrímeros (por ejemplo, un dendrímero derivatizado con PADRE) hace que el complejo o conjugado resultante sea un ligando para PAPC que expresan altos niveles de MHC de clase II. Por tanto, este complejo se vuelve un sistema de administración de antígeno dirigido universal con alta afinidad por células que expresan MHC de clase II o PAPC. PADRE es un péptido de unión a DR universal que se une a muchas moléculas de MHC de clase II murinas, de primates no humanos y humanas. Es un epítopo de células T cooperadoras sintético, no natural [AKchxAVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 26) (chxA = ciclohexilalanina)]. Cuando se fusiona a la superficie del dendrímero, PADRE se unirá a, y activará, principalmente células que tienen MHC de clase II incluyendo todas las PAPC. Pueden unirse varios epítopos PADRE (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, etc.) a cada dendrímero. La unión se realiza con espaciadores adecuados para conservar las propiedades de unión del péptido que dan lugar a sus propiedades de unión a MHC. Puede usarse una molécula de ligador o espaciador en la conjugación de antígeno u otras moléculas a los conjugados de dendrímero descritos en el presente documento. Los espaciadores pueden ser cualquier combinación de aminoácidos incluyendo AAA, KK, g S, GSGGGGS (SEQ ID NO: 27), RS o AAY. Tal como se usan en el presente documento, los términos “ligador” o “espaciador” significan los grupos químicos que se interponen entre el dendrímero y las(s) molécula(s) expuesta(s) en superficie tal(es) como el ligando de m Hc de clase II, epítopo de células T cooperadoras CD4+, polipéptido o agente terapéutico que se conjuga o se une al dendrímero (por ejemplo, PADRE-dendrímero) y la(s) molécula(s) expuesta(s) en superficie. Preferiblemente, los ligadores se conjugan a la molécula de superficie en un extremo y en su otro extremo a la nanopartícula (por ejemplo, PADRE-dendrímero). El acoplamiento puede realizarse con agentes o bien homo o bien heterobifuncionales, es decir, SPDP, DSS, SIAB. Se dan a conocer métodos de acoplamiento en el documento PCT/DK00/00531 (WO 01/22995) concedido a deJongh, et al., que se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican para un antígeno tal como se describe en el presente documento pueden estar en forma de ARN (por ejemplo, ARNm, microARN, ARNip, ARNhp o ARN sintético químicamente modificado) o en forma de ADN (por ejemplo, ADNc, ADN genómico y ADN sintético). El ADN puede ser bicatenario o monocatenario, y si es monocatenario, puede ser la cadena codificante (sentido) o la cadena no codificante (antisentido). En una realización, un ácido nucleico puede ser una molécula de ARN aislada o amplificada a partir de líneas de células tumorales inmortalizadas o primarias.
Tal como se describió anteriormente, en una realización, una composición para evaluar la eficacia de una vacuna (una respuesta inmunitaria montada frente a la vacuna o antígeno) incluye al menos un dendrímero que tiene conjugados al mismo al menos un péptido de unión a DR universal y un ácido nucleico que codifica para un antígeno. El uso de ADN para introducir un antígeno con el fin de evaluar la eficacia de una vacuna o evaluar la inmunogenicidad de un fármaco o producto biológico tiene varias ventajas. En primer lugar, el uso de ADN proporciona un espectro completo de epítopos procesados (de manera natural) no expuestos. Además, los dendrímeros conjugados a un péptido de unión a DR universal y un ácido nucleico que codifica para un antígeno proporcionan la administración dirigida a APC de >95% de todos los MHC humanos (AKA, h La ) y eliminan la necesidad de purificación de proteínas que son difíciles de purificar. Tales proteínas pueden ser parte de un complejo de múltiples proteínas, pueden ser proteínas de membrana, y pueden estar plegadas de manera incorrecta y ser insolubles. Los conjugados de dendrímero descritos en el presente documento no requieren glicosilación o modificaciones postraduccionales de proteínas, marcan la interferencia con la estructura o el plegamiento de proteínas, y ofrecen drásticos ahorros de coste y tiempo. El hecho de que PADRE-dendrímero dirige y administra ácidos nucleicos a PBMC de ratones, babuinos y seres humanos hace que esta plataforma sea un candidato ideal para investigación de transferencia rápida de ratones a primates no humanos, y a seres humanos.
También tal como se describió anteriormente, en otra realización, una composición para evaluar la eficacia de una vacuna (una respuesta inmunitaria) u otra terapia o intervención incluye al menos un dendrímero que tiene conjugados al mismo al menos un péptido de unión a DR universal (por ejemplo, un epítopo tal como el epítopo Pa Dr E o de células T cooperadoras HA de influenza: SFERFEIFPKEC (SEQ ID NO: 28)) y un antígeno peptídico o polipeptídico, en la que el al menos un péptido de unión a DR universal y el antígeno peptídico o polipeptídico están conjugados a la superficie exterior del dendrímero y pueden captarse por APC. Los polipéptidos y péptidos con una carga neta negativa pueden complejarse, por ejemplo, con PADRE-dendrímero sin necesidad de conjugación covalente.
Tal como se mencionó anteriormente, las composiciones, kits, ensayos y métodos descritos en el presente documento pueden usarse para evaluar la eficacia de una vacuna u otra terapia o intervención administrada a un sujeto que está tratándose para cualquier patógeno infeccioso o cáncer. Los ejemplos de patógenos infecciosos incluyen virus tales como, pero sin limitarse a, influenza, VIH, virus del dengue, rotavirus, VHP, VHB, VHC, CMV, VHS, VHZ y VEB, agentes patógenos incluyendo los agentes causantes de malaria, Plasmodium(p) falciparum, P. malariae, P. ovale, P. vivax y P. knowlesi; el agente causante de leishmaniasis (L), L. major, L. trópica, L. aetiopica, L. mexicana, L. donovani, L. infantum syn., L. chagas; bacterias patógenas incluyendo Bacillus anthracis, Bordetella pertussis, Streptococcus pneumonia y meningococos.
Los dendrímeros conjugados a un péptido de unión a DR universal y un antígeno o un ácido nucleico que codifica para un antígeno tal como se describe en el presente documento pueden usarse para evaluar la eficacia de una vacuna frente a cualquier cáncer o cualquier otra terapia o intervención para cáncer. Los ejemplos de cánceres incluyen cánceres de cuello uterino inducidos por VHP (por ejemplo, antígenos asociados a tumor E7/E7 (TAA) o plásmidos que codifican para estos antígenos pueden complejarse con el péptido de unión a DR universal/dendrímeros (por ejemplo PADRE-dendrímero) descritos en el presente documento), melanoma humano (por ejemplo, pueden usarse TRP-1, TRP-2, gp-100, MAGE-1, MAGE-3 y/o p53 como TAA y complejarse con el péptido de unión a DR universal/dendrímeros (por ejemplo PADRE-dendrímero) descritos en el presente documento) y cáncer de próstata (por ejemplo, puede usarse TSA como TAA y complejarse con el péptido de unión a DR universal/dendrímeros (por ejemplo PADRE-dendrímero) descritos en el presente documento). De manera similar, para tumores de pulmón, tumores de mama y leucemia, puede usarse cualquier TAA adecuado, y se han descrito muchos. Muchos de tales TAA son comunes entre diversos cánceres (por ejemplo, CEA, MUC-1, Her2, CD20).
Métodos y ensayos para detectar una respuesta inmunitaria frente a vacuna u otra terapia o intervención
En el presente documento se describen ensayos, reactivos, kits y métodos para determinar si un sujeto que ha recibido una terapia o intervención (por ejemplo, vacunación) para tratar o prevenir una patología (por ejemplo, infección) ha montado una respuesta inmunitaria frente a la terapia o intervención, así como cuantificar la respuesta inmunitaria. Estos métodos, reactivos, kits y ensayos son útiles para evaluar la eficacia de una vacuna, por ejemplo. La figura 11 ilustra un método, kit y ensayo típicos para detectar una respuesta inmunitaria frente a una vacuna u otra terapia o intervención. Antígenos o ácidos nucleicos que codifican para los antígenos se complejan con un dendrímero derivatizado con péptido (por ejemplo, PADRE) y se usan para transfectar APC en preparaciones de PBMC, y convertirlas en APC autólogas que expresan antígeno (denominadas en el presente documento “células diana”).
En un ejemplo de un método y ensayo para detectar una respuesta inmunitaria frente a una vacuna u otra terapia o intervención, se obtiene una primera muestra a partir de un sujeto antes de que el sujeto reciba la vacuna u otra terapia o intervención, en el que la vacuna u otra terapia o intervención incluye un antígeno, fármaco o producto biológico; se obtiene una segunda muestra a partir del sujeto después de que el sujeto haya recibido la vacuna u otra terapia o intervención; se pone cada una de las muestras primera y segunda en contacto con dendrímeros poliméricos altamente ramificados conjugados a: un péptido de unión a d R universal y de direccionamiento a MHC, y el antígeno, fármaco o producto biológico; medir una respuesta inmunitaria en la primera muestra y medir una respuesta inmunitaria en la segunda muestra; correlacionar una respuesta inmunitaria aumentada en la segunda muestra con respecto a una respuesta inmunitaria en la primera muestra con una respuesta inmunitaria frente a la vacuna u otra terapia o intervención. En este método y ensayo, medir una respuesta inmunitaria incluye normalmente medir o detectar uno o más de: activación de células T, proliferación de células T, célula B activación, célula B proliferación y expresión de citocinas.
