具体实施方式
实施例1:冲剂的制备
a)按照下列用量称量原料:
鹿茸 10g 女贞子 500g
淫羊霍 500g 补骨脂 333g
肉苁蓉 333g 珍珠母 200g
蛇床子 333g 牛膝 400g;
b)将鹿茸粉碎过80目筛,制成鹿茸粉,备用;珍珠母在90℃用食醋提取得到提取液,并浓缩干燥,粉碎制成粉末,备用;淫羊藿等6味加水煎煮,得到水提取液,减压浓缩,得到浸膏,真空干燥,制成干膏粉,备用;将上述三种药粉混合,加入糖粉450g和糊精150g制粒,干燥,制成冲剂1000g。
试验例1:本发明中药组合物对去卵巢大鼠骨质疏松症的防治作用
实验目的:由于“肾阳不足,肾精亏虚”所致的“骨痿”,按现代医学理论分析,属于骨质疏松症,其原因主要与体内激素,尤其是性激素如雌激素等分泌不足或紊乱,钙、磷、镁等的吸收及利用障碍有关。本研究以手术切除雌性成年大鼠双侧卵巢,引起大鼠性激素分泌不足,复制大鼠骨质疏松症模型,观察本发明中药组合物对去卵巢雌大鼠骨质疏松症的防治作用。
材料与方法:
一、药物
受试药物本发明中药组合物的浸膏由三九医药研究院制剂室提供,每克浸膏相当于生药3.9克,批号930219。使用时加蒸馏水制成一定浓度溶液灌胃。
阳性对照药己烯雌酚片为广州市桥药厂产品,批号920102;龙牡壮骨冲剂为武汉健民药厂产品,批号930396-5。使用时将上述两药研磨成细粉,加蒸馏水溶解配成一定浓度溶液灌胃。
二、动物
SD大白鼠,雌性,三月龄,体重213±21g,购自第一军医大学实验动物中心,合格证号93003。为排除动物饲养条件差异对实验结果的影响,本实验所有动物饲养条件一致,均养于25×40cm2的不锈钢金属笼内,每笼5只,室温调节在24±2℃,自由摄食与饮水,各组饲料(购自第一军医大学实验动物中心)与饮用水完全相同。
三、方法
(一)动物造型与给药
1、大鼠以35mg/kg戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉,腹位固定,按文献方法,造型动物分别切除双侧卵巢,模型对照组(假手术组)动物做同样手术操作但不切除卵巢。
2、动物按随机化原则分组,其给药情况见表1,设计去卵巢+己烯雌酚组,是由于大量文献已表明该药是去卵巢雌性大鼠骨质疏松症有效的防治药物,所以本研究中既以该药作为模型与实验方法可靠性的阳性检验药物,又以该药作为受试药物的阳性对照药。设计假手术组的目的,是为了消除手术损伤和大鼠增龄性骨质变化对实验结果可能产生的影响。
3、开始给药时间及给药天数是根据我们以前报道及参考文献报道设计的。
表3 大鼠分组与给药情况
组别 动物 药物剂量 给药 开始 结束 给药天数
英文符号 数 途径 时间 时间
假手术+蒸馏水 10 2ml/200g ig day3 day52 49
HAM+H2O
去卵巢+蒸馏水 10 2ml/200g ig day3 day52 49
OVX+H20
去卵巢+己烯雌酚 10 30ug/kg ig day3 day52 49
OVX+ET
去卵巢+龙牡壮骨冲剂 9 5g/kg ig day3 day52 49
OVX+LM
去卵巢+本发明中药组 10 1g/kg ig day3 day52 49
合物低剂量
OVX+AOL
去卵巢+本发明中药组 10 2g/kg ig day3 day52 49
合物中剂量
OVX+AOM
去卵巢+本发明中药组 10 5g/kg ig day3 day52 49
合物高剂量
OVX+AOH
(二)检测标本制备
1、术后第二日开始给药,7周(49天)后处死。
2、所有动物在术后第42天(day42)和第49天(day49)先后两次皮下注射盐酸四环素(25mg/kg),四环素因能鳌合钙并主要沉积在新形成骨基质的钙化起始点,先后两次注射可在骨表面形成双层萤光,反映两次注射四环素期间骨形成情况。
3、处死动物前摘眼球取血标本,分离血清用于测定血中Ca、P浓度,血清碱性磷酸酶(ALP)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性和血中性激素(雌二醇,睾酮)含量。
4、处死动物后摘取左侧胫骨,细心去尽肌肉,用低速锯(BuehlerLTD USA)将胫骨等分为三段,取胫骨近心端的1//3做松质骨组织形态学研究,取中段做密质骨组织形态学研究。骨标本置10%磷酸缓冲液配置的福尔马林中固定24h后经酒精脱水,用特殊的骨染料(Osteochrome Villaneuva Bone Stain,Polysciences INCUSA)浸染3天,骨标本再经酒精系列脱水及丙酮脱脂,最后用甲基丙烯酸甲酯进行不脱钙骨包埋。全埋块用低速锯锯成230um骨片,再磨成20-30um厚的薄片,脱水封片后用于骨组织形态计量学观测。
(三)标本检测
1、血标本测试
血清Ca、P、ALP、ALT的测试使用意大利产AT638型自动生化分析仪,台湾元生生物科技股份有限公司生产的试剂盒进行检测。血Ca用邻甲酚酞络合酮法,血P用米吐尔直接显色法,ALP和ALT用速率法。
血中激素检测使用瑞士SERONO公司的试剂盒用ELISA法进行检测。
2、骨组织形态计量学检测。
采用美国半自动图像数字化分析仪检测,该系统包括光镜和萤光显微镜、数字化板、电脑和形态学程序“Stereology”体视学,对胫骨近心段从距骺线1mm处至远端3mm范围内的骨组织作松质骨静态和动态测量与计算,对胫骨中段的骨组织作密质骨静态和动态测量与计算,各参数值以X±SD表示。
四、统计学处理
实验组数据以X±SD表示,组间比较采用t检验法
结果
一、大鼠体重变化
大鼠实验前后体重变化见表4,从表4可见,手术前各组动物体重无明显差别,实验结束假手术组(SHAM+H2O)与模型组(OVX+H2O)动物体重相比较差异显著,P<0.05,表明切除双侧卵巢可使大鼠体重明显增加,即具有增重效应。各给药组大鼠体重均有所增加,与假手术组比较无明显差异(P>0.05),表明雌激素、龙牡壮骨冲剂和本发明中药组合物均有一定的减缓去卵巢所致的增重现象。
表4 大鼠实验前后体重变化(g,X±SD)
组别 动物数 手术前 用药结束 差值 P值
SHAM+H2O 10 210±16 223±22 13
OVX+H2O 10 209±13 243±20 34 <0.05
OVX+EST 10 213±15 235±21 22 >0.05
OVX+LM 9 204±11 231±22 27 >0.05
OVX+AOL 10 208±17 234±29 26 >0.05
OVX+AOM 10 211±19 246±34 39 >0.05
OVX+AOH 10 207±12 236±27 29 >0.05
二、血液生化指标变化
