CN1610744A - 胃蛋白酶敏感经过修饰的苏云金芽孢杆菌杀虫毒素 - Google Patents

Abstract

本发明涉及苏云金芽孢杆菌(Bacillasthyringiensis)Cry蛋白在哺乳动物消化道中的降解。具有肽序列已被修饰的苏云金芽孢杆菌Cry蛋白使所述蛋白对哺乳动物消化道中的特定酶尤其是胃蛋白酶敏感。根据本发明，通过将胃蛋白酶切割位点插入其序列中来修饰Cry蛋白。本发明还涉及表达所述修饰的Cry蛋白的转化植物。

Description

胃蛋白酶敏感经过修饰的苏云金芽孢杆菌杀虫毒素

本发明涉及苏云金芽孢杆菌(Bacillus thruingiensis)Cry蛋白在哺乳动物消化道中的降解。它涉及苏云金芽孢杆菌Cry蛋白，这种蛋白的肽序列已被修饰以使它们对哺乳动物消化道中的特定酶尤其是胃蛋白酶敏感。根据本发明，通过将胃蛋白酶-切割位点插入其肽序列中来修饰所述Cry蛋白。本发明还涉及表达这些修饰的Cry蛋白的转化植物。

苏云金芽孢杆菌属的细菌(以后称为Bt)以其产生的杀虫毒素而著称。这些革兰氏阳性菌在其稳定期中形成伴孢晶体蛋白，这种晶体大大增强了其杀虫活性。这些细菌的晶体由杀虫毒素构成，这种杀虫毒素性质上是蛋白质，被称为Cry蛋白，并由cry基因编码。由于其杀虫特性，这种Cry蛋白被用于保护农作物抵抗有害昆虫，作为合成杀虫剂的替代物。目前，这种农学用途主要是通过两种方法实现的，即将该产品作为生物杀虫剂直接喷洒，以及用编码Cry蛋白的基因转化生长的植物。根据其所衍生的Bt菌株，所述Cry蛋白对不同的昆虫具有杀虫活性。Cry毒素对抗的昆虫的主要顺序为鳞翅目、鞘翅目和双翅目，但一些毒素有效对抗其它昆虫。所有分离自各种Bt菌株的Cry蛋白按照其序列同源性的功能分类归在一起，并用一代码表示以示区别(Crickmore等，1998，Microbiol.Molec.Biol.Review(62(3)，807-813)。因此，在农业上使用这些毒素的优点在于它们对一种或多种特定昆虫的作用特异性，而且还在于它们对哺乳动物、鸟类、两栖类和爬行类无毒性。

对哺乳动物没有毒性使得人们能够开发培养表达Cry蛋白的转基因植物，并将这些植物的种子用于人和动物的食物。然而，尽管它们对哺乳动物无毒，这些蛋白质中有一些在哺乳动物的消化物中相对是不降解的，无法降解致使这种毒性在所述哺乳动物的消化道中保留相对长的时间。此外，Cry蛋白在哺乳动物消化道中缺乏持久性也是行政当局(如美国环保署-EPA)需要考虑的标准之一，EPA允许含有这些蛋白质的种子或衍生自这些种子的制品在食物中销售。

本发明有可能克服上述缺点。本发明所基于的原则是，某些Cry蛋白在哺乳动物消化道中的稳定性被认为是因为这些蛋白质对所述消化道中特定的酶，尤其是蛋白酶不敏感。因此，解决这一问题的关键在于将对哺乳动物消化道的酶特异的特定位点人工整合入Cry蛋白中。因此，本发明的主题是对哺乳动物消化道中的特定酶类，尤其是哺乳动物胃中的特异性蛋白酶，更具体说是胃蛋白酶敏感的Cry蛋白进行修饰。胃蛋白酶是蛋白酶家族中一种特殊的酶，它是存在于哺乳动物胃中的主要蛋白酶(占胃蛋白酶类的95％)。这是一种天冬氨酸蛋白酶，它在最佳pH2时起作用。胃蛋白酶可作为降解Cry蛋白的酶来源的一种选择，因为它不存在于昆虫的消化管中，尤其是鳞翅目，其消化管的pH在10和11之间(Terra，W.B.和C.Ferreira，1994，Insect digestive enzymes：properties，compartmentalization andfunction。Comp.Biochem.Physiol.109B：1-62)。昆虫中缺乏胃蛋白酶因此可保证将胃蛋白酶-特异性位点引入Cry蛋白不会增加它们在昆虫消化管中降解的风险。因此，本发明解决了上述技术问题，即增加Cry蛋白对哺乳动物消化道酶类的敏感性，而不改变所述Cry蛋白的杀虫性质。

然而，Cry蛋白是非常有组织的蛋白质，其活化形式由三个区域组成，且区域中和区域之间的结构-功能关系非常强。Cry蛋白的这种高水平的组织不允许在蛋白中任意插入突变。特别地，插入对哺乳动物胃中的酶类特异的切割位点必须不改变毒素的杀虫特性。

Cry蛋白是由苏去金芽孢杆菌以无活性的原毒素的形式天然产生的。使这些蛋白质起作用的天然方法包括，将所述晶体蛋白溶解在昆虫肠内，蛋白水解性降解释放的原毒素，使活化的毒素附着到所述昆虫肠内的受体中，并将所述毒素插入肠细胞的顶端膜中以产生离子通道或孔。昆虫肠内原毒素的蛋白水解性降解是在碱性pH和消化液中丝氨酸蛋白酶(基本为胰蛋白酶)的共同作用下发生的(Schnepf等，1998)。

Cry毒素由三个结构域-域I、域II和域III构成。域I大致占活化的毒素的N-末端一半部分。域II和域III各自大致占活化的毒素的四分之一。域III位于活化的毒素的C-末端。Cry蛋白的各个域有其自己的结构和功能。

域I由7个α-螺旋、6个两亲螺旋和一个疏水螺旋构成，它们通过由若干氨基酸构成的内螺旋环相互连接。该域是跨膜域，负责形成离子通道或孔(Aronson等，1995；Chen等，1993；Manoj-Kumar和Aronson，1999；Masson等，1999；Rang等，1999；Coux等，1999)。由域I的α-螺旋形成的跨膜实际上包括四个Cry蛋白，它们用四个各自的α4-螺旋形成完整的孔(Masson等，1999)。因此形成了四个α4-螺旋的圆柱形孔。该孔的内侧由两亲螺旋的亲水表面构成；由于负电荷残基存在于亲水表面，它们在孔的腔内，在含水介质中，并执行其离子运输功能。所述孔的外则由疏水表面构成，它将该孔锚定在脂质膜中。因此，由域I的α-螺旋形成的孔具有非常强的结构-功能关系，且随时间发生构象变化。因此，在域I的α-螺旋中引入突变很可能扰乱该域的功能，因此影响所述毒素的活性。

所述活化的毒素的域II和域III由β-片层构成，β-片层本身也呈非常紧密的形式。这两种域与受体位点识别(特异性)和毒素稳定性有关(Abdul-Rauf和Ellar，1999；Dean等，1996；Hussain等，1996；Lee等，1999；Rajamohan等，1996，1998；Wu和Dean，1996)。域III的交换引起特异性的变化(de Maagd等，1999)。该区域不十分保守，因此比域I可变。它与各毒素的特异性有关。这种变异性和对各毒素特异的相互作用与各毒素非常特异的宿主范围的特性有关，并与不同受体位点的识别有关。受体的识别通过域II和域III中的环发生，且这些环的构象从一种毒素到其它毒素微妙变化作为域II和域III的排列以及域II和域III之间相互作用的函数。域I还会干扰其它两个域并影响通常的构象(Rang等，1999，2001)。此外，对这两个域中结构-功能的关系知之甚少，实际上没有关于识别受体位所需的构象的信息。因此，很难预测在特异性上将修饰引入域II和域III的后果，识别受体位点的能力和Cry蛋白的毒性。此外，已知域II和域III中的突变很容易引起毒素在昆虫中不稳定，从而导致毒性丧失。

Cry蛋白的域I和域II之间还存在盐桥(salt bridge)。这些桥在毒素的稳定性及其功能方面起重要作用。人工消除Cry1Aa1中的这些桥显示，原毒素和活化的毒素不如亲本蛋白稳定(Vachon等，2000)。这些盐桥存在于域II和域I的α7-螺旋之间。已知的这些桥的重要性说明，在域II和域I的α7-螺旋中突变对扰乱Cry蛋白功能的风险高。

                                   描述

本发明涉及胃蛋白酶敏感修饰的Cry蛋白，其特征在于，它至少有一个额外的胃蛋白酶切割位点。

术语“Cry蛋白”是指苏云金芽孢杆菌(以后称为Bt)的细菌菌株产生的杀虫蛋白，其各种已经存在和即将出现的正模标本是由Bt分类委员会定位的(Crikmore，2001)，并可在互联网地址 http：//www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil Crickmore/Bt/index.html上访问。特别地，这种Cry蛋白由cry基因编码，或由Bt细菌天然产生，或以重组的方式在宿主生物中完成，该宿主生物被cry基因或者被包含至少一个Cry蛋白的编码序列的基因转化。本发明的Cry蛋白还包括序列已被人工修饰以增加其杀虫活性或它们对处理条件抗性的Cry蛋白。该定义还包括具有杀虫活性的Cry蛋白片段，如截短的Cry蛋白，它仅含有完整Cry蛋白的N-末端部分，尤其是这种蛋白的域I(WO 94/05771)。还包括融合的Cry蛋白，如国际专利申请WO 94/24264所述。优选地，本发明的Cry蛋白选自Cry1，Cry3，Cry4，Cry7，Cry8，Cry9，Cry10，Cry16，Cry17，Cry19和Cry20蛋白。优选地，它是Cry9C蛋白，更优选地是Cry9Ca1蛋白(Lambert等，Appl.Environm.Microbiol.62，80-86；WO 94/05771)。特别地，本发明也适合任何Cry蛋白，其毒性已得到改善，例如，专利申请WO 97/49814或WO 99/00407中所描述的那些。

根据本发明，所述Cry蛋白是经过修饰的。术语“修饰的Cry蛋白”是指肽序列不同于衍生出这种蛋白的天然Cry蛋白肽序列的Cry蛋白。这种序列差异是通过遗传工程引入人工修饰的结果，尤其是在所述肽序列中插入或取代特定的氨基酸残基。特别地，所述修饰的Cry蛋白是通过修饰编码它的核苷酸序列产生的，尤其是用精通此领域的技术人员熟知的定点诱变技术(Hutchinson C.A.等，1978，J.Biol.Chem.253：6551)。优选地，Cry蛋白的修饰包括氨基酸残基取代。

本发明的修饰的Cry蛋白是胃蛋白酶敏感的。胃蛋白酶蛋白水解作用的焦点是特定的由亮氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸构成的切割位点。所述蛋白酶解发生在残基的C-末端位置。根据本发明，术语“胃蛋白酶敏感的”是指修饰的Cry蛋白特有的经受被胃蛋白酶蛋白酶解的性质。Cry蛋白的蛋白酶解导致所述蛋白质的杀虫活性部分或全部丧失。因此，可通过使本发明的修饰的Cry蛋白与胃蛋白酶接触，最好是在体外，然后测量与未按本发明进行修饰的天然Cry蛋白相比所述修饰的Cry蛋白杀虫活性的损失来测量胃蛋白酶-敏感。例如，可用实施例7和8中所述的试验来测量本发明的Cry蛋白的胃蛋白酶敏感性。或者，可用蛋白质印迹技术来测量所述胃蛋白酶敏感性。采用这种技术，可通过观察与胃蛋白酶接触后修饰的Cry蛋白的结构降解来测量敏感性。该观察包括，与未按本发明修饰的天然Cry蛋白相比，凝胶电泳转移膜上与Cry蛋白相应的条带强度的消失或减小。这些技术的应用是精通此领域的技术人员的普通知识的一部分。

本发明的修饰的Cry蛋白的特征在于，它至少有一个额外的胃蛋白酶切割位点。所述“胃蛋白酶切割位点”是指由至少一个氨基酸残基构成的位点，识别胃蛋白酶的蛋白酶解的位点。被胃蛋白酶识别的氨基酸残基是亮氨酸、苯丙氨酸或谷氨酸。术语“额外的胃蛋白酶切割位点”是指与Bt细菌产生的天然Cry蛋白相比额外的切割位点。

优选地，所述额外的胃蛋白酶切割位点由选自亮氨酸、苯丙氨酸或谷氨酸残基的氨基酸残基表示。根据本发明的一个特定的实施方案，所述修饰的Cry蛋白有几个由相同的氨基酸残基表示的额外的胃蛋白酶切割位点。根据本发明的另一个实施方案，所述修饰的Cry蛋白有几个由不同氨基酸残基表示的额外的胃蛋白酶切割位点。

根据本发明的一个特定的实施方案，本发明的修饰的Cry蛋白的特征在于，它在域I的至少一个间-α-螺旋环(inter-α-helix loops)上有至少一个额外的胃蛋白酶切割位点。词名“域I的间-α-螺旋环”是指如Grochulski等(1995)和Li等(1991)所述，连接Cry蛋白的七个域I的α-螺旋的肽链。根据本发明，所述Cry蛋白应含有至少一个额外的胃蛋白酶切割位点。此外，所述额外的切割位点是在至少一个域I的间-α-螺旋环内。术语“额外的”因此应理解为与由Bt细菌产生的天然Cry蛋白的域I的间-α-螺旋环中天然存在的胃蛋白酶切割位点的数目相比是附加。该定义是指，本发明的修饰的Cry蛋白的特征在于，它在域I的间-α-螺旋环中有一定数目的胃蛋白酶切割位点，这一数目大于由Bt细菌产生的相同天然Cry蛋白中这些位点的数目，所述数目之间的差异至少差于1。

根据本发明的一个特定的实施方案，本发明的修饰的Cry蛋白在连接域I的α3和α4螺旋的间-α-螺旋环中至少有一个胃蛋白酶切割位点。

根据本发明的一个优选地实施方案，所述修饰的Cry蛋白是修饰的Cry9C蛋白。优选地，所述修饰的Cry蛋白是修饰的Cry9Ca1蛋白，它在氨基酸残基164上有胃蛋白酶切割位点。特别地，在按照本发明修饰的Cry9Ca1蛋白上，天然存在于Cry9Ca1蛋白164位的精氨酸残基被选自亮氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸残基的氨基酸残基替代。优选地，按照本发明修饰的Cry9Ca1蛋白选自其序列以标识符SEQ IDNo.4、SEQ ID No.6或SEQ ID No.8表示的Cry蛋白。

本发明还涉及胃蛋白酶敏感的修饰的Cry蛋白，其特征在于，所述额外的胃蛋白酶切割位点是通过用谷氨酸残基代替天冬氨酸残基，用苯丙氨酸残基代替色氨酸残基以及用亮氨酸残基代替缬氨酸或异亮氨酸残基引入的。优选地，所述修饰的Cry蛋白的取代程度为25％。词句“取代程度”是指被与本发明的修饰的Cry蛋白中的胃蛋白酶切割位点相应的氨基酸残基替代的天然Cry蛋白的氨基酸残基的百分比。

本发明的一个主题还包括增加Cry蛋白的胃蛋白酶敏感性的方法，其特征在于，在所述Cry蛋白中引入至少一个额外的胃蛋白酶切割位点。词句“增加Cry蛋白的胃蛋白酶敏感性”是指与相应的天然Cry蛋白相比，通过所述方法增加获得的Cry蛋白的胃蛋白酶敏感性，这种增加导致蛋白水解破坏和所述Cry蛋白杀虫活性的丧失，这些作用可能是部分或完全的。

引入至少一个胃蛋白酶切割位点是通过遗传工程人工进行的。特别地，它包括插入或替代氨基酸残基。优选地，它包括取代。这种取代可通过精通此领域的技术人员熟知的定点诱变技术简单实现。

优选地，施用本发明所述方法的Cry蛋白选自Cry1，Cry3，Cry4，Cry7，Cry8，Cry9，Cry10，Cry16，Cry17，Cry19和Cry20蛋白。优选地，它是Cry9C蛋白，更优选是Cry9Ca1蛋白。

特别地，额外的胃蛋白酶切割位点由选自亮氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸残基的氨基酸残基表示。

根据本发明的一个特定的实施方案，本发明所述方法的特征在于，至少一个额外的胃蛋白酶切割位点被引入所述Cry蛋白域I的至少一个间-α-螺旋环中。

根据本发明的另一个特定的实施方案，本发明所述方法的特征在于，至少一个额外的胃蛋白酶切割位点被引入连接域I的α3和α4螺旋的间-α-螺旋环中。

根据本发明的一个优选地实施方案，本发明使用了Cry9C蛋白。优选地，它使用了Cry9Ca1蛋白，且额外的胃蛋白酶切割位点是通过氨基酸残基164的取代引入的。特别地，天然存在于Cry9Ca1蛋白164位的精氨酸残基被选自亮氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸残基的氨基酸残基取代。

本发明还涉及增加Cry蛋白胃蛋白酶敏感性的方法，其特征在于，所述额外的胃蛋白酶切割位点是通过用谷氨酸残基取代天冬氨酸残基，用苯丙氨酸残基取代色氨酸残基以及用亮氨酸残基取代缬氨酸或异亮氨酸残基引入的。

优选地，引入所述Cry蛋白的取代程度为25％。

本发明还涉及编码本发明的修饰的Cry蛋白的多核苷酸。根据本发明，术语“多核苷酸”是指天然或人工的核苷酸序列，它可以是DNA或RNA类型，优选是DNA类型，尤其是双链的。

本发明还涉及功能性相互连接的嵌合基因，它含有至少一个在宿主生物中有功能的启动子，编码本发明修饰的Cry蛋白的多核苷酸以及在同一宿主生物中有功能的终止子元件。嵌合基因可以含有的各种元件首先是蛋白质转录、翻译和突变的调节元件，如启动子，编码信号肽或转运肽的序列，或构成聚腺苷酸化信号的终止子元件，其次，编码蛋白质的多核苷酸。词句“功能性相互连接”是指嵌合基因的所述元件以其中一种元件的功能受其它元件影响的方式相互连接。例如，当一个启动子能够影响所述编码序列的表达时，该启动子功能性连接于所述编码序列。本发明嵌合基因的构建以及它的各种元件的装配是用精通此领域的技术人员熟知的技术进行的，尤其是在Sambrook等(1989，分子克隆：实验室手册，Nolan C.编，纽约：冷泉港实验室出版社)中描述的那些技术。对构成嵌合基因的调节元件的选择主要取决于它们必需发挥作用的宿主种类，那些精通此领域的技术人员能够选择出在给定宿主生物中有功能的调节元件。术语“功能的”是指能够在给定宿主生物中发挥功能。

根据本发明的一个特定的实施方案，嵌合基因含有“组成型”启动子。本发明所述的组成型启动子可诱导编码序列在宿主生物的所有组织中表达，并且是连续的，即在所述宿主生物的整个生命周期中表达。一些启动子可以是组织特异的，即能够连续表达编码序列，但仅在宿主生物的特定组织中。组成型启动子可来源于任何类型的生物。在这些可用于本发明的嵌合基因的组成型启动子中，值得一提的是，例如，细菌启动子，如章鱼碱合酶基因或胭脂碱合酶基因的启动子，病毒启动子，如控制花椰菜花叶病毒19S或35S RNA转录的基因的启动子(Odell等，1985，Nature，313，810-812)，或木薯叶脉花叶病毒的启动子(如专利申请WO 97/48819中所述)。在这些植物来源的启动子中，值得一提的是核酮糖-二羧化酶/加氧酶(RuBisCO)小亚基基因的启动子，如申请EP 0 507 698中所述的组蛋白基因的启动子，EF1-α基因的启动子(WO 90/02172)，肌动蛋白基因的启动子(US 5,641,876)，或遍在蛋白基因的启动子(EP 0342926)。

根据本发明的另一个特定地实施方案，所述嵌合基因含有可诱导的启动子。可诱导的启动子是当它自身被诱导剂诱导时才有功能的启动子，即只诱导编码基因的表达。诱导剂通常可在宿主生物中合成然后外部刺激所述生物的物质，这种外部刺激可能是物理性或化学性的，在自然界中有生命或无生命的。这种启动子是已知的，例如，专利申请WO 00/56897中所述的植物O-甲基转移酶类II(COMT II)基因的启动子，拟南芥(Arabidopsis)PR-1启动子(Lebel等，1998，PlantJ.16(2)：223-233)，烟草倍半萜合酶基因的EAS4启动子(Yin等，1997，PlantPhysiol.115(2)，437-451)，或编码3-羟基3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因的启动子(Nelson等，1994，Plant Mol.Biol.25(3)：401-412)。

在可用于本发明的嵌合基因的终止子元件中，值得一提的是，例如，由编码根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合酶的基因的nos终止子元件(Bevan等，1983，Nucleic Acids Res.11(2)，369-385)，或如申请EP 0 633 317中所述的组蛋白基因的终止子元件。

根据本发明的一个特定的实施方案，本发明的嵌合基因的启动子和终止子元件在植物中都是有功能的。

所述嵌合基因还含有信号肽或转运肽似乎也是重要的，这可使它能够控制和定位Cry蛋白在宿主生物的特定细胞区室中产生，例如细胞质，在胞质的特定区室中，或细胞膜，就植物而论，在特定类型的细胞区室中，例如叶绿体，或在胞外基质中。

转运肽可以是单链或双链。双链转运肽可任选地被中间序列分离，即它们在转录方向含有编码植物基因转运肽的序列，该植物基因编码定位在质体中的酶，编码定位在质体中的酶的植物基因的成熟的N-末端部分的序列部分，然后是编码植物基因的第二转运肽的序列，该植物基因编码定位在质体中的酶。例如，在专利申请EP 0 508 909描述了这种双链转运肽。

值得一提的是用于本发明的单链肽特别包括Cornelissen等(1987，NucleicAcid Res.15，6799-6811)所述的烟草PR-1α基因的信号肽，尤其是当本发明的嵌合基因被引入植物细胞或植物时。

本发明还涉及含有本发明嵌合基因的载体。这种载体被用来转化宿主生物和在所述生物中表达本发明的修饰的Cry蛋白。这种载体可以是质粒、粘粒、噬菌体或病毒。通常，这种载体的主要性质是在宿主生物的细胞中保持其本身和自我复制的能力，尤其是依靠复制起点的存在，以及在其中表达修饰的Cry蛋白的能力。对这种载体的选择以及在其中插入本发明的嵌合基因的技术广泛描述在Sambrook等(1989，分子克隆：实验室手册，Nolan C.编，纽约：冷泉港实验室出版社)，且是精通此领域的技术人员普通知识的一部分。除本发明的嵌合基因外，用于本发明的载体也可含有可选择标记的嵌合基因。这种可选择标记使其可能选择有效转化的宿主生物，即那些已掺入载体的宿主生物。在这些可用于许多宿主生物的可选择标记中，值得一提的可由含有对抗生素抗性的基因的标记构成，如潮霉素磷酸转移酶的标记(Gritz等，1983，Gene 25：179-188)。优选地，要转化的宿主生物是植物。在可用于植物的可选择标记中，值得一提的可由含有对除草剂有耐性的基因的标记构成，如对双丙氨酰膦有耐性的bar基因(White等，NAR 18：1062，1990)，对草甘膦有耐性的EPSPS基因(US 5,188,642)或对异噁唑有耐性的HPPD基因(WO 96/38567)。值得一提的还可由编码易于鉴别酶类如GUS酶的基因，或编码色素或调节转化的细胞中色素产生的酶的基因构成。这种可选择的标记基因特别描述在专利申请WO 91/02071和WO 95/06128中。

本发明还涉及用上述载体转化的宿主生物。术语“宿主生物”是指任何类型的生物，尤其是植物或微生物，如细菌、病毒、真菌或酵母。术语“转化的宿主生物”是指在其基因组中引入了本发明所述的嵌合基因，随后在其组织中产生了本发明的修饰的Cry蛋白。为得到本发明的宿主生物，那些精通此领域的技术人员可使用许多已知的转化方法。这些方法之一包括使要转化的细胞与聚乙二醇(PEG)接触，然后和本发明的载体接触(Chang和Cohen，1979，Mol.Gen.Genet.168(1)，111-115；Mercenier和Chassy，1988，Biochimie 70(4)，503-517)。电穿孔是另一种方法，它包括将要转化细胞或组织以及本发明的载体置于电场中(Andreason和Evans，1988，Biotechniques 6(7)，650-660；Shigckawa和Dower，1989，Aust..J.Biotechnol.3(1)，56-62)。另一种方法包括通过微注射将载体直接注射到宿主细胞或组织中(Gordon和Ruddle，1985，Gene(33(2)，121-136)。有利地，可使用“生物射弹”法。它包括用吸附有本发明载体的颗粒轰击细胞或组织(Bruce等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.US 86(24)，9692-9696；Klein等，1992，Biotechnology10(3)，286-291；美国专利4,945,050号)。优选地，植物的转化是用土壤杆菌属的细菌进行的，优选用根癌土壤杆菌(Knopf，1979，Subcell.Biochem.6，143-173；Shaw等，1983，Gene 23(3)：315-330)或发根土壤杆菌(Bevan和Chilton，1982，Annu.Rev.Genet.16：357-384；Tepfer和Casse-Delbart，1987，Microbiol.Sci.4(1)，24-28)感染所述植物的细胞或组织。优选地，用根癌土壤杆菌转染植物细胞是按照Ishida等(1996，Nat.Biotechnol.14(6)，745-750)所述的方法进行的。

在以下专利和专利申请中特别描述了这些不同的技术：US 4,459,355，US 4,536,475，US 5,464,763，US 5,177,010，US 5,187,073，EP 267,159，EP 604 662，EP 672 752，US 4,945,050，US 5,036,006，US 5,100,792，US 5,371,014，US 5,478,744，US 5,179,022，US 5,565,346，US 5,484,956，US 5,508,468，US 5,538,877，US 5,554,798，US 5,489,520，US 5,510,318，US 5,204,253，US 5,405,765，EP 270 615，EP 442 174，EP 486 233，EP 486 234，EP 539 563，EP 674 725，WO 91/02071和WO 95/06128。

本发明还涉及产生本发明的修饰的Cry蛋白的方法。该方法至少包括以下步骤：

(a)在适合所述生物生长和繁殖的培养基中培养本发明的转化的宿主生物，

(b)提取由步骤(a)中培养的转化的生物产生的Cry蛋白。

根据选择用来实施该方法的宿主生物以及它所含的嵌合基因，Cry蛋白或是在宿主生物内产生，或被分泌到培养基中。要确保，如果所述蛋白质未被分泌到培养基中，则步骤(b)中的提取可能需要破坏微生物，或至少是含有它们的细胞，的步骤，以便释放Cry蛋白。提取步骤通常有两种可能性(分泌或不分泌蛋白质)，包括通过过滤或离心培养基从这些生物中除去宿主生物或碎片。

根据一个特定的实施方案，所述产生修饰的Cry蛋白的方法还包括额外的步骤(c)：从培养基中纯化产生的Cry蛋白。

根据一个优选地实施方案，所述宿主生物是微生物。优选地，所述宿主生物是苏云金芽孢杆菌，且步骤(a)中的培养连续进行直到所述细菌的孢子形成期。

本发明还包括用本发明的载体转化的植物，其特征在于，它们含有本发明的嵌合基因，该嵌合基因稳定地整合到它们的基因组中，并在它们的组织中表达修饰的Cry蛋白。本发明还涉及这些植物的部分以及这些植物的后代。词句“这些植物的部分”是指这些植物的任何器官，无论它是气生的或地下的。气生的器官有茎、叶和花。地下的器官主要是根，但也可是块茎。术语“后代”主要是指种子，它含有这些植物相互繁殖而来的胚。此外，术语“后代”被用于在植株间杂交产生的新一代中形成的所有植株和种子，尤其是植株变种和本发明的转化的植株。

本发明的转化的植物可以是单子叶植物或双子叶植物。优选地，这些植物具有农业价值。有利地，所述单子叶植物是小麦、玉米和水稻。有利地是，所述双子叶植物是油菜、大豆、烟草和棉花。