En otra realización, determinar si un sujeto que ha recibido una terapia o intervención (por ejemplo, vacunación) para tratar o prevenir una patología (por ejemplo, infección) ha montado una respuesta inmunitaria frente a la terapia o intervención, así como cuantificar la respuesta inmunitaria no implica obtener una primera muestra a partir del sujeto antes de recibir la terapia o intervención (por ejemplo, una vacunación). Tales métodos y ensayos pueden ser útiles, por ejemplo, en técnicas de monitorización inmunológica para antígenos tumorales en pacientes que no han recibido ninguna vacunación (algunas veces, la inmunidad se ceba de manera espontánea incluso en ausencia de una vacuna). En esta realización, uno o más antígenos irrelevantes (es decir, un antígeno que no está incluido en la vacuna o relacionado con la terapia o intervención) a los que no se espera que se hayan expuesto los individuos se usan como controles negativos. Un ejemplo de un método de este tipo para determinar la eficacia de una vacuna incluye las siguientes etapas. PBMC obtenidas a partir del sujeto (por ejemplo, se obtiene una muestra que incluye PBMC a partir del sujeto) después de que el sujeto se haya vacunado se dividen en al menos tres porciones (puede desearse tener más controles positivos y negativos) y se colocan en diferentes pocillos (por ejemplo, en una placa de múltiples pocillos). Cada porción incluye aproximadamente cinco millones de células. Una porción, las “células efectoras”, no recibe tratamiento y se incuba en medios regulares en una incubadora (37°C/CÜ2 al 5%). Esta porción se denomina espécimen A en este ejemplo. A la porción, denominada espécimen B en este ejemplo, se le añade PDD complejado con el antígeno de vacuna o con un ácido nucleico que codifica para el antígeno de vacuna. A una tercera porción, denominada espécimen C en este ejemplo, se le añade PDD complejado con la proteína o péptido irrelevante (o con un ácido nucleico que codifica para la proteína o péptido irrelevante). Estos PDD sirven como control negativo. Los ejemplos de proteínas irrelevantes (de control) incluyen proteínas albúmina y luciferasa de luciérnaga. Como otro control negativo, pueden añadirse a PBMC PDD que no están complejados a una proteína o péptido irrelevante o al antígeno. Como otro control negativo, los plásmidos sin inserción (vectores vacíos) complejados con PDD pueden añadirse a PBMC. También pueden usarse en pocillos adicionales controles positivos opcionales tales como antígenos de recuerdo tales como aquellos frente a toxoide del tétanos o antígenos de influenza (proteína o plásmidos que codifican para proteínas) complejados con dendrímeros tal como se describen en el presente documento. Tras incubación durante la noche (u otra cantidad de tiempo adecuada) en una incubadora (37°C/CÜ2 al 5%), se mezcla el espécimen A por separado con el espécimen B y C. Las respuestas de células T se medirán tras 12-48 horas mediante métodos opcionales tales como ELISA para la medición de IFN-y en los sobrenadantes de la prueba (mezcla de A y B), y el control negativo (mezcla de A y C). Una diferencia estadística, normalmente una diferencia de cinco veces, demuestra una respuesta de células T positiva frente a antígeno sometido a prueba frente al control negativo.
En esta realización, un método típico de detección de una respuesta inmunitaria frente a una vacuna u otra terapia o intervención incluye las siguientes etapas. Se prepara o proporciona una primera composición que incluye una pluralidad de dendrímeros poliméricos cargados altamente ramificados que tienen cada uno conjugados a los mismos al menos un péptido de unión a DR universal y al menos un antígeno peptídico o polipeptídico o un ácido nucleico que codifica para el al menos un antígeno, conjugándose el al menos un péptido de unión a DR universal y el ácido nucleico o al menos un antígeno peptídico o polipeptídico a la superficie exterior de la pluralidad de dendrímeros poliméricos cargados altamente ramificados de tal manera que el al menos un péptido de unión a DR universal se une específicamente a PAPC. En esta realización, la vacuna u otra intervención terapéutica incluye el antígeno o una porción del mismo. Se obtiene una primera muestra que incluye PAPC a partir del sujeto después de que el sujeto se haya vacunado, y se divide la primera muestra en al menos una primera porción y una segunda porción. Se pone al menos la primera porción en contacto con la primera composición en condiciones de incubación de tal manera que la pluralidad de dendrímeros poliméricos cargados altamente ramificados se captan por las PAPC y de tal manera que el antígeno se procesa por las PAPC y se presenta por las PAPC en combinación con MHC de clase II. Se pone la segunda porción en contacto con una segunda composición que incluye una pluralidad de dendrímeros poliméricos cargados altamente ramificados que tienen cada uno conjugados a los mismos al menos un péptido de unión a DR universal y al menos un péptido o polipéptido de control negativo o un ácido nucleico que codifica para el al menos un péptido o polipéptido de control negativo, conjugándose el al menos un péptido de unión a DR universal y el al menos un antígeno peptídico o polipeptídico de control o ácido nucleico que codifica para el al menos un péptido o polipéptido de control negativo a la superficie exterior de la pluralidad de dendrímeros poliméricos cargados altamente ramificados de tal manera que el al menos un péptido de unión a DR universal se une específicamente a PAPC. Se examina al menos la primera porción puesta en contacto con la primera composición para determinar la presencia de al menos una molécula o un marcador que es indicativo de una respuesta inmunitaria frente a la vacuna u otra intervención terapéutica, y se determina el nivel de la al menos una molécula o un marcador. De manera similar, se examina al menos la segunda porción puesta en contacto con la segunda composición para determinar la presencia de la al menos una molécula o un marcador, y se determina el nivel de la al menos una molécula o un marcador. Se compara el nivel de la al menos una molécula o un marcador en al menos la primera porción puesta en contacto con la primera composición con el nivel de la al menos una molécula o un marcador en al menos la segunda porción puesta en contacto con la segunda composición, y un nivel superior de la al menos una molécula o marcador en al menos la primera porción puesta en contacto con la primera composición en comparación con al menos la segunda porción puesta en contacto con la segunda composición se correlaciona con una respuesta inmunitaria frente a la vacuna. Si no se detecta o se mide un nivel superior de la al menos una molécula o marcador en al menos la primera porción puesta en contacto con la primera composición con respecto al nivel en al menos la segunda porción puesta en contacto con la segunda composición, no se concluye que se montó una respuesta inmunitaria frente a la vacuna u otra intervención terapéutica. El al menos un antígeno peptídico o polipeptídico de control puede ser cualquier control negativo adecuado, tal como, por ejemplo, albúmina o luciferasa. La al menos una molécula o un marcador que es indicativo de una respuesta inmunitaria frente a la vacuna u otra intervención terapéutica puede ser, por ejemplo, activación o proliferación de células T o células B, o una citocina (por ejemplo, IFN-y). Examinar al menos la primera porción puesta en contacto con la primera composición y al menos la segunda porción puesta en contacto con la segunda composición para determinar la presencia de la al menos una molécula o un marcador, y determinar el nivel de la al menos una molécula o un marcador en al menos la primera porción puesta en contacto con la primera composición y al menos la segunda porción puesta en contacto con la segunda composición puede realizarse usando cualquier ensayo adecuado, tal como un ensayo de citocinas y/o ensayo de CTL.
Un ejemplo de una aplicación en la que esta realización puede ser particularmente útil se refiere a la búsqueda insatisfactoria para detectar y/o distinguir tuberculosis (TB) activa frente a latente. La prueba T SPOT.TB es una prueba de diagnóstico in vitro que mide células T específicas para antígenos de Mycobacterium tuberculosis (MTB). Esta prueba implica el uso de un cóctel de epítopos peptídicos, y es positiva incluso tras el tratamiento debido a células T de memoria frente a péptidos inmunodominantes que se usan en la prueba. Con el fin de distinguir TB activa frente a latente usando los métodos, kits, reactivos y ensayos descritos en el presente documento, puede usarse un plásmido que codifica para antígenos que son específicos para infección por Tb latente con PDD tal como se describe en el presente documento y medir niveles de IFN.
En los métodos, se usa cualquier cantidad adecuada de una composición que incluye APC autólogas obtenidas tal como se describió anteriormente eficaz para inducir la activación de células T cooperadoras mediada por MHC de clase II. Un ejemplo es usar 1 millón de PBMC en 2 ml de medios (relevantes) en un pocillo en una placa de 24 pocillos, 1-5 ug de ADN de plásmido o antígeno o 0,5 ug de ARNip mezclados con PDD en una razón de (4-10):1, en la que se usan 4-10 veces de PDD. El al menos un péptido de unión a DR universal puede ser dos epítopos de pan-DR que tienen cada uno la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Alternativamente, el al menos un péptido de unión a DR universal puede ser distinto de un epítopo de pan-DR (epítopo PADRE), por ejemplo, HA de influenza. Generalmente, el al menos un dendrímero es un dendrímero de G5. Un paciente o que es un candidato para recibir un producto biológico o fármaco particular, o que se ha vacunado o ha recibido otra terapia o intervención, o se vacunará o recibirá otra terapia o intervención, o que está considerándose para la vacunación u otra terapia o intervención, es un sujeto típico.