骨代谢与血中钙、磷含量有关,血Ca升高有利于骨形成。本研究测定给药后各组动物血Ca、血P含量(表5),结果模型组(OVX+H2O)动物摘取双侧卵巢后血Ca无明显变化,但血P降低,与假手术对照组(SHAM+H2O)相比,P<0.01,造型同时给予本发明中药组合物灌服,三个剂量组均显著提高血Ca含量,血P接近假手术对照组水平,表明本发明中药组合物不仅能对抗去卵巢造成的血P降低,更具有明显的补钙作用。
骨代谢还涉及血碱性磷酸酶活性的变化,骨形成增加时ALP活性升高。由于血中ALP主要来源于骨和肝脏,为排除可能因肝脏病变所致的ALP升高,本实验在检测ALP同时,检测大鼠ALT的变化。结果(表5)各组动物ALT均较接近,组间无明显差异(P>0.05),说明动物肝功能正常,血中ALP的变化由骨代谢引起。假手术组与模型组相比,ALP无明显差异,本发明中药组合物中、高剂量组则明显升高,表明本发明中药组合物组动物骨形成增强,提示本发明中药组合物具有促进骨形成作用。
表5 去卵巢雌大鼠血生化指标的变化
组别 动物 Ca P ALP ALT
数 mg/dl mg/dl u/L u/L
HAM+H2O 10 8.25±1.04 5.50±1.27 187.13±73.91 51.33±20.60
OVX+H2O 10 8.25±0.76 4.51±1.07** 187.75±52.17 59.50±12.49
OVX+ET 10 8.43±0.79 5.43 ±0.53ΔΔ 163.57±60.32 53.04±9.64
OVX+LM 9 8.02±0.63 5.17±0.41ΔΔ 128.50±22.24ΔΔΔ 56.33±22.18
OVX+AOL 10 9.00±0.68**ΔΔ 5.83±0.41ΔΔ 179.17±39.46 56.83±8.66
OVX+AOM 10 9.07±1.00**ΔΔ 5.60±1.04ΔΔ 239.75±91.67Δ 52.75±17.55
OVX+AOH 10 9.58±0.94***ΔΔΔ 5.75±0.50ΔΔ 261.33±84.35ΔΔ 56.50±6.61
与假手术组比较,**P<0.01,***P<0.001。与模型组比较,ΔP<0.05,
ΔΔP<0.01,ΔΔΔP<0.001
三、血清性激素含量变化
雌性SD大鼠血中雄激素睾酮含量极低,仅在假手术对照组(SHAM+H2O)部分动物中检出0.003-0.009ng/ml,落在本检测法线性检测范围最低值之外,其它各组动物血中均检测不出睾酮。血雌二醇含量(表6),假手术对照组为18.10±5.08pg/ml,而模型组<5pg/ml,(本法最低检出值),表明去卵巢手术成功。给药各组动物血雌二醇含量不仅显著高于模型组,而且明显高于SD大鼠本身水平,提示龙牡壮骨冲剂、本发明中药组合物组方中药物含有雌激素或雌激素样物质。
表6 去卵巢大鼠血清雌二醇含量
组别 动物数 E2(pg/ml)
SHAM+H2O 10 18.10±5.08
OVX+H2O 10 <5.00
OVX+EST 10 43.31±30.12
OVX+LM 9 47.17±4.49
OVX+AOL 10 54.71±19.29
OVX+AOM 10 55.08±7.71
OVX+AOH 10 54.30±10.29
四、对松质骨代谢的影响
(一)骨组织形态计量学参数的意义
在计量形态学参数中,反映骨量的指标是骨小梁面积百分数,反映骨形态的指标是骨小梁的厚度、密度及间隙,反映成骨细胞合成与分泌骨基质功能的是类骨质周长百分数,反映成骨细胞调节钙、磷进出骨的流量和新骨钙化情况的指标是标记周长百分数、骨矿化沉积率、矿化延迟时间及骨形成率,骨吸收(陷窝)周长百分数反映了破骨细胞数量与活性。
(二)模型组松质骨代谢变化
假手术对照组与模型组松质骨参数值见表7,从表中可以看出,大鼠去卵巢术后7周,胫骨近段质骨(骨小梁)骨量及形态发生显著改变,骨小梁面积、骨小梁厚度和骨小梁密度均明显减少,骨小梁之间的间隙却明显增大,表明切除双侧卵巢后7周成功复制了大鼠骨质疏松症模型。去卵巢鼠反映破骨细胞功能的骨吸收周长百分数明显增加,与假手术对照相比,P<0.01,而反映成骨细胞功能的标记周长百分数、骨形成率均较假手术对照组明显降低(P<0.05),表明去卵巢大鼠骨吸收增加,骨形成减少,骨的重建处于一种负平衡状态,所以引起骨量减少。此外,类骨质周长百分数、骨矿化沉积率和骨矿化延迟时间虽有变化,但经统计学处理其差异均无显著性(P>0.05)这可能与去卵巢所致雌激素缺乏对类骨质形成影响较小有关。
表7 假手术对照组与模型组松质骨参数(X±SD,n=10)
参数 符号 单位 HAM+H2O OVX+H2O P值
骨小梁面积百分数 Tb.Ar% % 18.87±4.83 13.37±2.14 <0.01
骨小梁厚度 Tb.Th um 61.10±4.44 52.54±5.15 <0.001
骨小梁密度 Tb.N #/mm 3.75±1.14 2.55±0.38 <0.01
骨小梁间隙 Tb.P μm 231.31±105.68 347.01±66.69 <0.01
类骨质周长百分数 O.pm% % 3.53±2.23 2.83±2.10 >0.05
标记周长百分数 L.pm% % 11.43±3.65 7.11±1.81 <0.01
骨矿化沉积率 MAR μm/d 1.31±0.11 1.35±0.26 >0.05
骨矿化延迟时间 MLT d 7.73±1.28 6.64±2.36 >0.05
骨形成率 BFR μm2/d/um 13.39±3.41 10.19±1.62 <0.01
骨吸收周长百分数 E.pm% % 2.35±0.75 2.87±0.14 <0.05
(三)用药组松质骨代谢变化
l、雌二醇组(OVX+EST)与模型组(OVX+H2O)比较
切除双侧卵巢所致大鼠骨质疏松症的发生机理与大鼠体内缺乏雌激素有关,给予外源性雌激素则能明显对抗去卵巢所引起的大鼠骨量丢失和减轻骨质疏松症的病理变化,本研究选用雌二醇作为对照药,目的不仅在于作为本发明中药组合物的一个阳性对照药物,而且也作为进一步检验去卵巢复制大鼠骨质疏松症模型是否成功的模型对照药物。实验结果(表8)发现雌二醇组大鼠骨量和骨组织形态指标虽无明显改变,反映成骨细胞功能的类骨质周长百分数、标记周长百分数、骨矿化沉积率、骨矿化延迟时间、骨形成率五项指标与模型组相比亦无显著差异,但骨吸收被显著抑制(P<0.01),抑制率达39.37%,说明雌二醇对骨质疏松症具有一定的预防作用。其预防机理在于抑制骨吸收,这与文献报道的该药对骨骼系统的影响一致。雌二醇对骨质疏松症具有预防作用的这一实验结果,表明其可以作为本发明中药组合物防治骨质疏松症的一个阳性对照药,同时也进一步证明本研究用切除大鼠双侧卵巢的方法成功地复制了骨质疏松症动物模型。
表8 模型组与阳性药物对照组松质骨参数(X±SD)
参数 符号 单位 OVX+H2O OVX+ET OVX+LM