根据本发明一个特定的实施方案，除本发明的嵌合基因外，本发明的转化的植物至少包含另一种基因，该基因含有编码感兴趣的蛋白的多核苷酸。在编码感兴趣的蛋白的多核苷酸中，值得一提可由编码对除草剂抗性的酶的多核苷酸构成，例如编码bar酶的多核苷酸(White等，NAR 18：1062，1990)以耐受双丙氨酰膦，编码EPSPS酶的多核苷酸(US 5,188,642；WO 97/04103)以耐受草甘膦，或是编码HPPD酶的多核苷酸(WO 96/38567)以耐受异恶唑。这些植物还可含有对疾病有抗性的多核苷酸，例如编码如专利申请EP 0 531 498或美国专利5,866,788所述的草酸氧化酶的多核苷酸，或编码如专利申请WO 97/30082，WO 99/24594，WO 99/02717，WO 99/53053和WO 99/91089中所述的抗细菌和/或抗真菌肽的多核苷酸。值得一提的可由编码植物农艺特性的多核苷酸构成，尤其是编码如美国专利5,552,306和5,614,313，以及专利申请WO 98/46763和WO 98/46764所述的δ-6脱饱和酶的多核苷酸，或是编码如专利申请WO 00/01833和PCT/FR 99/03179所述的丝氨酸乙酰转移酶(SAT)的多核苷酸。本发明的转化的植物还含有编码其它杀虫毒素的多核苷酸，如编码其它苏云金芽孢杆菌Cry蛋白的多核苷酸(例如，参见国际专利申请WO 98/40490)。

本发明的一个主题还包括抗本发明的修饰的Cry蛋白或其片段的单克隆或多克隆抗体。产生抗体的技术广泛描述在一般的文献以及参考书中，如Immunological《简易免疫技术》(Techniques Made Easy)(1998，O.Cochet，J.-L.Teillaud，C.Sautès编，John Wiley & Sons，Chichester)。优选地，本发明的抗体被用于试验或试剂盒，以检测本发明的Cry蛋白。

以下实施例是用来阐述本发明的，而不是限制其范围。

实施例1：在Cry9Ca1毒素的164位氨基酸上产生胃蛋白酶切割位点

用胃蛋白酶识别的三种氨基酸之一：亮氨酸、苯丙氨酸或谷氨酸替代该毒素第164位上天然存在的精氨酸，以将胃蛋白酶-特异位点引入苏云金芽孢杆菌Cry9Ca1毒素。氨基酸164存在于连接域I的α3和α4螺旋的间-α-螺旋环(以后称为α3-α4间-螺旋环)。

α3-α4间-螺旋环的天然序列在天冬氨酸159和缬氨酸168之间。该环的序列如下：DRNDTRNLSV。这种氨基酸序列相应于以下DNA序列，从碱基475-延伸到碱基504：

GAT  CGA  AAT  GAT  ACA  CGA  AAT  TTA  AGT  GTT

Asp  Arg  Asn  Asp  Thr  Arg  Asn  Leu  Ser  Val

编码精氨酸的密码子164(CGA)被修饰成编码亮氨酸或苯丙氨酸或谷氨酸的密码子。该密码子可能性如下：

亮氨酸：TTA，TTG，CTT，CTC，CTA或CTG

苯丙氨酸：TTT或TTC

谷氨酸：GAA或GAG

在定点诱变中，对优选密码子的选择取决于生物体，其中，修饰的cry基因必须被表达，以及与此相应的变化。这种选择是精通此领域的技术人员的普通知识的一部分，技术人员将根据这种优选地密码子来选择用于生产的生物体。在此实施例中，所选供表达的生物是苏云金芽孢杆菌。苏云金芽孢杆菌优选使用的用来编码亮氨酸、苯丙氨酸或谷氨酸的密码子分别是TTA(亮氨酸)、TTT(苯丙氨酸)和GAA(谷氨酸)。

因此，可采用以下诱变寡核苷酸进行在Bt中表达的修饰(在以下实施例中所述的寡核苷酸中，上一行的密码子与突变的密码子相对应，用黑体表述的碱基和氨基酸与特定突变的碱基和氨基酸对应)：

寡核苷酸No.1：5′-gat cga aat gat aca TTA aat tta agt gtt gtt-3′

                  Asp Arg Asn Asp Thr Leu Asn Leu Ser Val Val

寡核苷酸No.1用亮氨酸替代精氨酸164。

寡核苷酸No.2：5′-gat cga aat gat aca TTT aat tta agt gtt gtt-3′

                  Asp Arg Asn Asp Thr Phe Asn Leu Ser Val Val

寡核苷酸No.2用苯丙氨酸替代精氨酸164。

寡核苷酸No.3：5′-gat cga aat gat aca GAA aat tta agt gtt gtt-3′

                  Asp Arg Asn Asp Thr Glu Asn Leu Ser Val Val

寡核苷酸No.3用谷氨酸替代精氨酸。

用来修饰cry9Ca1基因序列的大肠杆菌(Escherichia coli)菌株的特征如下：

- JM 109基因型recA1 supE44 endA1 hsdR17 gyrA96 relA1 thiD(lac-proAb)F′(traD36 proAB+lacIq lacZ DM15)

- BMH 71-18 mut S基因型thi，supE，Δ(lac-proAB)，(mutS∷Tn10)(F′，proAB，lacIqZΔM15)。

质粒DNA是按照碱裂解技术(alkaline lysis technique)(Birboim和Doly，1979)用小量制备(minipreparation)制备的。每个细菌集落于37℃在添加适当抗生素的2ml LB培养基中振荡培养过夜(200rpm)。然后将培养物转移到微量管中，然后在13500g离心5分钟。除去上清后，将细菌重悬于100μl 25mM Tris-HCl(pH 8)和10mM EDTA的溶液中，该溶液含有最终浓度为100μg/ml的Rnase A。加入200μl含有1％SDS的0.2 MNaOH溶液，并通过颠倒微量管混合悬液两次。加入150μl 2.55M乙酸钾溶液(pH 4.5)，并将悬液在冰中培育5分钟。在13500g离心15分钟后，将上清转移到含有1ml冷乙醇的微量管中。在13500g离心30分钟后，除去上清并用1ml 70％乙醇洗涤沉淀。在真空下将含有DNA的沉淀干燥数分钟，然后加到50μl无菌蒸馏水中。然后将样品置于65℃30分钟。

对最终体积为20μl的1μg DNA进行限制性内切酶消化，对每种酶供应商建议在占终体积的10X缓冲液的十分之一情况下，并使用5个单位的酶。对酶在最佳温度下反应2-3小时。

用小牛肠碱性磷酸酶作为限制性酶进行5’末端的去磷酸化。在50μl的终体积中，每μg DNA用5μl 10X去磷酸化缓冲液(500mM Tris-Hcl，pH 9.3，10mM MgCl₂，1mM ZnCl₂和10mM亚精胺)和1单位酶进行反应。在突出5’末端情况下反应在37℃进行1小时，在平端或3’突出端情况下则在55℃进行1小时。去磷酸化后，然后在65℃将酶钝化30分钟，然后对每体积提取物用两体积苯-氯仿-异戊醇(25-24-1)的混合物除去。然后用T4噬菌体DNA连接酶形成连接。它们是用相当于100ng的载体量进行的，且插入片段/载体的摩尔比在5和10之间。反应物的最终体积为30μl，并含有3μl 10X连接缓冲液(300mM Tris-Hcl，pH 7.8，100mM MgCl₂，100mMDTT和10mM ATP)和3单位的酶。反应物在14℃培育过夜。

所述诱变寡核苷酸(寡核苷酸No.1，寡核苷酸No.2和寡核苷酸No.3)在5’位被磷酸化以进行连接。将100pmol寡核苷酸和5单位T4多核苷酸激酶在37℃培育30分钟，最终体积为25μl，在有2.5μl 10X磷酸化缓冲液(700mM Tris-HCl，pH 7.6，100mM MgCl₂和50mM DTT)和最终浓度为1mM的ATP的情况下。然后将酶在70℃灭活10分钟。

按照以下所述的常规方法进行定点诱变。精通此领域的技术人员已知的其它方法描述在文献中并得到一样的结果。所用定点诱变法是制造商描述的，它被用于Promega公司的Altered SitesII系统。该诱变系统和方法的详细描述可在Promega公司的互联网地址http：//www.promega.com中找到。cry9Ca1基因被预克隆成携带四环素抗性基因和含有点突变的氨苄青霉素抗性基因的噬菌粒(phagemide)pAlter-1(Promega)。将要突变的DNA片段预克隆成质粒pAlter-1。加入2μl 2M NaOH，2mM EDTA，终体积为20μl，并在室温培育5分钟，使0.5pmol质粒DNA变性。加入2μl 2M醋酸铵，pH 4.6，和75μl乙醇，并将混合物在-70℃培育30分钟。在4℃以14000g离心15分钟后，用200μl 70％乙醇洗涤沉淀，并于4℃以14000g离心15分钟。然后在真空下干燥变性的DNA沉淀，并将其重悬于100μl无菌蒸馏水中。在杂交缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.5，10mM MgCl₂，50mM NaCl)存在时，将10μl变性的DNA，即0.05pmol，与0.25pmol磷酸化的氨苄青霉素-抗性基因修复寡核苷酸，0.25pmol四环素-抗性基因破坏寡核苷酸和1.25pmol磷酸化的诱变寡核苷酸(寡核苷酸No.1，No.2或No 3)混合，并在75℃培育5分钟，然后缓慢冷却至室温。加入5μl无菌蒸馏水，3μl 10x合成缓冲液(100mM Tris-HCl，pH 7.5，20mM DTT，10mM ATP，5mM dNTP)，10单位T4 DNA聚合物和3单位T4 DNA连接酶，并在37℃培育90分钟进行反应。然后在1.5μl上述反应物存在时，将200μl感受态大肠杆菌BMH 71-18在冰中培育30分钟。然后将细菌在42℃放置50秒进行热休克，再在冰中放置2分钟。然后加入900μlLB培养基并将悬液在37℃振荡培育1小时。然后加入4ml LB培养基(添加有氨苄青霉素，最终浓度为100μg/ml)并将培养物在37℃振荡培育过夜。按照上述质粒DNA提取方法，用4ml培养物制备质粒DNA的小量制备。然后在1ng质粒DNA存在时将200μl感受态大肠杆菌JM109在冰中培育30分钟。然后将细菌在42℃放置50秒进行热休克，再在冰中放置2分钟。然后加入900μl LB培养基并将悬液在37℃振荡培育过夜。然后将100μl细菌悬液取出铺在含有固体LB培养基的培养皿上，培养基中添加最终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素。筛选获得的重组体以发现感兴趣的克隆。用上述小量制备技术将几个集落的质粒DNA分离以进行研究，然后测序此DNA。用添加有终浓度为12.5μg/ml四环素的培养基选择重组体。通过在定点诱变后测序DNA控制所需突变的正确性和缺乏不需要的突变的鉴定。用Wizard Plus SV Minipreps DNA纯化系统(Promega)，按照供应商推荐的方法纯化供测序的DNA样品，并在ABI 377自动测序仪(Perkin-Elmer)上，用按照链终止法进行测序反应(Sanger等，1977)，通过PCR(使用ABI PRISM BigDye终止子循环测序试剂盒系统(ABI PRISM BigDye terminator Cycle Sequencing Kit system))进行测序。在进行样品的测序反应和自动分析时，所用方法是供应商(AppliedBiosystems)推荐的。

实施例2：在Cry9Ca1毒素的α3-α4间-螺旋环中产生胃蛋白酶切割位点

用胃蛋白酶识别的氨基酸：即亮氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸替代该间-螺旋环的至少一个氨基酸，以将胃蛋白酶-特异位点引入CrygCa1毒素的α3-α4间-螺旋环。因此，编码这三种氨基酸的密码子将替代天然存于从碱基475延伸到碱基504的区域中的密码子。这三种氨基酸密码子的可能性如实施例1所述。

如实施例1，选择用来产生修饰的Cry蛋白的生物是苏云金芽孢杆菌，因此对置换密码子的选择和实施例1一样。此外，如果选择了另一种产生菌，那些精通此领域的技术人员将能够根据选的产生菌的功能来调节优选密码子。

α3-α4间-螺旋环的各种可选序列都是可能的，它们都含有可变数量的亮氨酸、苯丙氨酸或谷氨酸残基。一些可能性列于表1中。α3-α4间-螺旋环的修饰的可能性不限于表中给出的那些。在表1中给出列表的目的是阐述修饰的一些可能性，而不是要将本发明的范围限制与此。那些精通此领域的技术人员能够根据生物知道各氨基酸特异的密码子，将能够根据所有的可能性修改实施例1中所述的方法以修饰α3-α4间-螺旋环，尤其是表1中未描述的那些。

表1.Cry9Ca1毒素的α3-α4间-螺旋环的可能修饰的例子

蛋白质           氨基酸序列              核苷酸序列

Cry9Ca1         DRNDTRNLSV    gat cga aat gat aca cga aat tta agt gtt

                              Asp Arg Asn Asp Thr Arg Asn Leu Ser Val

Mutant No.1     ELNEFLNLSV    gaA TTa aat gaA TTT TTa aat tta agt gtt

                              Glu Leu Asn Glu Phe Leu Asn Leu Ser Val

Mutant No.2     ELNELLNLSV    gaA TTa aat gaA TTa TTa aat tta agt gtt

                              Glu Leu Asn Glu Leu Leu Asn Leu Ser Val

Mutant No.3     ELLEFLLLSV    gaA TTa TTA gaA TTT TTa TTA tta agt gtt

                              Glu Leu Leu Glu Phe Leu Leu Leu Ser Val

Mutant No.4     ELLELLLLSV    gaA TTa TTA gaA TTa TTa TTA tta agt gtt

                              Glu Leu Leu Glu Leu Leu Leu Leu Ser Val

Mutant No.5     ELLEELLLSV    gaA TTa TTA gaA GAa TTa TTA tta agt gtt

                              Glu Leu Leu Glu Glu Leu Leu Leu Ser Val

Mutant No.6     ERLEFLLLSV    gaA cga TTA gaA TTT TTa TTA tta agt gtt

                              Glu Arg Leu Glu Phe Leu Leu Leu Ser Val

Mutant No.7     ERLELLLLSV    gaA cga TTA gaA TTa TTa TTA tta agt gtt

                              Glu Arg Leu Glu Leu Leu Leu Leu Ser Val

Mutant No.8     ERLEELLLSV    gaA TTa GAA gaA TTa TTa TTA tta agt gtt

                              Glu Leu Glu Glu Leu Leu Leu Leu Ser Val

Mutant No.9     ELLEEEELSV    gaA TTa TTA gaA GAa GAa GAA tta agt gtt

                              Glu Leu Leu Glu Glu Glu Glu Leu Ser Val

对每种突变体，在α3-α4间-螺旋环内对几种氨基酸的取代需要连续使用一些诱变寡核苷酸。所述需要用来产生表1所给突变体例子的诱变寡核苷酸如下(从4号到20号)。

Oligonucleotide No.4：     cga aat gat aca cga TTA tta agt gtt gtt cgt

                           Arg Asn Asp Thr Arg Leu Leu Ser Val Val Arg

Oligonucleotide No.5：     cga aat gat aca cga GAA tta agt gtt gtt cgt

                           Arg Asn Asp Thr Arg Glu Leu Ser Val Val Arg

Oligonucleotide No.6：     ttg gct gat cga aat gaA TTT TTa aat tta agt gtt gtt

                           Leu Ala Asp Arg Asn Glu Phe Leu Asn Leu Ser Val Val

Oligonucleotide No.7：     ttg gct gat cga aat gaA TTT TTa tta tta agt gtt gtt

                           Leu Ala Asp Arg Asn Glu Phe Leu Leu Leu Ser Val Val

Oligonucleotide No.8：     ttg gct gat cga aat gaA TTa TTa aat tta agt gtt gtt

                           Leu Ala Asp Arg Asn Glu Leu Leu Asn Leu Ser Val Val

Oligonucleotide No.9：     ttg gct gat cga aat gaA TTa TTa tta tta agt gtt gtt

                           Leu Ala Asp Arg Asn Glu Leu Leu Leu Leu Ser Val Val

Oligonucleotide No.10：    ttg gct gat cga aat gaA GAa GAa gaa tta agt gtt gtt

                           Leu Ala Asp Arg Asn Glu Glu Glu Glu Leu Ser Val Val

Oligonucleotide No.11：    ttg gct gat cga aat gaA GAa TTa tta tta agt gtt gtt

                           Leu Ala Asp Arg Asn Glu Glu Leu Leu Leu Ser Val Val

Oligonucleotide No.12：    caa aat tgg ttg gct gaA TTa aat gaa tta tta aat

                           Gln Asn Trp Leu Ala Glu Leu Asn Glu Leu Leu Asn

Oligonucleotide No.13：    caa aat tgg ttg gct gaA TTa aat gaa ttt tta aat

                           Gln Asn Trp Leu Ala Glu Leu Asn Glu Phe Leu Asn

Oligonucleotide No.14：    caa aat tgg ttg gct gaA TTa TTA gaa ttt tta tta tta

                           Gln Asn Trp Leu Ala Glu Leu Leu Glu Phe Leu Leu Leu

Oligonucleotide No.15：    caa aat tgg ttg gct gaA TTa TTA gaa tta tta tta tta

                           Gln Asn Trp Leu Ala Glu Leu Leu Glu Leu Leu Leu Leu

Oligonucleotide No.16：    caa aat tgg ttg gct gaA TTa TTA gaa gaa tta tta tta

                           Gln Asn Trp Leu Ala Glu Leu Leu Glu Glu Leu Leu Leu

Oligonucleotide No.17：    caa aat tgg ttg gct gaA cga TTA gaa ttt tta tta tta

                           Gln Asn Trp Leu Ala Glu Arg Leu Glu Phe Leu Leu Leu

Oligonucleotide No.18：    caa aat tgg ttg gct gaA cga TTA gaa tta tta tta tta

                           Gln Asn Trp Leu Ala Glu Arg Leu Glu Leu Leu Leu Leu

Oligonucleotide No.19：    caa aat tgg ttg gct gaA TTa gaA gaa tta tta tta tta

                           Gln Asn Trp Leu Ala Glu Leu Glu Glu Leu Leu Leu Leu

Oligonucleotide No.20：    caa aat tgg ttg gct gaA TTa TTA gaa gaa gaa gaa tta

                           Gln Asn Trp Leu Ala Glu Leu Leu Glu Glu Glu Glu Leu

连续的定点诱变方法与实施例1中所述的方法类似。不同之处在于寡核苷酸的组合。对于表1中所述的各个突变体的例子，寡核苷酸的连续组合如下所述。

突变体No.1：突变体No.1的产生需要按照实施例1所述的方法进行两次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.6，第二次用寡核苷酸No.13。寡核苷酸No.13被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.6引入的修饰。

突变体No.2：突变体No.2的产生需要按照实施例1所述的方法进行两次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.8，第二次用寡核苷酸No.12。寡核苷酸No.12被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.8引入的修饰。

突变体No.3：突变体No.3的产生需要按照实施例1所述的方法进行三次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.4，第二次用寡核苷酸No.7，第三次用寡核苷酸No.14。寡核苷酸No.7被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.4引入的修饰，寡核苷酸No.14被限定识别在前两次诱变时用寡核苷酸No.4和No.7引入的修饰。

突变体No.4：突变体No.4的产生需要按照实施例1所述的方法进行三次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.4，第二次用寡核苷酸No.9，第三次用寡核苷酸No.15。寡核苷酸No.9被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.4引入的修饰，寡核苷酸No.15被限定识别在前两次诱变时用寡核苷酸No.4和No.9引入的修饰。

突变体No.5：突变体No.5的产生需要按照实施例1所述的方法进行三次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.4，第二次用寡核苷酸No.11，第三次用寡核苷酸No.16。寡核苷酸No.11被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.4引入的修饰，寡核苷酸No.16被限定识别在前两次诱变时用寡核苷酸No.4和No.11引入的修饰。

突变体No.6：突变体No.6的产生需要按照实施例1所述的方法进行三次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.4，第二次用寡核苷酸No.7，第三次用寡核苷酸No.17。寡核苷酸No.7被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.4引入的修饰，寡核苷酸No.17被限定识别在前两次诱变时用寡核苷酸No.4和No.7引入的修饰。

突变体No.7：突变体No.7的产生需要按照实施例1所述的方法进行三次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.4，第二次用寡核苷酸No.9，第三次用寡核苷酸No.18。寡核苷酸No.9被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.4引入的修饰，寡核苷酸No.18被限定识别在前两次诱变时用寡核苷酸No.4和No.9引入的修饰。

突变体No.8：突变体No.8的产生需要按照实施例1所述的方法进行三次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.4，第二次用寡核苷酸No.9，第三次用寡核苷酸No.19。寡核苷酸No.9被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.4引入的修饰，寡核苷酸No.19被限定识别在前两次诱变时用寡核苷酸No.4和No.9引入的修饰。

突变体No.9：突变体No.9的产生需要按照实施例1所述的方法进行三次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.5，第二次用寡核苷酸No.10，第三次用寡核苷酸No.20。寡核苷酸No.10被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.5引入的修饰，寡核苷酸No.20被限定识别在前两次诱变时用寡核苷酸No.5和No.10引入的修饰。

根据这一方法，所述寡核苷酸被分成三类，第一类寡核苷酸，第二类寡核苷酸和第三类寡核苷酸。分类如下：

第一类寡核苷酸：寡核苷酸No.4，5，6和8

第二类寡核苷酸：寡核苷酸No.7，9，10，11，12和13

第三类寡核苷酸：寡核苷酸No.14，15，16，17，18，19和20。

产生这些突变体的完整方法与实施例1中所描述的相同。该方法对每种诱变系列都是共同的，只是诱变寡核苷酸和用来抑制/恢复对抗生素抗性的寡核苷酸发生了变化。在突变后对感兴趣的克隆进行筛选，这些克隆已经整合了上述突变。如果该步骤是第一类和第二类诱变的最后步骤，来自该系列实验的材料被作为初始材料分别供第二类和第三类诱变重新使用，第二类和第三类诱变分别使用了第二类或第三类寡核苷酸。然后可用获自DNA基质的质粒DNA和用来修复四环素抗性基因的寡核苷酸和用来破坏氨苄青霉素抗性基因的寡核苷酸以及第二类诱变寡核苷酸进行诱变的第二次循环。然后用添加有终浓度为12.5μg/ml四环素的培养基选择重组体。可用在第二次诱变循环终点获得的作为DNA基质的质粒DNA和用来修复氨苄青霉素抗性基因的寡核苷酸和用来破坏四环素抗性基因的寡核苷酸以及第三类诱变寡核苷酸进行诱变的第三次循环。然后用添加有终浓度为100μg/ml氨苄青霉素的培养基选择重组体。当产生突变体所需的所有诱变完成后，按实施例1的描述进行控制突变的步骤。

实施例3：在Cry9Ca1毒素的α4-α5，α5-α6和α6-α7间-螺旋环中产生胃蛋白酶切割位点

Cry9Ca1毒素的α4-α5，α5-α6和α6-α7间-螺旋环的天然序列的位置列于表2。核苷酸序列和在cry9Ca1基因中相应的位置列于表3。

表2.Cry9Ca1毒素的α4-α5，α5-α6和α6-α7间-螺旋环的位置和序列

    环              序列                  位置

环α4-α5           FAVNGQQVPLL           苯丙氨酸187-亮氨酸197

环α5-α6           LFGEGWGF              亮氨酸216-苯丙氨酸223

环α6-α7           LRGTN                 亮氨酸257-天冬氨酸261

     表3.编码α4-α5，α5-α6和α6-α7间-螺旋环的cry9ca1基因的位置和序列

环           序列                                             位置

环α4-α5    TTT GCA GTA AAT GGA CAG CAG GTT CCA TTA CTG      559-591

环α5-α6    CTT TTT GGA GAA GGA TGG GGA TTC                  646-669

环α6-α7    TTA AGA GGA ACA AAT                              769-783

核苷酸和氨基酸序列的重叠如下：

环α4-α5：TTT GCA GTA AAT GGA CAG CAG GTT CCA TTA CTG

           Phe Ala Val Asn Gly Gln Gln Val Pro Leu leu

环α5-α6  CTT TTT GGA GAA GGA TGG GGA TTC

           Leu Phe Gly Glu Gly Trp Gly Phe

环α6-α7  TTA AGA GGA ACA AAT

           Leu Arg Gly thr Asn

用胃蛋白酶识别的氨基酸，即亮氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸，替代Cry9Ca1毒素α4-α5，α5-α6或α6-α7间-螺旋环的至少一个氨基酸，以将胃蛋白酶-特异位点引入这些间-螺旋环。因此，编码这三种氨基酸的密码子将替代天然存于从碱基559延伸到591(α4-α5间-螺旋环)、646-669(α5-α6间-螺旋环)和769-783(α6-α7间-螺旋环)的区域中的密码子。这三种氨基酸密码子的可能性如实施例1所述。

如实施例1，选择用来产生修饰的Cry蛋白的生物是苏云金芽孢杆菌，因此对置换密码子的选择也和实施例1一样。此外，如果选择了另一种产生菌，那些精通此领域的技术人员将能够根据所选择的产生菌的功能来调节优选密码子。

α4-α5，α5-α6和α6-α7间-螺旋环的各种可选序列都是可能的，它们都含有可变数量的亮氨酸、苯丙氨酸或谷氨酸残基。一些可能性列于表4、5和6中。α4-α5，α5-α6和α6-α7间-螺旋环的修饰可能性不限于表4、5和6中给出的那些。在表4、5和6中给出列表的目的是阐述修饰的一些可能性，而不是要将本发明的范围限制与此。那些精通此领域的技术人员能够根据生物知道各氨基酸特异的密码子，将能够根据所有的可能性修改该实施例中所述的方法以修饰α4-α5，α5-α6和α6-α7间-螺旋环，尤其是表4、5和6中未列出的那些。

