KR20030055262A

KR20030055262A - 면역성 미립입자 함유 조성물

Info

Publication number: KR20030055262A
Application number: KR10-2003-7003743A
Authority: KR
Inventors: 플레반스키막달레나
Original assignee: 디 오스틴 리서치 인스티튜트
Priority date: 2000-09-14
Filing date: 2001-09-14
Publication date: 2003-07-02
Also published as: PT1326633E; US20040014708A1; DK1326633T3; US20120082725A1; NZ535851A; IL154913A0; AUPR011700A0; JP2004507566A; ES2363735T3; US8846026B2; EP1326633A4; CN1630531A; JP5198712B2; CN100446811C; DE60144240D1; NZ524843A; US20100136043A1; CA2422575A1; CA2422575C; EP1326633B1

Abstract

본 발명은 미립입자와 조합되는 적어도 하나의 항원을 포함하고, 상기 미립입자가 바이러스와 동일한 크기범위에 있는 것을 특징으로 하는 면역성 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 대상체에게 면역반응을 유도하기 위한 백신 조성물과 방법을 제공한다.

Description

면역성 미립입자 함유 조성물 {COMPOSITION COMPRISING IMMUNOGENIC MICROPARTICLES}

인간과 동물의 면역 시스템의 작동은 어떤 질병 혹은 그 상태를 벗어나거나 치료하는 인지된 방식 중 하나이다.

면역 시스템이 질병을 제어하는 메카니즘은 중성화된 항체 (체액 면역반응)의 유도 및 세포 혹은 T-세포 반응의 발생을 포함한다. 후자는 T-헬퍼세포(T_H) 및 세포독성 T-임파구(CTL)를 포함한다. 바이러스성 감염 예컨대, 소아마비나 간염의 경우, 항체는 바이러스가 세포를 감염시키는 것을 방지하여 보호하는 역할을 한다. 항체는 또한 살균 메카니즘을 통해 및 세균독소를 중화시켜서 폐렴구균 및 포도상구균 같은 박테리아로부터 예방할 수 있다.

T-세포는 항원으로부터 얻은 펩티드 절편이 MHC I 혹은 MHC II (주 조직적합 복합체, I종 혹은 II종)으로 공지된 분자들에 결합되고 또한 DCs (수지상 세포) 혹은 마크로파지 같은 전문적인 APCs (항원 발현세포)의 표면에 나타날 때 자극될 수있다. T-세포는 항원으로부터 펩티드 절편의 존재에 대해 세포 표면이 모니터할 수 있는 항원 수용체를 함유한다. T_H세포 상의 항원 수용체는 MHC II 분자에 결합된 항원성 펩티드를 인지한다. 대조적으로, CTLs 상의 수용체는 I종 분자 상에 나타나는 항원과 반응한다.

자극된 T-세포는 T-세포가 병원체에 의해 감염되는 타겟세포를 인지 할 때 혹은 그것이 인지할 수 있는 에피토프(epitope)를 갖는 타겟세포를 인지할 때 면역반응을 증폭하여 일련의 과정이 촉발되고 이것은 종종 감염된 세포를 사멸시킨다.또한, T-세포의 일부는 사이토카인 혹은 림포카인의 분비를 자극하여 이들이 궁극적으로 병원체의 비활성화 혹은 제거를 유도하는 효과를 수행할 수 있게 한다.

시중에서 구할 수 있는 백신은 다수 있으나 수많은 질병 혹은 그 조건을 치료하기 위한 더욱 효과적이고 광범위한 백신류를 생산하는 것이 요구된다. 또한 현재의 백신이 실용화되거나 효과를 발휘하지 못하는 감염성 작용제 혹은 병원체를 예방할 필요성도 여전히 남아있다. 덧붙여서, 특히 경제적인 측면에서 바람직하게는 효율적인 단일 투여성 백신이 전달의 간편성 및 환자나 투여대상에 대한 순응성을 고려하여 요구된다.

백신은 대부분 면역학적 효과를 발휘하기 위해 각종 체액성 및 세포성 반응의 최적의 조합을 유도할 수 없다는 단점을 갖는다. 예컨대, 어떤 백신은 항체와 세포성 반응이 모두 더 큰 효능을 가질 때만 항체반응을 자극한다. 또다른 경우, 적절한 감염성 작용제를 예방하기 위해 백신을 수회 투여해야 한다. (예를 들어 부스터 샷). 그 밖의 예에서, IgE의 생산은 다른 바람직한 면역글로부린 예컨대 IgA, IgG 및 IgM 등과 같이 유도된다. IgE를 유도하는 백신은 면역글로부린이 알레르기반응을 수반하므로 바람직하지 않다.

IgA 생성의 자극은 점막부위나 표면을 통해 유입하여 감염시키는 병원체에 대한 "제1 방어선"이다. 따라서, IgE 생성을 증진하지 않고 고-IgA 분비성 면역반응을 일으킬 수 있는 백신류가 중요하게 된다.

또다른 예로서, 백신이 APCs 자극을 가져오더라도 면역자극도는 최적-이하이다. 예를 들어, 수지상 세포 혹은 DCs는 T-세포 상에서 수용체를 결합시키는 특이 리간드를 일부 포함하는 표면분자들에 의해 서로 구별될 수 있는 일련의 부속세포군에 의해 특징지워진다. 따라서, T-세포가 다수의 세포간 병원체 및 암에 대한 예방면역성 측면에서 중요한 역할을 하나 이를 유도하기가 극히 곤란하므로, DCs 부속군 즉, 효과적인 CD8 T-세포를 최상화 할 수 있는 부속군을 선별적으로 타겟화할 백신을 제조하는 것이 요청된다.

한편, 백신에 관련하여 세포외 항원은 통상적으로 대부분의 세포에서 MHC-I 처리경로에 들어가지 못한다. 대체로, 사(non-living)백신을 이용하는 CTL 면역의 생성은, 비록 I종에 대한 별도의 처리경로 및 프레젠테이션이 아포프토틱(apoptotic)세포 흡수, 면역 복합체 및 입자물을 경유하는 APC에서 제기되었다고 해도, 용이하지 않다 [1]. 표면 B형 간염 단백질 혹은 이스트 레트로-트랜스포존 단백질 입자로 구성된 비감염성 바이러스형 입자 (VLP)는 마크로파지에 의한 MHC I 발현에 관련하여 효과적으로 처리되고 그 결과, in vitro 및 in vivo에서 CD8 CTL 반응을 유도하는 것으로 밝혀졌다 [2,3]. VLPs 은 지질 함량이 전체량의 50%를 초과하는 복수분자형 지질함유 단백질 입자이다.

그러나, B형 간염 코어 단백질 입자는 면역성이 없고 저지질 함량을 갖기 때문에, VLP는 크기가 아닌 생화학적 조성 측면에서 면역성이라고 제안하였다. 이것은 항원이 지질 혹은 세제를 함유하지 않는 제형물에 존재할 때 세포막을 손상시켜 APC와 융해할 수 있고 이에 의해 세포혈장 내로 유입될 수 있다는 제안과 일치하는 주장이다.

항원을 포집할 수 있는 소구체의 용도에 대해 가능한 백신 조성물 중 하나로서 연구 검토하였다. 소구체는 젖산과 글리콜산 (PLA 및 PLGA)의 생분해성 폴리에스테르로 제조한다. 소구체는 이것의 크기와 고분자 조성이 분해속도를 제어하는 방식으로 구성된다. 소구체가 분해되면, 포집되어 있던 항원이 방출되며 또한 면역반응을 자극할 항원의 방출을 조절하게 된다. 이들 분자가, 단백질 입자들이 세포막과 생물학적으로 조화되는 것과 동일한 방식으로 면역 세포들과 인터페이스 및 반응하기는 어렵다.

그러나, 이러한 백신 조성물에서의 곤란한 점은 항원 안정성, 구체의 크기 및 항원-방출 역학성 등으로 이들은 모두 아직까지 우수한 항원성 및 궁극적인 면역성을 가진 백신을 제조하기 위해서, 또한 경제적 측면에서 바람직하게 제조 및 투여할 수 있는 백신을 제조하기 위해서 해결해야할 과제로 남아있다 [4].

미국특허 4,225,581 에서는 크기가 불균일한 입자들의 혼합물을 포함하는 조성물이 고분자성 입자의 표면에 흡착되는 항원을 몸체에 전달하기에 유리하다고 개시하였다. 그러나, 이러한 백신이 전달성, 항원성 및 면역성 측면에서 성공적이었는지는 구체적으로 명시 혹은 입증되지 않았다. 특히, CD8 T-세포 반응의 유도 혹은, MHC I종 프레젠테이션 경로에 대한 진행과정에 관한 내용이 전혀 없었다. 입자의 고분자 물질은 위에서 검토했던 PLA 혹은 PLGA 미립입자와 유사한 특징을 갖는 것으로 예상된다.

그러므로 본 발명에 앞서서, 백신의 일부로서 본래 크기대로 투여된 입자들이 면역반응을 유도할 수 있는지에 대해서는 밝혀진 바가 없다.

본 발명자는 항원 관련 바이러스와 거의 동일한 크기의 미립입자가 대상체에 대해 강력한 세포성 및 체액성 항체반응을 제공한다는 놀라운 사실을 밝혀내어 본 발명을 달성하게 되었다.

본 발명은 면역성 조성물, 백신 조성물, 면역대상의 면역반응을 유도하는 방법 및 상기 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

도 1의 패널 A - 마크로파지와 수지상 세포에 의한 상이한 크기의 입자들의 다른 흡수율을 비교도시한 그래프이고; 패널 B - 바이러스 크기의 입자(VSP)들이 체내의 림프절 세포에서 우선적으로 발견되며; 패널 C 및 D - 바이러스 크기의 입자(VSP)들이 림프절 NLDC 145+ (DEC205+ 으로도 공지된) 세포(패널 C) 및 F4/80+ 세포(패널 D)에 의해 선별적으로 흡수됨을 도시하고;

도 2의 패널 A - 상이한 크기의 비이드에 접합된 OVA를 이용한 면역화에 의해 IFN_γ를 생성하는 CD8 및 CD9 T-세포의 유도를 도시하고; 패널 B - SIINFEKL에 Q반응하여 ELISPOT 에 의해 측정된 세포독성 활성도를 갖는 T-세포 및 IFN_γ분비형 T 세포의 상관관계를 도시하고; 패널 C - 상이한 크기의 비이드에 접합된 OVA를 이용한 면역화에 의해 유도된 항체 생성을 도시하고;

도 3은 최적의 T-세포 반응을 유도하기 위해 필요한 비이드에 대한 항원의 공유접합성을 도시하고;

도 4는 바이러스 크기의 비이드-OVA을 이용한 1회 면역화가 고레벨 MHC I종 제한 T-세포의 장기 지속력을 유도하기에 충분함을 도시하고;

도 5는 미처리된 C57BL/6 생쥐(좌측) 또는 생쥐 다리(우측) 피내 면역화 후배출 림프절 내의 비이드를 흡수한 세포에 의한 CD40 발현의 평가 결과를 도시하고;

도 6은 0.1㎛ OVA-비이드에 반응하는 미성숙 및 성숙 뮤린 DC 증식의 유도를 도시하고;

도 7은 0.04㎛ 및 1㎛ 입자를 흡수하는 APC의 표현형 특징을 비교 도시하고;

도 8A는 DC에 의한 바이러스 크기 입자 흡수율의 메카니즘을 도시하고;

도 8B는 흡수 메카니즘을 도시하고;

도 9는 가용성 OVA 및 1㎛-OVA 비이드가 0.05㎛-OVA 비이드에 상응하는 예방효과를 유도할 수 없음을 도시하고;

도 10은 바이러스 크기의 입자가 초기 엔도섬과 공동-국소화 하지 않음을 도시하고;

도 11의 패널 A - OVA-VSSP를 1회 피내주사(ID) 하여 면역화된 C57/B6 생쥐 (면역화) 및 처리없이 그대로 둔 생쥐 (미처리)에게 5 x 10⁶EG7 (종양 세포)를 피하주사한 뒤 30일후 챌린지하여 관찰한 종양 예방효과를 도시하고; 패널 B - 상술한 바와 같이 종양이 유발되었고 종양 성장 8일째 (면역화 0일째) 6마리에 대해 처리하지 않고 (미처리) 및 6마리에게는 OVA-VSSP를 ID로 면역화 한 것을 도시하고;

도 12는 VSSP 면역화 후 치사량의 말라리아를 챌린지한 때의 생쥐의 생존율을 도시하고;

도 13은 항원 nm23를 상술한 바와 같이 0.05 마이크론 비이드에 접합시켰고,생쥐에게 1마리당 100㎍로 OVA를 피내주사 한 뒤 10일 후 면역화된 동물의 비장내에서 IFN 감마반응도를 ELISPOT 으로 평가한 것을 도시하고;

도 14는 표준규약에 따라 VSP에 접합되거나 100㎍/생쥐의 양으로 피내주사하여 접합된 암항원 nm23 혹은 OVA을 도시하고;

도 15a는 OVA에 접합된 0.05㎛ 비이드를 1회 피내주사하여 면역화된 (VSP-OVA) 생쥐의 혈청내의 OVA에 대한 항체 반응도를 도시하며;

도 15b는 도 15a의 생쥐에서 취한 동일 혈청을 2마리의 미처리된 생쥐 (A2 및 A3)와 3마리의 VSP-OVA 생쥐 (B2, 3 및 5)의 OVA 특이성 IgE 항체의 존재여부에 대하여 ELISA 로 검사한 결과를 도시하고;

도 16의 패널 A - 단일 면역화에 의한 장기 지속성 항체 반응의 유도를 도시하고; 패널 B - 0.04㎛ 비이드 OVA를 이용하는 단일 면역화에 의한 장기 지속성 IFNγ 생성 T-세포의 유도를 도시하고;

도 17은 프라임/부스트 CP57/B6 동물이 미처리되거나 (미처리); 컴플리트 프라운즈(Complete Freunds) 보조제 내에서 700㎍ KLH에 접합된 MUC1 으로부터 나온 100㎍ 펩티드 cp13-32(cp13); 만난 접합된 재조합 MUC1-GST 융해단백질(MFP); 혹은 MUC1-GST 융해단백질에 접합된 0.1㎛ VSP(VSP)를 각각 1차 피내주사한 상태를 도시하고;

도 18은 0.05㎛ VSP-OVA 입자를 폴리스티렌 및 유리와 비교하여 도시하고; 및

도 19는 비이드 접합 방식 및 면역성을 도시한다.