骨小梁面积百分数 Tb.Ar% % 13.37±2.14 14.41±5.23 15.06±5.55
骨小梁厚度 Tb.Th um 52.54±5.15 51.62±9.07 60.88±5.89
骨小梁密度 Tb.N #/mm 2.55±0.38 2.42±0.30 2.59±0.64
骨小梁间隙 Tb.P μm 347.01±66.69 331.21±92.66 307.71±119.81
类骨质周长百分数 O.pm% % 2.83±2.10 3.06±1.17 3.63±2.12
标记周长百分数 L.pm% % 7.11±1.81 9.17±2.73 9.77±1.28**
骨矿化沉积率 MAR μm/d 1.33±0.23 1.44±0.18 1.51±0.23
骨矿化延迟时间 MLT d 7.73±1.28 6.64±2.36 6.83±1.68
骨形成率 BFR μm2/d/um 10.19±1.62 13.37±4.94 13.80±5.33
骨吸收周长百分数 E.pm% % 2.87±0.14 1.74±1.07** 1.96±0.65***
注:①与OVX+H2O组相比,**P<0.01,***P<0.001。②OVX+LM组n=9,其它两组n=10。
2、龙牡壮骨冲剂组(OVX+LM)与模型组(OVX+H2O)比较
龙牡壮骨冲剂具有改善维甲酸所致和切除睾丸所致大鼠骨质疏松症作用,本研究据此选作本发明中药组合物的阳性对照药物。实验结果(表8)显示,与模型组比较龙牡壮骨冲剂明显抑制骨吸收(P<0.001),并使萤光标记周长百分数明显增加(P<0.01),其增加百分率达37.41%,表明龙牡丹壮骨冲剂具有抑制骨吸收,促进新骨钙化作用,有一定的对抗骨量丢失效果。
3、本发明中药组合物组与模型组比较
低剂量的本发明中药组合物(OVX+AOL组)对反映骨量的参数骨小梁面积百分数和反映骨组织形态的参数骨小梁厚度、密度、间隙无改善作用(表9),对类骨质的形成、骨矿化沉积率和矿化延迟时间亦无明显影响,但使萤光标记周长百分数增加50.49%(表10),与模型组相比具有显著性差异(P<0.01),使骨形成率提高54.56%(与模型组相比,P<0.05),说明低剂量的本发明中药组合物具有明显地激活成骨细胞,促进骨形成作用。同时低剂量本发明中药组合物还使骨吸收周长百分数减少32.75%,与模型组相比,P<0.001,表明其明显抑制了骨的吸收。从上述结果可看出低剂量组本发明中药组合物虽未能有效对抗骨量的丢失,但已具有促进骨形成抑制骨吸收的药理效应。
中、高剂量的本发明中药组合物(OVX+AOM组和OVX+AOH组)均明显抑制骨量的丢失,与模型组比较,骨量分别恢复23.56%和25.80%,同时骨小梁的厚度明显增加,骨小梁间隙也有所减小,具有明显防治骨质疏松症作用。反映骨重建的动态参数方面,骨吸收被显著抑制,骨形成率分别是升高62.22%和78.41%,萤光标记周长百分数分别提高50.63%和88.89%,矿化延迟时间明显缩短,矿化沉积率也增加12.08%-20.30%,高剂量组类骨质周长百分数亦提高26.15%,表明中、高剂量本发明中药组合物对骨质疏松症的防治机理是抑制骨吸收,促进骨形成。
表9 本发明中药组合物组与模型组松质骨参数
参数 符号 单位 OVX+H2O OVX+AOL OVX+AOM OVX+AOH
骨小梁面积百分数 Tb.Ar% % 13.37±2.14 12.88±1.77 16.52±3.52* 16.82±3.50*
骨小梁厚度 Tb.Th μm 52.54±5.15 47.77±8.77 60.39±5.58** 61.77±4.46***
骨小梁密度 Tb.N #/mm 2.55±0.38 2.26±0.28 2.21±0.96 2.31±0.31
骨小梁间隙 Tb.P μm 347.01±66.69 386.37±52.35 309.63±61.65 310.75±41.10
类骨质周长百分数 O.pm% % 2.83±2.10 3.11±1.95 3.36±1.06 3.57±1.52
标记周长百分数 L.pm% % 7.11±1.81 10.70±2.67** 10.71±2.15** 13.43±0.87***
骨矿化沉积率 MAR μm/d 1.33±0.23 1.39±0.21 1.49±0.20 1.60±0.18**
骨矿化延迟时间 MLT d 7.73±1.28 8.29±0.85 6.21±4.25*** 5.81±0.77***
骨形成率 BFR μm2/d/um 10.19±1.62 15.75±6.34* 16.53±4.25*** 18.18±4.01***
骨吸收周长百分数 E.pm% % 2.87±0.14 1.93±0.62*** 1.84±0.49*** 1.79±0.28***
与OVX+H2O组相比,*P<0.005,**P<0.01,***P<0.001,n=10.
表10 本发明中药组合物组参数变化百分率
参数 符号 单位 OVX+AOL OVX+AOM OVX+AOH
骨小梁面积百分数 Tb.Ar% % -3.66 23.56 25.80
骨小梁厚度 Tb.Th um -9.08 14.94 17.57
骨小梁密度 Tb.N #/mm -11.37 -13.33 -9.41
骨小梁间隙 Tb.P um 11.34 -10.77 -10.45
类骨质周长百分数 O.pm% % 9.89 18.73 26.15
标记周长百分数 L.pm% % 50.49 50.63 88.89
骨矿化沉积率 MAR um/d 4.51 12.08 20.30
骨矿化延迟时间 MLT d 17.79 -19.66 -24.84
骨形成率 BFR um2/d/um 54.56 62.22 78.41
骨吸收周长百分数 E.pm% % -32.75 -35.89 -37.63
*参数变化百分率=(药物组均数÷模型组均数)×100-100
从表9-10还可看出,本发明中药组合物对骨质疏松症的防治作用,,中剂量组就很明显,高剂量组效果更佳,并且这一作用随剂量增加而加强,具有明显的剂量效应。
纵观用药组、模型组、假手术对照组骨计量学参数可以看出:①无论是阳性对照药物雌二醇或龙牡壮骨冲剂,还是本发明中药组合物,均能减少骨质疏松症大鼠的骨量丢失,使骨量恢复到正常,②用药组中,中、高剂量组本发明中药组合物对骨质疏松症的防治效果高于阳性对照性药雌二醇和龙牡壮骨冲剂。③作用机理方面,雌二醇仅对模型动物的骨吸收具有抑制作用,龙牡壮骨冲剂除抑制骨吸收外,尚有一定的促进新骨钙化作用,而本发明中药组合物不仅明显抑制模型动物的骨吸收,而且明显促进骨形成、促进新骨钙化、提高骨钙化的速度和缩短钙化所需时间,此外还具有一定的促进骨基质(类骨质)形成作用。
五、对密质骨代谢的影响
(一)骨组织形态计量学参数的意义
