JPWO2005053740A1 - 免疫増強剤およびこれを用いた強化抗原 - Google Patents

Abstract

本発明は従来法を凌ぐ効率で免疫を可能とする免疫増強剤およびこれを用いた強化抗原を提供することを目的とする。本発明を適用した免疫増強剤はスチレン系多孔質材料および/またはヒドロキシアパタイトを主成分とする。スチレン系多孔質材料は架橋スチレン系の多孔質重合体ビーズであることが、ヒドロキシアパタイト素材は多孔質性ビーズであることが好ましい。また、本発明を適用した強化抗原はこの免疫増強剤を含む担体と、当該担体に吸着せしめられた抗原とからなる。

Description

本発明は、抗原の免疫原性を強化し、生体内で人為的に行われる免疫反応を活性化させる免疫増強剤およびこれを用いた強化抗原に関する。

モノクローナル抗体は、タンパク質を中心とする様々な生体物質の検出、単離、同定、精製といった目的に学術的研究、商業的目的を問わず、使用されている。このモノクローナル抗体の作製は、現在次のように行われている。

先ず、実験動物（通常はマウスまたはラット）を目的の抗原物質で免疫し動物の体内で抗体を作らせた後、動物体内から抗体産生細胞を取り出す。その後、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合してハイブリドーマ細胞を取得する。ハイブリドーマ細胞は、癌細胞同様に半永久的に増殖しつつ目的の抗体を細胞培養液中に分泌する。

このモノクローナル抗体製造に際して、抗原物質の免疫原性を高め、免疫反応を活性化して目的とするモノクローナル抗体産生細胞を良好な収率で得るために、従来抗原をアジュバントと混合し、動物体内に注射して免疫反応を高める方法が採られている。アジュバントを使用することによって、注射されて局所において全般的な免疫反応の上昇がもたらされ、免疫担当細胞の凝集が促進されるという効果が得られている。また、抗原とアジュバントとのエマルジョンを形成させることによって、抗原を長期間にわたって分解されずに注射部位に存在させることができる。

また、この他、抗原の免疫原性を増強させる方法として、ハプテンをキャリアー蛋白質と結合させたり、特定のペプチドに対する抗体を作製するためにペプチドを蛋白質に結合させたりする方法が知られている。

さらに、アジュバントを使用せずに、免疫原性を増強させる方法としては、特許文献１に開示されているように、ニトロセルロースビーズを使用する方法が知られている。特許文献１に開示された方法によれば、投与する抗原量が通常のアジュバント法の百分の一程度であっても、免疫を成立させることがでる。
特許２０８９０７６号

確かに、特許文献１に開示された方法によって免疫の効率を向上させることが可能となったが、より詳細な微量生体成分の解析やより精密なプロテオーム解析のためには、更に効率の高い強化免疫手法が必要となってきている。また特許文献１の方法では、ニトロセルロースを担体として使用しているため、ウエスターンブロットを行う際に、ニトロセルロースそのものもエピトープとして認識されることも多く、抗体作製法としては多くの改良の余地を残すものであった。
そこで、本発明は、上述したような実状に鑑み、従来法を凌ぐ効率で免疫を可能とする免疫増強剤およびこれを用いた強化抗原を提供することを目的とする。

課題が解決するための手段

上述した目的を達成するため本発明者が鋭意検討した結果、スチレン材質の多孔質材料を使用することによって免疫原性を大幅に増強できるといった知見を得ることができ、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下を包含する。
（１） スチレン系多孔質材料を主成分とする免疫増強剤。
（２） 上記スチレン系多孔質材料は、架橋スチレン系の多孔質重合体ビーズであることを特徴とする（１）記載の免疫増強剤。
（３） （１）または（２）記載の免疫増強剤を含む担体と、当該担体に吸着せしめられた抗原とからなる強化抗原。
（４） （３）記載の強化抗原を、動物に対して免疫することを特徴とする免疫方法。
（５） ヒドロキシアパタイト素材を主成分とする免疫増強剤。
（６） 上記ヒドロキシアパタイト素材は、多孔質性ビーズであることを特徴とする（５）記載の免疫増強剤。
（７） （５）または（６）記載の免疫増強剤を含む担体と、当該担体に吸着せしめられた抗原とからなる強化抗原。
（８） （７）記載の強化抗原を、動物に対して免疫することを特徴とする免疫方法。