Métodos y ensayos para evaluar la inmunogenicidad de un fármaco o producto biológico
Además, en el presente documento se describen métodos, reactivos, kits y ensayos para evaluar la inmunogenicidad de un fármaco o producto biológico. Estos métodos, reactivos y ensayos pueden usarse para evaluar la inmunogenicidad (o falta de la misma) de cualquier fármaco o producto biológico. Un método típico de evaluación de si un fármaco o producto biológico es o no inmunogénico en un sujeto o una población de sujetos incluye las siguientes etapas: obtener una muestra que incluye PBMC a partir de un sujeto; dividir la muestra en al menos una primera porción, una segunda porción y una tercera porción; añadir a la segunda porción una composición que incluye una pluralidad de dendrímeros poliméricos cargados altamente ramificados que tienen cada uno conjugados a los mismos al menos un péptido de unión a DR universal y al menos un fármaco o producto biológico, en el que el al menos un péptido de unión a DR universal y el fármaco o producto biológico están conjugados a la superficie exterior de la pluralidad de dendrímeros poliméricos cargados altamente ramificados de tal manera que el al menos un péptido de unión a DR universal se une específicamente a PAPC; añadir a la tercera porción una composición que incluye una pluralidad de dendrímeros poliméricos cargados altamente ramificados que tienen cada uno conjugados a los mismos al menos un péptido de unión a DR universal y al menos un polipéptido de control negativo o ácido nucleico que codifica para el polipéptido de control negativo, en el que el al menos un péptido de unión a DR universal y el polipéptido de control negativo o ácido nucleico que codifica para el polipéptido de control negativo están conjugados a la superficie exterior de la pluralidad de dendrímeros poliméricos cargados altamente ramificados de tal manera que el al menos un péptido de unión a DR universal se une específicamente a PAPC; incubar al menos la primera porción, segunda porción y tercera porción; mezclar una primera alícuota de la primera porción con la segunda porción o una alícuota de la misma, mezclar una segunda alícuota de la primera porción con la tercera porción o alícuota de la misma, e incubar las mezclas en condiciones que permiten la proliferación y activación de células T; medir la proliferación o activación de células T en la mezcla de la primera alícuota de la primera porción con la segunda porción; medir la proliferación o activación de células T en la mezcla de la segunda alícuota de la primera porción con la tercera porción; y correlacionar una proliferación o activación de células T aumentada en la mezcla de la primera alícuota de la primera porción y la segunda porción en comparación con la proliferación o activación de células T en la mezcla de la segunda alícuota de la primera porción y la tercera porción con una respuesta inmunitaria frente al fármaco o producto biológico. En el método, medir la proliferación o activación de células T incluye medir los niveles de IFN-y, o el/los nivel(es) de cualquier otra citocina. Además, en el método, una respuesta inmunitaria frente al fármaco o producto biológico se correlaciona normalmente con inmunogenicidad del fármaco o producto biológico.
Un ejemplo de un método y ensayo para evaluar la inmunogenicidad de un fármaco o producto biológico incluye las siguientes etapas, PBMC obtenidas a partir del/los sujeto(s) o poblaciones que van a someterse a prueba para determinar reacciones inmunitarias adversas se dividen en al menos tres porciones (puede desearse tener más controles positivos y negativos) y se colocan en diferentes pocillos (por ejemplo, en una placa de múltiples pocillos). Cada porción incluye aproximadamente cinco millones de células. Una porción, las “células efectoras”, no recibe tratamiento y se incuba en medios regulares en una incubadora (37°C/CO2 al 5%). Esta porción puede denominarse espécimen A. A una segunda porción, espécimen B, se le añaden PDD complejados con los productos biológicos/fármaco/compuesto o autoantígenos o con un ácido nucleico que codifica para un producto biológico o autoantígeno que se añaden. A una tercera porción, denominada espécimen C, se le añaden PDD complejados con la proteína o péptido irrelevante (o con un ácido nucleico que codifica para la proteína o péptido irrelevante, o plásmido vacío). Estos PDD sirven como control negativo. Los ejemplos de proteínas irrelevantes (de control) incluyen proteínas albúmina y luciferasa de luciérnaga. Como otro control negativo, pueden añadirse a las PBMC PDD que no se complejan con una proteína o péptido irrelevante o con el antígeno. Como otro control negativo, los plásmidos sin inserción complejados con PDD pueden añadirse a las PBMC. También pueden usarse en pocillos adicionales controles positivos opcionales tales como antígenos de recuerdo tales como aquellos frente a toxoide del tétanos o antígenos de influenza (proteína o plásmidos que codifican para proteínas) complejados con dendrímeros tal como se describen en el presente documento. Tras la incubación durante la noche (o tiempo apropiado) en una incubadora (37°C/CÜ2 al 5%), se mezcla el espécimen A por separado con los con especímenes B y C. Se miden las respuestas de células T tras 12-48 horas mediante métodos opcionales tales como ELISA para la medición de IFN-y en los sobrenadantes de la prueba (mezcla de A y B), y el control negativo (mezcla de A y C). Una diferencia estadística, normalmente una diferencia de cinco veces, demuestra una respuesta de células T positiva frente a antígeno sometido a prueba frente al control negativo. Con respecto a la preparación de complejo de PDD/antígeno/fármaco, tal complejo de dendrímero/plásmido de ADN o complejos de dendrímero/producto biológico o fármaco se preparan tal como se describe en el presente documento. Se someten a prueba diferentes razones de PDD con respecto a plásmido de ADN o producto biológico o fármaco. Puede realizarse electroforesis en gel como ensayo convencional para determinar la mejor razón que da como resultado la retención de la carga en el gel. Un ejemplo de una razón es 7 veces (en peso) de PDD y una vez de fármaco/proteína, producto biológico, ARN o ADN de plásmido. Pueden usarse 2-5 |ig de cualquiera de fármaco, proteína, producto biológico o ARN o ADN de plásmido en un volumen final de 100 |il en PBS u OptiMem. Para preparar el complejo, se usan 100 |il para cada reacción. Esto se deja normalmente a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos. Se añaden 100 |il del complejo a un millón de PBMC en 2 ml de medios RPMI. Se cultiva esta mezcla en una incubadora a 37°C/CO2 al 5% durante la noche. Se añaden un millón de PBMC del mismo individuo o animal, y se incuban en una incubadora a 37°C/CO2 al 5% durante 24 horas. Se miden los niveles de citocinas y/o la proliferación de células T mediante cualquier método deseado.
Composiciones y métodos para administrar un ácido nucleico a una célula
En los experimentos descritos en el presente documento, la administración de un gen que codifica para GFP se administró específicamente a células de MHC de clase II (células que expresan MHC de clase II) y se observó la expresión del gen. Por tanto, las composiciones y los métodos descritos en el presente documento pueden encontrar uso en cualquier aplicación de terapia génica. Una composición para administrar un ácido nucleico a una célula incluye normalmente al menos un dendrímero polimérico altamente ramificado cargado positivamente que tiene conjugados al mismo al menos un péptido de unión a DR universal (por ejemplo, péptido de células T cooperadoras) y al menos un ácido nucleico que codifica para un péptido o proteína, en la que el al menos un péptido de unión a DR universal y el ácido nucleico están conjugados a la superficie exterior del al menos un dendrímero polimérico altamente ramificado cargado positivamente de tal manera que el al menos un péptido de unión a DR universal se une específicamente a la célula, y la combinación del al menos un péptido de unión a DR universal, al menos un dendrímero polimérico altamente ramificado cargado positivamente y el ácido nucleico se internalizan por la célula. Un método de administrar un ácido nucleico a una célula incluye normalmente poner en contacto la célula con una composición que incluye al menos un dendrímero polimérico altamente ramificado cargado positivamente que tiene conjugados al mismo al menos un péptido de unión a DR universal y al menos un ácido nucleico que codifica para un péptido o proteína, en el que el al menos un péptido de unión a DR universal y el ácido nucleico están conjugados a la superficie exterior del al menos un dendrímero polimérico altamente ramificado cargado positivamente de tal manera que el al menos un péptido de unión a DR universal se une específicamente a la célula, y la combinación del al menos un péptido de unión a DR universal, al menos un dendrímero polimérico altamente ramificado cargado positivamente y el ácido nucleico se internalizan por la célula. En una realización típica, el péptido o proteína se expresan dentro de la célula.
En una realización, el al menos un péptido de unión a DR universal es al menos un péptido de cadena invariable asociado a clase II (CLIP). En algunas realizaciones, el dendrímero polimérico altamente ramificado cargado es un dendrímero de PAMAM y el al menos un CLIP es CLIP p88-99. El dendrímero polimérico altamente ramificado cargado puede conjugarse además a al menos un ácido nucleico (por ejemplo, ARNip, microARN, iARN, ARN o ADN), y el ácido nucleico entra en la célula presentadora de antígeno profesional. El al menos un dendrímero polimérico altamente ramificado cargado puede incluir un fármaco (por ejemplo, portar y administrar un fármaco).
Kits para evaluar la eficacia de una vacuna u otra terapia o intervención y para evaluar la inmunogenicidad de un fármaco o producto biológico
En el presente documento también se describen kits para evaluar la eficacia de una vacuna u otra terapia o intervención y para evaluar la inmunogenicidad de un fármaco o producto biológico. La figura 11 ilustra cómo se usa un kit típico para evaluar la eficacia de una vacuna u otra terapia o intervención o para evaluar la inmunogenicidad de un fármaco o producto biológico. Un kit típico incluye un recipiente que incluye una pluralidad de complejos (conjugados) de dendrímero/péptido de unión a DR universal tal como se describe en el presente documento (por ejemplo, dendrímeros derivatizados con PADRE, dendrímeros conjugados a HA de influenza, etc.), un tampón fisiológico e instrucciones de uso. Los complejos de dendrímero/péptido de unión a DR universal pueden conjugarse a ácidos nucleicos, péptido, proteínas, fármacos o productos biológicos, dependiendo del uso previsto. Debido a la naturaleza universal del kit, puede adquirirse y usarse para evaluar la eficacia de cualquier vacuna u otra terapia o intervención, y/o para evaluar la inmunogenicidad de cualquier producto biológico o fármaco. Normalmente, se usa un tampón con un pH de 7,4 para diluir PDD, ADN, ARN o antígeno. En un ejemplo de un tampón o medio, el tampón o medio incluye medio esencial mínimo de Eagle, tamponado con HEPEs y bicarbonato de sodio, y complementado con hipoxantina, timidina, piruvato de sodio, L-glutamina, y menos del 10% de albúmina sérica bovina o proteínas séricas individuales incluyendo insulina y/o transferrina con CaCl2100 mg/l en el que el nivel de endotoxinas es inferior a 1,0 UE/ml. En otras realizaciones, el tampón o los medios usados para producir el complejo de PDD (dendrímero derivatizado con péptido) es una solución salina a base de agua que contiene cloruro de sodio, fosfato de sodio y (en algunas formulaciones) cloruro de potasio y fosfato de potasio tal como PBS (solución salina tamponada con fosfato).