表4.Cry9Ca1毒素的α4-α5间-螺旋环可能修饰的例子

蛋白质           氨基酸序列      核苷酸序列

Cry9Ca1          FAVNGQQVPLL     ttt gca gta aat gga cag cag gtt cca tta ctg

                                 Phe Ala Val Asn Gly Gln Gln Val Pro Leu leu

Mutant No.10     FLLNLFFLPLL     ttt TTa Tta aat TTa TTT TTT TtA cca tta ctg

                                 Phe Leu leu Asn Leu Phe Phe Leu Pro Leu leu

Mutant No.11     FLLNLEELPLL     ttt TTa Tta aat TTa GaA GaA TtA cca tta ctg

                                 Phe Leu leu Asn Leu Glu Glu Leu Pro Leu leu

Mutant No.12     FEENLEFLPLL     ttt GAa GAa aat TTa GaA GaA TtA cca tta ctg

                                 Phe Glu Glu Asn Leu Glu Glu Leu Pro Leu leu

Mutant No.13     FEENFLLFPLL     ttt GAa GAa aat TTT TTA TTA Ttt cca tta ctg

                                 Phe Glu Glu Asn Phe leu Leu Phe Pro Leu leu

Mutant No.14     FEENFEEFPLL     ttt GAa GAa aat TTT GaA GaA Ttt cca tta ctg

                                 Phe Glu Glu Asn Phe Glu Glu Phe Pro Leu leu

Mutant No.15     FLLNFEEFPLL     ttt Tta TTa aat TTT GaA GaA Ttt cca tta ctg

                                 Phe Leu leu Asn Phe Glu Glu Phe Pro Leu leu

Mutant No.16     FLLNEFFEPLL     ttt TTa TTa aat GAa TTT TTT gAA cca tta ctg

                                 Phe Leu leu Asn Glu Phe Phe Glu Pro Leu leu

表5.Cry9Ca1毒素的α5-α6间-螺旋环可能修饰的例子

蛋白质           氨基酸序列      核苷酸序列

Cry9Cal          LFGEGWGF        ctt ttt gga gaa gga tgg gga ttc

                                 Leu Phe Gly Glu Gly Trp Gly Phe

Mutant No.17     LFLELFLF        ctt ttt TTa gaa TTa tTT TTa ttc

                                 Leu Phe Leu Glu Leu Phe Leu Phe

Mutant No.18     LFLLLFLF        ctt ttt TTa TTa TTa tTT TTa ttc

                                 Leu Phe Leu Leu Leu Phe Leu Phe

Mutant No.19     LFLEEFEL        ctt ttt TTa gaa gAa tTT gAa TTA

                                 Leu Phe Leu Glu Glu Phe Glu Leu

Mutant No.20     LFEEEFEL        ctt ttt gAa gaa gAa tTT gAa TTA

                                 Leu Phe Glu Glu Glu Phe Glu Leu

Mutant No.21     LFEEEFEE        ctt ttt gAa gaa TTa tTT gAa GAA

                                 Leu Phe Glu Glu Glu Phe Glu Glu

表6.Cry9Ca1毒素的α6-α7间-螺旋环可能修饰的例子

蛋白质            氨基酸序列          核苷酸序列

Cry9Ca1           LRGTN               tta aga gga aca aat

                                      Leu Arg Gly thr Asn

Mutant No.22      LLELN               tta TTa gAa TTa aat

                                      Leu Leu Glu Leu Asn

Mutant No.23      LLFLN               tta TTa TTT TTa aat

                                      Leu Leu Phe Leu Asn

Mutant No.24      LELLN               tta GAa TTa TTa aat

                                      Leu Glu Leu Leu Asn

Mutant No.25      LLFFN               tta TTa TTT TTT aat

                                      Leu Leu Phe Phe Asn

Mutant No.26      LEELN               tta GAa GAa TTa aat

                                      Leu Glu Glu Leu Asn

Mutant No.27      LEFLN               tta GAa TTT TTa aat

                                      Leu Glu Phe Leu Asn

Mutant No.28      LEFEN               tta GAa TTT GAa aat

                                      Leu Glu Phe Glu Asn

Mutant No.29      LEEEN               tta GAa gAa GAa aat

                                      Leu Glu Glu Glu Asn

3-1-在α4-α5间-螺旋环中产生胃蛋白酶切割位点

对每种突变体，在α4-α5间-螺旋环内对几种氨基酸的取代需要连续使用一些诱变寡核苷酸。需要用来产生表4所给突变体例子的诱变寡核苷酸如下(从21号到34号)。

Oligonucleotide No.21：gct att cca ttg ttt TTa Tta aat gga cag cag gtt

                       Ala Ile Pro Leu Phe Leu leu Asn Gly Gln Gln Val

Oligonucleotide No.22：gct att cca ttg ttt GAa GAa aat gga cag cag gtt

                       Ala Ile Pro Leu Phe Glu Glu Asn Gly Gln Gln Val

Oligonucleotide No.23：tta tta aat gga cag cag TtA cca tta ctg tca gta

                       Leu leu Asn Gly Gln Gln Leu Pro Leu Leu Ser Val

Oligonucleotide No.24：tta tta aat gga cag cag Ttt cca tta ctg tca gta

                       Leu leu Asn Gly Gln Gln Phe Pro Leu Leu Ser Val

Oligonucleotide No.25：tta tta aat gga cag cag gAA cca tta ctg tca gta

                       Leu leu Asn Gly Gln Gln Glu Pro Leu Leu Ser Val

Oligonucleotide No.26：gaa gaa aat gga cag cag TtA cca tta ctg tca gta

                       Glu Glu Asn Gly Gln Gln Leu Pro Leu Leu Ser Val

Oligonucleotide No.27：gaa gaa aat gga cag cag Ttt cca tta ctg tca gta

                       Glu Glu Asn Gly Gln Gln Phe Pro Leu Leu Ser Val

Oligonucleotide No.28：cca ttg ttt tta tta aat TTa TTT TTT tta cca tta ctg tca gta

                       Pro Leu Phe Leu Leu Asn Leu Phe Phe Leu Pro Leu Leu Ser Val

Oligonucleotide No.29：cca ttg ttt tta tta aat TTa GaA GaA tta cca tta ctg tca gta

                       Pro Leu Phe Leu Leu Asn Leu Glu Glu Leu Pro Leu Leu Set Val

Oligonucleotide No.30：cca ttg ttt gaa gaa aat TTa GaA GaA tta cca tta ctg tca gta

                       Pro Leu Phe Glu Glu Asn Leu Glu Glu Leu Pro Leu Leu Ser Val

Oligonucleotide No.31：cca ttg ttt gaa gaa aat TTT TTA TTA ttt cca tta ctg tca gta

                       Pro Leu Phe Glu Glu Asn Phe Leu Leu Phe Pro Leu Leu Ser Val

Oligonucleotide No.32：cca ttg ttt gaa gaa aat TTT GaA GaA ttt cca tta ctg tca gta

                       Pro Leu Phe Glu Glu Asn Phe Glu Glu Phe Pro Leu Leu Ser Val

Oligonucleotide No.33：cca ttg ttt tta tta aat TTT GaA GaA ttt cca tta ctg tca gta

                       Pro Leu Phe Leu Leu Asn Phe Glu Glu Phe Pro Leu Leu Ser Val

Oligonucleotide No.34：cca ttg ttt tta tta aat GAa TTT TTT gaa cca tta ctg tca gta

                       Pro Leu Phe Leu Leu Asn Glu Phe Phe Glu Pro Leu Leu Ser Val

连续的定点诱变方法与实施例2中所述的方法类似。不同之处在于寡核苷酸的组合。对于表4中所述的各个突变体，寡核苷酸的连续组合如下所述。

突变体No.10：突变体No.10的产生需要按照以下所述的方法进行三次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.21，第二次用寡核苷酸No.23，第三次用寡核苷酸No.28。寡核苷酸No.23被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.21引入的修饰，寡核苷酸No.28被限定识别在前两次诱变时用寡核苷酸No.21和No.23引入的修饰。

突变体No.11：突变体No.11的产生需要按照以下所述的方法进行三次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.21，第二次用寡核苷酸No.23，第三次用寡核苷酸No.29。寡核苷酸No.23被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.21引入的修饰，寡核苷酸No.29被限定识别在前两次诱变时用寡核苷酸No.21和No.23引入的修饰。

突变体No.12：突变体No.12的产生需要按照以下所述的方法进行三次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.22，第二次用寡核苷酸No.26，第三次用寡核苷酸No.30。寡核苷酸No.26被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.22引入的修饰，寡核苷酸No.30被限定识别在前两次诱变时用寡核苷酸No.22和No.26引入的修饰。

突变体No.13：突变体No.13的产生需要按照以下所述的方法进行三次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.22，第二次用寡核苷酸No.27，第三次用寡核苷酸No.31。寡核苷酸No.27被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.22引入的修饰，寡核苷酸No.31被限定识别在前两次诱变时用寡核苷酸No.22和No.27引入的修饰。

突变体No.14：突变体No.14的产生需要按照以下所述的方法进行三次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.22，第二次用寡核苷酸No.27，第三次用寡核苷酸No.32。寡核苷酸No.27被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.22引入的修饰，寡核苷酸No.32被限定识别在前两次诱变时用寡核苷酸No.22和No.27引入的修饰。

突变体No.15：突变体No.15的产生需要按照以下所述的方法进行三次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.21，第二次用寡核苷酸No.24，第三次用寡核苷酸No.33。寡核苷酸No.24被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.21引入的修饰，寡核苷酸No.33被限定识别在前两次诱变时用寡核苷酸No.21和No.24引入的修饰。

突变体No.16：突变体No.16的产生需要按照以下所述的方法进行三次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.21，第二次用寡核苷酸No.25，第三次用寡核苷酸No.34。寡核苷酸No.25被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.21引入的修饰，寡核苷酸No.34被限定识别在前两次诱变时用寡核苷酸No.21和No.25引入的修饰。

根据这一方法，用来产生表4中所述突变体No.10-No.16的寡核苷酸被分成三类，第一类寡核苷酸，第二类寡核苷酸和第三类寡核苷酸。分类如下：

第一类寡核苷酸：寡核苷酸No.21和22

第二类寡核苷酸：寡核苷酸No.23，24，25，26和27

第三类寡核苷酸：寡核苷酸No.28，29，30，31，32，33和34。

3-2-在α5-α6间-螺旋环中产生胃蛋白酶切割位点

对每种突变体，在α5-α6间-螺旋环内对几种氨基酸的取代需要连续使用一些诱变寡核苷酸。需要用来产生表5所给突变体例子的诱变寡核苷酸如下(从35号-44号)。

Oligonucleotide No.35：gat gca tct ctt ttt TTa gaa gga tgg gga ttc

                       Asp Ala Ser Leu Phe Leu Glu Gly Trp Gly Phe

Oligonucleotide No.36：gat gca tct ctt ttt TTa TTa gga tgg gga ttc aca

                       Asp Ala Ser Leu Phe Leu Leu Gly Trp Gly Phe Thr

Oligonucleotide No.37：gat gca tct ctt ttt gAa gaa gga tgg gga ttc

                       Asp Ala Ser Leu Phe Glu Glu Gly Trp Gly Phe

Oligonucleotide No.38：tta gaa gga tgg gga TTa aca cag ggg gaa att

                       Leu Glu Gly Trp Gly Leu Thr Gln Gly Glu Ile

Oligonucleotide No 39：gga gaa gga tgg gga GAA aca cag ggg gaa att

                       Gly Glu Gly Trp Gly Glu Thr Gln Gly Glu Ile

Oligonucleotide No.40：gca tct ctt ttt tta gaa TTa tTT TTa ttc aca cag ggg gaa att

                       Ala Ser Leu Phe Leu Glu Leu Phe Leu Phe Thr Gln Gly Glu Ile

Oligonucleotide No.41：gca tct ctt ttt tta tta TTa tTT TTa ttc aca cag ggg gaa att

                       Ala Ser Leu Phe Leu Leu Leu Phe Leu Phe Thr Gln Gly Glu Ile

Oligonucleotide No.42：gca tct ctt ttt tta gaa TTa tTT TTa ttc aca cag ggg gaa att

                       Ala Ser Leu Phe Leu Glu Glu Phe Glu Leu Thr Gln Gly Glu Ile

Oligonucleotide No.43：gca tct ctt ttt gaa gaa TTa tTT TTa ttc aca cag ggg gaa att

                       Ala Ser Leu Phe Glu Glu GLu Phe Glu Leu Thr Gln Gly Glu Ile

Oligonucleotide No.44：gca tct ctt ttt gaa gaa TTa tTT TTa gaa aca cag ggg gaa att

                       Ala Ser Leu Phe Glu Glu Glu Phe Glu Glu Thr Gln Gly Glu Ile

连续的定点诱变方法与实施例2中所述的方法类似。不同之处在于寡核苷酸的组合。对于表5中所述的各个突变体，寡核苷酸的连续组合如下所述。

突变体No.17：突变体No.17的产生需要按照以下所述的方法进行进行两次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.35，第二次用寡核苷酸No.40。寡核苷酸No.40被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.35引入的修饰。

突变体No.18：突变体No.187的产生需要按照以下所述的方法进行进行两次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.36，第二次用寡核苷酸No.41。寡核苷酸No.41被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.36引入的修饰。

突变体No.19：突变体No.19的产生需要按照以下所述的方法进行三次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.35，第二次用寡核苷酸No.38，第三次用寡核苷酸No.42。寡核苷酸No.38被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.35引入的修饰，寡核苷酸No.42被限定识别在前两次诱变时用寡核苷酸No.35和No.38引入的修饰。

突变体No.20：突变体No.20的产生需要按照以下所述的方法进行三次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.37，第二次用寡核苷酸No.38，第三次用寡核苷酸No.43。寡核苷酸No.38被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.37引入的修饰，寡核苷酸No.43被限定识别在前两次诱变时用寡核苷酸No.37和No.38引入的修饰。

突变体No.21：突变体No.21的产生需要按照以下所述的方法进行三次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.37，第二次用寡核苷酸No.39，第三次用寡核苷酸No.44。寡核苷酸No.39被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.37引入的修饰，寡核苷酸No.44被限定识别在前两次诱变时用寡核苷酸No.37和No.39引入的修饰。

根据这一方法，用来产生表5中所述突变体No.17-No.21的寡核苷酸被分成三类，第一类寡核苷酸，第二类寡核苷酸和第三类寡核苷酸。分类如下：

第一类寡核苷酸：寡核苷酸No.35，36和37

第二类寡核苷酸：寡核苷酸No.38，39，40和41

第三类寡核苷酸：寡核苷酸No.42，43和44。

3-3-在α6-α7间-螺旋环中产生胃蛋白酶切割位点

对每种突变体，在α6-α7间-螺旋环内对几种氨基酸的取代需要连续使用一些诱变寡核苷酸。需要用来产生表6所给突变体例子的诱变寡核苷酸如下(从45号到52号)。

Oligonucleotide No.45：ggt tta gat cgt tta TTa gAa TTa aat act gaa agt tgg

                       Gly Leu Asp Arg Leu Leu Glu Leu Asn Thr Glu Ser Trp

Oligonucleotide No.46：ggt tta gat cgt tta TTa TTT TTa aat act gaa agt tgg

                       Gly Leu Asp Arg Leu Leu Phe Leu Asn Thr Glu Ser Trp

Oligonucleotide No.47：ggt tta gat cgt tta GAa TTa TTa aat act gaa agt tgg

                       Gly Leu Asp Arg Leu Glu Leu Leu Asn Thr Glu Ser Trp

Oligonucleotide No.48：ggt tta gat cgt tta TTa TTT TTT aat act gaa agt tgg

                       Gly Leu Asp Arg Leu Leu Phe Phe Asn Thr Glu Ser Trp

Oligonucleotide No.49：ggt tta gat cgt tta GAa GAa TTa aat act gaa agt tgg

                       Gly Leu Asp Arg Leu Glu Glu Leu Asn Thr Glu Ser Trp

Oligonucleotide No.50：ggt tta gat cgt tta GAa TTT TTa aat act gaa agt tgg

                       Gly Leu Asp Arg Leu Glu Phe Leu Asn Thr Glu Ser Trp

Oligonucleotide No.51：ggt tta gat cgt tta GAa TTT GAa aat act gaa agt tgg

                       Gly Leu Asp Arg Leu Glu Phe Glu Asn Thr Glu Ser Trp

Oligonucleotide No.52：ggt tta gat cgt tta GAa gAa GAa aat act gaa agt tgg

                       Gly Leu Asp Arg Leu Glu Glu Glu Asn Thr Glu Ser Trp

寡核苷酸No.45被用来产生突变体No.22。

寡核苷酸No.46被用来产生突变体No.23。

寡核苷酸No.47被用来产生突变体No.24。

寡核苷酸No.48被用来产生突变体No.25。

寡核苷酸No.49被用来产生突变体No.26。

寡核苷酸No.50被用来产生突变体No.27。

寡核苷酸No.51被用来产生突变体No.28。

寡核苷酸No.52被用来产生突变体No.29。

产生这些突变体的完整方法与实施例2中所描述的相同。该方法对每种突变体都是共同的，只是诱变寡核苷酸和用来抑制/恢复对抗生素抗性的寡核苷酸发生了变化。

实施例4：在各种Cry毒素的α3-α4，α4-α5，α5-α6和α6-α7间-螺旋环中产生胃蛋白酶切割位点

几组Cry蛋白具有结构相似性。尤其是在Cry1，Cry3，Cry4，Cry7，Cry8，Cry9，Cry10，Cry16，Cry17，Cry19或Cry20家族的蛋白中。这些相似性在文献中被证实(Schnepf等，1998)。其它在该文献中未引用的Cry蛋白也和这些家族有结构和序列相似性。实施例4的目的是证实本发明，如实施例2和3中有关Cry9Ca1蛋白的例证对所有这些结构类似家族的适用性。

实施例2和3中所述的间-螺旋环的修饰可用等价的方式对所有Cry蛋白进行，其中可能鉴别与Cry9Ca1毒素的域I中存在的那些类似的间-螺旋环。如果确定了这些不同Cry毒素的中间-螺旋环的位置和序列，对精通此领域的技术人员而言，用实施例2和3中提供的技术细节形成与实施例2和3所给类似的修饰就非常容易了。在本发明中，在Cry毒素中产生供胃蛋白酶降解的特异位点的元件除Cry9Ca1毒素外，还有Cry1，Cry3，Cry4，Cry7，Cry8，Cry9，Cry10，Cry16，Cry17，Cry19和Cry20蛋白。为在Cry1，Cry3，Cry4，Cry7，Cry8，Cry9，Cry10，Cry16，Cry17，Cry19或Cry20毒素中产生被胃蛋白酶降解的位点，对这些间-螺旋环的修饰需要以下步骤：

1)根据下表6-13所给的间-螺旋环的序列和位置，像实施例2和3和表1，4，5和6中所给的那样，建立含有一个或多个亮氨酸、苯丙氨酸或谷氨酸残基的可能突变体的列表。

2)考虑宿主生物的密码子偏爱建立突变体基因的序列，如果所述生物是苏云金芽孢杆菌，则亮氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸优选使用的密码子分别是TTA，TTT和GAA。

3)合成诱变寡核苷酸以修饰编码毒素的基因序列，该毒素是基于实施例2和3中所给的那些模型选出的。

4)用如实施例2和3中所述的单个或多个诱变策略，并按照实施例2和3中详细描述的实验方法。

Cry1，Cry3，Cry4，Cry7，Cry8，Cry9，Cry10，Cry16，Cry17，Cry19和Cry20毒素的域I的α3-α4，α4-α5，α5-α6和α6-α7间-螺旋环的定位和它们的序列给在下表7，8，9，10，11，12和13中。这些序列是对苏云金芽孢杆菌分类委员会(Crickmore等，2001)定义的各个正模标本蛋白给出的。然而，由于内-正模标本(intra-holotype)序列的同源性，即同一正模标本的不同亚型之间的序列同源性非常高，那些精通此领域的技术人员可修改实施例4中所述的方法使其适合所有的Cry蛋白亚型。

表7.Cry1蛋白中α3-α4间-螺旋环的定位和序列

蛋白质        氨基酸      在蛋白质上        核苷酸序列        在基因上的位置

              序列        的位置

Cry1Aa        DPTN        120 to 123        gatcctactaat         358 to 369

Cry1Ab        DPTN        120 to 123        gatcctactaat         358 to 369

Cry1Ac        DPTN        120 to 123        gatcctactaat         358 to 369

Cry1Ad        DPTN        120 to 123        gatcctactaat         358 to 369

Cry1Ae        DPTN        120 to 123        gatcctactaat         358 to 369

Cry1Af        DPTN        120 to 123        gatcctactaat         358 to 369

Cry1Ag        DPTN        120 to 123        gatcctactaat         358 to 369

Cry1Ba        NRDD        139 to 142        aaccgtgacgat         415 to 426

Cry1Bb        NRND        144 to 147        aaccgaaatgat         430 to 441

Cry1Bc        NRND        144 to 147        aaccgaaatgat         430 to 441

Cry1Bd        NRND        144 to 147        aaccgaaatgat         430 to 441

Cry1Ca        DPNN        119 to 122        gatcctaataat         355 to 366

Cry1Cb        DPDN        119 to 122        gatcctgataat         355 to 366

Cry1Da        DPTN        119 to 122        gatcctaataat         355 to 366

Cry1Db        DPSN        119 to 122        gatccgtctaat         355 to 366

Cry1Ea        DPTN        118 to 121        gatcctactaat         352 to 363

Cry1Eb        DPTN        117 to 120        gatcctactaat         349 to 360

Cry1Fa        NPNN        118 to 121        aatcctaataat         352 to 363

Cry1Fb        NPNN        118 to 121        aatcctaataat         352 to 363

Cry1Ga        DPNN        118 to 121        gatcctaataat         352 to 363

Cry1Gb        DPDN        118 to 121        gatcctgataac         352 to 363

Cry1Ha        SPNN        122 to 125        tctcctaataat         364 to 375

Cry1Hb        SPNN        121 to 124        tctcctaataat         361 to 372

Cry1Ia        NRNN        148 to 151        aatcgtaataac         442 to 453

Cry1Ib        NRNN        148 to 151        aatcgtaataac         442 to 453

Cry1Ic        NRNN        148 to 151        aatcgtaataac         442 to 453

Cry1Id        NRNN        148 to 151        aatcgcaataac         442 to 453

Cry1Ic        NRNN        148 to 151        aatcgcaacaac         442 to 453

Cry1Ia        DPDN        119 to 122        gatcctgataac         355 to 366

Cry1Jb        TPDN        119 to 122        actccagataac         355 to 366

Cry1Ka        NRND        145 to 148        aaccgaaatgat         433 to 444

表8.Cry1蛋白α4-α5间-螺旋环的位置和序列

蛋白质        氨基酸序列         在蛋白质上              核苷酸序列                            在基因上的位置

                                 的位置

Cry1Aa        LAVQNYQVPLL        148 to 158        ttggcagttcaaaattatcaagttcctctttta           442 to 474

              FLAVQNYQVPLL       148 to 158        tttgcagttcaaaattatcaagttcctctttta           442 to 474

Cry1Ab        FAVQNYQVPLL        148 to 158        tttgcagttcaaaattatcaagttcctctttta           442 to 474

Cry1Ac        FAVQNYQVPLL        148 to 158        tttgcagttcaaaattatcaagttcctctttta           442 to 474

              LAVQNYQVPLL        148 to 158        ttggcagttcaaaattatcaagttcctctttta           442 to 474

Cry1Ad        FTVQNYQVPLL        148 to 158        tttgcagttcaaaattatcaagtacctcttcta           442 to 474

Cry1Ae        FTVQNYQVPLL        148 to 158        tttgcagttcaaaattatcaagtacctcttcta           442 to 474

Cry1Af        FAVQNYQVPLL        148 to 158        tttgcagttcaaaattatcaagttcctctttta           442 to 474

Cry1Ag        LAVQNYQVPLL        148 to 158        ttggcagttcaaaattatcaagttcctctttta           442 to 474

Cry1Ba        FAIRNQEVPLL        167 to 177        ttcgcaattagaaaccaagaagttccattattg           499 to 531

Cry1Bb        FRIRNEEVPLL        172 to 182        ttcagaatacgaaatgaagaagttccattatta           514 to 546

Cry1Bc        FRIRNEEVPLL        172 to 182        ttcagaatacgaaatgaagaagttccattatta           514 to 546

Cry1Bd        FRIRNEEVPLL        172 to 182        ttcagaatacgaaatgaagaagttccattatta           514 to 546

Cry1Ca        FRISGFEVPLL        147 to 157        tttcgaatttctggatttgaagtacccctttta           439 to 471

Cry1Cb        FRIAGFEVPLL        147 to 157        tttcgaattgctggatttgaagtacccctttta           439 to 471

Cry1Da        FRVQNYEVALL        147 to 157        tttagagttcaaaattatgaagttgctctttta           439 to 471

Cry1Db        LRVRNYEVALL        147 to 157        ttaagagttcgtaattatgaagttgctctttta           439 to 471

Cry1Ea        LFSVQNYQVPFL       145 to 156        cttttttcagttcaaaattatcaagtcccattttta        433 to 468

Cry1Eb        LFSVQGYEIPLL       144 to 155        cttttttcagttcaaggttatgaaattcctctttta        430 to 465

Cry1Fa        NFTLTSFEIPLL       145 to 156        aattttacacttacaagttttgaaatccctctttta        433 to 468

Cry1Fb        NFTLTSFEIPLL       145 to 156        aattttacacttacaagttttgaaatccctctttta        433 to 468

Cry1Ga        TLAIRNLBVVNL       145 to 156        actttggcaattcggaatcttgaggtagtgaattta        433 to 468

Cry1Gb        LMAIPGFELATL       145 to 156        cttatggcaattccaggttttgaattagctacttta        433 to 468

Cry1Ha        LREQGFEIPLL        150 to 160        ctgagagaacaaggctttgaaattcctctttta           448 to 480

Cry1Hb        LREQGFEIPLL        149 to 159        ctgagagaacagggctttgaaattcctctttta           445 to 477

Cry1Ia        FAVSGEEVPLL        176 to 186        tttgcagtgtctggagaggaggtaccattatta           526 to 558

Cry1Ib        FAVSGEEVPLL        176 to 186        tttgcagtatctggtgaggaagtaccattatta           526 to 558

Cry1Ic        FAVSGEEVPLL        176 to 186        tttgcagtatctggtgaggaagtaccattatta           526 to 558

Cry1Id        FAVSGEEVPLL        176 to 186        tttgcagtttctggagaagaggtgccgctatta           526 to 558

Cry1Ie        FAVSGEEVPLL        176 to 186        tttgcagtatcaggtgaggaagtaccattattg           526 to 558

Cry1Ja        FRIIGFEVPLL        147 to 157        tttcggataattggatttgaagtgccactttta           439 to 471

Cry1Jb        FRIPGFEVPLL        147 to 157        tttcggattcccggatttgaagtgccacttcta           439 to 471

Cry1Ka        FSIRNEEVPLL        173 to 183        ttcagcatacgaaacgaagaggttccattatta           517 to 549

表9.Cry1蛋白α5-α6间-螺旋环的位置和序列

蛋白质        氨基酸序列        在蛋白质上           核苷酸序列                  在基因上的位置

                                的位置

Cry1Aa         FGQRWGFD         178 to 185        tttggacaaaggtggggatttgat        532 to 555

Cry1Ab         FGQRWGFD         178 to 185        tttggacaaaggtggggatttgat        532 to 555

Cry1Ac         FGQRWGFD         178 to 185        tttggacaaaggtggggatttgat        532 to 555

Cry1Ad         FGQRWGFD         178 to 185        tttggacaacgttggggatttgat        532 to 555

Cry1Ae         FGQRWGLD         178 to 185        tttggacaacgttggggacttgat        532 to 555

Cry1Af         CGQRSGFD         175 to 182        tgtggacaaaggtcgggatttgat        523 to 546

Cry1Ag         FGQRWGFD         178 to 185        tttggacaaaggtggggatttgat        532 to 555

Cry1Ba         FGSEFGLT         197 to 204        tttggtagtgaatttgggcttaca        589 to 612

Cry1Bb         FGSEWGMA         202 to 209        tttggtagtgaatgggggatggca        604 to 627

Cry1Bc         FGSEWGMA         202 to 209        tttggtagtgaatgggggatggca        604 to 627

Cry1Bd         FGSEWGMA         202 to 209        tttggtagtgaatgggggatggca        604 to 627

Cry1Ca         FGERWGLT         177 to 184        tttggagaaagatggggattgaca        529 to 552

               FGERWGVT         177 to 184        tttggagaaagatggggagtgaca        529 to 552

Cry1Cb         FGARWGLT         177 to 184        tttggagcaagatggggattgaca        529 to 552

Cry1Da         FGERWGYD         177 to 184        ttcggagaaagatggggatatgat        529 to 552

Cry1Db         YGQRWGFD         177 to 184        tacggtcagagatggggctttgac        529 to 552

Cry1Ea         FGQAWGFD         176 to 183        tttgggcaggcttggggatttgat        526 to 549

Cry1Eb         FGQRWGFD         175 to 182        tttggacaacgttggggatttgat        523 to 546

Cry1Fa         FGQGWGLD         176 to 183        tttgggcagggttggggactggat        526 to 549

Cry1Fb         FGQGWGLD         176 to 183        tttgggcagggttgggggctggat        526 to 549

Cry1Ga         FGERWGLT         176 to 183        tttggagaaagatggggattaaca        526 to 549

Cry1Gb         FGERWGLT         176 to 183        tttggggagagatggggattgaca        526 to 549

Cry1Ha         FGQRWGLD         180 to 187        tttgggcaaagatggggacttgac        538 to 561

Cry1Hb         FGQRWGLD         179 to 186        tttggacagagatggggacttgat        535 to 558

Cry1Ia         FGKEWGLS         206 to 213        tttggaaaagagtggggattatca        616 to 639

Cry1Ib         FGKEWGLS         206 to 213        tttggaaaagaatggggattatca        616 to 639

Cry1Ic         FEKNGGLS         206 to 213        tttgaaaagaatgggggattatca        616 to 639

Cry1Id         FGKEWGLS         206 to 213        tttggaaaagaatggggattgtca        616 to 639