去卵巢大鼠密质骨组织形态学测量和计算参数中,反映骨量多少的参数是密质骨面积百分数(Ct.Ar%)和骨髓腔面积百分数(Ma.Ar%)。由于密质骨重建过程既有外骨膜下成骨又有内骨膜面成骨与吸收,所以密质骨外骨膜面和内骨膜面不同的标记周长百分数、骨矿化沉积率和骨形成率三项参数反映外骨膜面和内骨膜面的新骨钙化与形成情况。反映成骨细胞合成与分泌骨基质功能的参数是类骨质周长百分数(E-O.Pm%),反映破骨细胞功能的参数是内骨膜面骨吸收周长百分数(E-E.Pm%)。
(二)模型组密质骨代谢变化
假手术对照组和模型组密质骨参数见表9,大鼠去卵巢后7周,胫骨中段密质骨面积百分数明显减少,骨髓腔面积百分数明显增大,两者与假手术对照组相比,均有显著性差异(P<0.05),表明切除双侧卵巢使密质骨骨量明显丢失,骨皮质变薄,骨髓腔扩大,大鼠发生了明显的骨质疏松症。内外骨膜面反映成骨细胞功能和骨基质钙化情况的各项参数两组比较无显著性差异,但反映破骨细胞活性与功能的内骨膜面骨吸收周长百分数明显增高(增加60.71%),说明模型组动物骨量减少是由于内骨膜面骨吸收增强所致。
表11 假手术组和模型组密质骨参数
参数 符号 单位 HAM+H2O OVX+H2O P值
密质骨面积百分数 Ct.Ar% % 77.11±4.41 72.70±2.39 <0.05
骨髓腔面积百分数 Ma.Ar% % 22.89±2.41 25.54±1.69 <0.05
外骨膜面标记周长百分数 P-L.Pm% % 41.97±13.20 49.57±9.51 >0.05
外骨膜面骨矿化沉积率 P-MAR um/d 1.08±0.53 1.30±0.74 >0.05
外骨膜面骨形成率 p-BFR um2/d/um 52.91±27.93 61.04±27.59 >0.05
内骨膜面标记周长百分数 E-L.Pm% % 18.33±15.20 20.09±18.11 >0.05
内骨膜面骨矿化沉积率 E-MAR um/d 0.82±0.21 0.89±0.45 >0.05
内骨膜面骨形成率 E-BFR um2/d/um 38.20±22.97 37.84±11.29 >0.05
内骨膜面类骨质周长百分数 E-O.Pm% % 1.95±2.88 3.51±2.05 >0.05
内骨膜面骨吸收周长百分数 E-E.Pm% % 1.96±0.78 3.15±1.39 <0.05
注:两组均n=10。
(三)用药组密质骨代谢变化
1、阳性药物对照组
雌二醇组(OVX+EST)与模型组相比(表12)骨量明显增加,骨量和骨髓腔大小恢复到假手术对照组水平。反映骨重建的各项参数中,外骨膜面骨形成率和萤光标周长百分数虽有增加但不明显,仅骨吸收明显下降,表明骨量的增加主要是雌二醇抑制了骨吸收所致,该结果与雌二醇对松质骨的影响一致。龙牡壮骨冲剂(OVX+LM)较模型组骨量明显增加,恢复到假手术对照组水平,骨髓腔有缩小的趋势。龙牡壮骨冲剂的这种抗骨质疏松作用,在于它不仅能抑制内骨膜面的骨吸收,同时还能促进外骨膜面的骨形成和增加钙在骨基质的沉积。
表12 阳性药物对照组与模型组密质骨参数(X±SD)
参数 符号 单位 OVX+H2O OVX+ET OVX+LM
密质骨面积百分数 Ct.Ar% % 72.70±2.31 77.23±5.67* 78.26±3.47***
骨髓腔面积百分数 Ma.Ar% % 25.54±1.69 22.78±5.67 19.14±5.47
外骨膜面标记周长百分数 p-L.Pm% % 49.57±9.51 56.94±18.33 67.26±4.44***
外骨膜面骨矿化沉积率 P-MAR Mm/d 1.30±0.74 1.45±0.45 1.33±0.31
外骨膜面骨形成率 P-BFR μm2/d/μm 61.04±27.59 74.93±29.71 83.46±13.72*
内骨膜面标记周长百分数 E-L.Pm% % 20.09±18.11 28.60±19.23 18.28±11.53
内骨膜骨矿化沉积率 E-MAR Mm/d 0.89±0.45 0.85±0.39 0.86±0.34
内骨膜面骨形成率 E-BFR μm2/d/μm 37.84±11.29 38.05±21.66 32.27±11.35
内骨膜面类骨质周长百分数 E-O.Pm% % 3.51±2.05 4.16±1.14 2.63±2.01
内骨膜面骨吸收周长百分数 E-E.Pm% % 3.15±1.39 1.69±0.91** 1.96±1.01*
2、本发明中药组合物组
本发明中药组合物组去卵巢大鼠密质骨代谢参数的实验结果见表13,从表中可见,高、中、低三个剂量组的本发明中药组合物均使去卵巢大鼠密质骨面积百分数显著增加,骨髓腔面积百分数明显缩小,说明三个剂量组的本发明中药组合物均能有效抑制去卵巢所造成的骨量丢失,预防骨质疏松症的发生。从反映骨重建活动的动态参数看,小剂量组仅使外骨膜面萤光标记周长百分数增高(P<0.05)对骨吸收及骨矿化等参数无明显影响,因此其骨髓腔面积虽较模型组缩小,但与假手术对照组相当;而中、高剂量组本发明中药组合物不但使外骨膜面萤光标记周长百分数明显增加,而且使外骨膜面骨形成率加快,同时抑制了内骨膜面的骨吸收,因而该两组除密质骨面积百分数明显高于模型组外,骨髓腔面积不仅显著低于模型组,而且低于假手术对照组(P<0.05),表明中、高剂量组本发明中药组合物除明显对抗骨量丢失外,还能代偿性地使骨量增加。
表13 本发明中药组合物组与模型组密质骨参数
参数 符号 单位 OVX+H2O OVX+A0L OVX+AOM OVX+AOH
密质骨面积百分数 Ct.Ar% % 72.70±2.31 79.67±2.64*** 80.50±2.69*** 81.86±3.13***
骨髓腔面积百分数 Ma.Ar% % 25.54±1.69 22.15±4.13* 19.94±2.40*** 19.60±2.69***
外骨膜面标记周长百分数 P-L.Pm% % 49.57±9.51 61.66±11.91* 61.66±13.87* 59.71±9.22*
外骨膜面骨矿化沉积率 P-MAR μm/d 1.30±0.74 1.56±0.87 1.62±0.42 1.54±0.69
外骨膜面骨形成率 P-BFR μm2/d/μm 61.04±27.59 82.24±49.61 84.44±16.35* 84.53±18.96*
内骨膜面标记周长百分数 P-L.Pm% % 20.09±18.11 17.91±11.68 17.96±11.19 20.07±13.13
内骨膜面骨矿化沉积率 E-MAR μm/d 0.89±0.45 0.89±0.22 0.86±0.10 0.94±0.17
内骨膜面骨形成率 E-BFR μm2/d/μm 37.84±11.29 28.90±13.73 37.47±17.19 46.45±15.80