En una realización en la que un ácido nucleico debe complejarse con los complejos de dendrímero/péptido de unión a DR universal, un usuario del kit diluye al menos un ácido nucleico (por ejemplo, plásmido de a Dn ) que codifica para un antígeno con el tampón a 100-200 |ig/ml, y mientras agita suavemente, añade la composición (péptido de unión a DR universal-dendrímero) al ADN de plásmido diluido. En una realización típica, se usa una razón de 10:1 de péptido de unión a DR universal-dendrímero con respecto a ADN de plásmido (N:P), que es aproximadamente 7 veces (en peso) de composición con respecto a una vez (en peso) de plásmido(s) de ADN.
En una realización en la que los complejos de dendrímero/péptido de unión a DR universal se conjugan a proteínas o polipéptidos o alérgenos, normalmente la misma razón de 10:1 de los complejos de dendrímero/péptido de unión a d R universal con respecto a proteína o alérgeno da como resultado la formación de complejo. Las instrucciones de uso incluidas en un kit tal como se describe en el presente documento describen el protocolo de preparar razones apropiadas, tampones y optimización y resolución de problemas cuando se necesite. La complejación de ADN de plásmido, proteína/antígeno, alérgeno, fármaco o producto biológico con el péptido de unión a DR universaldendrímeros (por ejemplo, conjugados de PADRE-dendrímero) descritos en el presente documento se realiza generalmente mezclando los dos componentes en disolución acuosa tamponada a pH fisiológico con un tampón fisiológico incluyendo PBS. Razones de N/P (amina con respecto a fosfato) típicas son de 10:1. Puede usarse electroforesis en gel u otro ensayo adecuado para demostrar la completa complejación del ADN al péptido de unión a DR universal-dendrímeros (por ejemplo, conjugados de PADRE-dendrímero).
En algunas realizaciones, puede usarse un kit tal como se describe en el presente documento para predecir respuestas de células T y/o células B no pretendidas (no deseadas) frente a cualquier clase de productos químicos y compuestos que se usan en fármacos, productos biológicos u otros productos de consumo o que constituyen reactivos usados como conservantes, para potenciar la estabilidad o para aumentar la administración cuando una respuesta de células T y/o células B puede ser responsable o estar parcialmente implicada. Por ejemplo, una hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) es una respuesta de memoria inmunitaria mediada por células, o hipersensibilidad de tipo 4 en la que una reacción mediada inmunológicamente que implica células T sensibilizadas media reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado dando como resultado dermatitis de contacto alérgica. Pueden producirse reacciones de tipo 1 (relacionadas con IgE) y de tipo 4 (relacionadas con células T) en el mismo individuo. El desarrollo de dermatitis de contacto puede preceder a la aparición de síntomas mediados por IgE. Las reacciones de DTH pueden ser muy graves y estar asociadas con morbilidad significativa.
Un kit tal como se describe en el presente documento puede usarse con cualquier antígeno, alérgeno, fármaco, producto biológico, secuencia de ácido nucleico, vector o plásmido que codifica para un antígeno de interés. Generalmente se incluyen materiales de instrucciones para la preparación y uso de los complejos (conjugados) de dendrímero/péptido de unión a DR universal descritos en el presente documento. Aunque los materiales de instrucciones incluyen normalmente materiales escritos o impresos, no se limitan a los mismos. Cualquier medio que pueda almacenar tales instrucciones y comunicarlas a un usuario final queda abarcado por los kits y métodos en el presente documento. Tales medios incluyen, pero no se limitan, a medios de almacenamiento electrónico (por ejemplo, discos magnéticos, cintas, cartuchos, chips), medios ópticos (por ejemplo, CD-ROM) y similares. Tales medios pueden incluir direcciones de sitios de Internet que proporcionan tales materiales de instrucciones.
Ejemplos
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos específicos. Los ejemplos se proporcionan únicamente para ilustración y no deben interpretarse como que limitan el alcance de la invención de ninguna manera.
Ejemplo 1 - Una plataforma basada en nanopartículas con adyuvante/dirigidas para producir APC autólogas que presentan antígeno
Las nanopartículas basadas en dendrímero descritas en el presente documento se preparan normalmente mediante la conjugación de dos reactivos: un dendrímero de PAMAM terminado en amino, de quinta generación, y un péptido de direccionamiento/potenciación inmunitaria, o péptido de unión a DR universal (por ejemplo, PADRE). Los datos descritos a continuación mostraron que esta plataforma aumenta la eficiencia de transfección en APC tanto de ratón como humanas en de 2 a 3 veces. Además, experimentos in vivo usando plásmido que codifica para GFP conjugado a PADRE-dendrímero mostraron que se produce GFP en los ganglios linfáticos con drenaje.
Materiales y métodos
Se generó dendrímero PAMAM derivatizado con PADRE tal como se describió anteriormente con las siguientes modificaciones. Se generó el complejo de PADRE-dendrímero/ADN o ARNip mediante incubación a temperatura ambiente durante 10 minutos a una razón de N/P apropiada. Se añadieron tales complejos a PBMC primarias o esplenocitos para estudios in vitro o se inyectaron por vía subcutánea con fines de vacunación. La figura 1 muestra la decoración con PADRE de (conjugación a) dendrímero PAMAM de quinta generación.
Para mantener la superficie altamente cargada positivamente para la unión de múltiples ácidos nucleicos, una molécula de dendrímero tiene normalmente dos péptidos de PADRE conjugados a su superficie de modo que todavía mantendrá su carga neta positiva. La adición de PADRE a los dendrímeros da como resultado la selección específica como diana de APC, y una fuerte ayuda de CD4.
Resultados
Se caracterizaron los PADRE-dendrímeros preparados. Se preparó el conjugado de péptido-dendrímero mediante simple acoplamiento de amida entre el extremo terminal de -COOH del péptido y los grupos amina de dendrímero. En la reacción se usó una razón de exposición de péptido/dendrímero de 2:1, buscando la unión de tan sólo unos pocos péptidos por dendrímero, con el fin de mantener la mayor parte de los grupos amina libre para desarrollar grandes cargas positivas en el dendrímero. Se purificó el producto mediante diálisis frente a agua pura durante al menos 24 h y después se secó a vacío. Se caracterizó el producto recogido, un aceite transparente, mediante 1H-RMN, UV-Vis y espectroscopía de masas de MALDI-TOF. La RMN muestra grandes picos correspondientes a los protones del dendrímero y un pequeño conjunto de picos para los protones del péptido. El espectro de masas de MALDI-TOF del conjugado de PADRE-dendrímero muestra un pico a una razón de m/z aproximadamente 3.000 unidades superior al pico observado para el dendrímero por sí solo. El exceso de masa corresponde a aproximadamente 2 epítopos peptídicos.
Los datos establecieron que están presentes un promedio de dos PADRE en cada dendrímero. Se mostró la administración in vitro de múltiples ácidos nucleicos al interior de APC autólogas. La administración/transfección con múltiples nucleótidos in vitro de células mononucleares periféricas primarias humanas se logró mejor a las razones de carga de 1:5 y 1:10. La figura 2 muestra la administración de ARNbc (~86%) mediante PADRE-dendrímeros al interior de células B humanas purificadas en las que se incubó ARNbc marcado con Alexa Fluor complejado con (conjugado a) PADRE-dendrímero con células B durante 4 horas. Se tiñeron las células con CD19/FITC y el canal rojo (PE) representa células con el ARNbc/Alexa Fluor.man
Haciendo referencia a la figura 3, se mostró la administración de ADN in vivo de PADRE-dendrímeros. Se inyectaron plásmidos que codificaban para GFP o TRP-2 solos o complejados con PADRE-dendrímero, o dendrímero (es decir, dendrímero no complejado con PADRE). Las imágenes muestran la expresión de GFP en la piel (izquierda) y córnea (derecha) 24 y 16 horas tras la inyección. Se demuestra la expresión eficaz de GFP tanto en la piel como en la córnea 24 y 16 horas tras la inyección de complejos de PADRE-dendrímero. Se demostró la selección como diana de los ganglios linfáticos in vivo. Ocho días tras inyectarse complejos de PADRE-dendrímero/plásmido de GFP por vía subcutánea (5 |ig de plásmido total), se extirpó el ganglio linfático adyacente y se comparó con ganglios linfáticos de a ratón al que se inyectó ADN de GFP solo. Se tomaron imágenes de microscopio de fluorescencia en ganglios linfáticos con malla en el día ocho tras la inmunización. Se observó expresión de antígeno en el ganglio linfático adyacente al sitio de inyección, pero no se observó expresión de antígeno en un ganglio linfático de control.
Se demostró la selección como diana de los ganglios linfáticos in vivo. Ocho días tras inyectarse complejos de PADRE-dendrímero/plásmido de GFP por vía subcutánea (5 |ig de plásmido total), se extirpó el ganglio linfático adyacente y se comparó con ganglios linfáticos de un ratón al que se le inyectó ADN de GFP solo. Se tomaron imágenes de microscopio de fluorescencia en ganglios linfáticos con malla en el día ocho tras la inmunización. Se observó expresión de antígeno en el ganglio linfático adyacente al sitio de inyección, pero no se observó expresión de antígeno en un ganglio linfático de control.