Cry1Ie         FGKEWGLS         206 to 213        tttggaaaagagtggggattatct        616 to 639

Cry1Ja         FGERWGLT         177 to 184        tttggagagagatggggattgacg        529 to 552

Cry1Jb         FGERWGLT         177 to 184        ttcggagagagatggggattgacg        529 to 552

Cry1Ka         FGSEWGMS         203 to 210        tttggtagtgaatgggggatgtca        607 to 630

表10.Cry1蛋白中α6-α7间-螺旋环的定位和序列

蛋白质      氨基酸序列     在蛋白质上           核苷酸序列              在基因上的位置

                           的位置

Cry1Aa        VWGPD        218 to 222        gtatggggaccggat            652 to 666

Cry1Ab        VWGPD        218 to 222        gtatggggaccggat            652 to 666

Cry1Ac        VWGPD        218 to 222        gtatggggaccggat            652 to 666

Cry1Ad        VWGPD        218 to 222        gtatggggaccggat            652 to 666

Cry1Ae        VWGPD        218 to 222        gtatggggaccggat            652 to 666

Cry1Af        VWGPD        215 to 219        gtatggggaccggat            643 to 657

Cry1Ag        VWGPD        218 to 222        gtatggggaccggat            652 to 666

Cry1Ba        LRGTN        237 to 241        ttgagagggacaaat            709 to 723

Cry1Bb        LRGTN        242 to 246        ttaagagggacaaat            724 to 738

Cry1Bc        LRGTN        242 to 246        ttaagagggacaaat            724 to 738

Cry1Bd        LRGTN        242 to 246        ttaagagggacaaat            724 to 738

Cry1Ca        LPKST        217 to 221        ttaccgaaatctacg            649 to 663

Cry1Cb        LPKST        217 to 221        ttaccaaaatctacg            649 to 663

Cry1Da        LEGRF        217 to 221        ttggaaggtcgtttt            649 to 663

Cry1Db        LEGSR        217 to 221        ttagagggatctcga            649 to 663

Cry1Ea        LPRTGG       216 to 221        ttaccacgaactggtggg         646 to 663

Cry1Eb        LPRNEG       215 to 220        ttaccacgtaatgaaggg         643 to 660

Cry1Fa        LRGTNT       216 to 221        ttaagaggtactaatact         646 to 663

Cry1Fb        LRGTNT       216 to 221        ttaagaggtactaatact         646 to 663

Cry1Ga        IGGIS        216 to 220        attggagggataagt            646 to 660

Cry1Gb        LNVIR        216 to 220        ttaaatgttataaga            646 to 660

Cry1Ha        FGGVS        220 to 224        tttggtggtgtgtca            658 to 672

Cry1Hb        FGVVT        219 to 223        tttggtgttgtaaca            655 to 669

Cry1Ia        LRGTN        246 to 250        ttgaggggtacaaat            736 to 750

Cry1Ib        LRGTN        246 to 250        ttgaggggtacaaat            736 to 750

Cry1Ic        LRATN        246 to 250        ttgagggctacaaat            736 to 750

Cry1Id        LRGTN        246 to 250        ttgaggggaacaaat            736 to 750

Cry1Ie        LRGTN        246 to 250        ttgagaggtacaaat            736 to 750

CryIJa        LGFRS        217 to 221        ctagggtttagatct            649 to 663

Cry1Jb        LGFTS        217 to 221        ctagggtttacttct            649 to 663

Cry1Ka        LRGTT        243 to 247        ttaagagggacaact            727 to 741

表11.Cry3，Cry4，Cry7，Cry8，Cry9，Cry10，Cry16，Cry17，Cry19和Cry20蛋白中α3-α4间-螺旋环的定位和序列

蛋白质        氨基酸序列       在蛋白质上           核苷酸序列                      在基因上的位置

                               的位置

Cry3Aa         NPVSSRN         153 to 159       aatcctgtgagttcacgaaat                 457 to 177

Cry3Ba         APVNLRS         154 to 160       gcgcctgtaaatttacgaagt                 460 to 180

Cry3Bb         TPLSLRS         154 to 160       acacctttaagtttgcgaagt                 460 to 180

Cry3Ca         TPLTLRD         151 to 157       actcctttgactttacgagat                 451 to 471

Cry4Aa         NNPNPQNTQD      160 to 169       aataatccaaacccacaaaatactcaggat        478 to 507

Cry4Ba         EPNNQSYRTA      136 to 145       gagcctaataaccagtcctatagaacagca        406 to 435

Cry7Aa         KQDDPEAILS      147 to 156       aaacaagatgatccagaagctatactttct        439 to 468

Cry7Ab         NPDDPATITR      147 to 156       aatcctgatgatccagcaactataacacga        439 to 468

Cry8Aa         NRNDARTRSV      158 to 167       aatcgcaatgatgcaagaactagaagtgtt        472 to 501

Cry8Ba         NPNGSRALRD      159 to 168       aatccaaatggttcaagagccttacgagat        475 to 504

Cry8Ca         NPHSTRSAAL      159 to 168       aacccacacagtacacgaagcgcagcactt        475 to 504

Cry9Aa         NPNSASAEEL      146 to 155       aatcctaattctgcttctgctgaagaactc        436 to 465

Cry9Ba         RPNGVRANLV      134 to 143       agaccaaacggcgtaagagcaaacttagtt        400 to 429

Cry9Ca         DRNDTRNLSV      159 to 168       gatcgaaatgatacacgaaatttaagtgtt        475 to 504

Cry9Da         RPNGARASLV      159 to 168       agaccaaatggcgcaagggcatccttagtt        475 to 504

Cry9Ea         RPNGARANLV      159 to 168       agaccgaacggagcaagagctaacttagtt        475 to 504

Cry10Aa        ARTHANAKAV      162 to 171       gcacgtacacacgctaatgctaaagcagta        484 to 513

Cry16Aa        NYNPTSIDDV      109 to 118       aattataatccaacttctatagacgatgta        325 to 354

Cry17Aa        NKDDPLAIAEL     127 to 137       aataaagatgaccccttggctatagctgaatta     379 to 411

Cry19Aa        DPKSTGNLSTL     159 to 169       gatccaaaatctacaggtaatttaagcacctta     475 to 507

Cry19Ba        NKNNFASGEL      151 to 160       aataaaaataatttcgcaagtggtgaactt        451 to 480

Cry20Aa        ERNRTRENGQ      141 to 150       gaacgtaatagaactcgtgaaaacggacaa        421 to 450

表12.Cry3，Cry4，Cry7，Cry8，Cry9，Cry10，Cry16，Cry17，Cry19和Cry20蛋白中α4-α5间-螺旋环的定位和序列

蛋白质      氨基酸序列                在蛋白质上           核苷酸序列                                     在基因上的位置

                                      的位置

Cry3Aa        ISGYEVL                 186 to 192       atttctggatacgaggttcta                                 556 to 576

Cry3Ba        VSKFEVL                 187 to 193       gtttccaaattcgaagttctg                                 559 to 579

Cry3Bb        VSKFEVL                 187 to 193       gtttccaaattcgaagtgctg                                 559 to 579

Cry3Ca        VSGYEVL                 184 to 190       gtctctggatacgaagttcta                                 550 to 570

Cry4Aa        LVNSCPPNPSDCDYYNILVL    188 to 207

              cttgtaaactcttgtcctcctaatcctagtgattgcgattactataacatactagtatta                                   562 to 621

Cry4Ba        FSNLVGYFLLL             164 to 175       tttagcaacttagtaggttagaattattgttatta                   490 to 525

Cry7Aa        FKVTGYEIPLL             175 to 185       tttaaggttactggatatgaaataccattacta                     523 to 555

Cry7Ab        FRVAGYELPLL             175 to 185       tttagggttgctggatatgaaataccattacta                     523 to 555

Cry8Aa        FAVSGHEVLLL             186 to 196       tttgcagtatccggacacgaagtactattatta                     556 to 588

Cry8Ba        FRVTNFEVPFL             187 to 197       tttcgagtgacaaattttgaagtaccattcctt                     559 to 591

Cry8Ca        FSQTNYETPLL             187 to 197       ttttctcaaacgaattatgagactccactctta                     559 to 591

Cry9Aa        LTNGGSLARQNAQILLL       175 to 191       ttaacgaatggtggctcgttagctagacaaaatgcccaaatattattatta   523 to 571

Cry9Ba        FGSGPGSQRFQAQLL         161 to 175       tttggtagtggccctggaagtcaaaggtttcaggcacaattgttg         481 to 525

Cry9Ca        FAVNGQQVPLL             187 to 197       tttgcagtaaatggacagcaggttccattactg                     559 to 591

Cry9Da        FGSGPGSQNYATILL         186 to 200       tttggctctggtcctggaagtcaaaattagtcaactatattactt         556 to 600

Cry9Ea        FGTGPGSQRDAVALL         186 to 200       tttggtacgggtcctggtagtcaaagagatgcggtagcgttgttg         556 to 600

Cry10Aa       LKNNASYRIPTL            189 to 200       ttaaaaaataatgctagctatcgaataccaacactc                  565 to 600

Cry16Aa       FKVKNYEVTVL             136 to 146       tttaaggttaaaaattatgaagtaacagtgtta                     406 to 438

Cty17Aa       FKRANYEVLLL             155 to 165       tttaaaagggcgaattatgaagtcttactatta                     463 to 495

Cry19Aa       VNNQGSPGYELLLL          187 to 200       gttaataatcaggggagtccaggttatgagttacttttattg            559 to 600

Cry19Ba       FSLGGYETVLL             180 to 190       ttctcattaggaggttatgaaacagtattatta                     538 to 570

Cry20Aa       LSRRGFETLLL             173 to 183       ctttctcgcagaggattcgaaactctttatta                      517 to 549

表13.Cry3，Cry4，Cry7，Cry8，Cry9，Cry10，Cry16，Cry17，Cry19和Cry20蛋白中α5-α6间-螺旋环的定位和序列

蛋白质      氨基酸序列         在蛋白质上            核苷酸序列                               在基因上的位置

                               的位置

Cry3Aa       GEEWGYE           215 to 221       ggagaagaatggggatacgaa                         643 to 663

Cry3Ba       GEEWGYS           216 to 222       ggagaagaatggggatattct                         646 to 666

Cry3Bb       GEEWGYS           216 to 222       ggagaagaatggggatattct                         646 to 666

Cry3Ca       GTDWGYS           213 to 219       ggaacggattggggatattct                         637 to 657

Cry4Aa       FEAYLKNNRQFDYLE   227 to 241

                               tttgaagcgtatttaaaaaacaatcgacaattcgattatttagag                  679 to 723

Cry4Ba       LINAQEWSL         193 to 201       ctcataaatgcacaagaatggtcttta                   577 to 603

             PHKCTRMVY         193 0  201       cctcataaatgcacaagaatggtctat                   577 to 603

Cry7Aa       GDKWGF            206 to 211       ggagataaatggggattc                            616 to 633

             GDKWEF            206 to 211       ggagataaatgggaattc                            616 to 633

Cry7Ab       GDKWGF            206 to 211       ggagataaatggggattc                            616 to 633

Crt8Aa       GEEWGF            217 to 222       ggagaagagtggggattt                            649 to 666

Cry8Ba       GEEWGL            218 to 223       ggagaagaatggggattg                            652 to 669

Cry8Ca       GKEWGY            218 to 223       gggaaggaatggggatat                            652 to 669

Cry9Aa       RYGTNWGL          210 to 217       agatatggcaccaattgggggcta                      628 to 651

Cry9Ba1      KYGARWGL          194 to 201       aagtatggggcaagatggggactc                      580 to 603

Cry9Ca       LFGEGWGF          216 to 223       ctttttggagaaggatggggattc                      646 to 669

Cry9Da       IYGARWGL          219 to 226       atttatggagctagatgggggctg                      655 to 678

Cry9Ea       IYGARWGL          219 to 226       atctatggggcaagatggggactt                      655 to 678

Cry10Aa      TYYNIWLQ          219 to 226       acctattacaatatatggctgcaa                      655 to 678

Cry16Aa      IYGDAWNLYRELGP    165 to 178       atttatggagatgcatggaatttatatagagaattaggattt    493 to 534

Cry17Aa      LLNKVIDNF         184 to 192       cttttaaataaagttatagataatttt                   550 to 576

Cry19Aa      IYGDKWWSA         219 to 227       atttatggagataaatggtggagcgca                   655 to 681

Cry19Ba      IYGKELG           209 to 215       atttacggaaaagaattagga                         625 to 645

Cry20Aa      LYRNQWL           202 to 208       ctttatagaaatcaatggtta                         604 to 624

表14.Cry3，Cry4，Cry7，Cry8，Cry9，Cry10，Cry16，Cry17，Cry19和Cry20蛋白中α6-α7间-螺旋环的定位和序列

蛋白质       氨基酸序列      在蛋白质上        核苷酸序列                  在基因上的位置

                             的位置

Cry3Aa          RGSS          255 to 258       agaggttcatct                763 to 774

Cry3Ba          RGST          256 to 259       agaggttcaact                766 to 777

Cry3Bb          RGST          256 to 259       agaggttcaact                766 to 777

Cry3Ca          RGST          253 to 256       agaggttcgact                757 to 768

Cry4Aa          LIKTTPD       274 to 280       ttaattaaaacgacgcctgat       820 to 840

Cry4Ba          LRNKS         235 to 239       cttagaaataaatct             703 to 717

Cry4Aa          LNGST         245 to 249       ttgaacggttccact             433 to 747

Cry7Ab          LNGST         245 to 249       ttgaacggttccact             733 to 747

Cry8Aa          LKGTT         256 to 260       ttgaaaggtaccact             766 to 780

Cry8Ba          LKGSS         257 to 261       ttaaaaggctcgagc             769 to 783

Cry8Ca          LRGTG         257 to 261       ttaagaggaacgggt             769 to 783

Cry9Aa          LRQRGTS       252 to 258       ctaagacaacgaggcactagt       754 to 774

Cry9Ba1         LRGTS         236 to 240       ttacgaggaacgagc             706 to 720

Cry9Ca          LRGTN         257 to 261       ttaagaggaacaaat             769 to 783

Cry9Da          LRGTT         260 to 264       ttaagaggcacaacc             778 to 792

Cry9Ea          VRGTN         260 to 264       gtaagaggaacaaat             778 to 792

Cry10Aa         IRTNT         267 to 271       attagaactaatact             799 to 813

Cry16Aa         LKLDPN        210 to 215       ttaaaactagatccgaat          628 to 645

Cry17Aa         IKNKTRDF      224 to 231       ataaaaaataaaactagggatttt    670 to 693

Cry19Aa         FRTAG         261 to 265       tttagaacagcaggt             781 to 795

Cry19Ba         KKQIG         250 to 254       aaaaaacaaatagga             748 to 762

Cry20Aa         DRSS          245 to 248       gatcgttcaagt                733 to 744

基于实施例1、2和3的模型，可制备该实施例提到的各个cry基因的突变体。用来进行诱变的技术方法与实施例1、2和3给出的方法相似。

实施例5：整体增加Cry蛋白中亮氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸的含量

下面描述了对Cry9Ca1毒素整体增加Cry蛋白中亮氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸的含量。尽管该实施例是对Cry9Ca1蛋白和cry9Ca1基因进行的，它也可用于所有的Cry毒素和所有的cry基因。该技术特别适用于所有的Cry毒素，其序列是已知的并可在Genbank数据库中找到：

http：//www.ncbi.nlm.bih.gov/Genbank/index.html。

cry基因的Genbank登录号可从以下地址获得：

http：//www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil Crickmore/Bt/index.html

该技术还可用于所有的Cry毒素和cry基因，其序列未在Genbank中揭示。

不同于实施例1-4中所述的方法，其目的不是要修饰该毒素的精确区域以整合被胃蛋白酶识别的氨基酸，而是要通过增加亮氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸在所述毒素中的数量来整体增加这些位点的数量。该策略通过增加胃蛋白酶识别的残基的百分比能够使Cry毒素对胃蛋白酶更加敏感。谷氨酸(E-Glu)优选替代天冬氨酸(D-Asp)，苯丙氨酸(F-Phe)优选替代色氨酸(W-Trp)，亮氨酸(L-Leu)优选替代缬氨酸(V-Val)或异亮氨酸(I-Ile)。该策略需要产生活化的Cry9Ca1毒素的三维模型，这是通过与CrylAa1和Cry3Aa1的三维结构进行对比从该蛋白的一级序列产生的。该模型是用Swiss型蛋白模拟服务器(Swis-Model Protein ModellingServer)(Peitsch，1995；Peitsch，1996；Guex和Peitsch，1997)产生的。服务器地址如下：

( http：//www.expasy.ch/swissmod/swiss-model.html)。

优选地，取代的最大水平为25％。活化的Cry9Ca1毒素含有31个天冬氨酸，9个色氨酸和47个缬氨酸。有天然的26个谷氨酸，35个苯丙氨酸和62个亮氨酸。考虑各个氨基酸的最大取代为25％，相对比例如下：

氨基酸     天然Cry9Ca1中的残基数      修饰的Cry9Ca1中的残基数

Asp(D)              31                             24

Glu(E)              26                             33

Trp(W)              9                              7

Phe(F)              35                             37

Val(V)              47                             36

Leu(L)              61                             72

还可设想用亮氨酸取代异亮氨酸(I-Ile)来代替用亮氨酸取代缬氨酸，或者除用亮氨酸取代缬氨酸外。在Cry9Ca1毒素中有天然的27异亮氨酸。考虑到优选地取代程度为25％，则足以用亮氨酸取代6异亮氨酸残基。

可按如下所示修饰cry9Ca1基因的序列。以下实验的唯一目的就是例证该实施例，而不是要限制本发明的范围。该例证涉及天冬氨酸，苯丙氨酸和缬氨酸残基的替代。那些精通此领域的技术人员能够很容易地将此方法用于任何其它cry基因，序列或许已知，尤其是获自Genbank的序列，其登录号如下：

http：//www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil Crickmore/Bt/index.html

通常在转基因植物中表达的cry基因是截短的基因，即只有编码活化的毒素的基因序列被引入这些植物。在此实施例中所给的序列相应于此截短的形式，并且，根据它是基因还是蛋白，从起始密码子或从第一个甲硫氨酸第15个密码子或保守性嵌段5的氨基酸下游，该嵌段限制活化的毒素。

天然的和截短的cry9Ca1基因的序列列于SEQ ID No.1中。

天然的和截短的Cry9Ca1蛋白的序列列于SEQ ID No.2中。

在图1(SEQ ID No.9)中给出了修饰的cry9Ca1基因的序列，其中所有编码缬氨酸，谷氨酸和苯丙氨酸残基的密码子都被修饰。这种修饰的序列可作为基础以定义可使用的各种诱变寡核苷酸。被修饰的碱基以黑体表示。

在图2(SEQ ID No.10)中给出了修饰的Cry9Ca1蛋白的序列，其中所有缬氨酸，谷氨酸和苯丙氨酸残基都被修饰，被修饰的氨基酸以黑体表示。

所有可进行缬氨酸，苯丙氨酸和谷氨酸残基取代的诱变寡核苷酸列在图3(SEQID No.94-160)中。被修饰的碱基以黑体表示。

用某些寡核苷酸产生修饰的cry9Ca1基因，其中根据编码缬氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸残基的密码子进行取代的可能性达25％，这是以例举的方式说明的。这种例举的目的只是要例证所开发的方案而不是限制本发明的范围。根据该实施例和图1-3(SEQ ID Nos.9和10)，那些精通此领域的技术人员能够修改图5(SEQ IDNos.94-160)所示寡核苷酸的其它组合或按相同原则制备的其它寡核苷酸，尤其是替代异亮氨酸残基。

通过用多达25％的编码缬氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸残基的密码子取代修饰cry9Ca1基因的序列列于图4(SEQ ID No.11)。被修饰的碱基用黑体表示。

通过用多达25％的编码缬氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸残基的密码子取代修饰Cry9Ca1蛋白的序列列于图5(SEQ ID No.12)。被修饰的氨基酸用黑体表示。

在图4(SEQ ID No.11)中给出了修饰的cry9Ca1基因的产生，其中25％的缬氨酸苯丙氨酸和谷氨酸密码子被修饰，并在图5(SEQ ID Nos.94-160)给出的序列中用以下寡核苷酸进行修饰：

寡核苷酸No.60

寡核苷酸No.62

寡核苷酸No.67

寡核苷酸No.72

寡核苷酸No.77

寡核苷酸No.78

寡核苷酸No.80

寡核苷酸No.82

寡核苷酸No.83

寡核苷酸No.88

寡核苷酸No.90

寡核苷酸No.92

寡核苷酸No.96

寡核苷酸No.97

寡核苷酸No.103

寡核苷酸No.111

优选使用的方法是用上面提到的寡核苷酸的混合物进行多诱变。定点诱变方法与实施例1的描述类似，唯一的不同在于在此实施例中使用了诱变寡核苷酸的混合物，而在实施例1中使用了单个诱变寡核苷酸。所用方法描述在实施例1-4中。通常对每个诱变系列而言，只有抑制/恢复抗生素抗性的诱变寡核苷酸和寡核苷酸发生了变化。

实施例6：在苏云金芽孢杆菌中产生修饰的Cry蛋白和纯化

天然和修饰的基因以及它们的启动子和终止子序列被插入大肠杆菌-苏云金芽孢杆菌pHT3101穿梭载体(Lereclus等，1989)。

质粒DNA是按照碱裂解技术(Birboim和Doly，1979)用小量制备(minipreparation)制备的。每个细菌集落于37℃在添加有适当抗生素的2ml LB培养基中振荡培养过夜(200rpm)。然后将培养物转移到微量管中，然后在13500g离心5分钟。除去上清后，将细菌重悬于100μl 25mM Tris-HCl(pH 8)和10mM EDTA的溶液中，该溶液含有最终浓度为100μg/ml的Rnase A。加入200μl含有1％SDS的0.2M的NaOH溶液，并通过颠倒微量管混合悬液再次。加入150μl 2.55M的乙酸钾溶液(pH 4.5)并将悬液在冰中培育5分钟。在13500g离心15分钟后，将上清转移到含有1ml冷乙醇的微量管中。在13500g离心30分钟后，除去上清并用1ml 70％乙醇洗涤沉淀。在真空下将含有DNA的沉淀干燥数分钟，然后加到50μl无菌蒸馏水中。然后将样品置于65℃ 30分钟。

对最终体积为20μl的1μg DNA进行限制性内切酶消化，对每种酶供应商建议在占终体积的10X缓冲液的十分之一的情况下，并使用5个单位的酶。对酶在最佳温度下反应2-3小时。

用小牛肠碱性磷酸酶作为限制性酶进行5’末端的去磷酸化。在50μl的终体积中，每μg DNA用5μl 10X去磷酸化缓冲液(500mM Tris-Hcl，pH 9.3，10mM MgCl₂，1mM ZnCl₂和10mM亚精胺)和1单位酶进行反应。在突出5’末端情况下反应在37℃进行1小时，在平端或3’突出端情况下则在55℃进行1小时。去磷酸化后，然后在65℃将酶钝化30分钟，然后对每体积提取物用两体积苯-氯仿-异戊醇(25-24-1)的混合物除去。然后用T4噬菌体DNA连接酶形成连接。它们是用相当于100ng的载体量进行的，且插入片段/载体的摩尔比在5和10之间。反应物的最终体积为30μl，并含有3μl 10X连接缓冲液(300mM Tris-Hcl，pH 7.8，100mMMgCl₂，100mM DTT和10mM ATP)和3单位的酶。反应物在14℃培育过夜。

按照Lereclus等在1989年描述的方法将此构建物插入苏云金芽孢杆菌的acrystalliferous菌株，该方法在其它地方也有描述(Rang等，1999，2000)。将acrystalliferous苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种(Bacillus thuringiensissubsp.kurstaki)HD-1的预培养物于37℃ 10ml BHI培养基(Difco)中振荡培养过夜。然后将5ml预培养物接种在250ml BHI培养基中并于37℃振荡培养，直到培养物在600nm的OD值达到0.3。然后将培养物在4℃以1000g离心10分钟。除去上清并用50ml冷的无菌蒸馏水洗涤细菌沉淀。然后在4℃再以1000g离心细菌10分钟。取出沉淀放在4ml冷的无菌40％PEG-6000溶液中，该溶液置于冰中。然后将200μl细菌与5μg质粒混合，然后放置在直径为0.2cm的电穿孔小池中。然后将小池放在电穿孔室中，并使用相当于以下参数的电流：2.5kV，1000Ω，25μF。然后回收细菌，将其在冰中放置10分钟，然后加到2ml BHI培养基中并于37℃振荡培养90分钟。然后将200μl培养物铺在培养皿中，该培养皿中含有常规的添加有终浓度为25μg/ml的红霉素的固体培养基(IEBC，1994)，并在28℃培育过夜。

将表达天然基因或突变基因的苏云金芽孢杆菌的重组菌株培养在250ml常规的培养基中，该培养基中含有25μg/ml红霉素，并在28℃振荡。用相差光学显微镜观察细菌生长的变化。让细菌生长到孢子形成后细菌溶胞。然后将培养物在5000g离心10分钟。用25ml 1M NaCl洗涤沉淀，悬液在5000g再离心10分钟。然后取出沉淀放入15ml含有1mM PMSF的无菌蒸馏水中，在冰中培育，并用超声波(100W)处理1分钟，以分散孢子和晶体之间的聚集物。然后将悬液加到不连续的NaBr梯度中，该梯度是由4ml浓度为38.5％的一个层，6ml浓度为41.9％、45.3％，48.9％和52.7％的四个层以及3ml浓度为56.3％一个层构成的。然后将此梯度在20℃以20000g离心90分钟。根据密度不同，悬液的各种组分(孢子、细胞碎片、伴孢体)在此梯度中处于不同水平。回收各条带并用一体积无菌蒸馏水洗涤三次。用相差光学显微镜观察各条带。将含有包含体的部分以含有1mM PMSF的无菌蒸馏水形式贮存于-20℃供以后分析。

实施例7：该蛋白对蛋白酶的稳定性分析

所进行的第一个稳定性分析是确定对胰蛋白酶的稳定性。将伴孢包含体中存在的蛋白于37℃在溶解缓冲液(50mM Na₂CO₃，pH 10.8，14.6mM 2-巯基乙醇)中增溶1小时。然后将悬液在14000g离心10分钟以除去不溶物。然后在上清液中加入占总体积十分之一0.05％的胰蛋白酶，并将混合物在37℃培育2小时。按照Laemmli法(1970)，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶分析确定胰蛋白酶处理后蛋白质的状况。由于SDS的存在，它使所有的蛋白质都带上了负电荷，该技术使得蛋白质根据其分子量被分离。首先通过加入一体积2X处理液(125mM Tris-HCl，20％甘油，4％SDS，10％2-巯基乙醇，0.01％溴酚蓝)处理样品，然后在沸水中变性5分钟。然后将样品置于凝胶上并首先通过第一浓缩胶，浓缩胶是由4％丙烯酰胺-双丙烯酰胺混合物，0.1％SDS和125mM Tris-HCl，pH 6.8构成的。然后样品通过分离胶，分离胶是由12％丙烯酰胺-双丙烯酰胺，0.1％SDS和375mM Tris-HCl，pH 8.8构成的，它可将各种蛋白质按照其大小分离。然后在迁移缓冲液(25mM Tris-HCl，pH 8.3，192mM甘氨酸，0.1％SDS)中在100V下进行电穿孔，直到溴酚蓝离开凝胶。然后凝胶用含有0.025％考马斯蓝的40％甲醇-7％乙酸的溶液染色1小时，再用50％甲醇-10％乙酸溶液褪色。最终将凝胶固定在5％甲醇-7％乙酸溶液中。