첫번째 실시예에서, 본 발명은 적어도 미립입자와 조합된 하나의 항원을 포함하고 상기 미립입자가 바이러스와 동일한 크기 범위 내에 속하는 것을 특징으로 하는 면역성 조성물에 관한 것이다.

상기 면역성 조성물에 관련하여 "포함하는" 이란 항원과 미립입자를 포함하는 것을 의미한다. 또한 다른 성분들도 포함할 수 있다.

"항원"이란 면역반응을 유도할 수 있는 임의의 분자, 부분 혹은 실재물을 포함한다. 이것은 세포성 및/또는 체액성 면역반응을 포함한다. 조성물의 의도한 기능에 따라 하나 이상의 항원을 포함하기도 한다.

항원은 펩티드, 단백질, 지질, 탄수화물, 핵산 혹은 기타의 분자 혹은 이들의 조합물이다.

항원은 조성물의 의도된 목적에 따라 병원체, 조직, 세포, 기관 혹은 분자로부터 유래되며, 또한 박테리아, 이스트 혹은 세포 배양물 같은 적절한 벡터에서 생성되는 재조합 기원일 수도 있다. 예컨대, 병원체는 임의의 병원체, 세포내 혹은 세포외, 항원성 부분, 혹은 HIV, 인플루엔자 바이러스, 간염바이러스, 말라리아 등과 같이 바이러스성, 박테리아성 혹은 원충류 기원으로부터 유래된다. 특히, 본 발명에서 관찰한 항원의 예를 들면 다음과 같다: 화분, C형 간염 바이러스, (HIV)코어, E1, E2 및 NS2 단백질, P.vivax(삼일열 원충) 같은 변형체 종, 또한 열대열 말라리아 서컴스포로조이트(circumsporozoite)단백질 (CS) 및 인간 열대열 말라리아 원충, 삼일열 원충, 말라리아, TRAP, MSP-1, MSP-2, MSP-3, MSP-4, MSP-5, AMA-RESA, SALSA, STARP, LSA1 및 LSA3, HIP-gp120/160 엔벌로프 당단백질, 스트렙토코쿠스 표면 단백질 Ag, 인플루엔자 핵단백질, 헤마글루티닌-뉴라미니다제 표면 감염, TcpA 필린 소단위, VP1 단백질, LMCV 핵단백질, 레슈마니아 주 표면 당단백질(gp63), 보르데텔라 페르수시스 표면 단백질, 라비에스 바이러스 G 단백질, 스트렙토코쿠스 M 단백질, 포도상구균 단백질 혹은 헬리코박터 필로리 단백질, 신시티셜 바이러스(RSV) F 혹은 G 단백질, 엡스타인 바르 바이러스(EBV) gp340 혹은 핵항원 3A, 헤마글루티닌, 보렐리아 버그도르페리(Borrelia burgdorferi) 외표면 단백질(Osp) A, 미코박테리움 투베르쿨로시스 38kD 지질단백질 혹은 30kD 단백질(Ag85), 10kD 혹은 65kD 단백질, 나이제리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) 1종 외부단백질, 바리세포라 조스터(Varicella zoster) 바이러스IE62, 루벨라 바이러스 캡시드(세포껍질) 단백질, B형 간염 바이러스 프리 S1 ag, 헤르페스 심플릭스 바이러스 I종 당단백질 G 혹은 gp D 또는 CP27, 머레이 밸리 엔세팔리티스 (Murray valley encephalitis) 바이러스 E 당단백질, A형 간염 바이러스 VP1, 폴리오 바이러스 캡시드 단백질 VP1, VP2, VP3 및 VP6, 클라미디아 트라코마티스 표면 단백질, B형 간염 바이러스 엔벨롭프 Ag 프리 S2, 인간 리노바이러스 (HRV) 캡시드, 암유전자 E6 및 E7에서 유래된 유두종 바이러스 단백질, 리스테리아 표면 단백질, 바리세포라 바이러스 엔벨로프 단백질, 백시니아 바이러스 엔벨로프 단백질, 브루세포라 표면 단백질, 로타바이러스 VP-3, VP-4, VP-5, VP-7 및 VP-8, 이들 항원 중 하나 이상의 조합물, 5개 이상의 아미노산이 길이로 연결된 상기 항원의 아미노산 소단위체 조합물 혹은 하나 이상의 상기 소단위체로 된 조합물 등을 포함하는 기타의 변형체 종이 있다.

위에서 예로 든 병원체로부터 나온 세포용해물(lysate) 혹은 배양여액을 항원으로 사용한다. 이들 분획물은 항원성 및/또는 면역성을 제공할 수 있다면 정제, 농축 혹은 희석 형태로 사용하기도 한다. 따라서, 본 발명에 따라 환자에게 투여할 면역성 조성물을 환자의 종양 용해물 혹은 미립입자에 접합된 특이성 종양 단백질군을 이용하여 "맞춤-제조"할 수 있게 된다.

항원은 또한 종양의 종류 혹은 악성종양으로부터 유래되기도 한다. 항원이 유래되는 암종류의 예로는 유방, 폐, 췌장 및 장암 및 흑색종 등을 들 수 있다. 종양으로부터 얻은 특이 항원의 예로는 흑색종 특이 항원 (예컨대, MAGE계열 항원), 장에서 얻은 칼시노 엠브리오 항원(CEA), nm23 암 항원 및 기타의 암항원이나 사실상 임의의 종양에서 추출한 항원 예컨대, MUC-1 내지 MUC-7 항원 같은 무신(mucin)을 포함한다. 재조합 펩티드 혹은 단백질을 단독으로 혹은 조합하여 사용할 수도 있다.

항원은 또한 상술한 하나 이상의 항원에 기초한 인조 혹은 의사펩티드 같은 합성 에피토프일 수도 있다.

"조합된" 이란 미립입자 및 항원간의 조합을 의미한다. 이러한 조합은 흡착이나 접합 혹은 공유결합 등의 방식으로 행해지기도 한다. 바람직하게, 항원은 미립입자에 공유결합된다. 더 바람직하게, 항원은 미립입자의 표면에 접합된다.

미립입자는 소형 입자를 말하며 비이드나 구체 혹은 기타의 적절한 형상을 갖는다.

"바이러스 크기 입자" (VSP)란 본 명세서에서 본 발명의 면역성 조합물의 한 실시예를 설명하는 것이다. VSP 라는 용어는 편의에 따라 선택한 것으로 공지된 바이러스 크기로 본 발명을 제한하려는 것은 아니다. 예를 들어, 공지되지 않은 바이러스의 크기와 동일한 입자들 역시 본 발명의 범위에 속하는 것이다.

바람직하게, 미립입자는 접합 혹은 조합된 항원에 대해 안정성을 제공하는 고형 코어를 가지며 중공형(hollow)이거나 분자를 캡슐화 하는 공지의 소구체와는 구별되는 것이다. 편의상, 항원이 입자 외측에 존재하는 바이러스 크기의 고형 입자(VSSP)를 일컫는다. VSSP 제조에 사용되는 입자는 시중에서 구할 수 있으며 실질적으로 균일한 크기 (예, 확정크기 ±10% 이내)이다.

"고형 코어" 란 실질적으로 고형체(즉, 입자에 중공이 없는) 인 것을 의미한다. 미립입자는 면역성 조성물의 기능을 손상하지 않는 적절한 재료로 구성된다. 따라서, 미립입자는 라텍스, 철 함유 분자, 금(금 나노입자), 유리, 인산칼슘, 폴리스티렌 혹은 생분해성 및 생체조화성 고분자로서 PLG(폴리리신 g) 등의 재료로 제조할 수 있다. 가장 바람직하게는, 미립입자를 폴리스티렌으로 제조할 수 있다.

미립입자는 공지된 바이러스와 동일한 크기 범위에 있다. 이것은 미립입자가 바람직하게 약 0.50㎛ 미만이라는 것을 말한다. 미립입자는 면역반응을 유도하도록 조절된 크기의 것이 바람직하다. 특히 인간 대상체 혹은 동물내에서 항원을 발현하는 세포에 의해 흡수되도록 상기 미립입자의 크기를 조정한다. 바람직하게, 상기 미립입자는 약 0.03 내지 0.50㎛, 더 바람직하게는 0.03 및 0.15㎛, 그보다 더 바람직하게는 약 0.03 내지 0.10㎛의 크기이다. 더욱더 바람직하게는, 상기 미립입자가 0.03 내지 0.05㎛, 한층 더 바람직하게는 약 0.03 내지 0.049㎛이고 이보다 더 바람직하게는 약 0.03 내지 0.04㎛ 이거나 약 0.04 내지 0.049㎛ 이다.

한 바람직한 실시예에서, 1회 백신접종시 본 발명에 따라 사용되는 미립입자 집합체는 균질한 크기로 되어있다. 이것은 상기 집합체 내의 대부분의 입자들이 확정크기의 것이라는 걸 의미한다.

바람직하게, 미립입자/항원 조성물은 특히 세포형 및/또는 체액형 면역반응을 유도하도록 조정된다. 세포성 반응은 바람직하게 T_H세포 특히, IFN 및 IL4 생성 T-세포 같은 T-세포, CTLs 특히 CD8 CTL 및 B 세포의 활성화, 성숙분열 혹은 증식으로 구성된 군에서 선택된다. 바람직하게, 미립입자/항원 조성물은 실시예 4 및 7에서 설명한 바와 같은 후속의 Rab4 독립형 및 TAP 의존형 과정에 의해 처리될 카베올레(caveole) 및/또는 클라드린(clathrin) 공동을 수반하는 아직까지 공지되지 않은 메카니즘에 의해 수득되는 항원들의 MHC I종 프레젠테이션 메카니즘을 유발한다. 체액성 반응은 바람직하게 IgA, IgD, IgG, IgM 및 이들의 서브군으로 구성된 군으로부터 선택된다.

면역반응을 생성 혹은 증폭하는데 조력하는 세포 역시 상기 조성물에 의해 자극된다. 이들 세포는 특별히 제한되지는 않으나, 골수 혹은 림프계의 DCs 같은 APCs, 및 마크로파지를 포함한다. 그러한 세포의 성숙분열, 활성화 혹은 증식은 T-세포 예컨대, CD40, CD90 및 CD86와 상호작용하는 상기 세포의 공동-자극성 리간드 혹은 분자들이 있기 때문에 생각했다.

본 발명의 면역성 조성물은 항원에 의해 야기되거나 혹은 항원과 접촉하는 것에 연루된 질병 혹은 그의 상태를 치료, 방어 혹은 예방하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 어떤 종류의 암의 치료 혹은 예방에 이용될 수 있다.

또다른 실시예에서, 본 발명은 미립입자가 바이러스와 동일한 크기 범위에 있는 적어도 하나의 항원과 조합된 미립입자 함유 백신 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 특히 1회 투여로 유효한 백신일 뿐 아니라 다수회 투여 방식으로도 사용할 수 있는 유리한 장점을 갖는다.

따라서 한 실시예에서, 본 발명은 적어도 하나의 항원과 조합된 미립입자를 함유하고, 상기 미립입자가 바이러스와 동일한 크기 범위에 있는 것을 특징으로 하는 1회 투여식 백신 조성물을 제공한다.

"1회-투여"란, 체액성 및/또는 세포성 면역반응이 최대레벨 ("최대" 란 백신접종을 반복해도 더이상 증가하지 않는 레벨을 의미한다)까지 자극 혹은 향상되거나, 혹은 조성물이나 백신의 1회 투여로 조성물의 수용자에게 예방효과를 제공하는 것을 말한다. 조성물 투여는 근육주사, 복강주사, 혈관주사나 혹은 경구투여, 흡입투여, 또는 점막면이나 점막부위를 통한 투여 등의 적절한 방식에 따른다.

바람직하게, 항원은 미립입자의 표면에 접합된다. 미립입자의 크기는 직경 기준으로 약 0.03 내지 0.5㎛, 바람직하게 약 0.03 내지 0.15㎛, 더 바람직하게는 약 0.03 내지 0.10㎛, 더욱더 바람직하게는 약 0.03 내지 0.05㎛, 이보다 더 바람직하게는 약 0.03 내지 0.049㎛ 이다. 미립입자는 폴리스틸렌, PLG, 유리, 인산칼슘 혹은 금으로 제조하는 것이 가장 바람직하다. 한 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따라 사용할 각 항원은 균일한 크기의 미립입자에게 접합된다.

또다른 실시예에서, 본 발명은 체액성 및 세포성 면역반응을 일으킬 수 있는 1회-투여식 백신 조성물을 제공하며 이 조성물은 적어도 하나의 항원과 조합되고 또한 바이러스와 동일한 크기범위인 미립입자를 함유한다.

세포성 반응은 바람직하게는 T_H세포, CTLs 및 B 세포의 자극, 성숙분역 혹은 증식으로 구성된 군에서 바람직하게 선택된다. 체액성 반응은 바람직하게는 IgA, IgG, IgM 및 이의 하위종으로 구성된 군에서 선택된다. 바람직하게, IgG, IgA 및/또는 IgM 반응을 자극한다.

면역반응의 발생 혹은 증폭을 조력하는 세포들 역시 상기 조성물에 의해 자극된다. 이들은 특별히 제한되지 않으나 골수 혹은 림프계의 DCs 같은 APCs와 마크로파지를 포함한다. 상기 세포들의 성숙분열, 활성화 혹은 증폭은 생각된다.