本発明に係る免疫増強剤によれば、従来の方法を遙かに凌ぐ効率で免疫することができる。また、本発明に係る強化抗原によれば、抗原量が非常に微量であっても、優れた免疫原性を示すことができるうえに、ウエスターンブロットに汎用されるニトロセルロース膜と反応しない抗体を効率作製することが可能となる。したがって、本発明は、詳細な微量生体成分の解析やより精密なプロテオーム解析に大きな貢献を果たすことができる。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明を適用した免疫増強剤は、スチレン系多孔質材質および/またはヒドロキシアパタイト素材を主成分としている。また、本発明を適用した強化抗原は、免疫増強剤を含む担体と、当該担体に吸着せしめられた抗原とからなる。
更に本発明は、上記の強化抗原を用いて動物を免疫する方法に関する。

ｉ） 免疫増強剤
本発明者らは、ニトロセルロースビーズ以外の、タンパク質吸着能を有する種々の物質を担体として用いた場合について免疫増強剤としての能力を検討した。その結果、スチレン系多孔質材料またはヒドロキシアパタイトを免疫増強剤とした場合には、従来のニトロセルロースからなる免疫増強剤と比較して、優れた免疫強化効果を奏することを見出した。
ここで、スチレン系多孔質材質とは、スチレンおよび/またはスチレン誘導体を主成分とする材質であって、多孔質であるものを意味する。スチレン誘導体としては、架橋スチレン系の重合体等を挙げることができる。また、ここでいう、「多孔質」とは、細孔と呼ばれる微細な連続孔が、粒子内部にまで及んでいる構造のことをいう。この構造により、ビーズは、活性炭に匹敵する大きな表面積をもち、水溶液中のタンパク質を効率よく吸着することができる。
また、本発明で用いられるヒドロキシアパタイトは、組成式Ｃａ５（ＯＨ）（ＰＯ４）３で表される水酸化リン酸カルシウムであり、タンパク質、核酸などの高分子多価陰イオンを吸着することが知られる。免疫増強剤としてのヒドロキシアパタイトは、その形状、大きさ等は特に限定されないが、例えば市販の多孔質性ビーズ状のものを利用することができる。
免疫増強剤においてスチレン系多孔質材質を主成分とするとは、スチレンおよび/またはスチレン誘導体以外の夾雑物質が５〜１０重量％程度含有されていても良いという意味である。但し、免疫増強剤としては、夾雑物質を含まず、スチレンおよび/またはスチレン誘導体のみからなる物質であることが好ましい。
また、免疫増強剤においてヒドロキシアパタイトを主成分とするとは、ヒドロキシアパタイト以外の夾雑物質が５〜１０重量％程度含有されていても良いことを意味する。但し、免疫増強剤としては、夾雑物質を含まず、ヒドロキシアパタイトのみからなる物質であることが好ましい。
スチレン系多孔質材質またはヒドロキシアパタイトを主成分とする免疫増強剤は、ニトロセルロースよりも抗原吸着能力に優れる。また、免疫増強剤は、生体内には存在しないため免疫担当細胞により異物として認識され、免疫担当細胞の凝集が促進される。このため、免疫増強剤に吸着された抗原も異物として認識されやすくなる。さらに、スチレン系多孔質材質を主成分とする免疫増強剤および上記ヒドロキシアパタイト素材を主成分とする免疫増強剤は、細胞毒性が低いため生体内の免疫系を阻害することがない。

ｉｉ） 強化抗原
本発明を適用した強化抗原は、上述した免疫増強剤を含む担体と、当該担体に吸着せしめられた抗原とから構成される。抗原としては、抗原抗体反応を生じる物質であれば特に限定されないが、特に、微量生体成分または抗原性の低い成分で、通常の方法では抗体が得られない物質を使用することができる。微量生体成分または抗原性の低い成分の例としては、血中微量成分、種々のリンホカイン、各種酵素、各種制御タンパク質、各種細胞間基質、各種細胞骨格成分、各種細胞膜成分等を挙げることができる。純粋なタンパク質以外の抗原としては、多糖類、糖タンパク質、タンパク糖質、糖脂質、脂質、リポタンパク質、ポリグリセロールリン酸塩等を例示することができる。また、抗原としては、免疫性の低い病原菌やウイルス等の構成要素を使用することができる
担体に抗原を吸着せしめるとは、上述した免疫増強剤の表面および/または内部に上述した抗原を物理的に拘束すること、上述した免疫増強剤の表面に上述した抗原が化学的に結合することを意味する。担体に抗原を吸着せしめる方法としては、特に限定されないが、例えば、溶液中に免疫増強剤および抗原を添加して攪拌する方法を採用することができる。