第二次分析是确定对昆虫消化液的稳定性。用阴离子交换柱(Q-Sepharose)通过FPLC(Pharmacia)纯化胰蛋白酶-稳定的毒素，该柱用40mM Na₂CO₃溶液，pH 10.7平衡。然后用50-500mM的NaCl溶液进行梯度洗脱。测量组分在280nm的OD值，然后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析含有蛋白质的组分。将含有毒素的组分合并并在4℃用蒸馏水透析约48小时，直至蛋白质沉淀。然后将蛋白质悬液在4℃以8000g离心30分钟。将沉淀中含有的毒素重悬于蒸馏水中并按Bradford(1976)的方法分析。然后将它们等分成100μg，冻干并贮存于4℃。在使用前，将毒素溶解并用25mM Tris，pH 9.5使其浓度达到10mg/ml，以测试它们对玉米螟(Ostrinianubilalis)幼虫消化液的稳定性。玉米螟幼虫的消化液可用Ogiwara等(1992)的方法通过电击诱导反胃而获得，或按照Baines等(1994)所述的方法通过解剖幼虫并用移液管收集肠液获得。这两种情况都需要100-200只幼虫来收集消化液。使用前，将收集的液体在4℃以15000g离心15分钟。用Bradford法(BioRad)测定消化液的蛋白质浓度。以毒素与消化液为1∶1的比例(基于消化液的蛋白质浓度)在37℃反应15分钟。用混有等体积2X处理液(125mM Tris-HCl，20％甘油，4％SDS，10％2-巯基乙醇，0.01％溴酚蓝)的蛋白酶抑制剂(Protease InhibitorsSet，Roche Diagnostics)的混合物终止反应，然后在沸水中培育5分钟。然后按照上述方法通过SDS-PAGE分析蛋白质，以确定它们对幼虫消化液的抗性和它们可能的降解状态。

所进行的最后类型的稳定性分析是对胃蛋白酶的稳定性。冻干的天然毒素和修饰的毒素被溶解于模拟哺乳动物胃液并含有0.32％胃蛋白酶的胃缓冲液(0.5mgNaCl，1.75ml 1M HCl，于250ml水中，pH 2.0)。在37℃培育0，5，15，60和240分钟后移去样品，然后如上所述用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。这些情况与EPA(美国环保署)No.4458108所描述的情况相同。

通过这一系列分析可以知道天然和突变蛋白的保存状态，因此可知道它们对昆虫中存在的各种蛋白酶(胰蛋白酶和消化液)的稳定性，从而确定突变的蛋白在昆虫中可有效保存其稳定性。这些分析还可以证明，突变的蛋白在与哺乳动物的胃类似的条件下可被胃蛋白酶有效地降解。

实施例8：杀虫特性的分析

对杀虫特性的分析是通过两种类型的实验进行的，以测试昆虫中毒性处理的两个步骤：受体位点识别和体内毒性评价。

毒素对受体位点亲和性的分析是用以碘125(¹²⁵I)放射性标记的毒素进行的。将FPLC纯化并冻干的活化毒素置于存储缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 8.6)，然后通过SDS-PAGE分析以确定其状况。用Bradford法(1976)分析等分的部分。然后用氯胺-T法(Markwell，1982)将毒素碘化。将25μg毒素和0.25mCi Na-¹²⁵以及溶于50μl碳酸钠缓冲液(50mM Na₂CO₃，pH 10)的“碘珠”(Iodo-bead)(Pierce)在室温培育5分钟。然后在用CBS缓冲液(50mM Na₂CO₃，pH 10.8，150mM NaCl)平衡的葡聚糖脱盐柱(Pierce)的表面进行碘化反应以除去游离的碘。通过SDS-PAGE和放射自显影鉴定标记和蛋白质的量。标记的毒素的平均比活度为100000cpm/pmol。

为制备刷状缘膜小泡(BBMV)，进行了毒素对受体的亲和性的研究，让昆虫生长到最后幼虫阶段。所用昆虫是玉米螟，但此方法可用于任何昆虫种类。使用其它昆虫需要生产条件和营养培养基适合各个品种，这可由精通此领域的技术人员简单完成。在部分化学的人工营养培养基上产生玉米螟(Lewis和Lynch，1969；Reed等，1972；Ostlie等，1984)。用来产生玉米螟幼虫的方法如Huang等(1997)描述。在128孔平板(Bio-Ba-128，C-D International)上单独产生幼虫。各个孔含有2ml人工培养基。10天后，将幼虫转移到大的平皿(直径18.4cm，高7.6cm)，其中含有300ml人工营养培养基。放入褶皱的纸板内以便于蛹化。在幼虫阶段，产生细胞的温度为用恒定光(24小时)保持在25℃。将含有蛹的纸板放到屏蔽笼子中以便于产生成虫。放入蜡纸以接收卵。取出卵并保存在15℃。在25℃和75％相对湿度下产生成虫，光照期为14小时。

为测试毒素对受体位点的亲和性，在5龄幼虫阶段的开始收集幼虫，并将其禁食6小时。然后将它们在冰中放置5分钟。解剖幼虫并取出消化管。将解剖的消化管每组分20个，置于含有MET缓冲液(300mM甘露醇，5mM EGTA，17mM Tris-HCl，pH 7.5)的冷冻管中，在液氮中冷冻并贮存于-80℃。

根据差异的镁沉淀法(Wolfersberger等，1987；Nielsen-LeRoux和Charles，1992)制备BBMV。将BBMV放入TBS缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 8.5，150mM NaCl)，并通过Bradford法用Biorad试剂盒测定总蛋白浓度，用牛血清白蛋白(BSA)作为标准品(Bradford，1976)。

在1.5ml聚乙烯微量管中进行体外受体识别测定，其中装有20mM磷酸钠缓冲液，pH 7.4，含有0.15M NaCl和0.1％牛血清白蛋白(PBS/BSA)。测定进行两份，在室温，总体积为100μl，用10μg BBMV蛋白。在室温以14000g离心10分钟将附着于BBMV的毒素分离。各样品的沉淀，含有附着于膜的毒素，用200μl冷的PBS/BSA缓冲液(20mM Tris/HCl，150mM NaCl，0.1％BSA，pH 8.5)洗涤两次，然后离心。将沉淀最终重悬于200μl PBS/BSA缓冲液，并加到3ml装在闪烁瓶中的HiSafe 3闪烁混合物(scintillant cocktail)(Pharmacia)中。用液体闪烁计数器进行计数。

按Nielsen-LeRoux和Charles(1992)的方法进行直接结合测定。将每个微量管中30μg BBMV和一系列浓度为1-100mM的毒素一起培养，毒素用¹²⁵I-碘标记并溶于Tris/BSA缓冲液(20mM Tris/HCl，150mM NaCl，0.1％BSA，pH 8.5)。在过量300倍的未标记的毒素情况下进行平行实验以确定非特异性附着的量。在室温培养90分钟后，根据在4℃以14000g离心10分钟。沉淀用冷的Tris/BSA缓冲液洗涤两次，将沉淀最终重悬于150μl同样的缓冲液，并加到3ml装在闪烁瓶中的HiSafe 3闪烁混合物(Pharmacia)中。每个实验都进行两份，且在液体闪烁计数器中对各个实验点都计算两次。用Biosoft公司销售的LIGAND软件(Munson和Rodbard，1980)分析数据。

如上所述进行同源竞争实验以进行直接结合实验，用总体积为100μl的10μgBBMV，在室温90分钟。将BBMV培养在在固定浓度的10nM毒素中，毒素用¹²⁵I-碘标记并以一系列浓度(从0.1到300倍标记的毒素浓度)存在于Tris/BSA缓冲液中。从总的计算值中减去非特异性结合值(结合总在有过量300倍的未标记毒素存在时)。每个实验都进行两份，且在液体闪烁计数器中对各个实验点都计算两次。用Biosoft公司销售的LIGAND软件(Munson和Rodbard，1980)分析数据。

按照Lambert等(1996)描述的方法进行体内毒性测定。在营养培养基中以各种浓度掺入活化和溶解的毒素，每边有对玉米螟50％致死剂量(LD₅₀)的Cry9Cal，即每平方厘米的培养基表面积有96.6ng毒素。用六种剂量：0.1ng/cm²，1ng/cm²，10ng/cm²，100ng/cm²，1000ng/cm²和10000ng/cm²来评估天然毒素和修饰的毒素的LD₅₀值。对24孔平板上新生的幼虫进行毒性测定，孔的大小为2cm²(24-孔平板，Corning Costar公司)。将50μl各种毒素的稀释液铺在培养基上并在通风橱下干燥。在每个孔中放一只幼虫，对每个剂量共使用24只幼虫(每个平板一种剂量)。对每个剂量至少重复测定三次。用蒸馏水进行对照。将平板覆盖并置于25℃，相对湿度70％，光照期为16小时。在7天后对照死亡率，并用概率方法(Finney，1971)计算LD₅₀。

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                            序列表

<110>阿方蒂农科股份有限公司(AVENTIS CROPSCIENCE S.A.)

<120>胃蛋白酶敏感经过修饰的苏云金芽孢杆菌杀虫毒素

<130>PM 01008

<140>

<141>

<160>160

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>2019

<212>DNA

<213>苏云金芽孢杆菌(Bacillus thruingiensis)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2019)

<400>1

atg aat cga aat aat caa aat gaa tat gaa att att gat gcc ccc cat  48

Met Asn Arg Asn Asn Gln Asn Glu Tyr Glu Ile Ile Asp Ala Pro His

  1               5                  10                  15

tgt ggg tgt cca tca gat gac gat gtg agg tat cct ttg gca agt gac  96

Cys Gly Cys Pro Ser Asp Asp Asp Val Arg Tyr Pro Leu Ala Ser Asp

             20                  25                  30

cca aat gca gcg tta caa aat atg aac tat aaa gat tac tta caa atg  144

Pro Asn Ala Ala Leu Gln Asn Met Asn Tyr Lys Asp Tyr Leu Gln Met

         35                  40                  45

aca gat gag gac tac act gat tct tat ata aat cct agt tta tct att  192

Thr Asp Glu Asp Tyr Thr Asp Ser Tyr Ile Asn Pro Ser Leu Ser Ile

     50                  55                  60

agt ggt aga gat gca gtt cag act gcg ctt act gtt gtt ggg aga ata  240

Ser Gly Arg Asp Ala Val Gln Thr Ala Leu Thr Val Val Gly Arg Ile

 65                  70                  75                  80

ctc ggg gct tta ggt gtt ccg ttt tct gga caa ata gtg agt ttt tat  288

Leu Gly Ala Leu Gly Val Pro Phe Ser Gly Gln Ile Val Ser Phe Tyr

             85                      90                  95

caa ttc ctt tta aat aca ctg tgg cca gtt aat gat aca gct ata tgg  336

Gln Phe Leu Leu Asn Thr Leu Trp Pro Val Asn Asp Thr Ala Ile Trp

        100                     105                 110

gaa gct ttc atg cga cag gtg gag gaa ctt gtc aat caa caa ata aca  384

Glu Ala Phe Met Arg Gln Val Glu Glu Leu Val Asn Gln Gln Ile Thr

        115                 120                 125

gaa ttt gca aga aat cag gca ctt gca aga ttg caa gga tta gga gac    432

Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala Leu Ala Arg Leu Gln Gly Leu Gly Asp

    130                 135                 140

tct ttt aat gta tat caa cgt tcc ctt caa aat tgg ttg gct gat cga    480

Ser Phe Asn Val Tyr Gln Arg Ser Leu Gln Asn Trp Leu Ala Asp Arg

145                 150                 155                 160

aat gat aca cga aat tta agt gtt gtt cgt gct caa ttt ata gct tta    528

Asn Asp Thr Arg Asn Leu Ser Val Val Arg Ala Gln Phe Ile Ala Leu

                165                 170                 175

gac ctt gat ttt gtt aat gct att cca ttg ttt gca gta aat gga cag    576

Asp Leu Asp Phe Val Asn Ala Ile Pro Leu Phe Ala Val Asn Gly Gln

            180                 185                 190

cag gtt cca tta ctg tca gta tat gca caa gct gtg aat tta cat ttg    624

Gln Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr Ala Gln Ala Val Asn Leu His Leu

        195                 200                 205

tta tta tta aaa gat gca tct ctt ttt gga gaa gga tgg gga ttc aca    672

Leu Leu Leu Lys Asp Ala Ser Leu Phe Gly Glu Gly Trp Gly Phe Thr

    210                 215                 220

cag ggg gaa att tcc aca tat tat gac cgt caa ttg gaa cta acc gct    720

Gln Gly Glu Ile Ser Thr Tyr Tyr Asp Arg Gln Leu Glu Leu Thr Ala

225                 230                 235                 240

aag tac act aat tac tgt gaa act tgg tat aat aca ggt tta gat cgt    768

Lys Tyr Thr Asn Tyr Cys Glu Thr Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Asp Arg

                245                 250                 255

tta aga gga aca aat act gaa agt tgg tta aga tat cat caa ttc cgt    816

Leu Arg Gly Thr Asn Thr Glu Ser Trp Leu Arg Tyr His Gln Phe Arg

            260                 265                 270

aga gaa atg act tta gtg gta tta gat gtt gtg gcg cta ttt cca tat    864

Arg Glu Met Thr Leu Val Val Leu Asp Val Val Ala Leu Phe Pro Tyr

        275                 280                 285

tat gat gta cga ctt tat cca acg gga tca aac cca cag ctt aca cgt    912

Tyr Asp Val Arg Leu Tyr Pro Thr Gly Ser Asn Pro Gln Leu Thr Arg

    290                 295                 300

gag gta tat aca gat ccg att gta ttt aat cca cca gct aat gtt gga    960

Glu Val Tyr Thr Asp Pro Ile Val Phe Asn Pro Pro Ala Asn Val Gly

305                 310                 315                 320

ctt tgc cga cgt tgg ggt act aat ccc tat aat act ttt tct gag ctc    1008

Leu Cys Arg Arg Trp Gly Thr Asn Pro Tyr Asn Thr Phe Ser Glu Leu

                325                 330                 335

gaa aat gcc ttc att cgc cca cca cat ctt ttt gat agg ctg aat agc    1056

Glu Asn Ala Phe Ile Arg Pro Pro His Leu Phe Asp Arg Leu Asn Ser

            340                 345                 350

tta aca atc agc agt aat cga ttt cca gtt tca tct aat ttt atg gat    1104

Leu Thr Ile Ser Ser Asn Arg Phe Pro Val Ser Ser Asn Phe Met Asp

        355                 360                 365

tat tgg tca gga cat acg tta cgc cgt agt tat ctg aac gat tca gca    1152

Tyr Trp Ser Gly His Thr Leu Arg Arg Ser Tyr Leu Asn Asp Ser Ala

    370                 375                 380

gta caa gaa gat agt tat ggc cta att aca acc aca aga gca aca att    1200

Val Gln Glu Asp Ser Tyr Gly Leu Ile Thr Thr Thr Arg Ala Thr Ile

385                 390                 395                 400

aat ccc gga gtt gat gga aca aac cgc ata gag tca acg gca gta gat    1248

Asn Pro Gly Val Asp Gly Thr Asn Arg Ile Glu Ser Thr Ala Val Asp

                405                 410                 415

ttt cgt tct gca ttg ata ggt ata tat ggc gtg aat aga gct tct ttt    1296

Phe Arg Ser Ala Leu Ile Gly Ile Tyr Gly Val Asn Arg Ala Ser Phe

            420                 425                 430

gtc cca gga ggc ttg ttt aat ggt acg act tct cct gct aat gga gga    1344

Val Pro Gly Gly Leu Phe Asn Gly Thr Thr Ser Pro Ala Asn Gly Gly

        435                 440                 445

tgt aga gat ctc tat gat aca aat gat gaa tta cca cca gat gaa agt    1392

Cys Arg Asp Leu Tyr Asp Thr Asn Asp Glu Leu Pro Pro Asp Glu Ser

    450                 455                 460

acc gga agt tca acc cat aga cta tct cat gtt acc ttt ttt agc ttt    1440

Thr Gly Ser Ser Thr His Arg Leu Ser His Val Thr Phe Phe Ser Phe

465                 470                 475                 480

caa act aat cag gct gga tct ata gct aat gca gga agt gta cct act    1488

Gln Thr Asn Gln Ala Gly Ser Ile Ala Asn Ala Gly Ser Val Pro Thr

                485                 490                 495

tat gtt tgg acc cgt cgt gat gtg gac ctt aat aat acg att acc cca    1536

Tyr Val Trp Thr Arg Arg Asp Val Asp Leu Asn Asn Thr Ile Thr Pro

            500                 505                 510

aat aga att aca caa tta cca ttg gta aag gca tct gca cct gtt tcg    1584

Asn Arg Ile Thr Gln Leu Pro Leu Val Lys Ala Ser Ala Pro Val Ser

        515                 520                 525

ggt act acg gtc tta aaa ggt cca gga ttt aca gga ggg ggt ata ctc    1632

Gly Thr Thr Val Leu Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Gly Ile Leu

    530                 535                 540

cga aga aca act aat ggc aca ttt gga acg tta aga gta acg gtt aat    1680

Arg Arg Thr Thr Asn Gly Thr Phe Gly Thr Leu Arg Val Thr Val Asn

545                 550                 555                 560

tca cca tta aca caa caa tat cgc cta aga gtt cgt ttt gcc tca aca  1728

Ser Pro Leu Thr Gln Gln Tyr Arg Leu Arg Val Arg Phe Ala Ser Thr

                565                 570                 575

gga aat ttc agt ata agg gta ctc cgt gga ggg gtt tct atc ggt gat  1776

Gly Asn Phe Ser Ile Arg Val Leu Arg Gly Gly Val Ser Ile Gly Asp

            580                 585                 590

gtt aga tta ggg agc aca atg aac aga ggg cag gaa cta act tac gaa  1824

Val Arg Leu Gly Ser Thr Met Asn Arg Gly Gln Glu Leu Thr Tyr Glu

        595                 600                 605

tcc ttt ttc aca aga gag ttt act act act ggt ccg ttc aat ccg cct  1872

Ser Phe Phe Thr Arg Glu Phe Thr Thr Thr Gly Pro Phe Asn Pro Pro

    610                 615                 620

ttt aca ttt aca caa gct caa gag att cta aca gtg aat gca gaa ggt  1920

Phe Thr Phe Thr Gln Ala Gln Glu Ile Leu Thr Val Asn Ala Glu Gly

625                 630                 635                 640

gtt agc acc ggt ggt gaa tat tat ata gat aga att gaa att gtc cct  1968

Val Ser Thr Gly Gly Glu Tyr Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Ile Val Pro

                645                 650                 655

gtg aat ccg gca cga gaa gcg gaa gag gat tta gaa gcg gcg aag aaa  2016

Val Asn Pro Ala Arg Glu Ala Glu Glu Asp Leu Glu Ala Ala Lys Lys

            660                 665                 670

gcg                                                              2019

Ala

<210>2

<211>673

<212>PRT

<213>苏云金芽孢杆菌(Bacillus thruingiensis)

<400>2

Met Asn Arg Asn Asn Gln Asn Glu Tyr Glu Ile Ile Asp Ala Pro His

  1               5                  10                  15

Cys Gly Cys Pro Ser Asp Asp Asp Val Arg Tyr Pro Leu Ala Ser Asp

             20                  25                  30

Pro Asn Ala Ala Leu Gln Asn Met Asn Tyr Lys Asp Tyr Leu Gln Met

         35                  40                  45

Thr Asp Glu Asp Tyr Thr Asp Ser Tyr Ile Asn Pro Ser Leu Ser Ile

     50                  55                  60

Ser Gly Arg Asp Ala Val Gln Thr Ala Leu Thr Val Val Gly Arg Ile

 65                  70                  75                  80

Leu Gly Ala Leu Gly Val Pro Phe Ser Gly Gln Ile Val Ser Phe Tyr

                 85                  90                  95

Gln Phe Leu Leu Asn Thr Leu Trp Pro Val Asn Asp Thr Ala Ile Trp

            100                 105                 110

Glu Ala Phe Met Arg Gln Val Glu Glu Leu Val Asn Gln Gln Ile Thr

        115                 120                 125

Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala Leu Ala Arg Leu Gln Gly Leu Gly Asp

    130                 135                 140

Ser Phe Asn Val Tyr Gln Arg Ser Leu Gln Asn Trp Leu Ala Asp Arg

145                 150                 155                 160

Asn Asp Thr Arg Asn Leu Ser Val Val Arg Ala Gln Phe Ile Ala Leu

                165                 170                 175

Asp Leu Asp Phe Val Asn Ala Ile Pro Leu Phe Ala Val Asn Gly Gln

            180                 185                 190

Gln Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr Ala Gln Ala Val Asn Leu His Leu

        195                 200                 205

Leu Leu Leu Lys Asp Ala Ser Leu Phe Gly Glu Gly Trp Gly Phe Thr

    210                 215                 220

Gln Gly Glu Ile Ser Thr Tyr Tyr Asp Arg Gln Leu Glu Leu Thr Ala

225                 230                 235                 240

Lys Tyr Thr Asn Tyr Cys Glu Thr Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Asp Arg

                245                 250                 255

Leu Arg Gly Thr Asn Thr Glu Ser Trp Leu Arg Tyr His Gln Phe Arg

            260                 265                 270

Arg Glu Met Thr Leu Val Val Leu Asp Val Val Ala Leu Phe Pro Tyr

        275                 280                 285

Tyr Asp Val Arg Leu Tyr Pro Thr Gly Ser Asn Pro Gln Leu Thr Arg

    290                 295                 300

Glu Val Tyr Thr Asp Pro Ile Val Phe Asn Pro Pro Ala Asn Val Gly

305                 310                 315                 320

Leu Cys Arg Arg Trp Gly Thr Asn Pro Tyr Asn Thr Phe Ser Glu Leu

                325                 330                 335

Glu Asn Ala Phe Ile Arg Pro Pro His Leu Phe Asp Arg Leu Asn Ser

            340                 345                 350

Leu Thr Ile Ser Ser Asn Arg Phe Pro Val Ser Ser Asn Phe Met Asp

        355                 360                 365

Tyr Trp Ser Gly His Thr Leu Arg Arg Ser Tyr Leu Asn Asp Ser Ala

    370                 375                 380

Val Gln Glu Asp Ser Tyr Gly Leu Ile Thr Thr Thr Arg Ala Thr Ile

385                 390             395                     400

Asn Pro Gly Val Asp Gly Thr Asn Arg Ile Glu Ser Thr Ala Val Asp

                405                 410                 415

Phe Arg Ser Ala Leu Ile Gly Ile Tyr Gly Val Asn Arg Ala Ser Phe

            420                 425                 430

Val Pro Gly Gly Leu Phe Asn Gly Thr Thr Ser Pro Ala Asn Gly Gly

        435                 440                 445

Cys Arg Asp Leu Tyr Asp Thr Asn Asp Glu Leu Pro Pro Asp Glu Ser

    450                 455                 460

Thr Gly Ser Ser Thr His Arg Leu Ser His Val Thr Phe Phe Ser Phe

465                 470                 475                 480

Gln Thr Asn Gln Ala Gly Ser Ile Ala Asn Ala Gly Ser Val Pro Thr

                485                 490                 495

Tyr Val Trp Thr Arg Arg Asp Val Asp Leu Asn Asn Thr Ile Thr Pro

            500                 505                 510

Asn Arg Ile Thr Gln Leu Pro Leu Val Lys Ala Ser Ala Pro Val Ser

        515                 520                 525

Gly Thr Thr Val Leu Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Gly Ile Leu

    530                 535                 540

Arg Arg Thr Thr Asn Gly Thr Phe Gly Thr Leu Arg Val Thr Val Asn

545                 550                 555                 560

Ser Pro Leu Thr Gln Gln Tyr Arg Leu Arg Val Arg Phe Ala Ser Thr

                565                 570                 575

Gly Asn Phe Ser Ile Arg Val Leu Arg Gly Gly Val Ser Ile Gly Asp

            580                 585                 590

Val Arg Leu Gly Ser Thr Met Asn Arg Gly Gln Glu Leu Thr Tyr Glu

        595                 600                 605

Ser Phe Phe Thr Arg Glu Phe Thr Thr Thr Gly Pro Phe Asn Pro Pro

    610                 615                 620

Phe Thr Phe Thr Gln Ala Gln Glu Ile Leu Thr Val Asn Ala Glu Gly

625                 630                 635                 640

Val Ser Thr Gly Gly Glu Tyr Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Ile Val Pro

                645                 650                 655

Val Asn Pro Ala Arg Glu Ala Glu Glu Asp Leu Glu Ala Ala Lys Lys

            660                 665                 670

Ala

<210>3

<211>2019

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：Cry9Ca1 Leu-164

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2019)

<400>3

atg aat cga aat aat caa aat gaa tat gaa att att gat gcc ccc cat  48

Met Asn Arg Asn Asn Gln Asn Glu Tyr Glu Ile Ile Asp Ala Pro His

  1               5                  10                  15

tgt ggg tgt cca tca gat gac gat gtg agg tat cct ttg gca agt gac  96

Cys Gly Cys Pro Ser Asp Asp Asp Val Arg Tyr Pro Leu Ala Ser Asp

             20                  25                  30

cca aat gca gcg tta caa aat atg aac tat aaa gat tac tta caa atg  144

Pro Asn Ala Ala Leu Gln Asn Met Asn Tyr Lys Asp Tyr Leu Gln Met

         35                  40                  45

aca gat gag gac tac act gat tct tat ata aat cct agt tta tct att  192

Thr Asp Glu Asp Tyr Thr Asp Ser Tyr Ile Asn Pro Ser Leu Ser Ile

     50                  55                  60

agt ggt aga gat gca gtt cag act gcg ctt act gtt gtt ggg aga ata  240

Ser Gly Arg Asp Ala Val Gln Thr Ala Leu Thr Val Val Gly Arg Ile

 65                  70                  75                  80

ctc ggg gct tta ggt gtt ccg ttt tct gga caa ata gtg agt ttt tat  288

Leu Gly Ala Leu Gly Val Pro Phe Ser Gly Gln Ile Val Ser Phe Tyr

                 85                  90                  95

caa ttc ctt tta aat aca ctg tgg cca gtt aat gat aca gct ata tgg  336

Gln Phe Leu Leu Asn Thr Leu Trp Pro Val Asn Asp Thr Ala Ile Trp

            100                 105                 110

gaa gct ttc atg cga cag gtg gag gaa ctt gtc aat caa caa ata aca  384

Glu Ala Phe Met Arg Gln Val Glu Glu Leu Val Asn Gln Gln Ile Thr

        115                 120                 125

gaa ttt gca aga aat cag gca ctt gca aga ttg caa gga tta gga gac  432

Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala Leu Ala Arg Leu Gln Gly Leu Gly Asp

    130                 135                 140

tct ttt aat gta tat caa cgt tcc ctt caa aat tgg ttg gct gat cga  480

Ser Phe Asn Val Tyr Gln Arg Ser Leu Gln Asn Trp Leu Ala Asp Arg

145                 150                 155                 160

aat gat aca tta aat tta agt gtt gtt cgt gct caa ttt ata gct tta    528

Asn Asp Thr Leu Asn Leu Ser Val Val Arg Ala Gln Phe Ile Ala Leu

                165                 170                 175

gac ctt gat ttt gtt aat gct att cca ttg ttt gca gta aat gga cag    576

Asp Leu Asp Phe Val Asn Ala Ile Pro Leu Phe Ala Val Asn Gly Gln

        180                 185                 190

cag gtt cca tta ctg tca gta tat gca caa gct gtg aat tta cat ttg    624

Gln Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr Ala Gln Ala Val Asn Leu His Leu

        195                 200                 205

tta tta tta aaa gat gca tct ctt ttt gga gaa gga tgg gga ttc aca    672

Leu Leu Leu Lys Asp Ala Ser Leu Phe Gly Glu Gly Trp Gly Phe Thr

    210                 215                 220

cag ggg gaa att tcc aca tat tat gac cgt caa ttg gaa cta acc gct    720

Gln Gly Glu Ile Ser Thr Tyr Tyr Asp Arg Gln Leu Glu Leu Thr Ala

225                 230                 235                 240

aag tac act aat tac tgt gaa act tgg tat aat aca ggt tta gat cgt    768

Lys Tyr Thr Asn Tyr Cys Glu Thr Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Asp Arg