"포함하는" 이란 앞서 기술된 것과 같은 의미이다. 미립입자의 의미 역시 앞서 정의한 것과 동일하다. 상기 미립입자는 동물내의 항원 발현 세포에 의해 흡수되는 것으로 정한다. 바람직하게, 이 미립입자는 0.03 내지 0.5㎛, 더 바람직하게는 0.03 내지 0.15㎛ 의 크기를 갖는다. 더욱 바람직한 것은 0.03 내지 0.10㎛ 이보다 더 바람직한 것은 0.03 내지 0.05㎛의 미립입자가다. 그 밖에 더 바람직하게는 약 0.03 내지 0.049 혹은 0.04 내지 0.049㎛ 이다.

"항원" 및 "조합되는" 이란 모두 앞서 기술된 것과 같은 의미이다. 백신접종의 대상이 되는 상태/질병에 따라 적절한 항원을 사용할 수 있다.

본 발명에서 환자에게 전달되는 백신 조성물의 양은 특별히 중요하거나 제한되지 않는다. 유효량의 백신 조성물은 바람직하게는 1회 투약이나 투여후, 항원 성분에 대한 면역반응을 자극시키고 또한 강력한 세포성 및 체액성 반응을 가져오는 양을 말한다. 조성물 전달량은 환자의 면역상태 (환자가 면역억제 상태인지 혹은 면역자극된 상태인지)에 따라 달라질 수 있으며, 조성물을 질병상태의 예방 혹은 치료 용도의 백신으로 또는 종양 형성을 예방할 백신으로 사용할 것인지 아닌지의 결정, 또는 백신을 기존의 종량을 치료하는데 사용할 것인지의 판단은 전문의사 혹은 수의사에 판단에 따른다. 예를 들어, 환자가 본 발명의 조성물을 1 내지 10,000㎍, 바람직하게는 50 내지 5,000㎍, 더욱 바람직하게는 100 내지 1,000㎍, 이보다 더 바람직하게는 100 내지 500㎍의 약량으로 수용할 수 있다. 보조제는 대체로 필요치 않다. 그러나, 면역화를 위해 보조제가 사용되기도 한다. 적절한 보조제로는 알럼, 인간에 투여하기 위한 백신분야에서 널리 공지된 기타 다른 종류의 보조제(들)을 포함한다.

본 발명의 백신은 주사투여, 경구투여, 흡입투여 혹은 점막면이나 점막부위를 통해 투여될 수 있다. 한 실시예에서, 백신은 유전자총을 이용해 투여한다. 철을 함유하는 미립입자 및 금 미립입자를 본 발명에 따라 사용할 경우 특히 유전자총 투여방식이 적절하다. 그러나, 항원 내에 들어있는 다른 종류의 미립입자들도 이 방식으로 투여할 수 있다. 예를 들어 참고로, 말라리아 라이브러리, DNA 혹은 플라스미드로부터 유래된 항원은 Smooker PM et.al.이 개시한 방법 ("Expression library immunisation protects mice against a challenge with virulent malaria", Vaccine, 18(22): 2533-2540, 2000년 참조)에 따라 전자총을 이용하여 효과적으로 투여하는 것이 공지되었다. 백신접종은 1회 투여 혹은 복수회 투여 방식 혹은 주입분사 방식으로 실행할 수 있다.

그 외의 실시예에서, 본 발명은 대상체의 면역반응을 유도하는 방법으로서, 미립입자와 조합된 적어도 하나의 항원을 포함하고 상기 미립입자는 바이러스와 동일한 크기 범위를 가지는 것으로 된 조성물을 상기 대상체에게 면역학적으로 유효한 양만큼 투여하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

상기 대상은 면역반응을 유도할 필요가 있는 사람 또는 동물이다. 여기에는 가정에서 키우는 동물, 가축류 (소, 양, 말, 젖소, 돼지, 염소, 낙타류, 가금류, 타조, 에뮤 등의) 및 토종 및 외래종 동물, 야생동물 및 기타 맹수류가 포함된다.

"포함하는" 이란 위에서 설명한 바와 같은 의미이다.

면역학적 유효량이란 바람직하게는 1회 투여후 대상에게서 면역반응을 발생하기에 충분한 양을 말한다. 이 양은 상기에서 검토한 요인을 포함한 다수의 요인에 따라 변화될 수 있으며 또한, 대상체가 사람 혹은 동물인지, 나이와 몸무게 등에 따라 달라진다.

"항원" 및 "조합된" 의 의미도 상기에서 정의된 것과 같다.

"면역반응"이란 상술한 바와 같은 세포성 및 체액성 반응을 말하며 또한 상기에서의 변역반응을 발생 혹은 증폭시킬 때 조력하는 세포에 의한 반응도 포함한다. 특히 면역반응은 수지상 세포 특히, DEC205+, CD40+ 및 CD86+ 세포의 증식 및/또는 팽창에 의해 제공되기도 한다.

미립입자란 앞서 설명한 것과 동일한 의미이다. 바람직하게, 이 미립입자는 0.03 내지 0.5㎛, 더 바람직하게는 0.03 내지 0.15㎛ 더욱더 바람직하게는 0.03 내지 0.10㎛ 의 크기를 갖는다. 이보다 더 바람직한 것은 0.03 내지 0.05㎛, 더욱더 바람직한 것은 약 0.03 내지 0.04 혹은 0.19 내지 0.049㎛ 이다. 그 밖에도, 항원/미립입자 조성물은 강력한 세포성 및/또는 체액성 면역반응을 유도하도록 특별히 조정하는 것이 바람직하다.

한 바람직한 실시예에서, 본 발명은 대상체의 면역반응을 유도하는 방법으로서, 미립입자와 조합된 적어도 하나의 항원을 포함하고 상기 미립입자가 바이러스와 동일한 크기 범위를 가지는 것으로 된 조성물을 상기 대상체에게 면역학적으로 유효한 양만큼 투여하는 것을 포함하고 이 때의 면역반응이 수지상 세포의 자극및/또는 증식을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 바람직하게, 미립입자는 약 40nm 내지 50nm 더 바람직하게는 40 내지 49nm 의 크기를 갖는다.

또다른 실시예에서, 본 발명은 1회 투약을 통해 항원에 대한 방어적 면역반응을 유도하는 방법으로서, 미립입자와 조합된 적어도 하나의 항원을 포함하고 상기 미립입자가 바이러스와 동일한 크기 범위를 가지는 것으로 된 조성물을 상기 대상체에게 면역학적으로 유효한 양만큼 단 1회만 투여하는 것을 포함하고 이 때의 면역반응이 수지상 세포의 자극 및/또는 증식을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 바람직하게, 미립입자는 약 40nm 내지 50nm 더 바람직하게는 40 내지 49nm 의 크기를 갖는다.

또다른 실시예에서, 본 발명은 면역반응을 유도하기 위해 수지상 세포에 대해 항원을 in vivo 전달하는 방법으로서, 미립입자와 조합된 적어도 하나의 항원을 포함하고 상기 미립입자가 바이러스와 동일한 크기 범위를 가지는 것으로 된 조성물을 상기 대상체에게 면역학적으로 유효한 양만큼 투여하는 것을 포함하고 이 때의 면역반응이 수지상 세포의 자극 및/또는 증식을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 바람직하게, 미립입자는 약 40nm 내지 50nm 더 바람직하게는 40 내지 49nm 의 크기를 갖는다.

본 발명은 또한, 바이러스와 동일한 크기 범위에 있는 미립입자를 이 미립입자 및 항원이 서로 조합되는 방식으로 하나 이상의 항원과 접촉시키는 것을 포함하는 면역학적 미립입자/항원 조성물의 제조방법으로 확장한다. 당해 분야의 지식을 가진 경우라면 이러한 조성물을 제조하는데 이용되는 기술을 잘 숙지하고 있을 것이다.

본 발명을 다음의 비제한적인 실시예 및 도면을 참조하여 더욱 상세히 기술하기로 한다.

도 1의 패널 A에서, 세포 1개당 0.02, 0.1 혹은 1마이크론 크기의 형광 비이드 1000개를 배양된 복강 삼출액 마크로파지 혹은 C57BL/B6 생쥐의 골수에서 얻은 수지상 세포로 하룻밤동안 배양하고 형광세포의 비율을 FACSCan 으로 평가하였다. 3개의 유사 실험 중 하나를 도시한다. 상이한 비이드 크기의 흡수율에서의 유사한 차이는 10배 이상의 비이드 농도 및 비이드로 3시간 주기 혹은 Balb/c 유래의 항원 프레젠트(presenting) 세포에 이용하여도 유사하게 나타났다. 패널 B에서, 좌측의 C57BL/B6 생쥐는 50㎕ 의 상이한 크기 (0.02, 0.04, 0.1, 0.2, 0.5, 1 및 2 마이크론)를 갖는 0.1% 형광 비이드 용액을 이용하여 생쥐의 다리(footpad)에 피내주사하여 접종하고 10일 후 배출 슬와부 림프절을 해부하여 비이드 흡수 세포의 비율을 FACScan으로 평가하였다. 데이타는 3회 중복 시료로부터 얻은 형광세포의 평균 백분율 +/- 표준오차(SE) 로서 주어진다. 0.04 및 0.1 마이크론 입자크기는 기타 다른 크기의 입자들 (p>0.001)과 비교하여 훨씬 큰 흡수율을 갖고 있었다. 비교적으로, 0.1 혹은 1 마이크론 크기만 가진 비이드를 사용하는 유사실험에서, 접종후 3일, 6일 혹은 9일째에 수거한 림프절에서 0.1 마이크론 비이드의 흡수율은 1 마이크론 비이드의 경우보다 현저히 높았다. 패널 C 및 D에서, 형광입자를 흡수한 림프절 세포를 수지상 세포 표지물질 NLDC145/DEC205 혹은 마크로파지/단핵세포 F4/80의 공동발현에 관하여 FACScan 분석을 통해 평가했다. 이 데이타에서 비이드 흡수로 인해 형광성이 된 NLDC145+ 혹은 F4/80+ 세포의 비율을 보여준다.

도 2의 패널 A에서, C57BL/B6 생쥐는 0.02, 0.04, 0.1, 0.2, 0.5, 1 혹은 2마이크론 크기의 비이드에 접합된 100㎕ OVA로 2회 피내주사하여 면역화시키고 (10일 간격으로), 2차 예방주사로 면역화 처리한 후 10일째에 비장 T-세포의 활성도를 IFNγELISPOT으로 평가했다. H-2Kb 제한 CD8 T 세포 에피토프 SIINFEKL 혹은 전체 OVA에 대한 반응을 측정했다. OVA에 대한 반응도 평가시, VA 반응성 CD4 T 세포를 정량화 하기 위해, 자기성 비이드(Dynabeads)를 이용한 평가에 앞서서 비장세포를 CD8 T 세포로부터 분리하였다. SINFEKL을 2.5㎍/ml 및 OVA 를 25㎍/ml 사용하였다. 3가지의 유사한 실험 중 하나를 도시한다. 각 그룹당 2마리의 생쥐를 각 비이드 크기에 대해 면역화하였다. ELISPOT 배양을 중복 실행하고 그 평균값을 100만개의 실험 세포당 반점형성 단위량(SFU)으로 나타내었다. 표준편차(SD)는 항상 평균치의 20% 미만이었다. 패널 B 에서, C57BL/B6 생쥐를 상이한 크기의 비이드-OVA로 면역화 했고 SIINFEKL 에 대한 반응도를 상기와 같이 IFNγELISPOT로 평가했다. 별도로, 세포독성 활성도를 갖는 SIINFEKL 특이성 T 세포의 수를 제한희석 분석법으로 동시 측정했다. 크롬 함유 EL4 세포 단독 혹은 2.5㎍/ml의 SIINFEKL이 프리펄스된 세포를 타겟으로 사용했다. 도시된 데이타는 2가지 분석에 의해 밝혀진 밀접한 상관관계 (R스퀘어 = 0.9254)를 보여준다. 2가지 유사 실험 중 하나만 도시한다. 패널 C에서, 혈청은 패널 A에서 설명한 생쥐로부터 수거한 것이며 혈청 희석액에 대해 OVA 특이성 IgG 반응도를 ELISA로 검사했다. 0.02, 0.04, 0.1, 0.2, 0.5, 1 혹은 2 마이크론 크기의 OVA-비이드 면역화를 그래프로 도시한다. 2가지 유사 실험 중 하나만 도시한다.

도 3의 패널 A에서, 비이드-접합 OVA 만이 MHC I종 제한 T-세포 반응을 설명한다. C57BL/B6 생쥐를 사전투석 없이(대조부) 혹은 300Kd 제거막을 통과시켜 PBS에 대해 투석처리한 후(투석처리물)의 0.04 마이크론 비이드에 공유접합된 OVA로 면역화 하였다. IFNγ생성 비장 SIINFEKL 특이성 CD8 T-세포의 유도를 1회 피내 면역화 실시 후 10일째에 ELISPOT으로 평가했다. 그룹당 4마리의 생쥐에 대해 2중웰에서 ELISPOT 으로 평가한 평균 +/- SE 을 도시한다. 패널 B에서, 비이드 및 가용성 OVA의 공동투여로는 최적의 MHC I종 제한 T-세포 반응을 유도하는데 역부족이다. C57BL/B6 생쥐는 0.1 마이크론 비이드에 공유접합된 OVA (비이드 접합-OVA) 혹은 주사전에 OVA와 혼합한 비이드 (비이드/OVA 혼합물)로 각각 면역화 하였다. IFNγ 생성 비장 SIINFEKL 특이성 CD8 T-세포의 유도를 1회 피내 면역화 실시 후 10일째에 ELISPOT으로 평가했다. 그룹당 2마리에 대한 평균 T-세포 선구체 빈도를 2중웰에서 ELISPOT으로 평가한 결과를 도시한다.