内骨膜面类骨质周长百分数 E-O.Pm% % 3.51±2.05 3.52±2.61 3.94±2.59 4.57±1.86
内骨膜面骨吸收周长百分数 E-E.Pm% % 3.15±1.39 2.61±1.17 1.85±0.62* 1.60±0.74**
与模型组(OVX+H2O)比较,*P<0.05。**P<0.01。***P<0.001。各组n=10。
纵观各实验组大鼠骨量和骨髓腔面积参数变化可以看出:1、阳性对照药雌二醇和龙牡壮骨冲剂可以抑制去卵巢大鼠骨量丢失,使之恢复到正常水平,但不能使骨量高于正常。三个剂量组本发明中药组合物不仅能阻止去卵巢大鼠的骨量丢失,预防骨质疏松症发生,中、高剂量组还能使骨髓腔缩小,骨皮质变厚,尤其是高剂量组尚使骨量超过正常水平(表13)。2、用药组中本发明中药组合物中、高剂量组防治骨质疏松症的疗效优于雌二醇和龙牡壮骨冲剂。3、作用机理方面,雌二醇通过抑制骨吸收起作用,龙牡壮骨冲剂和本发明中药组合物既明显抑制骨吸收,又显著促进外骨膜新骨形成与钙化。
本研究中,本发明中药组合物去卵巢大鼠雌激素含量较假手术对照组明显为高,表明本发明中药组合物组方中某些中药含有性激素或结构类似成份,骨组织形态计量学实验结果证实本发明中药组合物明显抑制模型动物的骨吸收,也从疗效上证明本发明中药组合物方中药物含有雌激素或类似物质激素。文献报道雌激素不仅是骨吸收的拮抗剂,在大鼠的成骨细胞膜上还测到雌激素受体,而这些受体在调节骨代谢方面具有重要作用。此外,本发明中药组合物防治骨质疏松症还与促进新骨形成,提高新骨钙化速率和提高血Ca浓度有关。补骨脂、鹿茸、蛇床子含有性激素,具有雌激素样作用鹿茸、女贞子、蛇床子、肉苁蓉、补骨脂含有雌激素或具有雌激样作用。
结论
1、切除SD雌性大鼠双侧卵巢成功复制了骨质疏松症模型。
2、低剂量(1g/kg)本发明中药组合物对松质骨虽不能有效对抗骨量丢失。但已具有促进骨形成,抑制骨吸收的药理作用。中(2g/kg)、高(5g/kg)剂量具有升高骨量至正常水平,使骨小梁厚度、密度明显增加,骨小梁间隙缩小,具有明显防治骨质疏松症作用,其防治机理是抑制骨吸收,促进骨形成。
3、三个剂量的本发明中药组合物均使去卵巢大鼠密质骨面积百分数明显增加,骨髓腔明显缩小,说明三个剂量组的本发明中药组合物均能有效抑制去卵巢所造成的骨量丢失,预防骨质疏松的发症,其作用机理是抑制内骨膜的骨吸收,同时促进外骨面的骨形成。
4、本发明中药组合物防治骨质疏松症与以下三方面因素有关:①升高血中雌激素水平;②显著升高血钙,维持血磷正常,促进骨形成;③减缓去卵巢所致的增重作用。
5、本发明中药组合物对骨质疏松症的防治效果明显优于阳性对照药物雌二醇和龙牡壮骨冲剂。
试验例2:本发明中药组合物对维甲酸所致大鼠骨质疏松症的防治作
用
实验目的 抗癌药物维甲酸(维生素A酸)最常见的副作用之一是造成机体发生骨质疏松症。本研究根据这一特性选用维甲酸复制大鼠骨质疏松平模型,观察本发明中药组合物对大鼠骨质疏松症的防治作用。
材料与方法
一、药物
受试药物本发明中药组合物的浸膏由三九医药研究院制剂室提供,每克浸膏相当于生药3.9克,批号930219。使用时加蒸馏水制成一定浓度溶液灌胃。
造型药物维甲酸粉末原料药购自东北制药总厂,使用时磨成细粉,加蒸馏水配成一定浓度悬液灌胃。阳性对照药龙牡壮骨冲剂为武汉健民药厂产品,批号930396-5,使用时加蒸馏水配成一定浓度溶液灌胃。
二、动物
Wistar大鼠,雄性,3月龄,体重229.40±40.36,购自第一军医大学实验动物中心,合格证号93018。
为排除动物饲养条件差异对实验结果的影响,本研究所有动物饲养条件一致,均养于25×40cm2的不锈钢金属笼内,每笼5只,室温24±2℃,自由摄食与饮水,各组饲料与饮用水完全相同。
三、方法
(一)动物造型与给药。
1、造型大鼠连续两周按70mg/kg/d灌胃给予维甲酸,再停药两周,即可造成骨质疏松症模型。
2、分组与给药动物随机分组与给药情况见表14。前14天给动物灌服维甲酸和试验药物(包括阳性对照药),后14天停用维甲酸,仅用试验药物,第29天时处死动物。
表14 Wistar大鼠分组与给药情况
组别 英文符号 动物 药物剂量 给药 给药时间(天)
数 途径
生理盐水+蒸馏水 N+H2O 10 2ml/200g+2ml/200g ig 14+28
维甲酸+蒸馏水 RA+H2O 10 70mg/kg+2ml/200g ig 14+28
维甲酸+龙牡壮骨冲剂 RA+LM 10 70mg/kg+5g/kg ig 14+28
维甲酸+本发明中药组 RA+AOL 10 70mg/kg+1g/kg ig 14+28
合物低剂量
维甲酸+本发明中药组 RA+AOM 10 70mg/kg+2g/kg ig 14+28
合物中剂量
维甲酸+本发明中药组 RA+AOH 10 70mg/kg+5g/kg ig 14+28
合物高剂量
(二)检测标本制备
动物处死前分两次注射盐酸四环素进行骨标记,血标本、骨骼标本的制备等方法与前述实验方法(本发明中药组合物对去卵巢大鼠骨质疏松症的防治作用)相同。
(三)标本检测
与前述实验方法(本发明中药组合物对去卵巢雌大鼠骨质疏松症的防治作用)相同。
四、统计学处理
各组灵敏据均以X±SD表示,组间比较采用t检验。
结果
一、大鼠体重和脏器指数变化
大鼠体重及生殖系统脏器指数[器官湿重(mg)÷体重(g)]的变化见表15,从表15可见,各组大鼠实验开始时体重相近,实验结束时体重均有不同程度增加,模型组(RA+H2O)与各用药组间体重无明显差异(P>0.05),但对照组(NS+H2O)与其它各组相比,差异显著(P<0.01),表明大鼠灌服维甲酸导致体重明显下降,此乃维甲酸的毒副作用所致。实验中发现,大鼠灌服维甲酸3天后,饮食量即明显减少,至14天时除体重明显减轻外,尚有活动减少,拱背、竖毛等阳虚证相似表现。
睾丸指数(连附睾)各组间无显著差异,精液囊+前列腺指数和肾上腺指数则发生明显变化,模型组与对照组相比,精液囊+前列腺指数明显减小,肾上腺指数显著增加,表明维甲酸对性腺有明显的损伤,同时伴有肾上腺的代偿性肥大。用药组与模型组相比,龙牡壮骨冲剂组和本发明中药组合物低剂量组的精液囊+前列腺指数增大并恢复到模型对照组水平,本发明中药组合物中、高剂量组甚至超过对照组水平,各组肾上腺代偿性肥大亦消失,肾上腺指数恢复到模型对照组水平。上述结果提示阳性对照药物龙牡壮骨冲剂和受试药物本发明中药组合物能有效防治维甲酸对大鼠性器官的损害。
表15 大鼠体重、脏器指数变化
体重(g) 睾丸指数 精液囊+前列腺指数 肾上腺指数
组别 动物数
开始 结束 (mg/g体重) (mg/g体重) (mg/g体重)
N+H2O 10 231.43±40.59 319.71±47.30 8.85±0.84 4.60±1.77 0.213±0.007