                245                 250                 255

tta aga gga aca aat act gaa agt tgg tta aga tat cat caa ttc cgt    816

Leu Arg Gly Thr Asn Thr Glu Ser Trp Leu Arg Tyr His Gln Phe Arg

            260                 265                 270

aga gaa atg act tta gtg gta tta gat gtt gtg gcg cta ttt cca tat    864

Arg Glu Met Thr Leu Val Val Leu Asp Val Val Ala Leu Phe Pro Tyr

        275                 280                 285

tat gat gta cga ctt tat cca acg gga tca aac cca cag ctt aca cgt    912

Tyr Asp Val Arg Leu Tyr Pro Thr Gly Ser Asn Pro Gln Leu Thr Arg

    290                 295                 300

gag gta tat aca gat ccg att gta ttt aat cca cca gct aat gtt gga    960

Glu Val Tyr Thr Asp Pro Ile Val Phe Asn Pro Pro Ala Asn Val Gly

305                 310                 315                 320

ctt tgc cga cgt tgg ggt act aat ccc tat aat act ttt tct gag ctc    1008

Leu Cys Arg Arg Trp Gly Thr Asn Pro Tyr Asn Thr Phe Ser Glu Leu

                325                 330                 335

gaa aat gcc ttc att cgc cca cca cat ctt ttt gat agg ctg aat agc    1056

Glu Asn Ala Phe Ile Arg Pro Pro His Leu Phe Asp Arg Leu Asn Ser

            340                 345                 350

tta aca atc agc agt aat cga ttt cca gtt tca tct aat ttt atg gat    1104

Leu Thr Ile Ser Ser Asn Arg Phe Pro Val Ser Ser Asn Phe Met Asp

        355                 360                 365

tat tgg tca gga cat acg tta cgc cgt agt tat ctg aac gat tca gca    1152

Tyr Trp Ser Gly His Thr Leu Arg Arg Ser Tyr Leu Asn Asp Ser Ala

    370                 375                 380

gta caa gaa gat agt tat ggc cta att aca acc aca aga gca aca att    1200

Val Gln Glu Asp Ser Tyr Gly Leu Ile Thr Thr Thr Arg Ala Thr Ile

385                 390                 395                 400

aat ccc gga gtt gat gga aca aac cgc ata gag tca acg gca gta gat    1248

Asn Pro Gly Val Asp Gly Thr Asn Arg Ile Glu Ser Thr Ala Val Asp

                405                 410                 415

ttt cgt tct gca ttg ata ggt ata tat ggc gtg aat aga gct tct ttt    1296

Phe Arg Ser Ala Leu Ile Gly Ile Tyr Gly Val Asn Arg Ala Ser Phe

            420                 425                 430

gtc cca gga ggc ttg ttt aat ggt acg act tct cct gct aat gga gga    1344

Val Pro Gly Gly Leu Phe Asn Gly Thr Thr Ser Pro Ala Asn Gly Gly

        435                 440                 445

tgt aga gat ctc tat gat aca aat gat gaa tta cca cca gat gaa agt    1392

Cys Arg Asp Leu Tyr Asp Thr Asn Asp Glu Leu Pro Pro Asp Glu Ser

    450                 455                 460

acc gga agt tca acc cat aga cta tct cat gtt acc ttt ttt agc ttt    1440

Thr Gly Ser Ser Thr His Arg Leu Ser His Val Thr Phe Phe Ser Phe

465                 470                 475                 480

caa act aat cag gct gga tct ata gct aat gca gga agt gta cct act    1488

Gln Thr Asn Gln Ala Gly Ser Ile Ala Asn Ala Gly Ser Val Pro Thr

                485                 490                 495

tat gtt tgg acc cgt cgt gat gtg gac ctt aat aat acg att acc cca    1536

Tyr Val Trp Thr Arg Arg Asp Val Asp Leu Asn Asn Thr Ile Thr Pro

            500                 505                 510

aat aga att aca caa tta cca ttg gta aag gca tct gca cct gtt tcg    1584

Asn Arg Ile Thr Gln Leu Pro Leu Val Lys Ala Ser Ala Pro Val Ser

        515                 520                 525

ggt act acg gtc tta aaa ggt cca gga ttt aca gga ggg ggt ata ctc    1632

Gly Thr Thr Val Leu Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Gly Ile Leu

    530                 535                 540

cga aga aca act aat ggc aca ttt gga acg tta aga gta acg gtt aat    1680

Arg Arg Thr Thr Asn Gly Thr Phe Gly Thr Leu Arg Val Thr Val Asn

545                 550                 555                 560

tca cca tta aca caa caa tat cgc cta aga gtt cgt ttt gcc tca aca    1728

Ser Pro Leu Thr Gln Gln Tyr Arg Leu Arg Val Arg Phe Ala Ser Thr

                565                 570                 575

gga aat ttc agt ata agg gta ctc cgt gga ggg gtt tct atc ggt gat    1776

Gly Asn Phe Ser Ile Arg Val Leu Arg Gly Gly Val Ser Ile Gly Asp

            580                 585                 590

gtt aga tta ggg agc aca atg aac aga ggg cag gaa cta act tac gaa  1824

Val Arg Leu Gly Ser Thr Met Asn Arg Gly Gln Glu Leu Thr Tyr Glu

        595                 600                 605

tcc ttt ttc aca aga gag ttt act act act ggt ccg ttc aat ccg cct  1872

Ser Phe Phe Thr Arg Glu Phe Thr Thr Thr Gly Pro Phe Asn Pro Pro

    610                 615                 620

ttt aca ttt aca caa gct caa gag att cta aca gtg aat gca gaa ggt  1920

Phe Thr Phe Thr Gln Ala Gln Glu Ile Leu Thr Val Asn Ala Glu Gly

625                 630                 635                 640

gtt agc acc ggt ggt gaa tat tat ata gat aga att gaa att gtc cct  1968

Val Ser Thr Gly Gly Glu Tyr Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Ile Val Pro

                645                 650                 655

gtg aat ccg gca cga gaa gcg gaa gag gat tta gaa gcg gcg aag aaa  2016

Val Asn Pro Ala Arg Glu Ala Glu Glu Asp Leu Glu Ala Ala Lys Lys

            660                 665                 670

gcg                                                              2019

Ala

<210>4

<211>673

<212>PRT

<213>人工序列

<223>人工序列的描述：Cry9Ca1 Leu-164

<400>4

Met Asn Arg Asn Asn Gln Asn Glu Tyr Glu Ile Ile Asp Ala Pro His

  1               5                  10                  15

Cys Gly Cys Pro Ser Asp Asp Asp Val Arg Tyr Pro Leu Ala Ser Asp

             20                  25                  30

Pro Asn Ala Ala Leu Gln Asn Met Asn Tyr Lys Asp Tyr Leu Gln Met

         35                  40                  45

Thr Asp Glu Asp Tyr Thr Asp Ser Tyr Ile Asn Pro Ser Leu Ser Ile

     50                  55                  60

Ser Gly Arg Asp Ala Val Gln Thr Ala Leu Thr Val Val Gly Arg Ile

 65                  70                  75                  80

Leu Gly Ala Leu Gly Val Pro Phe Ser Gly Gln Ile Val Ser Phe Tyr

                 85                  90                  95

Gln Phe Leu Leu Asn Thr Leu Trp Pro Val Asn Asp Thr Ala Ile Trp

            100                 105                 110

Glu Ala Phe Met Arg Gln Val Glu Glu Leu Val Asn Gln Gln Ile Thr

        115                 120                 125

Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala Leu Ala Arg Leu Gln Gly Leu Gly Asp

    130                 135                 140

Ser Phe Asn Val Tyr Gln Arg Ser Leu Gln Asn Trp Leu Ala Asp Arg

145                 150                 155                 160

Asn Asp Thr Leu Asn Leu Ser Val Val Arg Ala Gln Phe Ile Ala Leu

                165                 170                 175

Asp Leu Asp Phe Val Asn Ala Ile Pro Leu Phe Ala Val Asn Gly Gln

            180                 185                 190

Gln Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr Ala Gln Ala Val Asn Leu His Leu

        195                 200                 205

Leu Leu Leu Lys Asp Ala Ser Leu Phe Gly Glu Gly Trp Gly Phe Thr

    210                 215                 220

Gln Gly Glu Ile Ser Thr Tyr Tyr Asp Arg Gln Leu Glu Leu Thr Ala

225                 230                 235                 240

Lys Tyr Thr Asn Tyr Cys Glu Thr Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Asp Arg

                245                 250                 255

Leu Arg Gly Thr Asn Thr Glu Ser Trp Leu Arg Tyr His Gln Phe Arg

            260                 265                 270

Arg Glu Met Thr Leu Val Val Leu Asp Val Val Ala Leu Phe Pro Tyr

        275                 280                 285

Tyr Asp Val Arg Leu Tyr Pro Thr Gly Ser Asn Pro Gln Leu Thr Arg

    290                 295                 300

Glu Val Tyr Thr Asp Pro Ile Val Phe Asn Pro Pro Ala Asn Val Gly

305                 310                 315                 320

Leu Cys Arg Arg Trp Gly Thr Asn Pro Tyr Asn Thr Phe Ser Glu Leu

                325                 330                 335

Glu Asn Ala Phe Ile Arg Pro Pro His Leu Phe Asp Arg Leu Asn Ser

            340                 345                 350

Leu Thr Ile Ser Ser Asn Arg Phe Pro Val Ser Ser Asn Phe Met Asp

        355                 360                 365

Tyr Trp Ser Gly His Thr Leu Arg Arg Ser Tyr Leu Asn Asp Ser Ala

    370                 375                 380

Val Gln Glu Asp Ser Tyr Gly Leu Ile Thr Thr Thr Arg Ala Thr Ile

385                 390                 395                 400

Asn Pro Gly Val Asp Gly Thr Asn Arg Ile Glu Ser Thr Ala Val Asp

                405                 410                 415

Phe Arg Ser Ala Leu Ile Gly Ile Tyr Gly Val Asn Arg Ala Ser Phe

            420                 425                 430

Val Pro Gly Gly Leu Phe Asn Gly Thr Thr Ser Pro Ala Asn Gly Gly

        435                 440                 445

Cys Arg Asp Leu Tyr Asp Thr Asn Asp Glu Leu Pro Pro Asp Glu Ser

    450                 455                 460

Thr Gly Ser Ser Thr His Arg Leu Ser His Val Thr Phe Phe Ser Phe

465                 470                 475                 480

Gln Thr Asn Gln Ala Gly Ser Ile Ala Asn Ala Gly Ser Val Pro Thr

                485                 490                 495

Tyr Val Trp Thr Arg Arg Asp Val Asp Leu Asn Asn Thr Ile Thr Pro

            500                 505                 510

Asn Arg Ile Thr Gln Leu Pro Leu Val Lys Ala Ser Ala Pro Val Ser

        515                 520                 525

Gly Thr Thr Val Leu Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Gly Ile Leu

    530                 535                 540

Arg Arg Thr Thr Asn Gly Thr Phe Gly Thr Leu Arg Val Thr Val Asn

545                 550                 555                 560

Ser Pro Leu Thr Gln Gln Tyr Arg Leu Arg Val Arg Phe Ala Ser Thr

                565                 570                 575

Gly Asn Phe Ser Ile Arg Val Leu Arg Gly Gly Val Ser Ile Gly Asp

            580                 585                 590

Val Arg Leu Gly Ser Thr Met Asn Arg Gly Gln Glu Leu Thr Tyr Glu

        595                 600                 605

Ser Phe Phe Thr Arg Glu Phe Thr Thr Thr Gly Pro Phe Asn Pro Pro

    610                 615                 620

Phe Thr Phe Thr Gln Ala Gln Glu Ile Leu Thr Val Asn Ala Glu Gly

625                 630                 635                 640

Val Ser Thr Gly Gly Glu Tyr Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Ile Val Pro

                645                 650                 655

Val Asn Pro Ala Arg Glu Ala Glu Glu Asp Leu Glu Ala Ala Lys Lys

            660                 665                 670

Ala

<210>5

<211>2019

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：Cry9Ca1 Phe-164

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2019)

<400>5

atg aat cga aat aat caa aat gaa tat gaa att att gat gcc ccc cat  48

Met Asn Arg Asn Asn Gln Asn Glu Tyr Glu Ile Ile Asp Ala Pro His

  1               5                  10                  15

tgt ggg tgt cca tca gat gac gat gtg agg tat cct ttg gca agt gac  96

Cys Gly Cys Pro Ser Asp Asp Asp Val Arg Tyr Pro Leu Ala Ser Asp

             20                  25                  30

cca aat gca gcg tta caa aat atg aac tat aaa gat tac tta caa atg  144

Pro Asn Ala Ala Leu Gln Asn Met Asn Tyr Lys Asp Tyr Leu Gln Met

         35                  40                  45

aca gat gag gac tac act gat tct tat ata aat cct agt tta tct att  192

Thr Asp Glu Asp Tyr Thr Asp Ser Tyr Ile Asn Pro Ser Leu Ser Ile

     50                  55                  60

agt ggt aga gat gca gtt cag act gcg ctt act gtt gtt ggg aga ata  240

Ser Gly Arg Asp Ala Val Gln Thr Ala Leu Thr Val Val Gly Arg Ile

 65                  70                  75                  80

ctc ggg gct tta ggt gtt ccg ttt tct gga caa ata gtg agt ttt tat  288

Leu Gly Ala Leu Gly Val Pro Phe Ser Gly Gln Ile Val Ser Phe Tyr

                 85                  90                  95

caa ttc ctt tta aat aca ctg tgg cca gtt aat gat aca gct ata tgg  336

Gln Phe Leu Leu Asn Thr Leu Trp Pro Val Asn Asp Thr Ala Ile Trp

            100                 105                 110

gaa gct ttc atg cga cag gtg gag gaa ctt gtc aat caa caa ata aca  384

Glu Ala Phe Met Arg Gln Val Glu Glu Leu Val Asn Gln Gln Ile Thr

        115                 120                 125

gaa ttt gca aga aat cag gca ctt gca aga ttg caa gga tta gga gac  432

Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala Leu Ala Arg Leu Gln Gly Leu Gly Asp

    130                 135                 140

tct ttt aat gta tat caa cgt tcc ctt caa aat tgg ttg gct gat cga  480

Ser Phe Asn Val Tyr Gln Arg Ser Leu Gln Asn Trp Leu Ala Asp Arg

145                 150                 155                 160

aat gat aca ttt aat tta agt gtt gtt cgt gct caa ttt ata gct tta  528

Asn Asp Thr Phe Asn Leu Ser Val Val Arg Ala Gln Phe Ile Ala Leu

                165                 170                 175

gac ctt gat ttt gtt aat gct att cca ttg ttt gca gta aat gga cag  576

Asp Leu Asp Phe Val Asn Ala Ile Pro Leu Phe Ala Val Asn Gly Gln

        180                 185                 190

cag gtt cca tta ctg tca gta tat gca caa gct gtg aat tta cat ttg    624

Gln Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr Ala Gln Ala Val Asn Leu His Leu

        195                 200                 205

tta tta tta aaa gat gca tct ctt ttt gga gaa gga tgg gga ttc aca    672

Leu Leu Leu Lys Asp Ala Ser Leu Phe Gly Glu Gly Trp Gly Phe Thr

210                 215                 220

cag ggg gaa att tcc aca tat tat gac cgt caa ttg gaa cta acc gct    720

Gln Gly Glu Ile Ser Thr Tyr Tyr Asp Arg Gln Leu Glu Leu Thr Ala

225                 230                 235                 240

aag tac act aat tac tgt gaa act tgg tat aat aca ggt tta gat cgt    768

Lys Tyr Thr Asn Tyr Cys Glu Thr Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Asp Arg

                245                 250                 255

tta aga gga aca aat act gaa agt tgg tta aga tat cat caa ttc cgt    816

Leu Arg Gly Thr Asn Thr Glu Ser Trp Leu Arg Tyr His Gln Phe Arg

            260                 265                 270

aga gaa atg act tta gtg gta tta gat gtt gtg gcg cta ttt cca tat    864

Arg Glu Met Thr Leu Val Val Leu Asp Val Val Ala Leu Phe Pro Tyr

        275                 280                 285

tat gat gta cga ctt tat cca acg gga tca aac cca cag ctt aca cgt    912

Tyr Asp Val Arg Leu Tyr Pro Thr Gly Ser Asn Pro Gln Leu Thr Arg

    290                 295                 300

gag gta tat aca gat ccg att gta ttt aat cca cca gct aat gtt gga    960

Glu Val Tyr Thr Asp Pro Ile Val Phe Asn Pro Pro Ala Asn Val Gly

305                 310                 315                 320

ctt tgc cga cgt tgg ggt act aat ccc tat aat act ttt tct gag ctc    1008

Leu Cys Arg Arg Trp Gly Thr Asn Pro Tyr Asn Thr Phe Ser Glu Leu

                325                 330                 335

gaa aat gcc ttc att cgc cca cca cat ctt ttt gat agg ctg aat agc    1056

Glu Asn Ala Phe Ile Arg Pro Pro His Leu Phe Asp Arg Leu Asn Ser

            340                 345                 350

tta aca atc agc agt aat cga ttt cca gtt tca tct aat ttt atg gat    1104

Leu Thr Ile Ser Ser Asn Arg Phe Pro Val Ser Ser Asn Phe Met Asp

        355                 360                 365

tat tgg tca gga cat acg tta cgc cgt agt tat ctg aac gat tca gca    1152

Tyr Trp Ser Gly His Thr Leu Arg Arg Ser Tyr Leu Asn Asp Ser Ala

    370                 375                 380

gta caa gaa gat agt tat ggc cta att aca acc aca aga gca aca att    1200

Val Gln Glu Asp Ser Tyr Gly Leu Ile Thr Thr Thr Arg Ala Thr Ile

385                 390                 395                 400

aat ccc gga gtt gat gga aca aac cgc ata gag tca acg gca gta gat    1248

Asn Pro Gly Val Asp Gly Thr Asn Arg Ile Glu Ser Thr Ala Val Asp

                405                 410                 415

ttt cgt tct gca ttg ata ggt ata tat ggc gtg aat aga gct tct ttt    1296

Phe Arg Ser Ala Leu Ile Gly Ile Tyr Gly Val Asn Arg Ala Ser Phe

            420                 425                 430

gtc cca gga ggc ttg ttt aat ggt acg act tct cct gct aat gga gga    1344

Val Pro Gly Gly Leu Phe Asn Gly Thr Thr Ser Pro Ala Asn Gly Gly

        435                 440                 445

tgt aga gat ctc tat gat aca aat gat gaa tta cca cca gat gaa agt    1392

Cys Arg Asp Leu Tyr Asp Thr Asn Asp Glu Leu Pro Pro Asp Glu Ser

    450                 455                 460

acc gga agt tca acc cat aga cta tct cat gtt acc ttt ttt agc ttt    1440

Thr Gly Ser Ser Thr His Arg Leu Ser His Val Thr Phe Phe Ser Phe

465                 470                 475                 480

caa act aat cag gct gga tct ata gct aat gca gga agt gta cct act    1488

Gln Thr Asn Gln Ala Gly Ser Ile Ala Asn Ala Gly Ser Val Pro Thr

                485                 490                 495

tat gtt tgg acc cgt cgt gat gtg gac ctt aat aat acg att acc cca    1536

Tyr Val Trp Thr Arg Arg Asp Val Asp Leu Asn Asn Thr Ile Thr Pro

            500                 505                 510

aat aga att aca caa tta cca ttg gta aag gca tct gca cct gtt tcg    1584

Asn Arg Ile Thr Gln Leu Pro Leu Val Lys Ala Ser Ala Pro Val Ser

        515                 520                 525

ggt act acg gtc tta aaa ggt cca gga ttt aca gga ggg ggt ata ctc    1632

Gly Thr Thr Val Leu Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Gly Ile Leu

    530                 535                 540

cga aga aca act aat ggc aca ttt gga acg tta aga gta acg gtt aat    1680

Arg Arg Thr Thr Asn Gly Thr Phe Gly Thr Leu Arg Val Thr Val Asn

545                 550                 555                 560

tca cca tta aca caa caa tat cgc cta aga gtt cgt ttt gcc tca aca    1728

Ser Pro Leu Thr Gln Gln Tyr Arg Leu Arg Val Arg Phe Ala Ser Thr

                565                 570                 575

gga aat ttc agt ata agg gta ctc cgt gga ggg gtt tct atc ggt gat    1776

Gly Asn Phe Ser Ile Arg Val Leu Arg Gly Gly Val Ser Ile Gly Asp

            580                 585                 590

gtt aga tta ggg agc aca atg aac aga ggg cag gaa cta act tac gaa    1824

Val Arg Leu Gly Ser Thr Met Asn Arg Gly Gln Glu Leu Thr Tyr Glu

        595                 600                 605

tcc ttt ttc aca aga gag ttt act act act ggt ccg ttc aat ccg cct    1872

Ser Phe Phe Thr Arg Glu Phe Thr Thr Thr Gly Pro Phe Asn Pro Pro

    610                 615                 620

ttt aca ttt aca caa gct caa gag att cta aca gtg aat gca gaa ggt  1920

Phe Thr Phe Thr Gln Ala Gln Glu Ile Leu Thr Val Asn Ala Glu Gly

625                 630                 635                 640

gtt agc acc ggt ggt gaa tat tat ata gat aga att gaa att gtc cct  1968

Val Ser Thr Gly Gly Glu Tyr Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Ile Val Pro

                645                 650                 655

gtg aat ccg gca cga gaa gcg gaa gag gat tta gaa gcg gcg aag aaa  2016

Val Asn Pro Ala Arg Glu Ala Glu Glu Asp Leu Glu Ala Ala Lys Lys

            660                 665                 670

gcg                                                              2019

Ala

<210>6

<211>673

<212>PRT

<213>人工序列

<223>人工序列的描述：Cry9Ca1 Phe-164

<400>6

Met Asn Arg Asn Asn Gln Asn Glu Tyr Glu Ile Ile Asp Ala Pro His

  1               5                  10                  15

Cys Gly Cys Pro Ser Asp Asp Asp Val Arg Tyr Pro Leu Ala Ser Asp

             20                  25                  30

Pro Asn Ala Ala Leu Gln Asn Met Asn Tyr Lys Asp Tyr Leu Gln Met

         35                  40                  45

Thr Asp Glu Asp Tyr Thr Asp Ser Tyr Ile Asn Pro Ser Leu Ser Ile

     50                  55                  60

Ser Gly Arg Asp Ala Val Gln Thr Ala Leu Thr Val Val Gly Arg Ile

 65                  70                  75                  80

Leu Gly Ala Leu Gly Val Pro Phe Ser Gly Gln Ile Val Ser Phe Tyr

                 85                  90                  95

Gln Phe Leu Leu Asn Thr Leu Trp Pro Val Asn Asp Thr Ala Ile Trp

            100                 105                 110

Glu Ala Phe Met Arg Gln Val Glu Glu Leu Val Asn Gln Gln Ile Thr

        115                 120                 125

Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala Leu Ala Arg Leu Gln Gly Leu Gly Asp

    130                 135                 140

Ser Phe Asn Val Tyr Gln Arg Ser Leu Gln Asn Trp Leu Ala Asp Arg

145                 150                 155                 160

Asn Asp Thr Phe Asn Leu Ser Val Val Arg Ala Gln Phe Ile Ala Leu

                165                 170                 175

Asp Leu Asp Phe Val Asn Ala Ile Pro Leu Phe Ala Val Asn Gly Gln

            180                 185                 190

Gln Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr Ala Gln Ala Val Asn Leu His Leu

        195                 200                 205

Leu Leu Leu Lys Asp Ala Ser Leu Phe Gly Glu Gly Trp Gly Phe Thr

    210                 215                 220

Gln Gly Glu Ile Ser Thr Tyr Tyr Asp Arg Gln Leu Glu Leu Thr Ala

225                 230                 235                 240

Lys Tyr Thr Asn Tyr Cys Glu Thr Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Asp Arg

                245                 250                 255

Leu Arg Gly Thr Asn Thr Glu Ser Trp Leu Arg Tyr His Gln Phe Arg

            260                 265                 270

Arg Glu Met Thr Leu Val Val Leu Asp Val Val Ala Leu Phe Pro Tyr

        275                 280                 285

Tyr Asp Val Arg Leu Tyr Pro Thr Gly Ser Asn Pro Gln Leu Thr Arg

    290                 295                 300

Glu Val Tyr Thr Asp Pro Ile Val Phe Asn Pro Pro Ala Asn Val Gly

305                 310                 315                 320

Leu Cys Arg Arg Trp Gly Thr Asn Pro Tyr Asn Thr Phe Ser Glu Leu

                325                 330                 335

Glu Asn Ala Phe Ile Arg Pro Pro His Leu Phe Asp Arg Leu Asn Ser

            340                 345                 350

Leu Thr Ile Ser Ser Asn Arg Phe Pro Val Ser Ser Asn Phe Met Asp

        355                 360                 365

Tyr Trp Ser Gly His Thr Leu Arg Arg Ser Tyr Leu Asn Asp Ser Ala

    370                 375                 380

Val Gln Glu Asp Ser Tyr Gly Leu Ile Thr Thr Thr Arg Ala Thr Ile

385                 390                 395                 400

Asn Pro Gly Val Asp Gly Thr Asn Arg Ile Glu Ser Thr Ala Val Asp

                405                 410                 415

Phe Arg Ser Ala Leu Ile Gly Ile Tyr Gly Val Asn Arg Ala Ser Phe

            420                 425                 430

Val Pro Gly Gly Leu Phe Asn Gly Thr Thr Ser Pro Ala Asn Gly Gly

        435                 440                 445

Cys Arg Asp Leu Tyr Asp Thr Asn Asp Glu Leu Pro Pro Asp Glu Ser

    450                 455                 460

Thr Gly Ser Ser Thr His Arg Leu Ser His Val Thr Phe Phe Ser Phe

465                 470                 475                 480

Gln Thr Asn Gln Ala Gly Ser Ile Ala Asn Ala Gly Ser Val Pro Thr

                485                 490                 495

Tyr Val Trp Thr Arg Arg Asp Val Asp Leu Asn Asn Thr Ile Thr Pro

            500                 505                 510

Asn Arg Ile Thr Gln Leu Pro Leu Val Lys Ala Ser Ala Pro Val Ser

        515                 520                 525

Gly Thr Thr Val Leu Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Gly Ile Leu

    530                 535                 540

Arg Arg Thr Thr Asn Gly Thr Phe Gly Thr Leu Arg Val Thr Val Asn

545                 550                 555                 560

Ser Pro Leu Thr Gln Gln Tyr Arg Leu Arg Val Arg Phe Ala Ser Thr

                565                 570                 575

Gly Asn Phe Ser Ile Arg Val Leu Arg Gly Gly Val Ser Ile Gly Asp

            580                 585                 590

Val Arg Leu Gly Ser Thr Met Asn Arg Gly Gln Glu Leu Thr Tyr Glu

        595                 600                 605

Ser Phe Phe Thr Arg Glu Phe Thr Thr Thr Gly Pro Phe Asn Pro Pro

    610                 615                 620

Phe Thr Phe Thr Gln Ala Gln Glu Ile Leu Thr Val Asn Ala Glu Gly

625                 630                 635                 640

Val Ser Thr Gly Gly Glu Tyr Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Ile Val Pro

                645                 650                 655

Val Asn Pro Ala Arg Glu Ala Glu Glu Asp Leu Glu Ala Ala Lys Lys

            660                 665                 670

Ala

<210>7

<211>2019

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：Cry9Ca1 Glu-164

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2019)