도 4의 패널 A에서, C57BL/B6 생쥐는 1회, 2회 혹은 3회에 걸쳐 비이드-OVA (0.1 마이크론)을 피내주사하여 면역화했다.각 회마다 14일간의 간격을 두었으며, SIINFEKL에 대한 이들의 IFN_γ반응을 최종 면역화 후 10일째에 ELISPOT 으로 검사하였다. 그룹당 3마리의 생쥐를 면역화 하였으며, 각 생쥐에 대해 중복평가한 값의 평균치를 데이타로 나타낸다. 2가지 유사 실험 중 하나만 도시한다. 패널 B에서, 생쥐를 비이드-OVA (0.1 마이크론)로 1회 면역화 하였고, SIINFEKL 혹은 OVA에 대한 IFNγ반응을 12일 혹은 82일 후에 ELISPOT으로 검사했다. 도 2에서 측정한 OVA에 대한 항체 레벨은 면역화 후 82일에 유지되었다.

도 5에서, 미처리된 C57BL/6 생쥐(좌측) 혹은 생쥐 다리에 0.04 형광성 비이드를 피내 주사하여 면역화한 생쥐(우측)로부터 나온 슬와부(popliteal) LN 세포를 주사후 48시간 뒤 해부하고 표지물질에 대한 특이성을 가진 PE 접합 항체로 염색하여 CD40 발현을 분석하였다. FL-1=FITC 양성 세포 (비이드 +) 및 FL-2=PE 양성 세포 (표지물질 +). 배경 염색은 무시하였다 (<1%). 좌측 패널은 면역되지 않은 동물의 슬와부 LN 세포를 표시하고 우측 패널은 VSP-OVA 면역화된 동물로부터 동일한 종류의 세포를 표시한다.

도 6에서, DCs 는 C57BL/6 생쥐의 뒷다리 경골 및 대퇴골에서 추출한 골수세포에 GM-CSF 및 IL-4F를 첨가하여 배양하였다. 배양 5일 후, 세포를 분리하여 1.25 x 10⁶세포/1.25ml 실험조건 하에 두고 1000 비이드/세포로 OVA에 접합된 비이드와 함께 펄스처리했다. 펄스처리 4시간 후, LPS 및 TNFa 를 첨가하여 배양물을 적절한 상태로 만들었다. 세포는 하룻밤동안 계속 배양하고 다음날 증식 티미딘 분석한 뒤 또다시 하룻밤동안 배양했다. 각 값은 3회 중복의 평균치 ±SD (펄스되지 않은 DCs 및 실험군의 차이 *p <0.00001, 독립된 t-실험)를 나타낸다.

도 7에서, C57/B6 생쥐의 다리에 50㎕의 0.04 혹은 1㎛ 형광 비이드-OVA 를 주사했다. 활성화 및 항원 발현 세포계통의 세포 표지물질에 의한 비이드 양성 세포의 공동염색성에 대해 배출 슬와부 LN을 48시간 후 분석하였고, 3-14마리의 생쥐/표지물질의 평균 +/- SE를 도시한다. 0.04 및 1㎛ 형광비이드 + 세포는 DEC205, F4/80. CD40, CD80 및 CD86을 현저히 다르게 발현하였다 (p<0.05).

도 8A에서, 골수 유래의 배양된 DC는 0μM(검정색), 5μM(백색), 10μM(회색)의 프로볼(Phrobol) 미리스테이트 아세테이트(PMA); 0mM(검정색), 1mM(백색), 3mM(회색)의 아밀로라이드(AML); 0㎍(검정색), 0.25㎍(백색) 또는 0.5㎍(회색)의 사이토칼라신 D (CDD)로 30분간 배양했고 또한 추가로 0.04㎛-0VA-형광입자를 3시간 동안 첨가했다. 소포, 클라드린 피복된 공동부 형성 또는 식작용에 대한 선별적 저해가 각각 10μM PMA, 3mM 아밀로라이드 및 0.5㎍/ml CCD에 대하여 각각 14, 15 기록되었다. 함께 사용했을 경우 PMA 는 10μM에서 일정하게 유지하고 AML은 각각 1mM (백색) 혹은 3mM (회색)의 양으로 첨가되었다. 형광세포의 수는 FACScan으로 평가했다. 3회 중복 배양물의 평균치 +/- SD 로 데이타를 표시한다.

도 8B에서, DC를 아무것도 없이, CDD 1㎍/ml, 1㎍/ml의 플리핀(FIL) 혹은 40mM의 염화암모늄(AC)으로 30분간 배양했고 추가로 0.04㎛ 혹은 1㎛ 형광비이드를 30분간 첨가했다. 소포 혹은 클라드린 피복된 공동부 형성에 대한 선별적 저해가 1㎍/ml 플리핀 및 40mM 염화암모늄에 대하여 각각 14-17, 29회 기록되었다. 형광세포의 수는 FACScan으로 평가했다. 3회 중복 배양물의 평균치 +/- SD 로 데이타를 표시한다.

도 9에서, C57/B6 생쥐를 0.05㎛ 혹은 1㎛ 비이드에 접합된 OVA, 가용성 OVA의 피내 주사로 면역화 혹은 미처리 뒤 상술한 바와 같이 챌린지했다. 각 그룹당 8마리에 대해 10일째의 개별 종양크기를 데이타로 표시한다. 2가지 유사한 실험 중 하나를 도시한다. 0.05㎛-OVA 비이드 그룹과 다른 각 그룹과의 종양의 빈도수 차이가 현저했다: P=0.0001 대 미처리; p=0.0007 대 가용성 OVA; 및 p=0.0035 대 1㎛비이드-OVA

도 10에서, (좌측) 골수 유래의 DC를 0.1 마이크론 비이드-OVA (500 비이드/세포)로 하룻밤동안 배양했고, 조심스럽게 세척하여 유리된 비이드를 제거하고 유리재질의 슬라이드 상에서 회전시켜 공동초점형 현미경 분석에 맞도록 준비했다. 세포를 파라포름알데히드에서 고정하고, 트리톤을 통과시키고 및 비오틴 접합 모노클로날 항체 및 스트렙타비딘-알렉사를 이용하여 초기 엔도섬(endosome) 표지물질 Rab4의 존재를 염색했다. 유사한 결과를 접합되지 않은 0.04 및 0.1 마이크론 비이드로 관찰했다. 3가지의 유사 실험 중 하나를 도시한다. 0.1 마이크론의 형광성 비이드 역시 비이드로 30분 혹은 3시간 동안 배양했던 DC를 이용하는 Rab4 염색으로 공동국소화 하는 것에 실패했다. (우측) 생쥐의 뒷발에 0.1 마이크론 비이드-OVA를 피내주사한 뒤 48시간 후 배출 슬와부 림프절을 절제하여 상술한 바와 같이 공동초점 분석하였다. Rab4 표지물질 및 OVA 접합 혹은 비접합된 0.1 마이크론 또는 0.04 마이크론 비이드에 대하여 공동-국소화 현상은 관찰되지 않았다. 3가지 실험 중 하나를 도시한다. 이에 대조적으로, 1 마이크론 크기의 형광성 비이드로 면역화된 양성 대조부 생쥐의 경우 공동-국소화 현상이 관찰되었다.

도 11의 패널 A에서, 종양을 캘리퍼로 측정했다. 패널 B에서 면역화 뒤 3일-13일의 개별 성장곡선을 도시한다.

도 12에서, 100㎍의 VSSP-OVA, VSSP-용해물 혹은 용해물 단독을 1회 피내주사하여 면역화한 C57/B6 생쥐를 플라스모디움 요엘리(Plasmodium yoelii) 17XL에 감염된 500,000개의 C57/B6 적세포로 챌린지했다. 일일 생존율을 관찰했다. 그룹당5마리를 챌린지했고 6가지 대표적인 실험 중 하나를 도시한다. 유사한 실험에서, 미처리 생쥐는 2주후 40%의 생존율 (8/20마리 생쥐)을 보였다. P.요엘리 17XL 감염 적세포의 냉동-해동 반복 및 초원심분리 방식으로 용해물을 발생하였고 표준규약에 따라 VSP에 접합되었다.

도 13에서, id 데이타는 반점형성단위(SFU/100만개 세포) ± 평균치의 표준오차 (SD)와 같이 100만개의 비장세포 당 nm23에 반응하는 세포의 선구체 빈도수로 표시하였다. 3마리 생쥐 (m1-m3)의 개별 반응을 도시한다.

도 14에서, 10일 후 IL4 분비 세포의 유도를 ELISPOT 으로 평가했다. 데이타는 각 면역원을 이용하여 개별적으로 면역화한 3마리의 생쥐를 SFU/100만개 세포 ± SD 와 같이 나타낸다.

도 15a에서, 면역화된 생쥐군(B군)을 90일 후 ELISA로 평가하고 이를 면역화되지 않은 대조부(A군)과 비교하였다.

도 16의 패널 A에서, C57/B6 생쥐를 0.04㎛ 비이드에 접합된 OVA로 1회 면역화 한 후 이 생쥐의 혈청을 상이한 시점에 수거했다. 4마리로 구성된 각 그룹의 405nm +/- SE 에서의 평균 광학밀도를 OVA 특이성 IgG ELISA로 평가하여 도시한다. 미처리 혈청을 음성 대조부로 보여준다. 2가지 유사 실험 중 하나를 도시한다. 유사한 ELISA 결과를 총 Ig 에 대하여 수득했으며 IgM 혹은 IgA 는 검출되지 않았다 (도면에 없음). OVA 단독은 PBS 면역화된 동물 전체에서 IgG 반응을 유도할 수 없었으며 컴플릿 프라운즈 보조제(CFA)에 혼합된 OVA는 단일 투약된 0.05㎛ 비이드-OVA 보다 더 큰 로그치의 IgG 반응을 유도하였다. 패널 B에서, C57/B6 생쥐를 0.04㎛ 비이드에 접합된 OVA (검정색 혹은 체크표시된 막대), PBS에 혼합된 가용성 OVA (백색 막대) 혹은 0.04㎛ 비이드와 혼합된 OVA (회색 막대)로 각각 1회 ID 투여하여 면역화했다. SIINFEKL 반응성 비장 T-세포의 선구물질 빈도를 10일 후(검정색, 백색 및 회색 막대) 혹은 12개월 후(체크표시된 막대) IFNγ ELISPOT로 평가했다. 각 그룹당 4마리의 생쥐를 검사했고 2가지 유사한 실험 중 하나를 도시한다. 100만개 세포당 반점형성단위값(SFU)의 평균치 +/- 표준편차(SE)를 각 그룹에 대해 도시한다. 10배 감소한 양의 항원(10㎍ VSP-OVA)을 사용하는 유사 실험에서 단일 면역화로 100만개 SIINFEKL 특이성 비장 세포당 102 +/- 56 (n=4) 를 유도했다. 표준 크롬 방출 분석시의 세포독성 T-세포 반응도 단일 면역화 10일 후 관찰되었다. (E:T 상대비가 20:1일 때의 3/3마리에 대한 특이성 세포용해율 >50%, 도면에 없음).

도 17에서, 14일 후 동물에 대해 MUC1 단백질을 발현하는 100만개의 감염성 백시니아 바이러스를 2차로 피내주사했고 10일 뒤 cp13-32 내의 에피토프에 대한 반응도를 IFNg ELISPOT 으로 평가했다. 도시된 데이타는 각 그룹당 2-3마리에 대해 평균한 100만개의 비장세포에 대한 IFNg 생성 세포 +/- SE 평균치이다.

도 18에서 폴리스티렌 0.05㎛ 비이드를 미리 OVA에 접합했고(PS) 이것을 동일한 방식의 OVA 접합 유리 비이드(G1)와 비교했다. 덧붙여서, 다른 화학적 방법을 유리 비이드에 대해 비교했다. 간단히 설명하면, 유리 비이드의 무게를 잰 후 PBS내 2.5% 고형물에 현탁하고 2회 세척했다. 비이드 펠릿을 PBS(pH7.4)에 혼합된 8% 글루테르알데히드에 재현탁했고 실온에서 하룻밤동안 천천히 혼합했다. 그 후 PBS로 3회 세척하고 PBS에 재현탁한 후 1ml 당 500㎍ 단백질을 첨가하고 5시간 동안 천천히 혼합했다. 이어서 비이드를 펠릿화하고 펠릿을 0.5M 에탄올아민에 재현탁 및 30분간 혼합하여 반응을 중단시켰다. 비이드를 다시 PBS로 세척하고 면역화 처리용도로 사용했다 (G2). 폴리스티렌(PS) 혹은 유리(G1이나 G2) VSP-OVA를 100㎍/생쥐 의 양으로 피내주사하여 면역화했고 10일 후 비장에서 수득한 SIINFEKL 특이성 IFNg 분비 T-세포를 ELISPOT으로 정량측정했다.

도 19에서, 50mM MES 완충액(pH6.0) 내의 2mg/ml 오발부민을 폴리스티렌 카르복시 변형 0.05㎛ 비이드 (2% 고형함량)과 15분간 혼합하였다. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디아미드를 4mg/ml(pH6.5)에서 각 조제물에 첨가 및 실온에서 2시간동안 배양하였다. 표준액(글리신)을 7mg/ml 글리신 혹은 20㎕의 1M 에탄올아민(아민)(pH 7.4), 20㎕의 1M 아미노아세트알데히드 디메틸 아세탈(알데히드)(pH8.0), 또는 20㎕의 1M 에틸렌디아민(알코올)(pH7.4)로 각각 냉각하였다. 조제물을 실온에서 약 16시간 동안 배양했다. 모든 조제물은 4 ℃ PBS에서 하룻밤동안 투석시켰다. 알데히드 조제물은 그 후 다시 20㎕의 1M HCl 로 냉각하고 4시간 동안 배양한 후 4 ℃ PBS에서 하룻밤동안 투석했다. 2-3마리의 C57/B6 생쥐 각각에 대해 상기 VSSP-OVA 입자물을 100㎍ 피내주사로 투여하여 면역화했고 CD8 T-세포 에피토프 SIINFEKL 에 대한 IFNg ELISPOT에 따라 비장내에서의 면역성을 평가했다. 그 결과를 각 동물에 대하여 100만개 비장세포당 SFU값을 평균치 +/- SE 로 나타냈다.