Estos datos demuestran claramente que la plataforma de nanopartículas con adyuvantes dirigidas descrita en el presente documento da como resultado la administración génica, expresión robusta del antígeno codificado y presentación de antígeno. Por tanto, las nanopartículas de PADRE-dendrímero descritas en el presente documento son una plataforma y herramienta de administración con adyuvante/dirigida novedosa y potente para la administración de ARNbc.
Ejemplo 2 - Administración dirigida in vitro y eficiencia de transfección
Haciendo referencia a la figura 4, la administración dirigida in vitro de PBMC da como resultado una eficiencia de transfección de células B del 77%. Se obtuvieron PBMC humanas de donantes sanos. Se cultivaron PBMC a 6 millones de células por ml de medios RPMI con suero bovino fetal al 10%. El plásmido que codificaba para GFP a 5 |ig se diluyó en 100 ul de un tampón fisiológico, PBS, y se añadieron 5 |ig de PADRE-dendrímero en 50 ul de PBS a ADN mientras se agitaba. Tras 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, después se añadió la mezcla/complejo del plásmido de GFP y PADRE-dendrímero a PBMC. Veinticuatro horas tras la incubación en una incubadora a 37°C/CÜ2 al 5%, se tiñeron las PBMC con CD19 PE y se analizaron las células mediante citometría de flujo. Se observó la expresión de GFP en el 43% de las PBMC totales mientras que cuando se reguló en células B el 77% de las células B expresaron GFP. Los grupos de control, PBMC incubadas con las mismas razones de dendrímero y plásmido de GFP, mostraron aproximadamente el 11% y el 7% de expresión de GFP en PBMC totales o células B. No se observó ningún cambio de viabilidad principal en comparación con PBMC sólo con medios. Esto es un experimento representativo de varios. Esto experimentos demuestran i) la administración de plásmido de GFP al interior de PBMC y en particular a células que expresan MHC de clase II (células B), y ii) la expresión de la GFP por PBMC y en particular por células B.
Ejemplo 3 - Administración de péptidos/proteínas al interior de DC de ratón in vivo y células B humanas in vitro
Se administró PDD/albúmina-FITC al interior de células B humanas purificadas (figura 5). Haciendo referencia a la figura 6 , esta figura muestra el direccionamiento de PADRE-dendrímero a, y la eficacia en, DC de ratón in vivo y una línea temporal para la inyección y el análisis de ganglio linfático. Los resultados de este experimento muestran que i) (figura 5) albúmina-FITC, una proteína, mezclada con PADRE-dendrímero se administró en células B humanas en menos de dos horas, ii) (figura 6) en el día 5 tras la inyección subcutánea, PADRE, un epítopo, conjugado a dendrímero se administró al interior de DC y células B del ganglio linfático in vivo (el PADRE-dendrímero se complejó con plásmido de GFP para visualizar la administración del complejo a ganglio linfático/células B/DC), iii) (figura 7) en el día 5 tras la inyección subcutánea, epítopo cooperador de HA de influenza, un epítopo, conjugado a dendrímero se administró al interior de DC del ganglio linfático in vivo (el PADRE-dendrímero se complejó con plásmido de GFP para visualizar la administración del complejo a DC de ganglio linfático). Estos datos fueron representativos de varios experimentos y en algunos se extirparon los ganglios linfáticos en el día 3 tras la inyección subcutánea de PADRE-dendrímero o HA-dendrímero cada uno complejado con plásmido de GFP. Estos resultados establecen ejemplos de la administración a APC incluyendo células B y DC de una proteína conjugada a FITC mediante visualización de FITC, así como la administración de dos péptidos, epítopos PADRE y cooperador de HA conjugados a dendrímero en los que el plásmido de GFP se complejó con el péptido-dendrímero para facilitar la visualización y el análisis del complejo (péptido unido a complejo de dendrímero con plásmido que codifica para GFP) en las células de ganglios linfáticos.
Se mostró la transfección específica in vitro e in vivo de DC mediante datos de citometría de flujo in vivo sobre la selección como diana y expansión de DC en un ganglio linfático adyacente, 5 días tras la inyección de la nanopartícula (PADRE-dendrímero/plásmido que codifica para GFP) frente a controles (el 78% frente al ~7% de expresión de GFP). El dendrímero derivatizado con PADRE (PDD) potencia la administración debido a su efecto opsonizado asistido de PADRE que se une con alta afinidad a MHC de clase II expresado en APC. De manera similar, se administró HA-dendrímero (DRHA)/plásmido de GFP in vivo en los ganglios linfáticos circundantes, cuando se inyectó por vía subcutánea (figura 7). Obsérvese que, en ratones, PADRE se une al MHC de clase II de lAb (ratones C57BL) (figura 6) mientras que epítopo de HA seleccionado se une al MHC de clase II de IAd (ratones Balb/c) (figura 7). Se ha mostrado la viabilidad de la administración in vivo en dos variedades de ratones diferentes con dos diferentes epítopos con resultados similares. La administración dirigida a APC que da como resultado la expresión de GFP mediante PADRE-dendrímero/plásmido de GFP en el interior de PBMC humanas (figura 4), células B humanas purificadas (figura 4) y en esplenocitos de ratones C57BL, y la administración de PADRE-dendrímero/ARNbc al interior de células B humanas (figura 8) y de PBMC de mono (figura 9) son evidencia in vitro adicional de la administración de péptido a PAPC mediante las composiciones descritas en el presente documento. Dado que el uso de dos péptidos de direccionamiento diferentes, cuya única característica es unirse al MHC de clase II, funciona tal como se muestra en los experimentos descritos en el presente documento, los métodos, kits, ensayos y composiciones descritos en el presente documento abarcan todos los péptidos de unión a MHC de clase II. Haciendo referencia a la figura 7, también se preparó dendrímero conjugado a epítopo cooperador de HA de influenza (HDD).
Ejemplo 4 - Administración de PADRE-dendrímero de ARNbc al interior de células B humanas y PBMC de primate no humano y administración de PADRE-dendrímero de plásmido al interior de PBMC de primate no humano
Haciendo referencia a la figura 8, PADRE-dendrímeros complejados con ARNbc (un ácido nucleico) mostraron una administración dirigida in vitro. Se diluyeron 0,1 |ig de ARNbc en 100 ul de PBS y se añadieron 0,7 |ig del PADRE-dendrímero en 20 ul a ARNbc marcado con Alexa Fluor mientras se agitaba. Se añadió el complejo, tras una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente, a un millón de células B purificadas (en RPMI más suero bovino fetal al 10%) en pocillos de una placa de 24 pocillos. Aproximadamente una hora tras la incubación en una incubadora a 37°C/CO2 al 5%, se lavaron las células y se colocaron de nuevo en los pocillos (en 1 ml de RPMI reciente más suero bovino fetal al 10%) y se analizaron con microscopio de fluorescencia en el canal rojo. La imagen superpuesta de células en campo brillante y canal rojo demuestra la captación de ARNbc marcado con Alexa Fluor por células B humanas (figura 8). Se incubaron las células durante la noche en una incubadora a 37°C/CO2 al 5% cuando se tiñeron con CD19 (un marcador de células B) y se analizaron mediante citometría de flujo (figura 2). Tal como se muestra en la figura 2, >80% de las células B fueron positivas para Alexa Fluor (marcado en ARNbc) frente a aproximadamente el 6% para el control, dendrímero/ARNbc-Alexa Fluor. Estos resultados demuestran claramente la robusta administración de ácidos nucleicos a PAPC mediante PADRE-dendrímero.
Se sometieron a prueba PBMC de una muestra de babuino (Papio hamadryas), y dos muestras diferentes de macaco cangrejero (Macaca fascicularis). Las imágenes de microscopio de fluorescencia mostradas en la figura 9 son representativas, tomadas dos horas tras la adición de PADRE-dendrímero o dendrímero, cada una complejada con ARNbc/Alexa Fluor. De manera similar, se añadieron PADRE-dendrímero o dendrímero complejado con plásmido de GFP a las PBMC y se analizaron 24 horas tras la incubación (figura 10). Los resultados muestran que, en menos de 2 horas, PADRE-dendrímero administra ácidos nucleicos al interior de las PBMC de los monos, mientras que el dendrímero sólo muestra una administración moderada. Estos resultados sugieren fuertemente que PADRE-dendrímero funciona en primates no humanos.
Ejemplo 5 - Evaluación de respuestas inmunitarias mediadas por células frente a la vacunación
Los ensayos, kits, composiciones y métodos descritos en el presente documento proporcionan varias ventajas. Estas ventajas incluyen: un espectro completo de epítopos nativos/procesados de manera natural se vuelve disponible para su evaluación inmunológica en las células del mismo individuo; la infección por VEB de PBMC, infectando células estimuladas mediante vectores virales, usando células que expresan CD40, cargando con péptido células requieren mucho trabajo/son caros y no son viables para laboratorios no especializados en todos los centros; a diferencia de los métodos actuales de administración de ADN que no son eficaces e inducen escasas respuestas inmunitarias, los métodos descritos en el presente documento dan como resultado fuertes respuestas de anticuerpos que implican una alta expresión; y los métodos descritos en el presente documento son rápidos. Además, la administración viral de genes a las PBMC da como resultado fuertes respuestas inmunitarias frente a vectores virales y la manipulación de vectores virales está asociada con cuestiones de seguridad.