RA+H2O 10 227.14±26.12 285.50±36.70** 8.87±2.66 2.27±0.66*** 0.501±0.056***
RA+LM 10 231.43±39.66 274.00±23.02** 9.19±1 66 5 01±0.90ΔΔΔ 0.218±0 006ΔΔΔ
RA+AOL 10 230.71±46.32 255.08±30.33** 8.86±1.29 4.50±1.69ΔΔ 0.306±0.005ΔΔΔ
RA+AOM 10 227.14±45.90 265.73±30.82** 8.77±2.59 6.42±1.51ΔΔΔ 0.246±0.088ΔΔΔ
RA+AOH 10 228.57±43.56 260.69±17.32** 9.16±2.76 5.94±0.88ΔΔΔ 0.200±0.036ΔΔΔ
与模型对照组(N+H2O)比较,**P<0.01,***P<0.001;与模型组(RA+H2O)比较,ΔΔP<0.01,ΔΔΔP<0.001
二、血液生化指标变化
模型组(RA+H2O)与对照组(NS+H2O)大鼠血Ca、P、ALP、ALT相比较,无统计学意义(表16),表明维甲酸造型对血生化指标无明显影响。阳生对照药龙牡壮骨冲剂组(RA+LM)与模型组比较,血Ca、P和ALT正常,但ALP明显降低,提示该组动物骨吸收过程增强。本发明中药组合物中、高剂量组(RA+AOM,RA+AOH)血P、ALT无明显变化,血Ca和ALP均明显升高,表明本发明中药组合物具有明显的补钙作用并能促进骨形成。
表16 本发明中药组合物对实验大鼠血生化指标影响
组别 动物数 血Ca(mg/dl) 血P(mg/dl) ALP(u/L) ALT(u/L)
NS+H2O 10 9.57±1.51 5.57±1.13 203.71±48.10 64.88±22.13
RA+H2O 10 9.00±1.15 6.30±0.48 179.10±24.13 61.10±11.12
RA+LM 10 8.80±2.17 6.50±1.73 136.40±35.63ΔΔ 58.20±18.73
RA+AOL 10 8.40±0.55 5.20±1.30 214.60±71.30 62.00±13.36
RA+AOM 10 10.17±1.19Δ 5.17±1.72 212.17±28.86Δ 60.17±21.52
RA+AOH 10 10.13±1.15Δ 5.67±1.58 272.33±43.38ΔΔΔ 59.33±16.81
与模型组(RA+H2O)比较,ΔP<0.05,ΔΔP<0.01。
三、血清性激素含量变化
雄性Wistar大鼠对照组(NS+H2O)和模型组(RA+H2O)雌二醇含量均低于5pg/ml,在本实验检测方法的最低检出限之外;各用药组中均可测到雌二醇(表17),提示龙牡壮骨冲剂和本发明中药组合物组方中含有雌激素物质。模型组(RA+H2O)血中睾酮含量有所下降,但与对照组(NS+H2O)相比,并无显著差异,推测与肾上腺代偿层肥大,其网状带产生性激素增加,抵消了大鼠因性腺受损所致的血睾酮下降有关。各用药组大鼠血睾酮含量处在正常范围,而肾上腺又未发生代偿性肥大(表17),提示本发明中药组合物和龙牡壮骨冲剂对维甲酸所致的性腺损害具有保护作用。
表17 大鼠性激素含量
组别 动物数 雌二醇(pg/ml) 睾酮(ng/ml)
NS+H2O 10 <5.00 0.68±0.33
RA+H2O 10 <5.00 0.45±0.26
RA+LM 10 11.03±8.34 0.68±0.74
RA+AOL 10 18.88±11.61 0.69±0.41
RA+AOM 10 19.43±17.26 0.73±0.60
RA+AOH 10 18.39±12.01 0.62±0.32
四、对松质骨代谢的影响
(一)模型组松质骨代谢变化
Wistar大鼠灌服大剂量(70mg/kg/day)维甲酸14天后2周,胫骨近段松质骨(骨小梁)骨量及形态发生明显改变(表18),骨小梁面积百分数减少27.19%,明显低于对照组(P<0.05),表明模型组动物骨量明显丢失。骨组织形态学方面,骨小梁厚度无明显改变,骨小梁密度显著减少,骨小梁间隙增大,说明骨小梁变得十分稀疏。骨量的减少和骨小梁变得稀疏证明给大鼠灌服大剂量维甲酸成功地复制了骨质疏松症模型,与文献报道的结果一致。
从骨组织形态学的动态参数来看,类骨质周长百分数和萤光标记周长百分数以及骨矿化沉积率、矿化延迟时间和骨形成率均无明显变化,提示维甲酸对类骨质的形成和骨的矿化影响不大,但动态参数中骨吸收周长百分数明显增大,表明维甲酸所致的大鼠骨质疏松症原因在于骨吸收增加。
表18 模型组与对照组骨形态学参数
参数 符号 单位 NS+H2O RA+H2O P值
骨小梁面积百分数 Tb.Ar% % 20.23±5.98 14.73±2.04 <0.05
骨小梁厚度 Tb.Th Um 58.05±11.35 54.08±5.88 >0.05
骨小梁密度 Tb.N #/mm 3.46±0.60 2.58±0.20 <0.001
骨小梁间隙 Tb.Sp Um 240.30±66.65 217.62±51.33 <0.01
类骨质周长百分数 Opm% % 1.29±0.42 1.10±0.70 >0.05
标记周长百分数 LPm% % 10.16±1.84 8.83±1.32 >0.05
骨矿化沉积率 MAR um/d 1.33±0.15 1.37±0.18 >0.05
骨矿化延迟时间 MLT D 6.21±1.09 5.89±1.57 >0.05
骨形成率 BFR um2/d/um 12.47±1.05 11.77±2.52 >0.05
骨吸收周长百分数 Epm% % 2.25±0.76 2.25±0.76 <0.05
(二)用药组松质骨代谢变化
本发明中药组合物和龙牡壮骨冲剂组大鼠骨组织形态学参数见表19,从表19可见,龙牡壮骨冲剂组大鼠骨小梁面积百分数较模型组有所提高,但两数据统计学处理并无显著性差异,其它静态和动态参数均与模型组接近,因此,龙牡壮骨冲剂对实验动物松质骨的代谢无明显影响。
表19 用药组大鼠松质骨形态学参数
参数 符号 单位 RA+H2O RA+LM RA+AOL RA+AOM RA+AOH
骨小梁面积百分数 Tb.Ar% % 14.73±2.04 17.85±5.97 16.46±7.04 17.79±3.52* 18.85±4.13*
骨小梁厚度 Tb.Th μm 54.08±5 88 54.92±6.18 54.90±8.21 58.20±8.21 63.14±6.96**
骨小梁密度 Tb.N #/mm 2.58±0.20 2.86±0.85 2.57±0.88 2.81±1.03 3.07±1.07