실시예 1: 사용된 재료와 방법

생쥐 및 면역화

생후 6주 내지 8주 C57/B6 및 BALB/c 생쥐를 월터 앤 엘리자 홀에서 구입하였다. 100㎕ 항원 접합된 비이드를 뒷다리에 피내주사(ID)하여 면역화하였다.

시약:항원 오발부민(OVA, III등급) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디아미드(EDAC)를 함유하는 별도의 언급이 없으면 모든 시약을 시그마사에서 구입하였다. FACScan 및 공동초점 연구 용도의 모노클로나 항체를 하이브리도마주로부터 실내에서 단백질 G 컬럼 (파마시아사 제품) 상에서 정제했거나 파미젠사에서 구입했다. FITC 접합된 혹은 카르복실화된 0.02-2 마이크론의 형광구체는 몰레큘러 프로브즈사에서 구입했고 비-형광성 카르복실화 소구체는 폴리사이언스사에서 구입했다. 사용되는 다음 표지물질에 대하여 간략히 표시했다: MHC II, MHC I, CD11c, CD11b, F4/80, NLD-145, CD8alpha, CD40, CD80 및 CD86. 공동초점 연구에서 사용되는 항-Rab4 모노클로날 항체는 러셀박사가 소개한 종류의 것이었다 (Peter McCallum Research Institute).

항원 발현 세포:공지방법[5]을 약간 변형시켜서 골수 단핵세포로부터 수지상 세포를 제조했다. 요약하면, 배지로 골수강으로부터 세포를 분출시키고 적세포를 용해함으로써 세포를 경골부 및 뒷다리의 긴 뼈로부터 수득했다. 세포를 10% 고온-비활성화된 태아소 혈청(FCS), 4mM L-글루타민, 100U/ml 페니실린, 100mg/ml 스트렙토마이신 황산염 및 100μM β-메르캅토에탄올을 첨가한 RPMI(CSL, AUST) 내에 1x10⁶세포/ml의 양으로 편평하게 깔고 여기에 1000유닛/ml의 GM-CSF 및 0.2ng/ml의IL-4을 첨가했다. 10ml 배양물을 100mm 직경크기의 페트리접시에 담아 37℃의 습윤성 CO₂인큐베이터 내에서 5-6일간 성장시켰다. 티오글리콜레이트 IP주사 뒤 3일후에, 공지문헌[6]에서 설명한 바와 같이 생쥐의 복강(IP)으로부터 마크로파지를 회수하고 3일간 배양하여 고유의 세포분획물이 농축되게 하였다.

비이드-항원 접합은 생산자의 지시에 따라 실행했다. 요약하면, 0.05M MES 완충액(pH6.0)에서 2.0mg/ml로 희석한 OVA를 2% 고형함량/부피의 비이드와 1:1 의 부피비로 혼합하였다. 혼합물을 15분간 천천히 젓고 다시 4mg/ml EDAC를 첨가했다. 혼합물을 희석 NaOH로 pH6.5가 되도록 조정하고 혼합물 2 내지 3시간 동안 천천히 저었다. 최종 농도가 100mM에 도달하면 글리신을 넣어 반응을 중단시켰다. 30분간 혼합한 후, 조제물을 PBS에 넣어 상온에서 하룻밤동안 투석시켰다. 조제물을 즉시 사용하거나 혹은 추후 사용을 위해 0.01% 아지드와 혼합하여 4℃에서 저장했다.

세포독성 분석:공지방법 [3]에 따라 분석을 실시했다. 요약하면, 독성 분석을 위한 효과 세포(effector cell)는 비장세포를, 10% 고온-비활성화된 태아소 혈청(FCS), 4mM L-글루타민, 100U/ml 페니실린, 100mg/ml 스트렙토마이신 황산염 및 100μM β-메르캅토에탄올을 함유한 RPMI 배지(CSL, AUST)에 담긴 10㎍/ml 펩티드 항원과 함께, 2ml의 웰플레이트에 2.5x10⁶/ml 의 양으로 담아 35℃ 온도 및 습윤성 CO₂인큐베이터 내에서 7일간 배양하여 생성했다. 인터루킨 2 (10U/ml, 재조합 인간 IL2, 림포컬트 HT, 바이오테스트, UK)를 3일째에 첨가했다. 타겟은⁵¹Cr 함유 EL4세포 단독이거나(배경) 혹은 1시간동안 37℃에서 10㎍/ml의 SIINFEKL 펩티드 혹은 EG7 및 오발부민 변형 EL4 세포주로 사전-펄스처리 되었다. 별도의 언급이 없으면, 분석은 효과 세포:타겟의 비율을 20:1로 하여 중복시행했다. 모든 타겟에 대해 자발적 세포용해 (배지의 단독사용) 및 최대 용해(5% 트리톤 사용)처리를 4회중복 시행했다. 4시간 후 상등액을 수득했다. 용해율(%)은 100 x ((실험적 방출-자발적 방출)/(최대 방출-자발적 방출))로 계산했다. 비용해율(%)은 펩티드 사용시의 용해율(%) - 펩티드 미사용시의 용해율(%) 로 계산했다.

세포독성 T-세포 선구물질(CTLp) 분석:CTLp 분석은 공지기술 [7]에서 기술된 바와 같이 실행했다. CTLp 빈도는 적어도 6개의 효과 세포수 (1x10³-1.28x10⁵)에 대하여 최소 32회 반복하여 결정했다. 세포는, 10% 태아소 혈청, 5μM SIINFEKL 혹은 OVA 및 10U/ml rhIL-2를 첨가한 DMEM 내에서 5 x 105 미토마이신 C 처리된 공통유전자형 비장세포와 함께, U형 바닥의 마이크로타이터 트레이에 담아 배양했다. 7일 후, 100ml의 사용배지를 104⁵¹Cr-라벨 EL4 혹은 EG7을 타겟으로서 함유하는 100㎕ 타겟세포 현탁액으로 교체하여 각 미량배양물의 세포독성을 분석했다.⁵¹Cr이 방출된 각 웰에서 평균값보다 큰 3개의 표준편차가 발견되면 세포독성 활성도가 존재하는 것으로 간주했으며 104 효과기에서 방출된 이소토프를 자극제만으로 혹은 펩티만으로 또는 rhIL2 만으로 배양하였다. 반응기 세포(responder cell) 갯수 사이에는 선형관계식 (0.987≤r2≤1)이 성립하며 선형 비례관계를 나타내었고, 또한 네가티브 웰의 빈도는 로그형 비례관계에 따랐다. CTLp 빈도는 37% 네가티브 웰을생성하는데 요구되는 반응기 세포 투약량의 역으로 측정되었다 [8,9]. CTLp 빈도 분석은 3회 시행하였고 각 빈도는 평균값으로부터 20% 이상 차이나지 않았다.

ELISPOT IFNγ 분석:이것은 공지문헌[3]에서 설명한 바와 같이 시행했다. 요약하면, 새로 분리한 5x10⁶/ml 비장세포 10㎕를 항-뮤린 IFN_γmAb(R4)로 사전피복된 혼합 아세테이트 플레이트 (MAHA 밀리포어) 상에서 18시간 동안 자극과 함께 배양했다 (EACC). 각 조건마다 2중웰을 설치했다. 사용된 배지는 상술한 바와 같이 첨가된 RPMI 1640 (CSL) 이었다. 하룻밤 배양후 세포를 씻어내고 플레이트는 뮤린 IFN_γ에 대한 2차 비오틴 접합 mAb로 배양한 후 (XMG.21-비오틴, 파마니젠, CA, USA) 이어서 1㎍/ml의 엑스트라비딘 알칼리성 포스파타제(A-AP) 접합물 (시그마사)로 다시 배양했다. 알칼리성 포트파타제 활성도 반점을 색도측정용 AP검출키트로 검출했고 (Biorad, Hercules, CA, USA) 해부용 현미경을 이용해서 그 수를 측정했다. 데이타는 100만개 세포당 반점형성유닛(sfu)으로 나타낸다. SIINFEKL 펩티드를 2.5㎍/ml로 사용했다.

통계분석:예방 연구에서의 통계분석은 각 그룹에서 예방된 생쥐의 수를 EpiInfor Version 5.0 패키지내의 Statcalc 프로그램에 있는 χ²테스트를 이용하여 비교하였다. 면역성 연구에서, 마이크로소프트 엑세포 Version 5.0a 패키지와 통계처리(Student's test)를 이용하여 ELISPOT 및 크롬 방출반응을 그룹간 비교하였다. 선형회귀분석은 윈도우 통계 프로그램 패키지 용도의 SPSS를 사용하여 면역성 및예방간의 상관관계를 평가하는데 이용했다.

수지상 세포 및 마크로파지에 의한 비이드 흡수율:현미경 슬라이드 상에서 성장한 3일 지난 마크로파지 배양물 및 5일 지난 수지상 세포 배양물에 5분 간격으로 24시간 동안 상이한 크기의 형광성 미량비이드를 공급했다. 그 뒤 배양물을 세척하여 유리된 비이드를 제거하고 FACScan 혹은 공동초점형 분석 대상으로 준비했다.

비이드를 흡수하는 세포의 in vivo 분석:면역후 12시간 내지 12일까지의 다양한 시간 간격으로 비이드 면역화된 생쥐로부터 배출 림프절 및 비장을 수거했다. 세포를 수거하고 적세포 용해 및 세척후 이들을 FACscan 혹은 공동초점(cofocal) 분석 용도로 조제했다.

세포 표면 표지물질 염색 및 유동세포 측정법:표면 염색에 있어서, 5x10⁵세포를 표지물질 F4/80 및 NLD-145, CD 에 대한 PE-라벨화 MoAb 와 함께 배양하였다. 2회의 세척단계후 항체가 직접 라벨화 되지 않은 경우, 제1 항체에 대한 특이성을 가진 2차 PE-라벨화 항체로 배양했다. 제2 항체가 생성된 계통의 미처리 혈청을 제2 항체를 이용한 배양에 앞선 차단 단계에 사용했다. 2회 세척한 후, 세포를 PBS/0.2% 파라포름알데히드로 세척했고 다시 FACScan 유동 세포측정치 (Becton-Dickinson사) 및 세포퀘스트(CellQuest) 소프트웨어로 분석했다. 광산란 게이트를 설치하여 사멸세포 및 비림프계 세포들을 배제시켰다. 임의의 표면 표지물질에 대해 미염색된 비이드 면역화 세포로부터 수득한 세포 및 표면 표지물질에 대해 PE-라벨화 항체로 염색한 미처리된 생쥐로부터 수득한 세포를 이용하여 FITC 및 PE 방출 스펙트럼 간의 중복에 대한 보상치를 결정하였다.

식작용된 FITC-라벨화 비이드의 공동초점 현미경 검사:올림퍼스 주사형 공동초점 현미경을 2중 형광 및 전송 검출기능을 갖춘 크립톤-아르곤 레이저광원과 함께 사용하여 상이한 크기의 형광화된 비이드가 마크로파지 혹은 수지상 세포에 의해 식작용 되었는지를 측정하였다. 시료를 단계적으로 취한 절편군의 크기는 식작용을 측정하기에 적절한 0.5 내지 1.0 마이크론이었고 광학주사 분석기로 분석했다. 세포는 플루오레세인 및 알렉사594 각각에 대해 488nm 및 568nm에서 자극하여 각각 530nm 및 610nm 밴드 패스필터에 통과시켜 검출하였다. 수득하는 동안, 레이저광을 포화레벨 이하로 유지했고 이득 및 오프셋 파라미터를 각 실험에 대해 유지했다.

ELISA 분석:OVA에 대한 항체 반응을 ELIS를 이용하여 측정했다. 폴리염화비닐 마이크로타이터 플레이트를 4℃ 에서 하룻밤동안 OVA (0.2M NaHCO3 완충액 내에혼합된 10㎍/ml 용액, pH9.6)으로 피복했다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈20 으로 4회 및 PBS로 다시 4회 세척한 뒤 2% 소혈청 알부민으로 실온에서 1시간 동안 비-특이적 결합에 대한 블럭을 하였다. 상술한 바와 같이 세척한 후 생쥐 혈청의 연속 희석액을 첨가하고 다시 실온에서 1시간 더 배양했다. 비면역성 생쥐 혈청을 음성 대조부로 사용했다. 플레이트를 세척하고 결합된 항체를 고추냉이-퍼옥시다제-접합된 양 항-마우스 Ig (세포리너스, AUS) 및 크로모제닉 기질 2,2"-아지노-디(3-에틸벤즈티아졸린) 술포네이트 (애머샴, UK)를 이용하여 검출했다. 405nm 에서의 흡수율을 EL 312e 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 기록했다.

실시예 2:항원 발현 세포에 의한 in vitro 및 in vivo의 VSSP 선택적 흡수율

마크로파지/단핵세포 계통에서 나온 세포를 이용한 다수의 연구 결과 입자크기 의존성 식작용이 1 마이크론 직경에서 최적의 흡수율을 나타내는 것이 입증되었다 [10,11]. 수지상 세포에서 흡수현상이 관측되었으나 광범위한 입자크기에 대해서는 시험하지 않았다. 본 발명자는 특히 바이러스 크기 (0.03-0.1㎛)의 단백질 피복 입자들이 수지상 세포 혹은 마크로파지에 효과적으로 흡수되는지를 확인하는 것에 관심을 가졌다. 도 1a는 티오글리콜레이트 제거된 복강 삼출물 마크로파지가 1㎛ 및 0.1㎛의 플루오레세인-라벨화 입자들 (형광비이드) 모두를 흡수했음을 보여준다. 미성숙 골수 유래의 수지상 세포는 이에 대조적으로, 0.1㎛ 크기의 형광비이드를 선택적으로 흡수하는 것으로 밝혀졌다. 공동초점 현미경 분석으로 입자들이 세포 내부에 있음을 확인했다 (도면에 없음). 이 체외 데이타는 바이러스 크기 고형입자(VSSP)가 또한 체내의 항원 프레젠트 세포들에 의해 선택적으로 흡수될 수 있음을 제기하였다.