En un método de evaluación de la eficacia de una vacuna, un dendrímero marcado con PADRE produce un complejo con antígeno, ADN o ARN que codifica para el antígeno de vacuna en 10 min (tales complejos se demostraron mediante electroforesis). Este complejo se cultiva conjuntamente con PBMC previamente vacunadas (durante la noche) y se usa para transfectar APC. Tales células se tratan con mitomicina C y se usan como células diana (APC autólogas) que expresan el antígeno que se usó en la vacunación. El PADRE sobre la superficie de dendrímero selecciona como diana MHC de clase II en las APC.
Se demostró la transfección de células T CD3 primarias entre las PBMC humanas. Se complejaron diez ug de plásmido de GFP con una nanopartícula tal como se describe en el presente documento durante 10 minutos. Se cultivó conjuntamente el complejo de nanopartícula y ADN durante la noche con PBMC. Se realizó un análisis de FACS en los días 3 y 7 tras la transfección. También se demostró la transfección de células B CD19 purificadas primarias, estableciendo la viabilidad de transfección de APC mediante cultivo conjunto con nanopartícula/plásmido de GFP. Se complejaron diez ug de plásmido de GFP con la nanopartícula durante 10 minutos. Se cultivó conjuntamente el complejo de nanopartícula y ADN durante la noche con células B humanas purificadas, y se realizó el análisis de FACS en el día 2 tras la transfección.
Haciendo referencia a las figuras 15-17, los resultados experimentales mostrados en estas figuras demuestran la utilidad de los dendrímeros descritos en el presente documento para la administración de ácidos nucleicos y péptidos/polipéptidos y para evaluar la eficacia de vacunas en mamíferos. En la figura 15, altos niveles de administración (73%) de PDD/albúmina-FITC en células B humanas muestran claramente que la plataforma puede usarse con proteínas/polipéptidos o sus antígenos similares. En la figura 16, los altos niveles de administración (77%) de PDD/plásmido de GFP en células B humanas muestran claramente que la plataforma administra eficazmente plásmidos al interior de células B y da como resultado la expresión de proteína/antígeno codificado. La figura 17 muestra que se midió la eficacia de vacunación en ratones; obsérvese las diferencias significativas en los niveles de IFN-y en ratones vacunados.
La figura 14 es una fotografía de resultados que muestra A) espectros UV de dendrímero, PADRE y dendrímero-PADRE. Se realizaron espectros UV de péptido-dendrímero mediante métodos convencionales. El pico de fenilalanina observado para dendrímero de G5-PADRE muestra que el péptido, PADRE, se añade al dendrímero. B) Electroforesis en gel de agarosa y análisis de movilidad electroforético de complejo de dendrímero/ADN. Se realizó el análisis de la formación de complejo y la unión de PDD a ADN examinando el retardo en la migración del ADN de plásmido durante la electroforesis en gel de agarosa. Se sometieron a prueba complejos de dendrímero derivatizado con péptido (PDD)/plásmido para determinar su retención de ADN en electroforesis en gel. Se realizó electroforesis en gel para PDD/plásmido y controles: ADN solo, dendrímero solo y muestras de [PDD/plásmido] en las que había diversas razones de (P:N) 1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 1:20. El PDD pudo retener plásmido de ADN en razones > (1:2). La figura 15 es una serie de diagramas de gráficos de puntos de citometría de flujo que muestra la administración específica de células de proteínas/antígenos. Se administró PDD/albúmina-FITC al interior de células B humanas purificadas. Se cultivaron conjuntamente PBMC con cualquiera de albúmina-FITC sola, [dendrímero/albúmina-FITC] o [dendrímero-PADRE (PDD)/albúmina-FITC]. Veinticuatro horas tras la incubación en una incubadora a 37°C/CÜ2, se analizaron células con cada tratamiento en citometría de flujo y se regularon para células B humanas usando anticuerpo anti-CD19-APC. Se usó una razón de 1:10 (p:p) de albúmina-FITC y PDD o dendrímero. Los altos niveles de administración (73%) de PDD/albúmina-FITC en células B humanas muestran claramente que la plataforma puede usarse con proteína / polipéptido o sus antígenos similares. La figura 16 es una serie de histogramas de citometría de flujo que muestran la transfección in vitro de células B humanas (CD19), panel superior, y población de esplenocitos de ratones, panel inferior, con PDD (PADRE-dendrímero (PDD)/GFP-plásmido). Panel superior, se cultivaron conjuntamente células B humanas purificadas con cualquiera de plásmido de GFP solo, [dendrímero / plásmido de GFP] o [dendrímero-PADRE (PDD) / plásmido de GFP] a las razones de P:N indicadas. Veinticuatro horas tras la incubación en una incubadora a 37°C/CÜ2, se analizaron células con cada tratamiento en citometría de flujo para determinar la expresión de proteína GFP. Los altos niveles de administración (77%) de PDD/plásmido de GFP en células B humanas muestran claramente que la plataforma administra eficazmente plásmidos al interior de células B y da como resultado la expresión de proteína / antígeno codificado. El panel inferior muestra diagramas de gráficos de puntos de citometría de flujo cuando se realizaron experimentos similares con esplenocitos de ratones C57BL no expuestos y muestra de manera similar la transfección con GFP de células positivas para CD-19 (células B). La figura 17 es un gráfico que muestra la generación de APC que expresan antígeno. Se inmunizaron ratones C57BL hembra de seis a ocho semanas de edad, en grupos de cinco, dos veces con proteína OVA en TiterMax (Sigma). Diez días tras la última inmunización, se recogieron los esplenocitos de ratones inmunizados y se sembraron en placa a 1 millón de células por pocillo en cuatro pocillos de una placa de 24 pocillos en RPMI con FBS al 10%, los pocillos se marcaron como “medios solos”, “PADRE-dendrímero (PDD) solo”, “PADRE-dendrímero (PDD)/plásmido de control” y “PADRE-dendrímero (PDD)/plásmido de OVA”. Se añadieron cinco microgramos de plásmidos complejados con PADRE-dendrímero (en una razón de 1:10) a los pocillos apropiados (células diana). La mañana siguiente, cada célula tratada / transfectada se añadió a esplenocitos sin tratar del mismo ratón en pocillos separados. Veinticuatro horas tras la estimulación, se detectaron los niveles de INF-y usando ELISA (Thermo) en los sobrenadantes. Los niveles de IFN fueron significativamente (valor de P < 0,006) superiores en pocillos que contenían esplenocitos tratados con [PDD/plásmido de OVA] que todos los controles lo cual muestra que el kit puede usarse para la evaluación de respuestas de células T tras la vacunación. La inducción de respuestas de células T se verificó mediante experimentos de exposición usando 50.000 B16-OVA, así como mediante estimulación con péptido OVA (no mostrado).
Ejemplo 6 - Preparación de péptido de unión a DR universal-dendrímeros para su uso en la evaluación de la eficacia de una vacuna y evaluación de la inmunogenicidad de un fármaco o producto biológico
Los péptidos de unión a DR universales (incluyendo los mencionados en la tabla 1) pueden adquirirse de cualquier fuente comercial o sintetizarse, pero generalmente se adquieren de un proveedor comercial con una pureza mínima del 95%. Se usan métodos convencionales para la unión del péptido a dendrímeros terminados en amino. La unión del péptido de PADRE a dendrímeros terminados en amino, por ejemplo, se investiga usando dos rutas de síntesis. El extremo amino-terminal del epítopo peptídico debe protegerse mediante acetilación. Una ruta usa el ácido carboxílico del residuo de cisteína terminal para lograr la unión mediante química de amidación convencional. La segunda ruta aprovecha el tiol de la cisteína del péptido (si el péptido no tiene este aminoácido, se añadirá) para hacerlo reaccionar con grupos bromuro añadidos a la superficie de dendrímero mediante tratamiento previo con cloruro de bromocaproílo. Ambas rutas permiten la funcionalización de dendrímeros con epítopos peptídicos, pero la segunda ruta proporciona un espaciador de 5-metileno entre la superficie de dendrímero y el epítopo. Se han unido diferentes números de epítopos por dendrímero. Un promedio de dos a seis epítopos por dendrímero potencia la propiedad de direccionamiento de los agentes de administración de ADN. Sin embargo, deja un gran número de grupos amina sin reaccionar de modo que el dendrímero adquirirá una gran carga positiva mediante protonación a valores de pH fisiológico. La caracterización de los dendrímeros derivatizados con péptido se realizó mediante UV-visible y espectroscopía de fluorescencia, análisis elemental, y espectrometría de masas MALDI-TOF. La razón de péptido-dendrímero con respecto a ADN se optimizó con el fin de favorecer la presentación del epítopo sobre la superficie del péptido-dendrímero, así como para permitir la formación de complejo de ADN. Se determinó que las razones óptimas para la administración génica eficaz y presentación de antígeno codificado por ADN, usando PBMC humanas, eran las razones cargadas de plataforma con respecto a plásmido de 5:1, 10:1,20:1.
Ejemplo 7 - Métodos sencillos y rápidos para la evaluación inmunológica
Se realizan transfecciones mediante la adición de una primera porción o muestra de PBMC a una mezcla de plásmido(s) que contiene(n) el gen diana (es decir, gen que codifica para el antígeno de interés) complejado con un dendrímero derivatizado con péptido (por ejemplo, un dendrímero de G5). Las PBMC y APC transfectadas resultantes se congelan en d Ms O y se usan como APC autólogas cuando se cultivan conjuntamente con una segunda muestra o porción de PBMC a partir del mismo individuo. Una porción de las PBMC de cada individuo se incubará durante la noche con un complejo compuesto por nanopartícula más plásmido que contiene el gene que codifica para el antígeno de interés. Al día siguiente, las PBMC tratadas con PDD/antígeno (células diana, PBMC cuando se tratan con PDD/plásmido o antígeno se vuelven APC que expresan antígeno) que expresan el antígeno en el contexto del MHC del individuo se cultivan conjuntamente con la segunda muestra de PBMC (células efectoras) a partir del individuo.