ｉｉｉ） 強化抗原の使用法
上述した強化抗原は、微量な抗原或いは免疫原性の弱い抗原を有するものであるが、免疫担当細胞を効率よく凝集させることができるため、効率よく、目的の抗原に対する抗体産生を誘導することができる。強化抗原を用いた免疫方法としては、特に限定されることなく、従来公知の手法を適用することができる。免疫の対象となる動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ハムスター、ニワトリ等を挙げることができる
上述した強化抗原は、例えば、（１）各種のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を製造するために動物を免疫する際に使用する、（２）動物またはヒトに対するワクチンとして使用する、といった使用方法を例示することができる。
モノクローナル抗体を製造するために強化抗原を使用する場合、強化抗原としては、当該免疫増強剤は、従来のニトロセルロースからなる免疫増強剤と比較して、優れた免疫増強効果を奏することから、０．０３〜０．３ μｇ程度の抗原蛋白質があれば十分である。０．０３〜０．３μｇ程度の抗原蛋白質を、上述した免疫強化剤とともに例えば、リン酸緩衝液等の溶液に添加し、混合することでモノクローナル抗体を製造するための強化抗原を調製することができる。調製した強化抗原を用いて、定法に従って動物に免疫するが、このとき、本発明を適用した強化免疫によれば、非常に微量の抗原蛋白質で免疫が可能となる。具体的には、動物１匹あたり０．０３〜０．３μｇ程度の抗原蛋白質となる。このように、本発明を適用した強化抗原は、従来の方法では免疫することができなかったような非常に微量な抗原量（従来のアジュバント法の百分の一〜千分の一、ニトロセルロースビーズ法の十分の一以下）であっても免疫できる。
したがって、本発明を適用した強化抗原を使用することによって、従来では大量に得ることが困難であった抗原を使用して、当該抗原に対するモノクローナル抗体を低コストで取得することができる。このように取得できたモノクローナル抗体を使用することによって、微量体内成分の存在部位を体内で確認することや、微量体内成分の生理活性等を阻害すること、微量体内成分の生理活性等を阻害する物質を精製することが可能となる。したがって、本発明を適用した強化抗原は、微量体内成分の生理活性についてのより深い理解が得られる学術ツールとしての応用が考えられる。また、本発明を適用した強化抗原は、より精度が高く、応用範囲の広い医療・食品・環境分野における応用ツールの製造をにも応用することができる。

以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は、以下の実施例に限定されるものではない。

ビーズのタンパク質吸着能による評価
本例では、様々な材質におけるタンパク質吸着能を検討した。具体的には、スチレン系多孔質材料として三菱化学株式会社製の「ダイヤイオン（商標）」を、ヒドロキシアパタイトビーズとしてはBio-Rad Laboratories社製の「ＢＩＯ−ＧＥＬＲ ＨＴＰ」を用い、比較例として、特許２０８９０７６号に開示されたニトロセルロースビーズ、およびキトサンビーズである富士紡績株式会社製の「キトパール（商標）」を使用した。
等量の各種ビーズペレットと５００μｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液を混和し、室温で０〜２時間定期的に撹拌してインキュベーションを行った。各時間での、上清中のタンパク質量を定量し、その減少量により、タンパク質吸着能を比較した。その結果を図１に示す。
図１に示すように、「ヒドロキシアパタイト」および「ダイヤイオン」は、特許２０８９０７６号に開示されたニトロセルロースビーズまたはキトパールよりも優れたタンパク質吸着能を有することが分かった。したがって、以下の実施例において抗体産生能の比較を、ニトロセルロースビーズ、ヒドロキシアパタイトおよびダイヤイオンで行うこととした。

KIAA1259のＣ末端強化抗原および候補の製造
粉末状のニトロセルロースビーズ（２ｍｌ）、ヒドロキシアパタイト（２ｍｌ）およびダイヤイオン（２ｍｌ）を、それぞれリン酸緩衝液（２〜４ｍｌ）中に懸濁し、そのペレットを調製した。
次いで、大腸菌の組み換えタンパク質発現系よりKIAA1259のＣ末端（３６ｋＤａ）を精製した。KIAA1259は、酵母で見出されている１３４個のヘリカーゼのひとつとアミノ酸配列相同性において、高い類似性を示すヒト遺伝子産物（１８０ｋＤ）で、現在、機能に関しては未知なタンパク質である。ここでは、あくまでも、モデルタンパク質として用いた。KIAA1259のＣ末端をコードするＤＮＡ断片を、ｐＥＴ３２ｂプラスミド（ベクター）に挿入し発現用コンストラクトとした。その発現コンストラクトを用いて大腸菌（ＢＬ２１）を形質転換させ、タンパク質発現誘導されたＨｉｓタグ付のKIAA1259のＣ末端を、大腸菌を超音波破砕し、その細胞破砕液（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ（細胞をすり潰したもの））に、コバルト固定金属アフィニティークロマトグラフィーを施してKIAA1259のＣ末端を精製した。
精製したKIAA1259のＣ末端１または１０μｇを、リン酸緩衝液中で２５〜５０%（ｖ／ｖ）となるように懸濁した各ビーズの溶液５００μｌと混合した。これにより、各ビーズにKIAA1259を吸着させた。次に、遠心分離によってビーズを回収しリン酸緩衝液で洗浄した。洗浄後、沈殿として回収した各ビーズをリン酸緩衝液に２５〜５０％（ｖ／ｖ）となるように懸濁して注射液とした。