일정 범위의 크기 (0.02, 0.04, 0.1, 0.2, 0.5, 1 및 2㎛)를 갖는 형광성 폴리스티렌 접합 입자들을 C57BL/B6 생쥐의 다리에 in vivo 주사했고 배출 슬와부 림프절에서 얻은 세포들은 FACScan 분석을 위해 10일 이후에 수거했다. 0.04-0.1㎛ 크기의 입자들은 림프절 세포에 의해 우선적으로 흡수되었다 (도 1b). 입자 주사후 1일, 3일, 6일 및 9일에 분석했을 때도 유사한 결과를 얻었다. VSSP는 마크로파지및 수지상 세포 표면 표지물질을 모두 발현하는 항원 프레젠트 세포에 의해 효율적으로 흡수되었다 (도 1b). 골수 유래의 수지상 세포 역시 체외에서 VSSP를 흡수했다. 예상대로, 이들 세포는 주로 미엘로이드 표현형이었다 [12].

실시예 3:VSSP는 세포독성 및 IFN _γ 분비 T-세포 및 항체의 고 선구물질 빈도를 제공한다.

수지상 세포에 의한 체내의 효율적 VSSP 흡수 때문에 이들이 타겟 항원의 전달을 위한 용도 및 새로운 백신으로의 능력을 갖는다고 제안하였다. C57/BL 생쥐는 0.02, 0.04, 0.1, 0/2, 0.5, 1 혹은 2㎛ 오발부민(OVA) 피복된 입자로 면역화 하였고 15일 후 2차 면역화 처리하였으며 그 후 10일 뒤에 혈청 혹은 비장세포를 수거했다. 도 2a는 MHC I종 제한 SIINFEKL 에피토프에 대한 IFN_γ분비 CD8 T-세포의 최적의 유도효과를 0.04㎛ 크기의 입자를 사용하여 달성하였음을 보여준다. OVA에 반응하는 CD4 T-세포는 0.04-1 마이크론 범위의 OVA 접합입자와 유사한 선구물질 빈도를 갖는 것으로 확인되었다. SIINFEKL에 대한 세포독성 T-세포는 또한 VSSP와 함께 유래되고 IFN 분비 T-세포의 선구물질 빈도와 상호관계가 있었다 (R2=0.92) (도 2b 참조). 놀랍게도, OVA-특이성 IgG 역시 0.04㎛ 입자로 면역화 되고 추가로 1㎛ 입자로 면역화된 생쥐에 있어서 최고의 선구물질 빈도를 제공했다 (도 2c). 이와 유사한 면역성 결과를 플루오레세인 없이 VSSP 만 사용한 경우에도 얻을 수 있었다. 따라서, 세포성 혹은 체액성 반응을 선택적으로 촉진하는 다수의 면역원 및 보조제놔 대조적으로 VSSP는 상기 반응 양쪽의 고레벨을 모두 유도할 수 있었다.

도 2에서 나타낸 결과는 가용성 항원 잔사물의 제거없이 접합후 항원의 동일한 총량을 주입하는 것에 기초한다. 도 3a 은 유사한 가용성 항원을 투석 혹은 초원심분리로 제거한 후 0.04 마이크론 VSSP를 이용하여 수득한 것을 보여준다. 따라서, 가용성 항원이 관측된 T-세포 반응에 대해 크게 기여하는 것은 아니었다. 또한, 접합된 및 미접합된 OVA 및 VSSP 혼합물을 비교하면 위의 사실을 뒷받침 할 수 있었다. 도 3b는 공유접합된 VSSP 만이 고레벨의 SIINFEKL 특이성 T-세포를 유도하였음을 보여준다. 따라서, VSSP에 대한 공유적 결합은 OVA를 I종 프레젠테이션 경로 속으로 타겟화하고 I종 제한 T-세포를 체내 유도하는 것을 필요로 했다. 큰 입자들과 대조적으로 소형 입자내에 접합된 단백질의 함량이 크면 그 자체로서 더 높은 VSSP 면역성을 가질 수 있다고 판단하는 것도 가능하다. 그러나, 사실은 그렇지 않으며 그 이유로; (1) 0.04㎛ 및 0.02㎛ 크기의 비이드에서 최대 피크인 면역성은 거의 반응성을 유도하지 않았으며(도 2); (2) 0.04-0.1 마이크론 VSSP는 항원 접합레벨과 무관하게 일관적으로 1㎛ 입자보다 더 큰 면역성을 나타냈고; (3) VSSP 에 필요한 농도의 100배(최고 1mg/생쥐)까지 1㎛ 입자의 면역농도를 증가시키면 VSSP에 접합된 항원의 농도범위와 함께 도시된 레벨에 대한 면역성을 향상시킬 수 없었으며; (4) 상이한 크기의 비이드에 결합된 등량의 단백질 혹은, 상이한 크기의 비이드를 동일한 갯수로 사용하여 면역화하면, VSSP가 일정한 농도 범위에서 (동물 1마리당 0.5-1000㎍ OVA 총량, 0.5-50㎍ 접합 OVA 및 10-10 비이드) 큰 입자보다 더 우수한 면역성을 나타내었기 때문이다.

실시예 4: 입자 흡수 및 처리를 위한 신규 경로

II종 MHC 처리경로를 통해 외인성 항원의 소화에서 유래된 펩티드는 역류하여 세포 표면에서 빈(empty) I종 MHC 분자에 결합할 수 있다 [1,10]. I종 프레젠테이션의 이 다른 메카니즘은 TAP(항원처리에 관련한 전달자) 조정된 내부원형질 망상조직(ER) 속으로 전달되는 것과는 무관하다. B형 간염 표면 단백질 VLP는 TAP 독립 메카니즘에 의해 마크로파지 내에서의 I종 프레젠테이션을 위해 처리된다 [2]. 본 발명자는 TAP 녹아웃 C57/BL 생쥐를 OVA-접합 VSSP로 면역화 하였다. TAP-KO 동물에 있어서 SIIFEKL 혹은 OVA 에 대하여 배경레벨보다 큰 T-세포 반응은 검출되지 않았으며 이것은 I종 프레젠테이션을 위한 VSSP 처리가, 위와 대조적으로, TAP 의존적이라는 사실을 입증했다. 외인성 항원의 I종 프레젠테이션에 관한 TAP 의존형 메카니즘은 내핵세포형 소포체의 '누출' 및 세포질 속으로의 항원의 우발적인 방출에 기인하여 1㎛ 입자 상에 흡착된 단백질에 관련하여 공지되었다 [1,10]. 식작용으로 흡수된 큰 입자들의 처리는 Rab4 어댑터 단백질을 발현하는 리소좀과의 초기 접합단계를 수반한다 [13]. 본 발명에서 사용하는 공동초점 현미경 분석법은 VSSP가 이 경로를 따르는지를 측정하기 위한 것이다. 도 4는 소포체를 함유하는 Rab4 및 VSSP 형광비이드가 골수 유래된 수지상 세포의 배양에서, 혹은 VSSP의 체내 투여뒤 24시간 후 체내의 림프절 세포에서 공동-국소화 하지 않았음을 보여준다. VSSP는 따라서 VLP 혹은 이보다 큰 입자들 모두에서 사용되는 것과 다르고 또한 Rab4 독립성 및 TAP 의존성인 처리경로를 사용하기도 한다. 이 메카니즘은 실시예 7에서 더 검토하였다.

실시예 5: VSSP는 체내 및 체외에서 항원 프레젠트 세포의 팽창을 유도한다.

C57BL/6 생쥐를 미처리 상태로 두거나 (미처리) 혹은 0.1㎛ 형광비이드를 생쥐 다리에 피내주사하여 면역화 하였다. 주사뒤 48시간 후 슬와부 림프절(LN)을 해부하고 이 표지물질에 대한 특이성을 가진 PE 접합 항체로 염색하여 CD40의 발현에 대해 분석하였다.

그 결과(도 5)는 0.04, 0.05 및 0.1㎛ 폴리스티렌 비이드 단독 혹은 이것을 OVA에 접합시켰을 때 피내주사에 따른 면역화 처리후 배출 슬와부 림프절로부터 회수되는 세포의 총수를 4배까지 증가시킬 수 있었음을 보여준다. 더욱더, 이것은 F4/80+ (단핵세포/마크로파지 표지물질)세포가 아닌 NLDC145+ (수지상 세포 표지물질) 비율이 1.5배로 증가하는 원인이 되었다. 또한, 활성물질 CD40 및 CD86을 발현하는 림프절 세포의 비율도 1.5배를 초과하여 증대시켰다. 도 5는 FACScan에 의해 관측된 면역화 후의 CD40+ 세포 증가 (33% 내지 63%)의 한 예를 보여준다. 또한, 이들 세포 대부분은 0.04㎛ 비이드를 흡수한 것으로 나타났으며 여기서의 0.04㎛ 비이드는 형광성 녹색 코어와 함께 사용되었다.

0.04, 0.05㎛ 및 0.1 폴리스티렌 비이드 단독 혹은 이것을 OVA에게 접합시킨 것이 증가시켰으며 생쥐의 골수로부터 정제된 수지상 세포의 in vitro 증식을 유도할 수 있었다. 성숙한 수지상 세포(LPS 및 TFN-알파로 활성화 한 후의)가 아닌, 미성숙 수지상 세포는 이러한 VSSP 활성화 효과를 받기 쉬웠다 (도 6).

데이타의 결과는 0.04-0.1㎛ 크기의 입자들(VSSP)이 예상외의 및 지금까지 알려지지 않은 능력 즉, 수지상 세포를 포함한 항원 발현세포 및 CD40과 CD86 같은 잠재적 공동자극형 분자들을 발현하는 특정 세포들을 자극하여 증식 및 팽창시키는능력을 가진 것임을 제시한다. 더욱더 이들이 효능을 갖는 이유도 설명할 수 있다. 또한, VSSP가 화학적으로 접합되지 않은 항원에 대한 반응에서까지도 보조효과 (하기 실시예 14 참조)를 나타낼 수 있는 메카니즘을 제안한다.

실시예 6: 주사후 즉시 VSSP를 흡수하는 확장 표현형 세포

생쥐 다리에 피내주사한 직후 VSSP를 흡수하는 (및 따라서 후속의 면역활성에 반응할 수 있는) 세포를 평가하기 위해, 배출 슬와부 림프절을 해부했다. 형광코어로 0.04㎛ VSSP-OVA를 흡수한 표현형 세포를 FACScan으로 분석한 후 1㎛ 크기인 것을 제외하고 동일한 입자와 비교했다. 도 7은 각 표현형 표지물질을 발현하는 0.04㎛ 비이드+ 혹은 1㎛ 비이드+ 세포의 비율을 도시한다. 0.04㎛ 비이드를 흡수하는 세포는 대부분 NLDC145+, CD40+ 및 CD86+ 이었다. 또한, CD11c+, CD4+ 및 CD8+ 세포도 1㎛ 비이드+ 보다 0.04㎛ 쪽이었다. 0.04㎛ 비이드를 흡수한 이러한 고활성화 DC 표현형 세포는 따라서 여기서 관찰된 면역반응 특히, CD8 T-세포 반응이 효과적인 이유를 설명해준다.

실시예 7: 미립입자의 흡수 및 처리

수지상 세포(DC)에 의한 0.04㎛ 비이드-OVA 흡수 메카니즘을 검토하기 위하여, 골수 유래의 DC를 식작용 저해제 (시토칼라신 D, CDD); 클라드린 피츠(아밀로라이드, AML) 혹은 카베올레 조정된 내재물질(포르볼 미리스테이트 아세테이트, PMA) 등과 함께 배양하였다 [14,15]. DC 는 PAM, AML, CDD, 플리핀(FIL) 혹은 염화암모늄(AM)(모두 시그마사 제품임)으로 소정 농도에서 30분간 3회중복하여 배양했다. OVA-형광성 0.04㎛ 비이드를 3시간 동안 첨가 및 흡수량을 FACScan 으로 정량측정했다.

PMA 및 AML 양쪽 모두 DC에 의한 0.04㎛ 비이드-OVA 흡수량을 감소시켰고 반면에 CCD는 저해효과를 일으키는데 실패했다 (도 8a). PMA 및 AML 에 의한 저해는 부가적(additive)이다 (도 8a). 이것은 클라드린 피츠 및 카베올레 모두 VSSP 흡수에 관여할 수 있음을 제시한 것이다.

아밀로라이드는 수용체 관여 엔도사이토시스(endocytosis)에 필요한 Na+-H+ 교환을 저해함으로써 작용한다 [14]. 본 발명자는 시토졸 산성화반응을 방해하여 린 피츠의 조합을 저해하는 염화암모늄을 추가적으로 시험했다 [14]. 염화암모늄은 0.04㎛ 크기의 비이드의 흡수율은 방해했으나 1㎛ 크기의 비이드는 방해하지 않았으며(도 8b), 이는 VSSP 흡수시의 클라드린 피츠의 역할을 확인시켜준다. 카베올레는 DC 내의 바이러스 입자의 흡수를 위한 신규 메카니즘을 조정하는 것으로 제안되었다 [15]. 본 발명자는 PMA를 이용하였을 때 카베올레가 DC 내의 VSSP 흡수에 관여하는 결과를 얻었다 (도 8a). 이것을 확인하기 위하여, 본 발명에서는 또다른 카베올레 저해제인 플리핀을 사용했다. 플리핀은 콜레스테롤 제거에 작용하며 반면에 PMA는 카베올레 내재화를 조정하는 인산화반응에 영향을 미친다 [14,15,16,17]. PMA와 유사하게, 플리핀은 1㎛ 비이드가 아닌 0.04㎛ 비이드만 차단했으며 따라서 본 발명에서의 가설이 확인되었다 (도 8b).

카베올레 및 클라드린 피츠는 엔도섬형 및 리소좀형 컴파트먼트에 분자를 이동시킬 수 있다 [14,16]. 또한, 항원을 직접 시토졸에 전달하여 [17] 세포질 처리 및 MHC I종 프레젠테이션을 위한 소포체 속으로의 TAP 의존형 전달을 유인할 수 있다 [1, 18].