骨小梁间隙 Tb.p μm 317.62±51.33 311.59±104.22 315.87±129.77 297.89±96.97 260.17±62.71*
类骨质周长百分数 Opm% % 1.10±0.70 1.32±1.80 1.25±0.87 1.92±1.27 1.88±1.72
标记周长百分数 LPm% % 8.83±1.32 9.70±5.66 9.03±4.35 9.73±4.52 10.64±3.24
骨矿化沉积率 MAR um/d 1.37±0.25 1.35±0.25 1.24±0.49 1.58±0.23* 1.59±0.16**
骨矿化延迟时间 MLT d 5.89±1.57 5.57±3.52 6.37±4.19 5.84±2.16 5.47±1.63
骨形成率 BFR um2/d/um 11.77±2.52 13.41±8.24 14.51±6.25 16.62±5.87* 17.83±1.82***
骨吸收周长百分数 Epm% % 2.81±0.34 2.75±0.79 2.14±0.80 2.33±0.36** 1.69±0.39***
与相应模型组RA+H2O相比,**P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
本发明中药组合物组动物与模型组相比,中、高剂量组骨小梁面积百分数分别增加20.77%和27.97%,具有显著性差异(P<0.05),高剂量组骨小梁厚度亦明显增加,同时骨小梁之间的空隙减少18.09%(P<0.05),说明中、高剂量,尤其是高剂量的本发明中药组合物能显著改善骨质疏松症动物的骨组织形态学病理变化,减少骨量丢失,使骨量恢复到模型对照组水症。反映骨重建的动态参数方面,中、高剂量组矿化沉积率明显增加,骨形成率也分别提高42.05%和51.49%。说明本发明中药组合物能使成骨细胞的活性增加,骨基质的钙化加速。对于反映破骨细胞活性的内骨膜面骨吸收周长百分数,本发明中药组合物中、高剂量组分别下降17.08%和43.06%,与模型组相比,具有显著性意义,表明本发明中药组合物能明显抑制破骨细胞活性,减少骨吸收。因此,本发明中药组合物防治骨质疏松症,减少松质骨量丢失的机理在于抑制骨吸收,同时促进骨形成,维持骨代谢处于正平衡状态。
五、对密质骨代谢的影响
(一)模型组密质骨代谢改变
大鼠灌服维甲酸后,胫骨中段密质骨形态计量学参数发生明显变化(见表20),密质骨面积百分数明显减少,骨髓腔面积百分数增大,两者与对照组(NS+H2O)相比,均有显著性差异(P<0.05),表明灌服大剂量(70mg/kg/d)维甲酸两周,停药2周后,大鼠密质骨骨量有明显的丢失,骨皮质变薄,骨髓腔扩大,大鼠发生了明显的骨质疏松症。内外骨膜面反映成骨细胞功能、基质钙化情况的各项参数并无明显变化,但反映破骨细胞活性与功能的内骨膜面骨吸收周长百分数明显增高,与模型对照组相比,有显著性差异(P<0.05),说明模型组动物骨量减少,骨皮质变薄、骨髓腔扩大是由于内骨膜面骨吸收增强所致。
表20 模型组密质骨组织形态学参数
参数 符号 单位 NS+H2O RA+H2O P值
密质骨面积百分数 Ct.Ar% % 76.19±2.31 73.19±2.51 <0.05
骨髓腔面积百分数 Ma.Ar% % 23.81±2.31 26.81±2.51 <0.05
外骨膜面标记周长百分数 P-L.Pm% % 57.58±11.81 66.11±10.74 >0.05
外骨膜面骨矿化沉积率 P-MAR μm/d 1.74±0.49 1.48±0.37 >0.05
外骨膜面骨形成率 P-BFR m2/d/μm 95.70±26.95 98.29±30.10 >0.05
内骨膜面标记周长百分数 E-L.Pm% % 31.38±8.26 29.71±13.51 >0.05
内骨膜面骨矿化沉积率 E-MAR μm/d 1.04±0.31 0.98±0.53 >0.05
内骨膜面骨形成率 E-BFR μm2/d/μm 39.45±22.12 29.71±13.51 >0.05
内骨膜面类骨质周长百分数 E-O.Pm% % 1.49±1.03 1.05±1.24 >0.05
内骨膜面骨吸收周长百分数 E-E.Pm% % 2.07±0.85 3.21±1.04 <0.05
(二)、用药组密质骨代谢变化
阳性对照药龙牡壮骨冲剂组大鼠密质骨面积百分数增大(表21),骨髓腔面积百分数缩小,两者与模型组比较,均有显著性意义,说明该药能防止骨质疏松症动物密质骨骨量丢失。其作用环节在于抑制内骨膜面骨吸收。
受试药物本发明中药组合物小剂量组对密质骨代谢不产生明显影响,但中、高剂量组大鼠密质骨面积百分数明显增高,骨髓腔面积百分数明显减少,两者均恢复到模型对照组水平,表明中、高剂量组本发明中药组合物均能有效抑制维甲酸所致的骨量丢失,预防骨质疏松症的发生。反映骨形成和骨基质钙化的参数均无明显改变,但代表破骨细胞功能和活性的内骨膜面骨吸收周长百分数在中、高剂量组明显下降,分别减少30.53%和38.94%,说明本发明中药组合物有效防治骨质疏松症的机理在于抑制骨吸收。
表21 用药组密质骨组织形态学参数
参数 符号 单位 RA+H2O RA+LM RA+AOL RA+AOM RA+AOH
密质骨面积百分数 Ct.Ar% % 73.19±2.51 77.56±2.74* 76.07±3.83 77.15±4.00* 79.19±245**
骨髓腔面积百分数 Ma.Ar% % 26.81±2.51 22.44±2.74** 23.93±3.83 22.85±4.00* 20.81±2.45***
外骨膜面标记周长百分数 P-L.Pm% % 66.11±10.74 61.16±11.26 62.70±8.69 61.18±10.16 60.12±12.86
外骨膜面骨矿化沉积率 P-MAR μm/d 1.48±0.37 1.56±0.29 1.26±0.41 1.50±0.33 1.64±0.48
外骨膜面骨形成率 P-BFR μm2/d/μm 98.29±30.10 93.08±7.10 80.66±34.12 93.21±3114 92.49±10.39
内骨膜面标记周长百分数 E-L.Pm% % 29.71±13.51 35.47±5.36 23.32±4.04 33.61±15.57 36.09±6.78
内骨膜面骨矿化沉积率 E-MAR μm/d 0.98±0.53 1.10±0.76 0.89±0.62 1.13±0.81 1.09±0.74
内骨膜面骨形成率 E-BFR μm2/d/μm 31.07±16.16 44.46±37.67 37.19±24.93 43.90±29.85 47.31±38.27
内骨膜面类骨质周长百分数 E-O.Pm% % 1.05±1.23 1.44±0.97 1.26±1.04 1.65±1.18 1.52±1.03