El/los péptido(s) de unión a DR universal(es) en el complejo de nanopartículas sirve(n) como ligando para moléculas de MHC de clase II presentes en las APC. En el presente documento se describe un enfoque novedoso de usar péptido(s) de unión a DR universal(es) por su capacidad para unirse a MHC de clase II como marcador de guiado para las APC. Las APC transfectadas que sirven como células diana se tratan normalmente con mitomicina C. Este tratamiento con mitomicina C tras la transfección de las APC con antígeno de vacuna da como resultado la eliminación de su proliferación, y la reducción de la expresión de citocinas, dando así como resultado la eliminación de la interferencia de las APC diana así como la reducción de posible fondo inducido por PADRE en ensayos de CTL.
Ejemplo 8 - Generación de APC que presentan antígeno codificado por ARN conjugado a dendrímeros
Las figuras 11 y 12 muestran resultados de experimentos que implican dendrímero (DRHA) decorado con epítopo de células T cooperadoras de hemaglutinina (HA) de influenza SFERFEIFPKEC (SEQ ID NO: 28), esplenocitos de ratones singénicos (células diana), células T CD8+ que reaccionan con MHC de clase 1-HA de ratones singénicos (células efectoras). En el experimento, se mezcló una mezcla de ARNm (incluyendo ARN de hemaglutinina) derivado a partir de tumores que expresan hemaglutinina con DRHA y después se añadió a células T que reconocían el péptido de hemaglutinina restringido para MHC de clase I. Se midió IFN gamma. Las figuras 12 y 13 muestran que sólo DRHA pudo inducir un nivel apreciable de IFN gamma. Dado que las células T CD8+ específicas para hemaglutinina sólo pueden reconocer la hemaglutinina si la proteína se traduce, procesa y compleja con el MHC de clase I, pero no pueden reconocer el péptido de HA restringido para MHC de clase II conjugado con el dendrímero o expuesto en moléculas de MHC de clase II, estos resultados muestran claramente que los dendrímeros conjugados con péptido restringido para MHC de clase II pueden can transfectar eficazmente las APC con ARNm. Estos ARNm que incluyen el antígeno de interés se traducen para dar una proteína, se procesan y se exponen en moléculas de MHC. Este experimento sugiere fuertemente que una respuesta inmunitaria frente a cualquier antígeno asociado a tumor puede detectarse mediante el uso de APC transfectadas por péptidodendrímeros cargados con una mezcla de ARN que también contiene el ARNm de interés. Esto es particularmente importante cuando se necesita evaluar una respuesta inmunitaria a partir de antígenos asociados a tumor desconocidos expresados por un tumor.
Ejemplo 9 - Preparación de péptido de unión a DR universal-dendrímeros adicionales
Se decora un dendrímero con dos péptidos de unión a MHC de clase II, que cubren cada uno un gran número de alelos de MHC. Alternativamente, para tener una opción de síntesis menos complicada, los dos conjuntos de dendrímeros se producen cada uno con uno de estos péptidos y se mezclan 1:1 en el punto de uso.
Una primera plataforma está compuesta por dendrímero decorado con péptido FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 30), y conjugación del dendrímero con el péptido FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 30). Hay un promedio de 2 péptidos en cada dendrímero. Este dendrímero derivatizado péptido se denomina “FNN-DR”. Se notifica que este péptido de unión a MHC universal se une a primates no humanos, Balb/c, C57B1, así como a los siguientes alelos en seres humanos: DRB1*1101, DRB1*1104, HLA-DPB1*0402, HLA-DRB1*1101 y HLA-DPB1*0401.
Una segunda plataforma está compuesta por dendrímero decorado con péptido SSVFNVVNSSIGLIM (SEQ ID NO: 29), y conjugación del dendrímero con el péptido SSVFNVVNSSIGLiM (SEQ ID NO: 29). Hay un promedio de 2 péptidos en cada dendrímero. Este dendrímero derivatizado con péptido se denomina “SSV-DR”. Este péptido de unión a DR universal se une a los siguientes alelos: DRB1*0401 (15%), DRB1*0405, DRB1*1101, DRB1*1302, DRB1*0701, DRB1*0802, DRB1*0901, DRB1*1501, DRB1*0101 (24%) y DRB5*0101.
Ejemplo 10 - Plataforma de supermotivo-dendrímero para seleccionar como diana APC
Los supermotivos seleccionan como diana MHC de clase II y, a diferencia de epítopos de células T cooperadoras universales, los péptidos de cadena invariable asociados a clase II (CLIP) no tienen actividad de células T cooperadoras, haciendo por tanto que sean un buen candidato para la selección como diana universal de MHC de clase II, en particular para aplicaciones de monitorización inmunológica, y la administración cuando no se desea la potenciación inmunitaria. También pueden usarse dendrímeros conjugados a CLIP para administrar, por ejemplo, ARNip de FoxP3 o plásmido(s) para inhibir o inducir la proliferación o actividad de células T reguladoras (células TReg), ya que las células Treg expresan MHC de clase II. Esta plataforma puede usarse para seleccionar como diana las a Pc para i) administración específica de fármacos antimicrobianos o antiparasitarios frente a macrófagos, ii) administración de ARNip o ADN específico de célula al interior de células Treg, y iii) para preparar un kit de monitorización inmunológica de células T (que requiere menos o nada de activación). La plataforma puede usarse, por ejemplo, para dirigir fármacos (por ejemplo, fármacos antileishmaniasis) para prevenir o tratar la infección por un parásito (por ejemplo, Leishmania) o microbio patógeno que vive en macrófagos y/o células dendríticas. Usando la plataforma, puede reducirse la dosis y toxicidad de un fármaco de este tipo.
Ejemplo 11 - Medición de respuestas de células T y B para evaluar la respuesta inmunitaria total frente a una vacuna u otra intervención

Claims (23)

  1. REIVINDICACIONES
    Método de evaluación de una respuesta de células T frente a una vacuna o un producto biológico, comprendiendo el método las etapas de:
    a) preparar o proporcionar una composición que comprende una pluralidad de dendrímeros poliméricos cargados altamente ramificados que tienen cada uno conjugados a los mismos al menos un péptido de unión a DR universal y al menos un antígeno peptídico o polipeptídico o un ácido nucleico que codifica para el al menos un antígeno, en el que el al menos un péptido de unión a DR universal y el ácido nucleico o al menos un antígeno peptídico o polipeptídico están conjugados a la superficie exterior de la pluralidad de dendrímeros poliméricos cargados altamente ramificados de tal manera que el al menos un péptido de unión a DR universal se une específicamente a células presentadoras de antígeno profesionales (pApC), en el que la vacuna o el producto biológico comprende el antígeno;
    b) proporcionar una primera muestra que comprende PAPC, obtenida a partir del sujeto antes de la vacunación del sujeto o la administración del producto biológico al sujeto;
    c) dividir la primera muestra en una primera porción de la primera muestra y una segunda porción de la primera muestra;
    d) poner en contacto la primera porción de la primera muestra con la composición en condiciones de incubación de tal manera que la pluralidad de dendrímeros poliméricos cargados altamente ramificados se captan por las PAPC y de tal manera que el antígeno se procesa por las PAPC y se presenta por las PAPC en combinación con MHC de clase II;
    e) lavar la primera porción de la primera muestra y la segunda porción de la primera muestra;
    f) combinar la primera porción de la primera muestra y la segunda porción de la primera muestra a dos o más razones, dando como resultado una primera pluralidad de mezclas;
    g) incubar la primera pluralidad de mezclas durante una o más horas;
    h) examinar la pluralidad de mezclas para determinar la presencia de al menos una molécula o un marcador que es indicativo de una respuesta de células T frente a la vacuna o el producto biológico y determinar el nivel de la al menos una molécula o un marcador;
    i) proporcionar una segunda muestra que comprende PAPC, obtenida a partir del sujeto después de que el sujeto se haya vacunado o haya recibido el producto biológico;
    j) dividir la segunda muestra en una primera porción de la segunda muestra y una segunda porción de la segunda muestra;
    k) poner en contacto la primera porción de la segunda muestra con la composición en condiciones de incubación de tal manera que la pluralidad de dendrímeros poliméricos cargados altamente ramificados se captan por las PAPC en la primera porción de la segunda muestra y de tal manera que el antígeno se procesa por las PAPC en la primera porción de la segunda muestra y se presenta por las PAPC en la primera porción de la segunda muestra en combinación con MHC de clase II;
    l) lavar la primera porción de la segunda muestra y la segunda porción de la segunda muestra;
    m) combinar la primera porción de la segunda muestra y la segunda porción de la segunda muestra a dos o más razones, dando como resultado una segunda pluralidad de mezclas;
    n) incubar la segunda pluralidad de mezclas durante una o más horas;
    o) examinar la segunda pluralidad de mezclas para determinar la presencia de la al menos una molécula o un marcador y determinar el nivel de la al menos una molécula o un marcador;
    p) comparar el nivel de la al menos una molécula o un marcador en la primera pluralidad de mezclas con el nivel de la al menos una molécula o un marcador en la segunda pluralidad de mezclas; y
    q) correlacionar un nivel superior de la al menos una molécula o marcador en la segunda pluralidad de mezclas en comparación con la primera pluralidad de mezclas con una respuesta de células T frente a la vacuna o el producto biológico.
  2. 2. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa d) de poner en contacto la primera porción de la primera muestra con la composición comprende añadir mitomicina C durante aproximadamente 30 minutos.
  3. 3. Método según la reivindicación 1, en el que la al menos una molécula o un marcador que es indicativo de una respuesta de células T frente a la vacuna o el producto biológico comprende una citocina.