免疫処理
実施例２で製造した注射液０．５ｍｌを各々６〜８週齢のBalb/cByJ Jcl（雌）２〜３匹ずつの腹腔内に注射した。１匹あたり注射液０．５ｍｌを注射することによって、１μｇのKIAA1259のＣ末端に相当するビーズを免疫したこととなる。
４、５、６、７および８週間後、同様の方法により、各マウス１匹あたり１０μｇのKIAA1259のＣ末端に相当するビーズを用いて追加免疫を行った。

ニトロセルロースビーズ法と本発明の方法との抗体価上昇比較
６週間後および８週間後にマウスの眼静脈より採血(１００〜５００μｌ)し、血液を凝固させた後遠心分離にかけて血清を得た。
次に、血清を１％の牛血清アルブミン溶液で希釈度５００〜３２０００に希釈した血清希釈液を調製した。得られた血清希釈液における抗体価を測定するため、１００ｎｇのKIAA1259のＣ末端を吸着させたアッセイ用９６穴プレートを準備した。このプレートを用いて血清希釈液における抗体価を測定した。測定方法は、定法に従った間接法による酵素抗体法（細胞工学別冊実験プロトコールシリーズ 坑ペプチド抗体実験プロトコール 大海 忍 辻村邦夫 稲垣昌樹 著）を採用した。その結果を図２（６週間後）および図３（８週間後）に示す。
図２および３に示すように、ニトロセルロースビーズを免疫増強剤とした強化抗原と比較して、架橋スチレン系の多孔質重合体ビーズであるダイヤイオンを免疫増強剤とした強化抗原においては、より優れた抗体価を達成することができた。また、ヒドロキシアパタイトにおいても、ニトロセルロースビーズと同等かそれ以上の抗体価を得ることができた。このことから、架橋スチレン系の多孔質重合体ビーズ（ダイヤイオン）は、ニトロセルロースビーズからなる免疫増強剤と比較して、より優れた免疫増強効果を奏するものであることが明らかとなった。また、ヒドロキシアパタイトにおいても、ニトロセルロースビーズからなる免疫増強剤と同等かそれ以上の免疫増強効果を奏することが示された。
なお、およびタンパク質吸着能に比較的優れたキトパール（実施例１参照）においては、ニトロセルロースとほぼ同等のタンパク質吸着能を有するものの、免疫増強効果は認められなかった。

図１は、ニトロセルロースビーズ、キトパール、ヒドロキシアパタイトおよびダイヤイオン（スチレン系多孔質材質）におけるタンパク質吸着能を比較した結果を示す特性図である。 図２は、各ビーズ（ニトロセルロースビーズ、ヒドロキシアパタイトおよびダイヤイオン）を用いて免疫を行い、６週間後に採取した血清における抗体価を比較した結果を示す特性図である。 図３は、各ビーズを用いて免疫を行い、８週間後に採取した血清における抗体価を比較した結果を示す特性図である。

Claims (8)

1. スチレン系多孔質材料を主成分とする免疫増強剤。
2. 上記スチレン系多孔質材料は、架橋スチレン系の多孔質重合体ビーズであることを特徴とする請求項１記載の免疫増強剤。
3. 請求項１または２記載の免疫増強剤を含む担体と、当該担体に吸着せしめられた抗原とからなる強化抗原。
4. 請求項３記載の強化抗原を、動物に対して免疫することを特徴とする免疫方法。
5. ヒドロキシアパタイト素材を主成分とする免疫増強剤。
6. 上記ヒドロキシアパタイト素材は、多孔質性ビーズであることを特徴とする請求項５記載の免疫増強剤。
7. 請求項５または６記載の免疫増強剤を含む担体と、当該担体に吸着せしめられた抗原とからなる強化抗原。
8. 請求項７記載の強化抗原を、動物に対して免疫することを特徴とする免疫方法。