이러한 결과는 도 4에서 나타낸 것과 함께 본 발명에 따른 항원 처리를 위한 신규 경로를 설명한다. 본 발명의 면역성 조성물은 카베올레 및/또는 클라드린 피츠를 경유하여 항원 프레젠트 세포에 의해 흡수되는 것으로 나타나며 그 후, 항원은 MHC I종 프레젠테이션을 위한 Rab4 독립형 및 TAP 의존형 경로에 의해 처리된다. 이러한 관찰결과는 카베올레가 TAP-의존형 항원 처리경로 및 CD8 세포를 유도하는 능력에 대해 아직까지 발표된 바가 없었다는 점에서 신규한 것이다.

실시예 8: 방어효능의 비교

50nm(즉, 0.05㎛) (VSSP) OVA 접합 입자를, OVA를 발현하는 100,000개의 종양세포를 후속으로 피하주사한 생쥐에 대한 방어력에 관하여, OVA 단독 혹은 1000nm(즉, 1㎛) OVA 접합 입자와 직접 비교하였다. 모든 생쥐에게 100㎍를 1회 피내주사하여 면역화 했고 (혹은 처리없이=미처리) 그 뒤 30일 후에 종양을 챌린지 했다. 도 9a 는 VSSP-OVA가 OVA 발현 종양의 성장을 완전 억제한 모습과, OVA 단독사용시 혹은 100nm 비이드와 함께 사용시 방어력 측면에서 큰 효과가 없었던 것을 보여준다.

실시예 9: 단일 VSSP 면역화 처리시 고레벨 면역성을 유도하며 종양 챌린지를 예방한다.

OVA-접합 VSSP 를 이용한 내피주사 면역화 처리시 IFNγ 생성 및 세포독성 SIINFEKL 특이성 T-세포를 유도하였다 (도 10a, 1a 및 b). 부가적인 면역화는 반응성을 더 증가하지 않았다 (도 10b 및 10c). T-세포는 면역화 처리 뒤 82일 후 높은선구물질 빈도를 유지할 수 있었다 (도 10d). 항체반응도 유사하게 유지되었다 (도 16). 단일 VSSP 면역화 처리에 의해 달성된 CD8 T-세포 선구물질 빈도의 레벨은 VLP의 1회 투약 혹은 복수회 투약시 관찰된 것보다 더욱 크고 고효율 헤테로형 1차/2차 면역주사 방식에만 필적하는 것이다 [1,2,3,19,20]. 고 IFNγ생성 및 세포독성 T-세포 선구물질 빈도는 다수의 세포내 병원체 및 암에 대한 방어력과 관계있다 [21,22,23]. 본 발명자는 1회 피내주사량의 OVA-접합 VSSP를 주사하여 C57/BL을 면역화 했고 그 뒤에, 세포질 OVA을 발현하고 또한 체외에서 SIINFEKL 특이성 T-세포의 타겟이 되는 EG7 종양 세포주를 챌린지했다. 그 결과, VSSP 면역화된 생쥐는 종양 챌린지로부터 완벽하게 방어되었으며 반면 미처리된 대조부에서는 모두 종양이 발생하였다. 또한, 항원 접합 VSSP의 단일 투여후 도 2c에서 관찰된 것과 유사하게 항체레벨이 증가하였다.

VSSP 백신에 대한 추가 연구

하기의 실시예 10 혹은 13은 VSSP가 각종 항원과 함께 사용가능하고 IFN 및 IL4 생성 T-세포를 동반하는 광역의 면역성을 유도하는 것을 설명한다. 잠재적인 알러지성 IgE 항체와 달리, 고레벨 IgG가 1회 투약후에 유래된다.

VSSP의 치유적 효능은 다음 2가지 모델을 통해 입증된다. 백신의 1회 투여후 (1) 발병된 종양의 100% 제거 (실시예 10 참조) 및 (2) 치사성 말라리아의 예방 효과 (실시예 11 참조). 이것은 VSSP가 각종 질병에 대하여 단일 투약형 백신을 개발함에 있어서 특별한 효능 및 융통성이 있는 백신접종 프로토콜임을 증명하는 것이다. 더욱더, 이러한 발견에 기초하여 본 발명자는 VSSP가 암예방 및 치료에 사용될수 있을 것으로 믿는다.

실시예 10: 기존 종양의 제거

본 발명자는 비이드-OVA에 의한 단일 면역화로 OVA 발현 종양의 후속 챌린지를 완전 방어하는 것을 관찰하였다.

C57/B6 생쥐에게 100㎍ 비이드(0.05㎛)-OVA(ID)으로 1회 면역화했거나 미처리 상태로 두었다(미처리). 30일 후, 생쥐에게 5x10⁶EG7 종양 세포주를 챌린지했다. 종양 크기는 면역화 처리후 3-13일째에 캘리퍼로 측정했다. 회귀 연구에서, 생쥐에게 EG7 세포를 제공하고 8일 후 유사한 종양크기 분포로 된 2개 그룹으로 분리했다. 그룹 중 하나는 미처리 상태로 두었고 다른 그룹에는 3일 후 (즉, 종양 세포주를 투여한 뒤 11일 후) 비이드-OVA로 면역화 시켰다.

본 발명자는 이미 발생된 기존의 종양을 종양 발생된 생쥐에게 단일 면역화 처리를 하여 치료할 수 있음을 증명한다. 종양은 1회 주사뒤 2주 후 면역화된 생쥐에게서 사라졌다. 치료학적 능력은 어떤 암치료용 백신에서도 아주 특별한 것이며 백신접종용 부형제가 치료용 백신의 개발 전망을 더욱 크게 해준다 (도 11B).

무신-1 혹은 Muc1은 유방암 관련 항원이다. VSSP-Muc1 단백질로 1회 면역화 함으로써 상기 유방암 항원을 발현하는 종양 세포주로 챌린지한 생쥐에 있어서 종양 형성을 억제하였다 (도 11A 참조).

실시예 11: 말라리아에 대한 방어

본 발명자는 0.05㎛ 직경의 폴리스티렌 비이드를 생쥐에 대해 말라리아 방어효과를 유도하기 위해 부형약으로 사용할 수 있음을 설명한다. 플라스모디윰 요엘리(Plasmodium yoelii) 감염된 적세포로부터 얻은 세포용해물을 비이드에 접합시키고 추후에 치사량의 유충을 챌린지한 생쥐를 면역화 하는데 사용하였다.

혈액을 50% 기생충혈증의P. yoelii 17XL에 의해 감염된 C57BL/6 생쥐로부터 수거했다. 15분동안 800g을 원심분리한 후 회수한 적세포(RBC)를 3회 냉동/해동을 반복한 후 초음파 처리했다 (세포용해물). 세포용해물은 상술한 바와 같이 0.05㎛로 접합했다. 비이드-세포용해물, 비이드-OVA 혹은 세포용해물만 단독으로 ID 주입했다. 면역화 혹은 미처리된 C57BL/6 생쥐에게 2주후 1,000,000개의P. yoelii 17XL에 감염된 RBC를 복강내 주사하여 챌린지했다.

챌린지에서 모든 동물이 생존하였으나, 그 중 세포용해물 만으로 (비이드 접합없이) 면역화된 동물의 60%는 감염억제에 실패하여 죽게되었다 (도 12). 이는 단일 투약형 백신이 혈액계내 말라리아에 대한 방어효과를 제공할 수 있음을 우선적으로 입증하는 것이다. 이 단일 투약형 백신은 간단히 투여 및 배급할 수 있어 광범위한 인구층을 수용하므로 특히 말라리아 및 제3세계에서 광범위하게 퍼져있는 다른 질병들에 효과적이다.

실시예 12: 세포성 면역

1) OVA 이외의 항원들 예컨대, 암 항원 nm23에 접합된 0.05㎛ 직경크기의 폴리스티렌 비이드 역시 고레벨 IFN 감마형 분비 T-세포의 유도에 의해 입증하듯이 강력한 세포성 면역을 유도한다 (도 13).

2) 세포성 면역의 유도와 더불어, 비이드-OVA 혹은 비이드-nm3는 고레벨 IL4을 유도했다 (도 13). 이 림포카인은 항체 생성을 촉진하고 세포 면역성과 함께 우수한 항체유도를 관측하게 되는 이유를 설명해 주기도 한다.

실시예 13: 항체 면역성

1) OVA 에 대해 접합된 0.05㎛ 직경크기의 폴리스티렌 비이드는 단일 피내주사(ID) 후 고역가의 IgG 항체를 유도했다 (도 15a)

2) 고 IgG 레벨에도 불구하고, IgE 레벨은 검출되지 않았다. 따라서, 이 백신은 정상적으로 IgE 반응의 손상 (알러지에 수반되는)을 유발할 위험이 전혀 없는 것으로 입증된다 (도 15b).

실시예 14: 상이한 경로를 통한 투여 및 IgG 및 IgA 항체의 유도

상술한 피내주사 이외에도 사람을 대상으로 유용한 백신 투여경로를 이용하여, OVA에 접합된 VSSP (100㎛/생쥐)를 생쥐에게 복강내, 피하내, 비강내 및 직장내로 투여했다. 피내주사와 유사하게, ELISPOT 분석결과 모든 경로에서 SIINFEKL 혹은 OVA에 대해 IFNg를 분비한 T-세포를 유도했다 (1/50,000 내지 1/2,000 비장세포). 놀랍게도, 고레벨 IgG을 유도했으나 IgA는 거의 혹은 전혀 유도하지 않았던 피내주사를 이용하는 초기의 관찰결과와 대조적으로, 이러한 다른 경로에 따른 VSSP-OVA는 혈청 IgA 반응을 유도했고 또한 직장내 및 비강내 경로는 검출가능한 정도의 IgG을 유도하지 않았다 (역가 <1/100) (표 1). 직장내, 복강내, 비강내 및 피하경로에 따른 VSSP는 따라서 IgA가 예컨대 점막감염의 방어역할을 하는 경우 (예, 폐, 자궁경부 혹은 장 등) 질병에 대한 방어 면역성을 유도하는데 사용할 수 있다.

표 1

경로	혈청 IgG 역가	혈청 IgA 역가
직장내	<1/100, <1/100, <1/100	1/1280, 1/640, 1/1280
복강내	1/1640, 1/100, 1/400	>1/5120, >1/5120, >1/5120
비강내	<1/100, <1/100, <1/100, <1/100	1/160, 1/320, 1/320, 1/640
피하	1/800, 1/200, 1/6560	>1/5120, >1/5120, >1/5120

특별히, 2회의 투약 후 고 IgG 반응은:

VSSP-OVA로 2회에 걸쳐 (100㎍/생쥐, 14일 간격) 면역화 처리하자 ELISA 평가시 놀랍게도 >1/500,000 의 현저히 큰 고혈청 Ig 및 IgG 항체역가를 발생하였다. VSSP에 대해 접합시켰을 경우, 유방암 항원 nm3 및 말라리아 항원 MSP4/5로 2차례 면역화 한 후의특이성 IgG 항체에 대해서도 이와 유사한 결과를 얻었다.

실시예 15: 장기 지속성 반응

VSSP-OVA에 대한 반응은 놀랍게도 장기지속되었다. 도 16은 강한 효능의 IgG OVA 특이성 항체가 ELISA 분석시(패널 A) 및 SIINFEKL에 대한 CD8 T-세포 반응이 IFNg ELISPOT 분석시(패널 B) 각각 단일 피내주사에 따른 면역화 처리뒤 1년 뒤에 여전히 존재했음을 보여준다. 패널 B는 또한 항원이 최적의 면역성을 위한 고형입자물에 공유적으로 접합되어 있었음을 보여준다.

실시예 16: 이종형 1차-2차 면역주사

백시니아-MUC1은 미처리, 컴플리트 프라운드 보조제(CFA) 내의 MUC1 로부터 얻은 펩티드 cp13-32(cp13), 만난 접합된 MUC1 (재조합 MUC1-GST 융해 단백질)(M-FP) 혹은 0.1㎛ VSSP-MUC1 (재조합 MUC1-GST 융해 단백질)(VSSP) 등으로 1차 면역주사한 동물에 대해 2차 면역주사 반응시키는데 사용했다. 도 17은 MUC1의 펩티드13-32 영역에 대한 반응이 VSSP-MUC1 1차 면역주사 뒤에, 백시니아-MUC1 2차 면역주사한 실험군을 백시니아-MUC1 만을 수용한 동물과 비교했을 때, 훨씬 향상되었음을 보여준다 (미처리/V 대 VSSP/V 비교). 따라서,VSSP-항원은 이종형 1차-2차 면역주사 프로토콜에서 사용하기에 적절하다.

실시예 17: VSSP 에 대한 고형 코어의 재료 조성

0.04-0.05㎛ 크기의 고형 코어가 VSSP 면역성에 가장 중요한 결정인자라는 본 발명의 가설에 따라 폴리스티렌 이외의 재료로 만든 입자들도 상기 크기 범위 내에서 큰 면역성을 가질 수 있다고 추측한다. 따라서, 폴리스티렌(PS) 혹은 유리(G1 혹은 G2) 재질로 되고 또한 동일한 화학적 방법(G1)으로 OVA에 접합되거나 혹은 글루타르알데히드(G2)를 사용하여 결합시킨 0.05㎛ 입자들을 피내주사하여 단일 면역화 한 뒤 생쥐의 면역성을 비교했다. 도 18은 폴리스티렌이나 유리로 제작된 VSSP가 마찬가지로 유사한 고면역성을 나타내었고, ELISPOT 분석시 SIIFEKL 에 대한 IFNg 생성 T-세포의 고 선구물질 빈도를 유도하는 것을 보여준다. 따라서, 단백질 접합을 위한 VSSP의 고형코어를 유리 및 폴리스티렌 재질로 사용하여 제공하였으며 또한 고형 코어에 다른 재료를 사용하는 것도 예컨대 PLG와 같이 기능적일 것으로 예상한다.