  4. 4. Método según la reivindicación 3, en el que la citocina es IFN-y.
  5. 5. Método según la reivindicación 1, en el que la al menos una molécula o un marcador que es indicativo de una respuesta de células T frente a la vacuna o el producto biológico comprende activación o proliferación de células T.
  6. 6. Método según la reivindicación 1, en el que examinar las pluralidades de mezclas primera y segunda para determinar la presencia de la al menos una molécula o un marcador y determinar el nivel de la al menos una molécula o un marcador se realizan usando un ensayo de citocinas o ensayo de CTL.
  7. 7. Método según la reivindicación 1, en el que el al menos un péptido de unión a DR universal es un epítopo de unión a pan-HLA-DR (PADRE).
  8. 8. Método según la reivindicación 7, en el que el al menos un péptido de unión a DR universal son dos epítopos PADRE que tienen cada uno la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
  9. 9. Método según la reivindicación 1, en el que el al menos un dendrímero polimérico altamente ramificado cargado es un dendrímero de poli-amidoamina (PAMAM).
  10. 10. Método de evaluación de una respuesta de células T frente a una vacuna u otra intervención terapéutica, comprendiendo el método las etapas de:
    a) preparar o proporcionar una primera composición que comprende una pluralidad de dendrímeros poliméricos cargados altamente ramificados que tienen cada uno conjugados a los mismos al menos un péptido de unión a DR universal y al menos un antígeno peptídico o polipeptídico o un ácido nucleico que codifica para el al menos un antígeno, en el que el al menos un péptido de unión a DR universal y el ácido nucleico o al menos un antígeno peptídico o polipeptídico están conjugados a la superficie exterior de la pluralidad de dendrímeros poliméricos cargados altamente ramificados de tal manera que el al menos un péptido de unión a DR universal se une específicamente a PAPC,
    en el que la vacuna u otra intervención terapéutica comprende el antígeno;
    b) proporcionar una primera muestra que comprende PAPC, obtenida a partir del sujeto después de que el sujeto se haya vacunado o haya recibido la otra intervención terapéutica;
    c) dividir la primera muestra en al menos una primera porción y una segunda porción;
    d) poner en contacto al menos la primera porción con la primera composición en condiciones de incubación de tal manera que la pluralidad de dendrímeros poliméricos cargados altamente ramificados se captan por las PAPC y de tal manera que el antígeno se procesa por las PAPC y se presenta por las PAPC en combinación con MHC de clase II;
    e) poner en contacto la segunda porción con una segunda composición que comprende una pluralidad de dendrímeros poliméricos cargados altamente ramificados que tienen cada uno conjugados a los mismos al menos un péptido de unión a DR universal y al menos un péptido o polipéptido de control negativo o un ácido nucleico que codifica para el al menos un péptido o polipéptido de control negativo, en el que el al menos un péptido de unión a DR universal y el al menos un antígeno peptídico o polipeptídico de control o ácido nucleico que codifica para el al menos un péptido o polipéptido de control negativo están conjugados a la superficie exterior de la pluralidad de dendrímeros poliméricos cargados altamente ramificados de tal manera que el al menos un péptido de unión a DR universal se une específicamente a PAPC;
    f) examinar al menos la primera porción puesta en contacto con la primera composición para determinar la presencia de al menos una molécula o un marcador que es indicativo de una respuesta de células T frente a la vacuna u otra intervención terapéutica, y determinar el nivel de la al menos una molécula o un marcador;
    g) examinar al menos la segunda porción puesta en contacto con la segunda composición para determinar la presencia de la al menos una molécula o un marcador, y determinar el nivel de la al menos una molécula o un marcador;
    h) comparar el nivel de la al menos una molécula o un marcador en al menos la primera porción puesta en contacto con la primera composición con el nivel de la al menos una molécula o un marcador en al menos la segunda porción puesta en contacto con la segunda composición; y
    i) correlacionar un nivel superior de la al menos una molécula o marcador en al menos la primera porción puesta en contacto con la primera composición en comparación con al menos la segunda porción puesta en contacto con la segunda composición con una respuesta de células T frente a la vacuna u otra intervención terapéutica.
  11. 11. Método según la reivindicación 10, en el que el al menos un antígeno peptídico o polipeptídico de control es albúmina o luciferasa.
  12. 12. Método según la reivindicación 10, en el que la al menos una molécula o un marcador que es indicativo de una respuesta de células T frente a la vacuna u otra intervención terapéutica comprende una citocina.
  13. 13. Método según la reivindicación 12, en el que la citocina es IFN-y.
  14. 14. Método según la reivindicación 10, en el que la al menos una molécula o un marcador que es indicativo de una respuesta de células T frente a la vacuna u otra intervención terapéutica comprende activación o proliferación de células T.
  15. 15. Método según la reivindicación 10, en el que examinar al menos la primera porción puesta en contacto con la primera composición y al menos la segunda porción puesta en contacto con la segunda composición para determinar la presencia de la al menos una molécula o un marcador, y determinar el nivel de la al menos una molécula o un marcador en al menos la primera porción puesta en contacto con la primera composición y al menos la segunda porción puesta en contacto con la segunda composición se realizan usando un ensayo de citocinas o ensayo de CTL.
  16. 16. Método para evaluar la inmunogenicidad de un fármaco o producto biológico, comprendiendo el método las etapas de:
    a) proporcionar una muestra que comprende PBMC obtenidas a partir de un sujeto;
    b) dividir la muestra en al menos una primera porción, una segunda porción y una tercera porción;
    c) añadir a la segunda porción una composición que comprende una pluralidad de dendrímeros poliméricos cargados altamente ramificados que tienen cada uno conjugados a los mismos al menos un péptido de unión a DR universal y al menos un fármaco o producto biológico, en el que el al menos un péptido de unión a DR universal y el fármaco o producto biológico están conjugados a la superficie exterior de la pluralidad de dendrímeros poliméricos cargados altamente ramificados de tal manera que el al menos un péptido de unión a DR universal se une específicamente a PAPC;
    d) añadir a la tercera porción una composición que comprende una pluralidad de dendrímeros poliméricos cargados altamente ramificados que tienen cada uno conjugados a los mismos al menos un péptido de unión a DR universal y al menos un polipéptido de control negativo o ácido nucleico que codifica para el polipéptido de control negativo, en el que el al menos un péptido de unión a DR universal y el polipéptido de control negativo o ácido nucleico que codifica para el polipéptido de control negativo están conjugados a la superficie exterior de la pluralidad de dendrímeros poliméricos cargados altamente ramificados de tal manera que el al menos un péptido de unión a DR universal se une específicamente a PAPC;
    e) incubar al menos la primera porción, segunda porción y tercera porción;
    f) mezclar una primera alícuota de la primera porción con la segunda porción o una alícuota de la misma, mezclar una segunda alícuota de la primera porción con la tercera porción o alícuota de la misma, e incubar las mezclas en condiciones que permiten la proliferación y activación de células T;
    g) medir la proliferación o activación de células T en la mezcla de la primera alícuota de la primera porción con la segunda porción;
    h) medir la proliferación o activación de células T en la mezcla de la segunda alícuota de la primera porción con la tercera porción; y
    i) correlacionar una proliferación o activación de células T aumentada en la mezcla de la primera alícuota de la primera porción y la segunda porción en comparación con la proliferación o activación de células T en la mezcla de la segunda alícuota de la primera porción y la tercera porción con una respuesta inmunitaria frente al fármaco o producto biológico.
  17. 17. Método según la reivindicación 16, en el que medir la proliferación o activación de células T comprende medir niveles de IFN-y.
  18. 18. Método según la reivindicación 16, que comprende además correlacionar una respuesta inmunitaria frente al fármaco o producto biológico con inmunogenicidad del fármaco o producto biológico.
  19. 19. Método según la reivindicación 1, en el que dicho al menos un péptido de unión a DR universal es al menos un péptido de cadena invariable asociado a clase II (CLIP).
  20. 20. Método según la reivindicación 19, en el que el dendrímero polimérico altamente ramificado cargado es un dendrímero de PAMAM y el al menos un CLIP es CLIP p88-99.
  21. 21. Método según la reivindicación 20, en el que el dendrímero polimérico altamente ramificado cargado está conjugado a un ácido nucleico que codifica para el al menos un antígeno, y el ácido nucleico entra en la célula presentadora de antígeno profesional.
  22. 22. Ensayo para evaluar una respuesta de células T frente a una vacuna u otra terapia o intervención, comprendiendo el método las etapas de:
    a) proporcionar una primera muestra que comprende PAPC obtenida a partir del sujeto antes de que el sujeto reciba la vacuna u otra terapia o intervención, en el que la vacuna u otra terapia o intervención comprende un antígeno, fármaco o producto biológico;
    b) proporcionar una segunda muestra que comprende PAPC obtenida a partir del sujeto después de que el sujeto haya recibido la vacuna u otra terapia o intervención;
    c) poner en contacto las muestras primera y segunda con dendrímeros poliméricos cargados altamente ramificados conjugados a:
    i) un péptido de unión a DR universal y de direccionamiento a MHC, y
    ii) el antígeno, fármaco o producto biológico;
    d) medir una respuesta de células T en la primera muestra y medir una respuesta de células T en la segunda muestra;
    e) correlacionar una respuesta de células T aumentada en la segunda muestra con respecto a la respuesta de células T en la primera muestra con una respuesta de células T frente a la vacuna u otra terapia o intervención.
  23. 23. Ensayo según la reivindicación 22, en el que medir una respuesta de células T comprende medir o detectar al menos uno seleccionado del grupo que consiste en: activación de células T, proliferación de células T y expresión de citocinas.
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