内骨膜面骨吸收周长百分数 E-E.Pm% % 3.21±1.04 2.18±0.76* 4.02±1.24 2.23±0.63* 1.96±0.72**
与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
讨论
维甲酸是维生素A的衍生物,大剂量维甲酸对骨质有明显的影响,具有强烈致骨质疏松作用。文献报道,每日灌胃给予维甲酸70mg/kg,连续2周,可造成大白鼠骨质疏松症模型。本研究按此造型方法给Wistar大白鼠灌服维甲酸,骨组织形态计量学参数测定结果表明成功复制了大鼠骨质疏松症模型。在灌服维甲酸同时,给大鼠灌服本发明中药组合物,结果发现本发明中药组合物具有明显的防治骨质疏松症功效,其机理可能与下列因素有关。
从本发明中药组合物对大鼠脏器指数的影响(表15)来看,本发明中药组合物具有对抗维甲酸对性腺的损害和一定的促进性腺生长功能,大鼠性腺(睾丸、肾上腺)是产生雄激素的主要器官,雄激素在机体调节骨代谢中起一定作用,如已发现在人的成骨细胞膜上存在雄激素受体,所以本发明中药组合物有效防治骨质疏松症,减少骨量丢失可能与之有关。
从大鼠血清激素测定结果(表17)来看,本发明中药组合物能升高动物血中雌激素水平,雌激素缺乏已被认为是绝经后妇女发生骨质疏松症的主要原因,而本发明中药组合物组方中鹿茸、女贞子、蛇床子、肉苁蓉、补骨脂均还有雌激素或雌激素样物质,因此本发明中药组合物含有雌激素及雌激素样物质是其发挥抗骨质疏松作用的原因之一。
从大鼠血钙测定结果(表16)来看,本发明中药组合物能明显升高动物血Ca水平,钙是新骨钙化不可缺少的离子,升高血钙是本发明中药组合物减少模型动物骨量丢失的机理之一。
从本发明中药组合物对大鼠松质骨、密质骨组织形态学参数影响来看,该药具体机理在于显著抑制骨吸收,同时能使成骨细胞活性增加,骨基质钙化加速,促进骨形成,使骨的重建过程处在一种骨形成大于骨吸收的正平衡状态,从而减少骨量的丢失,改善骨小梁的形态,阻止骨皮质变薄和骨髓腔扩大,起到防治骨质疏松症的目的。
结论
1、雄性Wistar大鼠灌服维甲酸(70mg/kg/d)14天后成功复制了骨质疏松动物模型。
2、中、高剂量的本发明中药组合物能显著减少松质骨骨量丢失,改善骨小梁的病理变化;阻止密质骨皮质变薄,骨髓腔缩小,具有明显的防治骨质疏松症的作用,其作用机理是抑制骨吸收,促进骨形成。
3、本发明中药组合物使骨代谢处于正平衡状态与其下列作用有关:①对维甲酸的性腺损害(睾丸、肾上腺)的保护作用;②明显补钙及促进骨形成作用;③升高血中雌激素水平。
4、本发明中药组合物防治骨质疏松症疗效显著优于阳性对照药龙牡壮骨冲剂。
试验例3:本发明中药组合物的镇痛作用
为了解其是否有镇痛作用及作用特点,本实验采用常规的小鼠热板法和扭体法进行了观察。
材料与方法
一、药品
本发明中药组合物的浸膏由三九企业集团医药研究院制剂室提供,每克浸膏相当于生药3.9克,批号930219,使用时加蒸馏水制成一定浓度溶液灌胃。阿司匹林系吉林制药厂生产的原料药,批号920217-4。
二、实验动物
健康昆明种小鼠,体重20±2g,由第一军医大学实验动物中心提供,合格证号93013。
三、实验分组
(一)、热板法分组
选择雌性小鼠于实验前一天进行筛选,将过敏、迟钝或喜跳者剔除不用,而选择痛反应阈在30秒以内的小鼠50只,随机分为生理盐水对照组、阿司匹林组(0.2g/kg)、本发明中药组合物低剂量组(1g/kg)、中剂量组(2g/kg)和高剂量组(5g/kg)五组,每组10只。
(二)、扭体法分组
50只小鼠雌雄各半,随机分为生理盐水对照组、阿司匹林阳性对照组(0.2g/kg)、本发明中药组合物低剂量组(1g/kg)、中剂量组(2g/kg)和高剂量组(5g/kg),每组10只。
四、实验条件
空调控温,排气扇间隔排气,普通采光,室温18~20℃,相对湿度70±5%。
五、实验方法
(一)热板法
用夹层铁皮水浴箱作实验装置,使水温恒定于55±0.5℃,将实验小鼠逐个放在热板上,记录自放入热板上到出现舔后足所需的时间,作为痛阈值。将各组动物按不同药物和剂量要求分别以0.2ml/只灌胃,各组均于给药后15分、30分、60分及120分测定其痛阈值,如给药后痛阈值超过60秒,则停止测试而按60秒计。按下式计算痛阈提高百分率。
(二)、扭体法
各组动物按不同药物和计量要求分别灌胃三天,末次灌胃半小时后,每鼠腹腔注射0.7%冰乙酸0.1ml/10g,定时计数15分钟内各鼠因疼痛而引起的扭体次数。
实验结果
一、用热板法测得各组小鼠出现舔后足的时间见表22,从表22可看出,与生理盐水组相比,本发明中药组合物能显著延长小鼠出现舔后足的时间,且随剂量增大作用加强,表明本发明中药组合物具有明显镇痛作用,其镇痛作用发生较阿司匹林略慢但镇痛持续时间长,在给药60分后作用最强,可持续2h以上。
表22 本发明中药组合物对小鼠痛阈的影响(X±SD,n=10)
药前出现舔 药后出现舔足时间(s)
组别
足时间(s) 15min 30min 60min 120min
生理盐水对照组 16.8±5.1 18.6±3.9 15.6±3.6 16.7±4.0 18.2±2.9
阿司匹林0.2g/kg组 18.3±4.7 30.4±7.9*** 23.1±6.4** 19.3±9.2 18.7±5.5
本发明中药组合物 17.7±3.9 23.7±4.8* 38.9±9.3*** 37.5±6.1*** 28.3±10.2**
1g/kg组
本发明中药组合物 16.4±3.7 27.9±4.0*** 35.6±5.1*** 41.9±5.7*** 32.9±8.2***
2g/kg组
本发明中药组合物 17.3±4.2 28.7±3.6*** 39.4±5.0*** 43.6±5.0*** 33.5±6.9***
5g/kg组
与生理盐水组相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
二、扭体法发现本发明中药组合物可明显减少小鼠扭体次数,表明本发明中药组合物具有明显的镇痛作用,并且中、高剂量组的镇痛作用略强于用药量为0.2g/kg的阿司匹林组(表23)。
表23 小鼠冰乙酸致痛扭体反应次数(X±SD)
组别 动物数 扭体次数 P值
生理盐水对照组 10 36.1±5.9
阿司匹林0.2g/kg组 10 5.1±3.8 <0.001
本发明中药组合物1g/kg组 10 9.0±5.7 <0.001
本发明中药组合物2g/kg组 10 3.6±3.9 <0.001
本发明中药组合物5g/kg组 10 1.7±1.6 <0.001
结论
本发明中药组合物具有明显镇痛作用,且随剂量增加作用加强,与阿司匹林相比其镇痛作用持续时间较长。本发明中药组合物的这种作用与组方中含有镇痛作用的药物有关,如牛膝具有活血通经、祛风镇痛功效。