실시예 18: VSSP에 대한 항원의 접합

결과적으로 0.05㎛ 입자 내에 항원을 혼합하면 항원만 있을 때보다 더욱 면역성이 증가하나 최적의 면역성을 얻기 위해서는 공유결합이 필요하게 된다. 항원을 VSSP에 접합하는데 사용되는 화학적 방법은 따라서 이론상으로는 면역성의 결정요인이 될 수 있다. 특히, 입자의 전체 전하는 특이성 혈청 혹은 다른 내인성 단백질과의 상호작용을 촉진할 수 있다. 따라서, 이론상으로 이들은 수지상 세포에 의한 흡수를 촉진하고 이것이 고면역성을 가져온다. 이러한 이론을 시험하기 위하여, 표면상에서 상이한 전하를 갖는 50nm (즉, 0.05㎛) 입자물로 생쥐를 면역화 했다. OVA-VSSP는 카르복실레이트 변형 나노입자를 사용한 것에 따라 전체적으로 음성전하를 띤다. 또한 OVA 접합후 활성화된 카르복실산기를 글리신으로 제거한다 (글리신, 도 19). 반응을 에탄올아민 전하로 제거하여 접합후의 OVA의 총전하를 제외한 전하가 모두 중성화 될 수 있다 (알코올, 도 19). 또한 에틸렌디아민으로 제거하면 한 양성전하가 도입된다 (아민, 도 19). 또한 아미노아세트알데히드 디메틸 아세탈로 제거하면 (알데히드, 도 19) 유용성이 있는 알데히드기를 도입할 수 있다. 접합 프로토콜의 상기 3가지 변형 모두 고면역성 입자를 제공하였으며, 아민 및 알코올 변형물은 글리신에 필적하며 단, 알데히드의 면역성이 다소 떨어진다. 따라서, 반대 전하를 입자에 도입하여 유사한 면역성을 얻는 것과 같은 혈청 단백질의 비-특이성 흡착으로 면역성을 갖기는 거의 불가능하다. 더욱더, 접합 방법에서 일부 다른 변경 및 전하를 변화시키는 것은 면역성의 감소없이 행할 수 있다.

검토

상술한 결과의 관점에서, 본 발명의 조성물은 각종 감염, 암 혹은 기타 질병에 응용할 수 있는 백신 혹은 백신접종 방법을 개선 혹은 최적화 하는 방법을 제공한다.

VSSP의 최적 크기는 가장 널리 알려진 바이러스의 크기와 대등한 정도이다(30-150nm). 이 때문에, VSSP의 용도가 생물학적으로 중요하다는 것을 추측할 수 있다. 상술한 관찰결과에서, 본 발명자는 면역계가 VSSP의 크기범위에 있는 입자들에 대해 충분히 반응하게 될 것이라고 생각한다. 본 발명에 앞서서, 면역반응의 자극이 특히, 박테리아나 균류 같은 다른 병원체로부터 나온 에피토프가 매우 클 때,바이러스의 크기범위 내에 있는 면역자극제의 크기에 크게 의존할 수 있다는 사실은 공지되거나 이해된 바가 없다. 실제로, 이러한 경로를 통해 타겟화된 항원들은 놀랍게도 광범위하고(면역반응의 체액성 및 세포성 작용력을 포함하는) 및 강력한 반응(장기지속적인 고 효과기 T-세포 선구물질 빈도를 유도하는)을 유도하였으므로 면역계는 바이러스 크기의 입자에 충분히 작용할 것이라고 생각한다. HepB 표면 단백질 혹은 이스트 레트로트랜스포존 단백질(Ty)로 구성된 VLP (예, 입자에 결합되지 않은 순수항원)을 활용하는 종래의 연구들도 단일 면역화 투약으로 유도한 광범위하고 장기지속적인 면역성을 증명하였으나, 이러한 반응들은 VSSP에 의해 달성되는 것의 1/10-1/100배에 불과한 것이다 [1,2,3,19,20]. 그러나, 크기를 제외한 다른 특징들, 예컨대 지질 혹은 만난 함량이나 막결합 단백질은 I종 제한 T-세포 반응을 유도하는 VLP의 능력에 필적한다고 추측하였다 [1]. 이론에 얽매이지 않고, 본 발명자는 수지상 세포 같은 체내의 항원 함유 세포를 VSSP로 효과적으로 타겟화하고 또한 VSSP로부터 단백질 가수분해에 따른 항원방출 속도를 감소시키는 복합적인 처리로 더욱 강력한 면역원을 발생할 수도 있다고 생각한다.

VSSP의 새로운 백신으로서의 용도는 OVA 모델에서 단일 면역화 투약으로 후속의 종양 챌린지를 방어할 수 있는 능력에 의해 입증되었다. 또한 본 발명자는 유방암, 무신-1(MUC-1)에서 발현된 항원에 대하여 광범위하고 강력한 면역성 및 예방력을 관찰하였다. 동물 연구에서 활용된 피내 투여경로는 사람에게 쉽게 응용될 수 있다. VSSP는 특히, 체액성 및 세포성 면역이 예방효과를 제공하는 말라리아, 암 및 바이러스 질환 더 구체적으로는 AIDS와 간염 같은 질병에 대한 인체 백신 개발에 관련하여 특히 바람직하고 간단한 방법을 제공한다 [10, 12, 21, 25-28]. 재조합 항원을 I종 프레젠테이션 경로에 타겟화 할 때 다수개의 에피토프에 대하여 T-세포 반응을 유도할 수 있으며 따라서, 다양한 MHC 타겟 계층의 사람들에게 이러한 백신을 확대 사용할 수 있다.

현재, CTL의 효과적인 자극을 위한 DC 1차 면역주사는 DC의 체외 펄스처리에 의해 달성되나 비용이 크고 방법상으로도 곤란하다. 본 발명은 체내에서 항원을 DC에 효과적으로 전달하고, 따라서 다수의 항원 특이성 CD8 T-세포의 유도 및 면역방어 효과를 가져올 수 있는 대안을 제공한다. 0.04-0.05㎛ 정도의 협소한 크기범위 내에 있는 VSSP는 1회만으로 고 CD8 T-세포 레벨을 유도할 수 있는 능력을 갖고 있으므로 APC 혹은 서브셋에 의해 효과적으로 흡수되어, MHC 1 처리경로 및/또는 APC 기능의 직접자극을 타겟화하는 결과를 가져올 수 있다. VSSP 흡수력은 다른 크기의 것과 달리 림프절에서 향상되는 것으로 밝혀졌고 이 흡수력 향상은 DC의 표지물질인 입자 양성 DEC205+ 세포의 빈도 증가에 기여했다. DC는 강력한 APC로서 CD40 및 CD86의 발현은 효과적인 CD8 T-세포 1차면역화를 가능하게 하는 서브셋을 특징으로 한다. 이들 표지물질은 VSSP+ 세포에서 발견되었다. 따라서, 체내에서 이 효능적 DC 서브셋에 대한 VSSP의 흡수 및 선택적인 국소화 현상은 본 발명에 따른 미립입자의 면역성을 설명하는 것이다.

본 발명에 관련하여, 당해 분야의 지식을 가진 경우라면 본 발명의 기본 개념과 사상을 벗어나지 않고 명세서에 기술된 범위 내에서 다양한 구현예가 가능할 것임을 이해할 수 있다.

본 발명의 VSSP에 대한 다른 장점으로는 다수 경로를 통해 투여되어 IgA를 생성하는 것을 포함한 면역반응 유도 능력 및 1차-2차 면역주사 백신접종 방법에 있어서의 적합성 등을 들 수 있다.

추가의 연구에서, 특별한 면역반응을 유도하는 생리학적 메카니즘을 확인하는 데에 VSSP를 이용할 것이다.

참고문헌

Claims

미립입자와 조합되는 적어도 하나의 항원을 포함하고, 상기 미립입자가 바이러스와 동일한 크기범위에 있는 것을 특징으로 하는 면역성 조성물.
미립입자와 조합되는 적어도 하나의 항원을 포함하고, 상기 미립입자가 바이러스와 동일한 크기범위에 있는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,

미립입자가 실질적으로 균일한 크기로 된 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서,

미립입자가 고형 코어를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서,

미립입자가 약 0.03 내지 0.05㎛의 직경크기를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서,

미립입자는 라텍스, 철함유 분자, 금, 유리, 인산칼슘, 폴리스티렌, 폴리 리신 G 또는 기타의 생분해성 및 생체조화성 고분자로 제조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 6항 중 어느 한 항에 있어서,

항원은 상기 미립입자에게 흡착, 접합 혹은 공유결합되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서,

항원은 펩티드, 단백질, 재조합 펩티드 혹은 단백질, 지질, 탄수화물, 핵산또는 기타의 분자 혹은 이들의 조합물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 8항 중 어느 한 항에 있어서,

항원은 병원체, 조직, 세포기관 혹은 분자로부터 유래되고 또한:

화분, C형 간염 바이러스, (HIV)코어, E1, E2 및 NS2 단백질, P.vivax(삼일열 원충) 같은 변형체 종, 또한 열대열 말라리아 서컴스포로조이트(circumsporozoite)단백질 (CS) 및 인간 열대열 말라리아 원충, 삼일열 원충, 말라리아, TRAP, MSP-1, MSP-2, MSP-3, MSP-4, MSP-5, AMA-RESA, SALSA, STARP, LSA1 및 LSA3, HIP-gp120/160 엔벌로프 당단백질, 스트렙토코쿠스 표면 단백질 Ag, 인플루엔자 핵단백질, 헤마글루티닌-뉴라미니다제 표면 감염, TcpA 필린 소단위, VP1 단백질, LMCV 핵단백질, 레슈마니아 주 표면당단백질(gp63), 보르데텔라 페르수시스 표면 단백질, 라비에스 바이러스 G 단백질, 스트렙토코쿠스 M 단백질, 포도상구균 단백질 혹은 헬리코박터 필로리 단백질, 신시티셜 바이러스(RSV) F 혹은 G 단백질, 엡스타인 바르 바이러스(EBV) gp340 혹은 핵항원 3A, 헤마글루티닌, 보렐리아 버그도르페리(Borrelia burgdorferi) 외표면 단백질(Osp) A, 미코박테리움 투베르쿨로시스 38kD 지질단백질 혹은 30kD 단백질(Ag85), 10kD 혹은 65kD 단백질, 나이제리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) 1종 외부단백질, 바리세포라 조스터(Varicella zoster) 바이러스 IE62, 루벨라 바이러스 캡시드 단백질, B형 간염 바이러스 프리 S1 ag, 헤르페스 심플릭스 바이러스 I종 당단백질 G 혹은 gp D 또는 CP27, 머레이 밸리 엔세팔리티스 (Murray valley encephalitis) 바이러스 E 당단백질, A형 간염 바이러스 VP1, 폴리오 바이러스 캡시드 단백질 VP1, VP2, VP3 및 VP6, 클라미디아 트라코마티스 표면 단백질, B형 간염 바이러스 엔벨롭프 Ag 프리 S2, 인간 리노바이러스 (HRV) 캡시드, 암유전자 E6 및 E7에서 유래된 유두종 바이러스 단백질, 리스테리아 표면 단백질, 바리세포라 바이러스 엔벨로프 단백질, 백시니아 바이러스 엔벨로프 단백질, 브루세포라 표면 단백질, 로타바이러스 VP-3, VP-4, VP-5, VP-7 및 VP-8, 이들 항원 중 하나 이상의 조합물, 5개 이상의 아미노산이 길이로 연결된 상기 항원의 아미노산 소단위체 또는 하나 이상의 소단위체의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 8항 중 어느 한 항에 있어서,

항원은 유방암, 폐암, 췌장암, 장암 혹은 흑색종 같은 암으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제10항에 있어서,

항원은 재조합 펩티드 혹은 단백질인 것을 특징으로 하는 조성물.
미립입자와 조합되는 적어도 하나의 항원을 포함하고 상기 미립입자가 바이러스와 동일한 크기범위에 있는 것으로 된 조성물을 대상체에게 면역학적으로 유효한 양만큼 투여하는 것을 포함하는 면역반응 유도방법.
제11항에 있어서,

면역 반응은 CD8 세포성 반응 및 항체 반응으로 구성된 군에서 선택되고 상기 항체는 IgG, IgM 혹은 IgA인 것을 특징으로 하는 면역반응 유도방법.
제11항에 있어서,

상기 면역반응은 수지상 세포의 증식 및/또는 팽창인 것을 특징으로 하는 면역반응 유도방법.
항원에 대한 방어적 면역반응을 단일 투약을 통해 유도하는 방법으로서,

미립입자와 조합되는 적어도 하나의 항원을 포함하고 상기 미립입자가 바이러스와 동일한 크기범위에 있는 것으로 된 조성물을 대상체에게 면역학적으로 유효한 양만큼 단 1회만 투여하는 것을 포함하고 상기 면역반응은 수지상 세포의 자극 및/또는 증식을 포함하는 것을 특징으로 하는 방어적 면역반응의 유도방법.
면역반응을 유도하기 위해 수지상 세포에 대한 항원의체내전달방법으로서,

미립입자와 조합되는 적어도 하나의 항원을 포함하고 상기 미립입자가 바이러스와 동일한 크기범위에 있는 것으로 된 조성물을 대상체에게 면역학적으로 유효한 양만큼 투여하는 것을 포함하는 전달방법.
제15항 또는 제16항에 있어서,

면역반응은 항원의 MHC I종 프레젠테이션을 위한 메카니즘을 유도하는 것을 포함하고, 이 때의 항원은 Rab4 독립형 및 TAP 의존형 프로세스에 의한 후속의 처리과정을 위해 카베올레 및/또는 클라드린 피츠에 의해 흡수되는 것을 특징으로 하는 방법.
미립입자와 항원이 조합되는 방식으로, 바이러스와 동일한 크기범위에 있는 미립입자를 적어도 하나의 항원과 접촉시키는 것을 포함하는 면역성 미립입자/항원 조성물의 제조방법.