<400>7

atg aat cga aat aat caa aat gaa tat gaa att att gat gcc ccc cat    48

Met Asn Arg Asn Asn Gln Asn Glu Tyr Glu Ile Ile Asp Ala Pro His

  1               5                  l0                  15

tgt ggg tgt cca tca gat gac gat gtg agg tat cct ttg gca agt gac    96

Cys Gly Cys Pro Ser Asp Asp Asp Val Arg Tyr Pro Leu Ala Ser Asp

             20                  25                  30

cca aat gca gcg tta caa aat atg aac tat aaa gat tac tta caa atg    144

Pro Asn Ala Ala Leu Gln Asn Met Asn Tyr Lys Asp Tyr Leu Gln Met

         35                  40                  45

aca gat gag gac tac act gat tct tat ata aat cct agt tta tct att    192

Thr Asp Glu Asp Tyr Thr Asp Ser Tyr Ile Asn Pro Ser Leu Ser Ile

     50                  55                  60

agt ggt aga gat gca gtt cag act gcg ctt act gtt gtt ggg aga ata    240

Ser Gly Arg Asp Ala Val Gln Thr Ala Leu Thr Val Val Gly Arg Ile

 65                  70                  75                  80

ctc ggg gct tta ggt gtt ccg ttt tct gga caa ata gtg agt ttt tat    288

Leu Gly Ala Leu Gly Val Pro Phe Ser Gly Gln Ile Val Ser Phe Tyr

                 85                  90                  95

caa ttc ctt tta aat aca ctg tgg cca gtt aat gat aca gct ata tgg    336

Gln Phe Leu Leu Asn Thr Leu Trp Pro Val Asn Asp Thr Ala Ile Trp

            100                 105                 110

gaa gct ttc atg cga cag gtg gag gaa ctt gtc aat caa caa ata aca    384

Glu Ala Phe Met Arg Gln Val Glu Glu Leu Val Asn Gln Gln Ile Thr

        115                 120                 125

gaa ttt gca aga aat cag gca ctt gca aga ttg caa gga tta gga gac    432

Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala Leu Ala Arg Leu Gln Gly Leu Gly Asp

    130                 135                 140

tct ttt aat gta tat caa cgt tcc ctt caa aat tgg ttg gct gat cga    480

Ser Phe Asn Val Tyr Gln Arg Ser Leu Gln Asn Trp Leu Ala Asp Arg

145                 150                 155                 160

aat gat aca gaa aat tta agt gtt gtt cgt gct caa ttt ata gct tta    528

Asn Asp Thr Glu Asn Leu Ser Val Val Arg Ala Gln Phe Ile Ala Leu

                165                 170                 175

gac ctt gat ttt gtt aat gct att cca ttg ttt gca gta aat gga cag    576

Asp Leu Asp Phe Val Asn Ala Ile Pro Leu Phe Ala Val Asn Gly Gln

            180                 185                 190

cag gtt cca tta ctg tca gta tat gca caa gct gtg aat tta cat ttg    624

Gln Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr Ala Gln Ala Val Asn Leu His Leu

        195                 200                 205

tta tta tta aaa gat gca tct ctt ttt gga gaa gga tgg gga ttc aca    672

Leu Leu Leu Lys Asp Ala Ser Leu Phe Gly Glu Gly Trp Gly Phe Thr

    210                 215                 220

cag ggg gaa att tcc aca tat tat gac cgt caa ttg gaa cta acc gct    720

Gln Gly Glu Ile Ser Thr Tyr Tyr Asp Arg Gln Leu Glu Leu Thr Ala

225                 230                 235                 240

aag tac act aat tac tgt gaa act tgg tat aat aca ggt tta gat cgt    768

Lys Tyr Thr Asn Tyr Cys Glu Thr Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Asp Arg

                245                 250                 255

tta aga gga aca aat act gaa agt tgg tta aga tat cat caa ttc cgt    816

Leu Arg Gly Thr Asn Thr Glu Ser Trp Leu Arg Tyr His Gln Phe Arg

            260                 265                 270

aga gaa atg act tta gtg gta tta gat gtt gtg gcg cta ttt cca tat    864

Arg Glu Met Thr Leu Val Val Leu Asp Val Val Ala Leu Phe Pro Tyr

        275                 280                 285

tat gat gta cga ctt tat cca acg gga tca aac cca cag ctt aca cgt    912

Tyr Asp Val Arg Leu Tyr Pro Thr Gly Ser Asn Pro Gln Leu Thr Arg

    290                 295                 300

gag gta tat aca gat ccg att gta ttt aat cca cca gct aat gtt gga    960

Glu Val Tyr Thr Asp Pro Ile Val Phe Asn Pro Pro Ala Asn Val Gly

305                 310                 315                 320

ctt tgc cga cgt tgg ggt act aat ccc tat aat act ttt tct gag ctc    1008

Leu Cys Arg Arg Trp Gly Thr Asn Pro Tyr Asn Thr Phe Ser Glu Leu

                325                 330                 335

gaa aat gcc ttc att cgc cca cca cat ctt ttt gat agg ctg aat agc    1056

Glu Asn Ala Phe Ile Arg Pro Pro His Leu Phe Asp Arg Leu Asn Ser

            340                 345                 350

tta aca atc agc agt aat cga ttt cca gtt tca tct aat ttt atg gat    1104

Leu Thr Ile Ser Ser Asn Arg Phe Pro Val Ser Ser Asn Phe Met Asp

        355                 360                 365

tat tgg tca gga cat acg tta cgc cgt agt tat ctg aac gat tca gca    1152

Tyr Trp Ser Gly His Thr Leu Arg Arg Ser Tyr Leu Asn Asp Ser Ala

    370                 375                 380

gta caa gaa gat agt tat ggc cta att aca acc aca aga gca aca att    1200

Val Gln Glu Asp Ser Tyr Gly Leu Ile Thr Thr Thr Arg Ala Thr Ile

385                 390                 395                 400

aat ccc gga gtt gat gga aca aac cgc ata gag tca acg gca gta gat    1248

Asn Pro Gly Val Asp Gly Thr Asn Arg Ile Glu Ser Thr Ala Val Asp

                405                 410                 415

ttt cgt tct gca ttg ata ggt ata tat ggc gtg aat aga gct tct ttt    1296

Phe Arg Ser Ala Leu Ile Gly Ile Tyr Gly Val Asn Arg Ala Ser Phe

            420                 425                 430

gtc cca gga ggc ttg ttt aat ggt acg act tct cct gct aat gga gga    1344

Val Pro Gly Gly Leu Phe Asn Gly Thr Thr Ser Pro Ala Asn Gly Gly

        435                 440                 445

tgt aga gat ctc tat gat aca aat gat gaa tta cca cca gat gaa agt    1392

Cys Arg Asp Leu Tyr Asp Thr Asn Asp Glu Leu Pro Pro Asp Glu Ser

    450                 455                 460

acc gga agt tca acc cat aga cta tct cat gtt acc ttt ttt agc ttt    1440

Thr Gly Ser Ser Thr His Arg Leu Ser His Val Thr Phe Phe Ser Phe

465                 470                 475                 480

caa act aat cag gct gga tct ata gct aat gca gga agt gta cct act    1488

Gln Thr Asn Gln Ala Gly Ser Ile Ala Asn Ala Gly Ser Val Pro Thr

                485                 490                 495

tat gtt tgg acc cgt cgt gat gtg gac ctt aat aat acg att acc cca    1536

Tyr Val Trp Thr Arg Arg Asp Val Asp Leu Asn Asn Thr Ile Thr Pro

            500                 505                 510

aat aga att aca caa tta cca ttg gta aag gca tct gca cct gtt tcg    1584

Asn Arg Ile Thr Gln Leu Pro Leu Val Lys Ala Ser Ala Pro Val Ser

        515                 520                 525

ggt act acg gtc tta aaa ggt cca gga ttt aca gga ggg ggt ata ctc    1632

Gly Thr Thr Val Leu Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Gly Ile Leu

    530                 535                 540

cga aga aca act aat ggc aca ttt gga acg tta aga gta acg gtt aat    1680

Arg Arg Thr Thr Asn Gly Thr Phe Gly Thr Leu Arg Val Thr Val Asn

545                 550                 555                 560

tca cca tta aca caa caa tat cgc cta aga gtt cgt ttt gcc tca aca    1728

Ser Pro Leu Thr Gln Gln Tyr Arg Leu Arg Val Arg Phe Ala Ser Thr

                565                 570                 575

gga aat ttc agt ata agg gta ctc cgt gga ggg gtt tct atc ggt gat    1776

Gly Asn Phe Ser Ile Arg Val Leu Arg Gly Gly Val Ser Ile Gly Asp

            580                 585                 590

gtt aga tta ggg agc aca atg aac aga ggg cag gaa cta act tac gaa    1824

Val Arg Leu Gly Ser Thr Met Asn Arg Gly Gln Glu Leu Thr Tyr Glu

        595                 600                 605

tcc ttt ttc aca aga gag ttt act act act ggt ccg ttc aat ccg cct    1872

Ser Phe Phe Thr Arg Glu Phe Thr Thr Thr Gly Pro Phe Asn Pro Pro

    610                 615                 620

ttt aca ttt aca caa gct caa gag att cta aca gtg aat gca gaa ggt    1920

Phe Thr Phe Thr Gln Ala Gln Glu Ile Leu Thr Val Asn Ala Glu Gly

625                 630                 635                 640

gtt agc acc ggt ggt gaa tat tat ata gat aga att gaa att gtc cct    1968

Val Ser Thr Gly Gly Glu Tyr Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Ile Val Pro

                645                 650                 655

gtg aat ccg gca cga gaa gcg gaa gag gat tta gaa gcg gcg aag aaa  2016

Val Asn Pro Ala Arg Glu Ala Glu Glu Asp Leu Glu Ala Ala Lys Lys

            660                 665                 670

gcg                                                              2019

Ala

<210>8

<211>673

<212>PRT

<213>人工序列

<223>人工序列的描述：Cry9Ca1 Glu-164

<400>8

Met Asn Arg Asn Asn Gln Asn Glu Tyr Glu Ile Ile Asp Ala Pro His

  1               5                  10                  15

Cys Gly Cys Pro Ser Asp Asp Asp Val Arg Tyr Pro Leu Ala Ser Asp

             20                  25                  30

Pro Asn Ala Ala Leu Gln Asn Met Asn Tyr Lys Asp Tyr Leu Gln Met

         35                  40                  45

Thr Asp Glu Asp Tyr Thr Asp Ser Tyr Ile Asn Pro Ser Leu Ser Ile

     50                  55                  60

Ser Gly Arg Asp Ala Val Gln Thr Ala Leu Thr Val Val Gly Arg Ile

 65                  70                  75                  80

Leu Gly Ala Leu Gly Val Pro Phe Ser Gly Gln Ile Val Ser Phe Tyr

                 85                  90                  95

Gln Phe Leu Leu Asn Thr Leu Trp Pro Val Asn Asp Thr Ala Ile Trp

            100                 105                 110

Glu Ala Phe Met Arg Gln Val Glu Glu Leu Val Asn Gln Gln Ile Thr

        115                 120                 125

Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala Leu Ala Arg Leu Gln Gly Leu Gly Asp

    130                 135                 140

Ser Phe Asn Val Tyr Gln Arg Ser Leu Gln Asn Trp Leu Ala Asp Arg

145                 150                 155                 160

Asn Asp Thr Glu Asn Leu Ser Val Val Arg Ala Gln Phe Ile Ala Leu

                165                 170                 175

Asp Leu Asp Phe Val Asn Ala Ile Pro Leu Phe Ala Val Asn Gly Gln

            180                 185                 190

Gln Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr Ala Gln Ala Val Asn Leu His Leu

        195                 200                 205

Leu Leu Leu Lys Asp Ala Ser Leu Phe Gly Glu Gly Trp Gly Phe Thr

    210                 215                 220

Gln Gly Glu Ile Ser Thr Tyr Tyr Asp Arg Gln Leu Glu Leu Thr Ala

225                 230                 235                 240

Lys Tyr Thr Asn Tyr Cys Glu Thr Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Asp Arg

                245                 250                 255

Leu Arg Gly Thr Asn Thr Glu Ser Trp Leu Arg Tyr His Gln Phe Arg

            260                 265                 270

Arg Glu Met Thr Leu Val Val Leu Asp Val Val Ala Leu Phe Pro Tyr

        275                 280                 285

Tyr Asp Val Arg Leu Tyr Pro Thr Gly Ser Asn Pro Gln Leu Thr Arg

    290                 295                 300

Glu Val Tyr Thr Asp Pro Ile Val Phe Asn Pro Pro Ala Asn Val Gly

305                 310                 315                 320

Leu Cys Arg Arg Trp Gly Thr Asn Pro Tyr Asn Thr Phe Ser Glu Leu

                325                 330                 335

Glu Asn Ala Phe Ile Arg Pro Pro His Leu Phe Asp Arg Leu Asn Ser

            340                 345                 350

Leu Thr Ile Ser Ser Asn Arg Phe Pro Val Ser Ser Asn Phe Met Asp

        355                 360                 365

Tyr Trp Ser Gly His Thr Leu Arg Arg Ser Tyr Leu Asn Asp Ser Ala

    370                 375                 380

Val Gln Glu Asp Ser Tyr Gly Leu Ile Thr Thr Thr Arg Ala Thr Ile

385                 390                 395                 400

Asn Pro Gly Val Asp Gly Thr Asn Arg Ile Glu Ser Thr Ala Val Asp

                405                 410                 415

Phe Arg Ser Ala Leu Ile Gly Ile Tyr Gly Val Asn Arg Ala Ser Phe

            420                 425                 430

Val Pro Gly Gly Leu Phe Asn Gly Thr Thr Ser Pro Ala Asn Gly Gly

        435                 440                 445

Cys Arg Asp Leu Tyr Asp Thr Asn Asp Glu Leu Pro Pro Asp Glu Ser

    450                 455                 460

Thr Gly Ser Ser Thr His Arg Leu Ser His Val Thr Phe Phe Ser Phe

465                 470                 475                 480

Gln Thr Asn Gln Ala Gly Ser Ile Ala Asn Ala Gly Ser Val Pro Thr

                485                 490                 495

Tyr Val Trp Thr Arg Arg Asp Val Asp Leu Asn Asn Thr Ile Thr Pro

            500                 505                 510

Asn Arg Ile Thr Gln Leu Pro Leu Val Lys Ala Ser Ala Pro Val Ser

        515                 520                 525

Gly Thr Thr Val Leu Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Gly Ile Leu

    530                 535                 540

Arg Arg Thr Thr Asn Gly Thr Phe Gly Thr Leu Arg Val Thr Val Asn

545                 550                 555                 560

Ser Pro Leu Thr Gln Gln Tyr Arg Leu Arg Val Arg Phe Ala Ser Thr

                565                 570                 575

Gly Asn Phe Ser Ile Arg Val Leu Arg Gly Gly Val Ser Ile Gly Asp

            580                 585                 590

Val Arg Leu Gly Ser Thr Met Asn Arg Gly Gln Glu Leu Thr Tyr Glu

        595                 600                 605

Ser Phe Phe Thr Arg Glu Phe Thr Thr Thr Gly Pro Phe Asn Pro Pro

    610                 615                 620

Phe Thr Phe Thr Gln Ala Gln Glu Ile Leu Thr Val Asn Ala Glu Gly

625                 630                 635                 640

Val Ser Thr Gly Gly Glu Tyr Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Ile Val Pro

                645                 650                 655

Val Asn Pro Ala Arg Glu Ala Glu Glu Asp Leu Glu Ala Ala Lys Lys

            660                 665                 670

Ala

<210>9

<211>2019

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：Cry9Ca1-100％

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2019)

<400>9

atg aat cga aat aat caa aat gaa tat gaa att att gaa gcc ccc cat  48

Met Asn Arg Asn Asn Gln Asn Glu Tyr Glu Ile Ile Glu Ala Pro His

  1               5                  10                  15

tgt ggg tgt cca tca gaa gaa gaa tta agg tat cct ttg gca agt gaa  96

Cys Gly Cys Pro Ser Glu Glu Glu Leu Arg Tyr Pro Leu Ala Ser Glu

             20                  25                  30

cca aat gca gcg tta caa aat atg aac tat aaa gaa tac tta caa atg  144

Pro Asn Ala Ala Leu Gln Asn Met Asn Tyr Lys Glu Tyr Leu Gln Met

         35                  40                  45

aca gaa gag gaa tac act gaa tct tat ata aat cct agt tta tct att  192

Thr Glu Glu Glu Tyr Thr Glu Ser Tyr Ile Asn Pro Ser Leu Ser Ile

     50                  55                  60

agt ggt aga gaa gca tta cag act gcg ctt act gtt att agg aga ata  240

Ser Gly Arg Glu Ala Leu Gln Thr Ala Leu Thr Val Ile Arg Arg Ile

 65                  70                  75                  80

ctc ggg gct tta ggt tta ccg ttt tct gga caa ata tta agt ttt tat  288

Leu Gly Ala Leu Gly Leu Pro Phe Ser Gly Gln Ile Leu Ser Phe Tyr

                 85                  90                  95

caa ttc ctt tta aat aca ctg ttt cca tta aat gaa aca gct ata ttt  336

Gln Phe Leu Leu Asn Thr Leu Phe Pro Leu Asn Glu Thr Ala Ile Phe

            100                 105                 110

gaa gct ttc atg cga cag tta gag gaa ctt tta aat caa caa ata aca  384

Glu Ala Phe Met Arg Gln Leu Glu Glu Leu Leu Asn Gln Gln Ile Thr

        115                 120                 125

gaa ttt gca aga aat cag gca ctt gca aga ttg caa gga tta gga gaa  432

Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala Leu Ala Arg Leu Gln Gly Leu Gly Glu

    130                 135                 140

tct ttt aat tta tat caa cgt tcc ctt caa aat ttt ttg gct gaa cga  480

Ser Phe Asn Leu Tyr Gln Arg Ser Leu Gln Asn Phe Leu Ala Glu Arg

145                 150                 155                 160

aat gaa aca cga aat tta agt tta tta cgt gct caa ttt ata gct tta  528

Asn Glu Thr Arg Asn Leu Ser Leu Leu Arg Ala Gln Phe Ile Ala Leu

                165                 170                 175

gaa ctt gaa ttt tta aat gct att cca ttg ttt gca tta aat gga cag  576

Glu Leu Glu Phe Leu Asn Ala Ile Pro Leu Phe Ala Leu Asn Gly Gln

            180                 185                 190

cag tta cca tta ctg tca tta tat gca caa gct tta aat tta cat ttg  624

Gln Leu Pro Leu Leu Ser Leu Tyr Ala Gln Ala Leu Asn Leu His Leu

        195                 200                 205

tta tta tta aaa gaa gca tct ctt ttt gga gaa gga ttt gga ttc aca  672

Leu Leu Leu Lys Glu Ala Ser Leu Phe Gly Glu Gly Phe Gly Phe Thr

    210                 215                 220

cag ggg gaa att tcc aca tat tat gaa cgt caa ttg gaa cta acc gct  720

Gln Gly Glu Ile Ser Thr Tyr Tyr Glu Arg Gln Leu Glu Leu Thr Ala

225                 230                 235                 240

aag tac act aat tac tgt gaa act ttt tat aat aca ggt tta gaa cgt    768

Lys Tyr Thr Asn Tyr Cys Glu Thr Phe Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg

                245                 250                 255

tta aga gga aca aat act gaa agt ttt tta aga tat cat caa ttc cgt    816

Leu Arg Gly Thr Asn Thr Glu Ser Phe Leu Arg Tyr His Gln Phe Arg

            260                 265                 270

aga gaa atg act tta tta tta tta gaa tta tta gcg cta ttt cca tat    864

Arg Glu Met Thr Leu Leu Leu Leu Glu Leu Leu Ala Leu Phe Pro Tyr

        275                 280                 285

tat gaa tta cga ctt tat cca acg gga tca aac cca cag ctt aca cgt    912

Tyr Glu Leu Arg Leu Tyr Pro Thr Gly Ser Asn Pro Gln Leu Thr Arg

    290                 295                 300

gag tta tat aca gaa ccg att tta ttt aat cca cca gct aat tta gga    960

Glu Leu Tyr Thr Glu Pro Ile Leu Phe Asn Pro Pro Ala Asn Leu Gly

305                 310                 315                 320

ctt tgc cga cgt ttt ggt act aat ccc tat aat act ttt tct gag ctc    1008

Leu Cys Arg Arg Phe Gly Thr Asn Pro Tyr Asn Thr Phe Ser Glu Leu

                325                 330                 335

gaa aat gcc ttc att cgc cca cca cat ctt ttt gaa agg ctg aat agc    1056

Glu Asn Ala Phe Ile Arg Pro Pro His Leu Phe Glu Arg Leu Asn Ser

            340                 345                 350

tta aca atc agc agt aat cga ttt cca tta tca tct aat ttt atg gaa    1104

Leu Thr Ile Ser Ser Asn Arg Phe Pro Leu Ser Ser Asn Phe Met Glu

        355                 360                 365

tat ttt tca gga cat acg tta cgc cgt agt tat ctg aac gaa tca gca    1152

Tyr Phe Ser Gly His Thr Leu Arg Arg Ser Tyr Leu Asn Glu Ser Ala

    370                 375                 380

tta caa gaa gaa agt tat ggc cta att aca acc aca aga gca aca att    1200

Leu Gln Glu Glu Ser Tyr Gly Leu Ile Thr Thr Thr Arg Ala Thr Ile

385                 390                 395                 400

aat ccc gga tta gaa gga aca aac cgc ata gag tca acg gca tta gaa    1248

Asn Pro Gly Leu Glu Gly Thr Asn Arg Ile Glu Ser Thr Ala Leu Glu

                405                 410                 415

ttt cgt tct gca ttg ata ggt ata tat ggc tta aat aga gct tct ttt    1296

Phe Arg Ser Ala Leu Ile Gly Ile Tyr Gly Leu Asn Arg Ala Ser Phe

            420                 425                 430

tta cca gga ggc ttg ttt aat ggt acg act tct cct gct aat gga gga    1344

Leu Pro Gly Gly Leu Phe Asn Gly Thr Thr Ser Pro Ala Asn Gly Gly

        435                 440                 445

tgt aga gaa ctc tat gaa aca aat gaa gaa tta cca cca gaa gaa agt    1392

Cys Arg Glu Leu Tyr Glu Thr Asn Glu Glu Leu Pro Pro Glu Glu Ser

    450                 455                 460

acc gga agt tca acc cat aga cta tct cat tta acc ttt ttt agc ttt    1440

Thr Gly Ser Ser Thr His Arg Leu Ser His Leu Thr Phe Phe Ser Phe

465                 470                 475                 480

caa act aat cag gct gga tct ata gct aat gca gga agt tta cct act    1488

Gln Thr Asn Gln Ala Gly Ser Ile Ala Asn Ala Gly Ser Leu Pro Thr

                485                 490                 495

tat tta ttt acc cgt cgt gaa tta gaa ctt aat aat acg att acc cca    1536

Tyr Leu Phe Thr Arg Arg Glu Leu Glu Leu Asn Asn Thr Ile Thr Pro

            500                 505                 510

aat aga att aca caa tta cca ttg tta aag gca tct gca cct tta tcg    1584

Asn Arg Ile Thr Gln Leu Pro Leu Leu Lys Ala Ser Ala Pro Leu Ser

        515                 520                 525

ggt act acg tta tta aaa ggt cca gga ttt aca gga ggg ggt ata ctc    1632

Gly Thr Thr Leu Leu Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Gly Ile Leu

    530                 535                 540

cga aga aca act aat ggc aca ttt gga acg tta aga tta acg tta aat    1680

Arg Arg Thr Thr Asn Gly Thr Phe Gly Thr Leu Arg Leu Thr Leu Asn

545                 550                 555                 560

tca cca tta aca caa caa tat cgc cta aga tta cgt ttt gcc tca aca    1728

Ser Pro Leu Thr Gln Gln Tyr Arg Leu Arg Leu Arg Phe Ala Ser Thr

                565                 570                 575

gga aat ttc agt ata agg tta ctc cgt gga ggg tta tct atc ggt gaa    1776

Gly Asn Phe Ser Ile Arg Leu Leu Arg Gly Gly Leu Ser Ile Gly Glu

            580                 585                 590

tta aga tta ggg agc aca atg aac aga ggg cag gaa cta act tac gaa    1824

Leu Arg Leu Gly Ser Thr Met Asn Arg Gly Gln Glu Leu Thr Tyr Glu

        595                 600                 605

tcc ttt ttc aca aga gag ttt act act act ggt ccg ttc aat ccg cct    1872

Ser Phe Phe Thr Arg Glu Phe Thr Thr Thr Gly Pro Phe Asn Pro Pro

    610                 615                 620

ttt aca ttt aca caa gct caa gag att cta aca tta aat gca gaa ggt    1920

Phe Thr Phe Thr Gln Ala Gln Glu Ile Leu Thr Leu Asn Ala Glu Gly

625                 630                 635                 640

tta agc acc ggt ggt gaa tat tat ata gaa aga att gaa att tta cct    1968

Leu Ser Thr Gly Gly Glu Tyr Tyr Ile Glu Arg Ile Glu Ile Leu Pro

                645                 650                 655

tta aat ccg gca cga gaa gcg gaa gag gaa tta gaa gcg gcg aag aaa    2016

Leu Asn Pro Ala Arg Glu Ala Glu Glu Glu Leu Glu Ala Ala Lys Lys

            660                 665                 670

gcg                                                                2019

Ala

<210>10

<211>673

<212>PRT

<213>人工序列

<223>人工序列的描述：Cry9Ca1-100％

<400>10

Met Asn Arg Asn Asn Gln Asn Glu Tyr Glu Ile Ile Glu Ala Pro His

  1               5                  10                  15

Cys Gly Cys Pro Ser Glu Glu Glu Leu Arg Tyr Pro Leu Ala Ser Glu

             20                  25                  30

Pro Asn Ala Ala Leu Gln Asn Met Asn Tyr Lys Glu Tyr Leu Gln Met

         35                  40                  45

Thr Glu Glu Glu Tyr Thr Glu Ser Tyr Ile Asn Pro Ser Leu Ser Ile

     50                  55                  60

Ser Gly Arg Glu Ala Leu Gln Thr Ala Leu Thr Val Ile Arg Arg Ile

65                   70                  75                  80

Leu Gly Ala Leu Gly Leu Pro Phe Ser Gly Gln Ile Leu Ser Phe Tyr

                 85                  90                 95

Gln Phe Leu Leu Asn Thr Leu Phe Pro Leu Asn Glu Thr Ala Ile Phe

            100                 105                 110

Glu Ala Phe Met Arg Gln Leu Glu Glu Leu Leu Asn Gln Gln Ile Thr

        115                 120                 125

Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala Leu Ala Arg Leu Gln Gly Leu Gly Glu

    130                 135                 140

Ser Phe Asn Leu Tyr Gln Arg Ser Leu Gln Asn Phe Leu Ala Glu Arg

145                 150                 155                 160

Asn Glu Thr Arg Asn Leu Ser Leu Leu Arg Ala Gln Phe Ile Ala Leu

                165                 170                 175

Glu Leu Glu Phe Leu Asn Ala Ile Pro Leu Phe Ala Leu Asn Gly Gln

            180                 185                 190

Gln Leu Pro Leu Leu Ser Leu Tyr Ala Gln Ala Leu Asn Leu His Leu

        195                 200                 205

Leu Leu Leu Lys Glu Ala Ser Leu Phe Gly Glu Gly Phe Gly Phe Thr

    210                 215                 220

Gln Gly Glu Ile Ser Thr Tyr Tyr Glu Arg Gln Leu Glu Leu Thr Ala

225                 230                 235                 240

Lys Tyr Thr Asn Tyr Cys Glu Thr Phe Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg

                245                 250                 255

Leu Arg Gly Thr Asn Thr Glu Ser Phe Leu Arg Tyr His Gln Phe Arg

            260                 265                 270

Arg Glu Met Thr Leu Leu Leu Leu Glu Leu Leu Ala Leu Phe Pro Tyr

        275                 280                 285

Tyr Glu Leu Arg Leu Tyr Pro Thr Gly Ser Asn Pro Gln Leu Thr Arg

    290                 295                 300

Glu Leu Tyr Thr Glu Pro Ile Leu Phe Asn Pro Pro Ala Asn Leu Gly

305                 310                 315                 320

Leu Cys Arg Arg Phe Gly Thr Asn Pro Tyr Asn Thr Phe Ser Glu Leu

                325                 330                 335

Glu Asn Ala Phe Ile Arg Pro Pro His Leu Phe Glu Arg Leu Asn Ser

            340                 345                 350

Leu Thr Ile Ser Ser Asn Arg Phe Pro Leu Ser Ser Asn Phe Met Glu

        355                 360                 365

Tyr Phe Ser Gly His Thr Leu Arg Arg Ser Tyr Leu Asn Glu Ser Ala

    370                 375                 380

Leu Gln Glu Glu Ser Tyr Gly Leu Ile Thr Thr Thr Arg Ala Thr Ile

385                 390                 395                 400

Asn Pro Gly Leu Glu Gly Thr Asn Arg Ile Glu Ser Thr Ala Leu Glu

                405                 410                 415

Phe Arg Ser Ala Leu Ile Gly Ile Tyr Gly Leu Asn Arg Ala Ser Phe

            420                 425                 430

Leu Pro Gly Gly Leu Phe Asn Gly Thr Thr Ser Pro Ala Asn Gly Gly

        435                 440                 445

Cys Arg Glu Leu Tyr Glu Thr Asn Glu Glu Leu Pro Pro Glu Glu Ser

    450                 455                 460

Thr Gly Ser Ser Thr His Arg Leu Ser His Leu Thr Phe Phe Ser Phe

465                 470                 475                 480

Gln Thr Asn Gln Ala Gly Ser Ile Ala Asn Ala Gly Ser Leu Pro Thr

                485                 490                 495

Tyr Leu Phe Thr Arg Arg Glu Leu Glu Leu Asn Asn Thr Ile Thr Pro

            500                 505                 510

Asn Arg Ile Thr Gln Leu Pro Leu Leu Lys Ala Ser Ala Pro Leu Ser

        515                 520                 525

Gly Thr Thr Leu Leu Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Gly Ile Leu

    530                 535                 540

Arg Arg Thr Thr Asn Gly Thr Phe Gly Thr Leu Arg Leu Thr Leu Asn

545                 550                 555                 560

Ser Pro Leu Thr Gln Gln Tyr Arg Leu Arg Leu Arg Phe Ala Ser Thr

                565                 570                 575

Gly Asn Phe Ser Ile Arg Leu Leu Arg Gly Gly Leu Ser Ile Gly Glu

            580                 585                 590

Leu Arg Leu Gly Ser Thr Met Asn Arg Gly Gln Glu Leu Thr Tyr Glu

        595                 600                 605

Ser Phe Phe Thr Arg Glu Phe Thr Thr Thr Gly Pro Phe Asn Pro Pro

    610                 615                 620

Phe Thr Phe Thr Gln Ala Gln Glu Ile Leu Thr Leu Asn Ala Glu Gly

625                 630                 635                 640

Leu Ser Thr Gly Gly Glu Tyr Tyr Ile Glu Arg Ile Glu Ile Leu Pro

                645                 650                 655

Leu Asn Pro Ala Arg Glu Ala Glu Glu Glu Leu Glu Ala Ala Lys Lys

            660                 665                 670

Ala

<210>11

<211>2019

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：Cry9Ca1-25％

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2019)

<400>11

atg aat cga aat aat caa aat gaa tat gaa att att gat gcc ccc cat  48

Met Asn Arg Asn Asn Gln Asn Glu Tyr Glu Ile Ile Asp Ala Pro His

  1               5                  10                  15

tgt ggg tgt cca tca gat gac gat gtg agg tat cct ttg gca agt gac  96

Cys Gly Cys Pro Ser Asp Asp Asp Val Arg Tyr Pro Leu Ala Ser Asp

             20                  25                  30

cca aat gca gcg tta caa aat atg aac tat aaa gat tac tta caa atg  144

Pro Asn Ala Ala Leu Gln Asn Met Asn Tyr Lys Asp Tyr Leu Gln Met

         35                  40                  45

aca gat gag gac tac act gat tct tat ata aat cct agt tta tct att    192

Thr Asp Glu Asp Tyr Thr Asp Ser Tyr Ile Asn Pro Ser Leu Ser Ile

     50                  55                  60

agt ggt aga gaa gca tta cag act gcg ctt acg tta tta ggg aga ata    240

Ser Gly Arg Glu Ala Leu Gln Thr Ala Leu Thr Leu Leu Gly Arg Ile

 65                  70                  75                  80

ctc ggg gct tta ggt gtt ccg ttt tct gga caa ata tta agt ttt tat    288

Leu Gly Ala Leu Gly Val Pro Phe Ser Gly Gln Ile Leu Ser Phe Tyr

                 85                  90                  95

caa ttc ctt tta aat aca ctg tgg cca gtt aat gat aca gct ata tgg    336

Gln Phe Leu Leu Asn Thr Leu Trp Pro Val Asn Asp Thr Ala Ile Trp

            100                 105                 110

gaa gct ttc atg cga cag gtg gag gaa ctt gtc aat caa caa ata aca    384

Glu Ala Phe Met Arg Gln Val Glu Glu Leu Val Asn Gln Gln Ile Thr

        115                 120                 125

gaa ttt gca aga aat cag gca ctt gca aga ttg caa gga tta gga gaa    432

Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala Leu Ala Arg Leu Gln Gly Leu Gly Glu

    130                 135                 140

tct ttt aat gta tat caa cgt tcc ctt caa aat tgg ttg gct gat cga    480

Ser Phe Asn Val Tyr Gln Arg Ser Leu Gln Asn Trp Leu Ala Asp Arg

145                 150                 155                 160

aat gat aca cga aat tta agt tta tta cgt gct caa ttt ata gct tta    528

Asn Asp Thr Arg Asn Leu Ser Leu Leu Arg Ala Gln Phe Ile Ala Leu

                165                 170                 175

gac ctt gat ttt gtt aat gct att cca ttg ttt gca gta aat gga cag    576

Asp Leu Asp Phe Val Asn Ala Ile Pro Leu Phe Ala Val Asn Gly Gln

            180                 185                 190

cag gtt cca tta ctg tca gta tat gca caa gct tta aat tta cat ttg    624

Gln Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr Ala Gln Ala Leu Asn Leu His Leu

        195                 200                 205

tta tta tta aaa gaa gca tct ctt ttt gga gaa gga tgg gga ttc aca    672

Leu Leu Leu Lys Glu Ala Ser Leu Phe Gly Glu Gly Trp Gly Phe Thr

    210                 215                 220

cag ggg gaa att tcc aca tat tat gaa cgt caa ttg gaa cta acc gct    720

Gln Gly Glu Ile Ser Thr Tyr Tyr Glu Arg Gln Leu Glu Leu Thr Ala

225                 230                 235                 240

aag tac act aat tac tgt gaa act tgg tat aat aca ggt tta gaa cgt    768

Lys Tyr Thr Asn Tyr Cys Glu Thr Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg

                245                 250                 255

tta aga gga aca aat act gaa agt ttt tta aga tat cat caa ttc cgt    816

Leu Arg Gly Thr Asn Thr Glu Ser Phe Leu Arg Tyr His Gln Phe Arg

            260                 265                 270

aga gaa atg act tta gtg gta tta gat gtt gtg gcg cta ttt cca tat    864

Arg Glu Met Thr Leu Val Val Leu Asp Val Val Ala Leu Phe Pro Tyr

        275                 280                 285

tat gat gta cga ctt tat cca acg gga tca aac cca cag ctt aca cgt    912

Tyr Asp Val Arg Leu Tyr Pro Thr Gly Ser Asn Pro Gln Leu Thr Arg

    290                 295                 300

gag gta tat aca gat ccg att gta ttt aat cca cca gct aat tta gga    960

Glu Val Tyr Thr Asp Pro Ile Val Phe Asn Pro Pro Ala Asn Leu Gly

305                 310                 315                 320

ctt tgc cga cgt tgg ggt act aat ccc tat aat act ttt tct gag ctc    1008

Leu Cys Arg Arg Trp Gly Thr Asn Pro Tyr Asn Thr Phe Ser Glu Leu

                325                 330                 335

gaa aat gcc ttc att cgc cca cca cat ctt ttt gaa agg ctg aat agc    1056

Glu Asn Ala Phe Ile Arg Pro Pro His Leu Phe Glu Arg Leu Asn Ser

            340                 345                 350

tta aca atc agc agt aat cga ttt cca gtt tca tct aat ttt atg gaa    1104

Leu Thr Ile Ser Ser Asn Arg Phe Pro Val Ser Ser Asn Phe Met Glu

        355                 360                 365

tat ttt tca gga cat acg tta cgc cgt agt tat ctg aac gat tca gca    1152

Tyr Phe Ser Gly His ThT Leu Arg Arg Ser Tyr Leu Asn Asp Ser Ala

    370                 375                 380

gta caa gaa gat agt tat ggc cta att aca acc aca aga gca aca att    1200

Val Gln Glu Asp Ser Tyr Gly Leu Ile Thr Thr Thr Arg Ala Thr Ile

385                 390                 395                 400

aat ccc gga gtt gat gga aca aac cgc ata gag tca acg gca gta gat    1248

Asn Pro Gly Val Asp Gly Thr Asn Arg Ile Glu Ser Thr Ala Val Asp

                405                 410                 415

ttt cgt tct gca ttg ata ggt ata tat ggc gtg aat aga gct tct ttt    1296

Phe Arg Ser Ala Leu Ile Gly Ile Tyr Gly Val Asn Arg Ala Ser Phe

            420                 425                 430

gtc cca gga ggc ttg ttt aat ggt acg act tct cct gct aat gga gga    1344

Val Pro Gly Gly Leu Phe Asn Gly Thr Thr Ser Pro Ala Asn Gly Gly

        435                 440                 445

tgt aga gat ctc tat gat aca aat gat gaa tta cca cca gat gaa agt    1392

Cys Arg Asp Leu Tyr Asp Thr Asn Asp Glu Leu Pro Pro Asp Glu Ser

    450                 455                 460

acc gga agt tca acc cat aga cta tct cat tta acc ttt ttt agc ttt    1440

Thr Gly Ser Ser Thr His Arg Leu Ser His Leu Thr Phe Phe Ser Phe

465                 470                 475                 480

caa act aat cag gct gga tct ata gct aat gca gga agt gta cct act    1488

Gln Thr Asn Gln Ala Gly Ser Ile Ala Asn Ala Gly Ser Val Pro Thr

                485                 490                 495

tat gtt tgg acc cgt cgt gat gtg gac ctt aat aat acg att acc cca  1536

Tyr Val Trp Thr Arg Arg Asp Val Asp Leu Asn Asn Thr Ile Thr Pro

            500                 505                 510

aat aga att aca caa tta cca ttg gta aag gca tct gca cct gtt tcg  1584

Asn Arg Ile Thr Gln Leu Pro Leu Val Lys Ala Ser Ala Pro Val Ser

        515                 520                 525

ggt act acg gtc tta aaa ggt cca gga ttt aca gga ggg ggt ata ctc  1632

Gly Thr Thr Val Leu Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Gly Ile Leu

    530                 535                 540

cga aga aca act aat ggc aca ttt gga acg tta aga gta acg gtt aat  1680

Arg Arg Thr Thr Asn Gly Thr Phe Gly Thr Leu Arg Val Thr Val Asn

545                 550                 555                 560

tca cca tta aca caa caa tat cgc cra aga tta cgt ttt gcc rca aca  1728

Ser Pro Leu Thr Gln Gln Tyr Arg Leu Arg Leu Arg Phe Ala Ser Thr

                565                 570                 575

gga aat ttc agt ata agg gta ctc cgt gga ggg gtt tct atc ggt gat  1776

Gly Asn Phe Ser Ile Arg Val Leu Arg Gly Gly Val Ser Ile Gly Asp

            580                 585                 590

gtt aga tta ggg agc aca atg aac aga ggg cag gaa cta act tac gaa  1824

Val Arg Leu Gly Ser Thr Met Asn Arg Gly Gln Glu Leu Thr Tyr Glu

        595                 600                 605

tcc ttt ttc aca aga gag ttt act act act ggt ccg ttc aat ccg cct  1872

Ser Phe Phe Thr Arg Glu Phe Thr Thr Thr Gly Pro Phe Asn Pro Pro

    610                 615                 620

ttt aca ttt aca caa gct caa gag att cta aca gtg aat gca gaa ggt  1920

Phe Thr Phe Thr Gln Ala Gln Glu Ile Leu Thr Val Asn Ala Glu Gly

625                 630                 635                 640

gtt agc acc ggt ggt gaa tat tat ata gat aga att gaa att gtc cct  1968

Val Ser Thr Gly Gly Glu Tyr Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Ile Val Pro

                645                 650                 655

gtg aat ccg gca cga gaa gcg gaa gag gat tta gaa gcg gcg aag aaa  2016

Val Asn Pro Ala Arg Glu Ala Glu Glu Asp Leu Glu Ala Ala Lys Lys

            660                 665                 670

gcg                                                              2019

Ala

<210>12

<211>673

<212>PRT

<213>人工序列

<223>人工序列的描述：Cry9Ca1-25％

<400>12

Met Asn Arg Asn Asn Gln Asn Glu Tyr Glu Ile Ile Asp Ala Pro His

  1               5                  10                  15

Cys Gly Cys Pro Ser Asp Asp Asp Val Arg Tyr Pro Leu Ala Ser Asp

             20                  25                  30

Pro Asn Ala Ala Leu Gln Asn Met Asn Tyr Lys Asp Tyr Leu Gln Met

         35                  40                  45

Thr Asp Glu Asp Tyr Thr Asp Ser Tyr Ile Asn Pro Ser Leu Ser Ile

     50                  55                  60

Ser Gly Arg Glu Ala Leu Gln Thr Ala Leu Thr Leu Leu Gly Arg Ile

65                   70                  75                  80

Leu Gly Ala Leu Gly Val Pro Phe Ser Gly Gln Ile Leu Ser Phe Tyr

                 85                  90                  95

Gln Phe Leu Leu Asn Thr Leu Trp Pro Val Asn Asp Thr Ala Ile Trp

            100                 105                 110

Glu Ala Phe Met Arg Gln Val Glu Glu Leu Val Asn Gln Gln Ile Thr

        115                 120                 125

Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala Leu Ala Arg Leu Gln Gly Leu Gly Glu

    130                 135                 140

Ser Phe Asn Val Tyr Gln Arg Ser Leu Gln Asn Trp Leu Ala Asp Arg

145                 150                 155                 160

Asn Asp Thr Arg Asn Leu Ser Leu Leu Arg Ala Gln Phe Ile Ala Leu

                165                 170                 175

Asp Leu Asp Phe Val Asn Ala Ile Pro Leu Phe Ala Val Asn Gly Gln

            180                 185                 190

Gln Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr Ala Gln Ala Leu Asn Leu His Leu

        195                 200                 205

Leu Leu Leu Lys Glu Ala Ser Leu Phe Gly Glu Gly Trp Gly Phe Thr

    210                 215                 220

Gln Gly Glu Ile Ser Thr Tyr Tyr Glu Arg Gln Leu Glu Leu Thr Ala

225                 230                 235                 240

Lys Tyr Thr Asn Tyr Cys Glu Thr Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg

                245                 250                 255

Leu Arg Gly Thr Asn Thr Glu Ser Phe Leu Arg Tyr His Gln Phe Arg

            260                 265                 270

Arg Glu Met Thr Leu Val Val Leu Asp Val Val Ala Leu Phe Pro Tyr

        275                 280                 285

Tyr Asp Val Arg Leu Tyr Pro Thr Gly Ser Asn Pro Gln Leu Thr Arg

    290                 295                 300

Glu Val Tyr Thr Asp Pro Ile Val Phe Asn Pro Pro Ala Asn Leu Gly

305                 310                 315                 320

Leu Cys Arg Arg Trp Gly Thr Asn Pro Tyr Asn Thr Phe Ser Glu Leu

                325                 330                 335

Glu Asn Ala Phe Ile Arg Pro Pro His Leu Phe Glu Arg Leu Asn Ser

            340                 345                 350

Leu Thr Ile Ser Ser Asn Arg Phe Pro Val Ser Ser Asn Phe Met Glu

        355                 360                 365

Tyr Phe Ser Gly His Thr Leu Arg Arg Ser Tyr Leu Asn Asp Ser Ala

    370                 375                 380

Val Gln Glu Asp Ser Tyr Gly Leu Ile Thr Thr Thr Arg Ala Thr Ile

385                 390                 395                 400

Asn Pro Gly Val Asp Gly Thr Asn Arg Ile Glu Ser Thr Ala Val Asp

                405                 410                 415

Phe Arg Ser Ala Leu Ile Gly Ile Tyr Gly Val Asn Arg Ala Ser Phe

            420                 425                 430

Val Pro Gly Gly Leu Phe Asn Gly Thr Thr Ser Pro Ala Asn Gly Gly

        435                 440                 445

Cys Arg Asp Leu Tyr Asp Thr Asn Asp Glu Leu Pro Pro Asp Glu Ser

    450                 455                 460

Thr Gly Ser Ser Thr His Arg Leu Ser His Leu Thr Phe Phe Ser Phe

465                 470                 475                 480

Gln Thr Asn Gln Ala Gly Ser Ile Ala Asn Ala Gly Ser Val Pro Thr

                485                 490                 495

Tyr Val Trp Thr Arg Arg Asp Val Asp Leu Asn Asn Thr Ile Thr Pro

            500                 505                 510

Asn Arg Ile Thr Gln Leu Pro Leu Val Lys Ala Ser Ala Pro Val Ser

        515                 520                 525

Gly Thr Thr Val Leu Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Gly Ile Leu

    530                 535                 540

Arg Arg Thr Thr Asn Gly Thr Phe Gly Thr Leu Arg Val Thr Val Asn

545                 550                 555                 560

Ser Pro Leu Thr Gln Gln Tyr Arg Leu Arg Leu Arg Phe Ala Ser Thr

                565                 570                 575

Gly Asn Phe Ser Ile Arg Val Leu Arg Gly Gly Val Ser Ile Gly Asp

            580                 585                 590

Val Arg Leu Gly Ser Thr Met Asn Arg Gly Gln Glu Leu Thr Tyr Glu

        595                 600                 605

Ser Phe Phe Thr Arg Glu Phe Thr Thr Thr Gly Pro Phe Asn Pro Pro

    610                 615                 620

Phe Thr Phe Thr Gln Ala Gln Glu Ile Leu Thr Val Asn Ala Glu Gly

625                 630                 635                 640

Val Ser Thr Gly Gly Glu Tyr Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Ile Val Pro

                645                 650                 655

Val Asn Pro Ala Arg Glu Ala Glu Glu Asp Leu Glu Ala Ala Lys Lys

            660                 665                 670

Ala

<210>13

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变体1

<400>13

gaattaaatg aatttttaaa tttaagtgtt                                       30

<210>14

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变体2

<400>14

gaattaaatg aattattaaa tttaagtgtt                                       30

<210>15

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变体3

<400>15

gaattattag aatttttatt attaagtgtt                                   30

<210>16

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变体4

<400>16

gaattattag aattattatt attaagtgtt                                   30

<210>17

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变体5

<400>17

gaattattag aagaattatt attaagtgtt                                   30

<210>18

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变体6

<400>18

gaacgattag aatttttatt attaagtgtt                                   30

<210>19

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变体7

<400>19

gaacgattag aattattatt attaagtgtt                                   30

<210>20

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变体8

<400>20

gaattagaag aattattatt attaagtgtt                                   30

<210>21

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变体9

<400>21

gaattattag aagaagaaga attaagtgtt                                   30

<210>22

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变体10

<400>22

tttttattaa atttattttt tttaccatta ctg                               33

<210>23

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：mutant11

<400>23

tttttattaa atttagaaga attaccatta ctg                               33

<210>24

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变体12

<400>24

tttgaagaaa atttagaaga attaccatta ctg                               33

<210>25

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变体13

<400>25

tttgaagaaa attttttatt atttccatta ctg                               33

<210>26

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变体14

<400>26

tttgaagaaa attttgaaga atttccatta ctg                               33

<210>27

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变体15

<400>27

tttttattaa attttgaaga atttccatta ctg                               33

<210>28

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变体16

<400>28

tttttattaa atgaattttt tgaaccatta ctg                               33

<210>29

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变体17

<400>29

ctttttttag aattattttt attc                                         24

<210>30

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变体18

<400>30

ctttttttat tattattttt attc                                         24

<210>31

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变体19

<400>31

ctttttttag aagaatttga atta                                         24

<210>32

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变体20

<400>32

ctttttgaag aagaatttga atta                                         24

<210>33

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变体21

<400>33

ctttttgaag aattatttga agaa                                         24

<210>34

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变体22

<400>34

ttattagaat taaat                                                   15

<210>35

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变体23

<400>35

ttattatttt taaat                                                   15

<210>36

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变体24

<400>36

ttagaattat taaat                                                   15

<210>37

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变体25

<400>37

ttattatttt ttaat                                                   15

<210>38

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变体26

<400>38

ttagaagaat taaat                                                   15

<210>39

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变体27

<400>39

ttagaatttt taaat                                                   15

<210>40

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变体28

<400>40

ttagaatttg aaaat                                                   15

<210>41

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：突变体29

<400>41

ttagaagaag aaaat                                                   15

<210>42

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸1

<400>42

gatcgaaatg atacattaaa tttaagtgtt gtt                               33

<210>43

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸2

<400>43

gatcgaaatg atacatttaa tttaagtgtt gtt                               33

<210>44

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸3

<400>44

gatcgaaatg atacagaaaa tttaagtgtt gtt                               33

<210>45

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸4

<400>45

cgaaatgata cacgattatt aagtgttgtt cgt                               33

<210>46

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸5

<400>46

cgaaatgata cacgagaatt aagtgttgtt cgt                               33

<210>47

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸6

<400>47

ttggctgatc gaaatgaatt tttaaattta agtgttgtt                         39

<210>48

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸7

<400>48

ttggctgatc gaaatgaatt tttattatta agtgttgtt                         39

<210>49

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸8

<400>49

ttggctgatc gaaatgaatt attaaattta agtgttgtt                         39

<210>50

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸9

<400>50

ttggctgatc gaaatgaatt attattatta agtgttgtt                         39

<210>51

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸10

<400>51

ttggctgatc gaaatgaaga agaagaatta agtgttgtt                         39

<210>52

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸11

<400>52

ttggctgatc gaaatgaaga attattatta agtgttgtt                         39

<210>53

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸12

<400>53

caaaattggt tggctgaatt aaatgaatta ttaaat                            36

<210>54

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸13

<400>54

caaaattggt tggctgaatt aaatgaattt ttaaat                            36

<210>55

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸14

<400>55

caaaattggt tggctgaatt attagaattt ttattatta                         39

<210>56

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸15

<400>56

caaaattggt tggctgaatt attagaatta ttattatta                         39

<210>57

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸16

<400>57

caaaattggt tggctgaatt attagaagaa ttattatta                         39

<210>58

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸17

<400>58

caaaattggt tggctgaacg attagaattt ttattatta                         39

<210>59

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸18

<400>59

caaaattggt tggctgaacg attagaatta ttattatta                         39

<210>60

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸19

<400>60

caaaattggt tggctgaatt agaagaatta ttattatta                         39

<210>61

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸20

<400>61

caaaattggt tggctgaatt attagaagaa gaagaatta                         39

<210>62

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸21

<400>62

gctattccat tgtttttatt aaatggacag caggtt                            36

<210>63

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸22

<400>63

gctattccat tgtttgaaga aaatggacag caggtt                            36

<210>64

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸23

<400>64

ttattaaatg gacagcagtt accattactg tcagta                            36

<210>65

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸24

<400>65

ttattaaatg gacagcagtt tccattactg tcagta                            36

<210>66

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸25

<400>66

ttattaaatg gacagcagga accattactg tcagta                            36

<210>67

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸26

<400>67

gaagaaaatg gacagcagtt accattactg tcagta                            36

<210>68

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸27

<400>68

gaagaaaatg gacagcagtt tccattactg tcagta                            36

<210>69

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸28

<400>69

ccattgtttt tattaaattt atttttttta ccattactgt cagta                  45

<210>70

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸29

<400>70

ccattgtttt tattaaattt agaagaatta ccattactgt cagta                  45

<210>71

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸30

<400>71

ccattgtttg aagaaaattt agaagaatta ccattactgt cagta                  45

<210>72

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸31

<400>72

ccattgtttg aagaaaattt tttattattt ccattactgt cagta                  45

<210>73

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸32

<400>73

ccattgtttg aagaaaattt tgaagaattt ccattactgt cagta                  45

<210>74

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸33

<400>74

ccattgtttt tattaaattt tgaagaattt ccattactgt cagta                  45

<210>75

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸34

<400>75

ccattgtttt tattaaatga attttttgaa ccattactgt cagta                  45

<210>76

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸35

<400>76

gatgcatctc tttttttaga aggatgggga ttc                               33

<210>77

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸36

<400>77

gatgcatctc tttttttatt aggatgggga ttcaca                            36

<210>78

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸37

<400>78

gatgcatctc tttttgaaga aggatgggga ttc                               33

<210>79

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸38

<400>79

ttagaaggat ggggattaac acagggggaa att                               33

<210>80

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸39

<400>80

gaagaaggat ggggagaaac acagggggaa att                               33

<210>81

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸40

<400>81

gcatctcttt ttttagaatt atttttattc acacaggggg aaatt                  45

<210>82

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸41

<400>82

gcatctcttt ttttattatt atttttattc acacaggggg aaatt                  45

<210>83

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸42

<400>83

gcatctcttt ttttagaatt atttttattc acacaggggg aaatt                  45

<210>84

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸43

<400>84

gcatctcttt ttgaagaatt atttttattc acacaggggg aaatt                  45

<210>85

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸44

<400>85

 gcatctcttt ttgaagaatt atttttagaa acacaggggg aaatt                 45

<210>86

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸45

<400>86

ggtttagatc gtttattaga attaaatact gaaagttgg                         39

<210>87

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸46

<400>87

ggtttagatc gtttattatt tttaaatact gaaagttgg                         39

<210>88

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸47

<400>88

ggtttagatc gtttagaatt attaaatact gaaagttgg                         39

<210>89

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸48

<400>89

ggtttagatc gtttattatt ttttaatact gaaagttgg                         39

<210>90

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸49

<400>90

ggtttagatc gtttagaaga attaaatact gaaagttgg                         39

<210>91

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸50

<400>91

ggtttagatc gtttagaatt tttaaatact gaaagttgg                         39

<210>92

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸51

<400>92

ggtttagatc gtttagaatt tgaaaatact gaaagttgg                         39

<210>93

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸52

<400>93

ggtttagatc gtttagaaga agaaaatact gaaagttgg                         39

<210>94

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸53

<400>94

tgaatatgaa attattgaag ccccccattg                                   30

<210>95

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸54

<400>95

tgggtgtcca tcagaagaag aattaaggta tcctttggca                        40

<210>96

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸55

<400>96

tcctttggca agtgaaccaa atgcagc                                      27

<210>97

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸56

<400>97

gaactataaa gaatacttac aaatg                                        25

<210>98

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸57

<400>98

caaatgacag aagaggaata cactga                                       26

<210>99

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸58

<400>99

tacactgaat cttatataaa                                              20

<210>100

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸59

<400>100

tattagtggt agagaagcat tacagactgc gcttac                            36

<210>101

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸60

<400>101

cagactgcgc ttactgttat tagggagaat actcggg                           37

<210>102

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸61

<400>102

gggctttagg tttaccgttt tctgg                                        25

<210>103

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸62

<400>103

ttctggacaa atattaagtt tttatcaa                                     28

<210>104

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸63

<400>104

cttttaaata cactgtttcc attaaatgaa acagctatat                        40

<210>105

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸64

<400>105

acagctatat ttgaagcttt catg                                         24

<210>106

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸65

<400>106

ctttcatgcg acagttagag gaactt                                       26

<210>107

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸66

<400>107

gaggaacttt taaatcaaca aataac                                       26

<210>108

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸67

<400>108

ggattaggag aatcttttaa t                                            21

<210>109

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸68

<400>109

tcttttaatt tatatcaacg ttc                                          23

<210>110

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸69

<400>110

ccttcaaaat tttttggctg a                                            21

<210>111

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸70

<400>111

ttggctgaac gaaatga                                                 17

<210>112

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸71

<400>112

cgaaatgaaa cacgaaattt aag                                          23

<210>113

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸72

<400>113

acacgaaatt taagtttatt acgtgctcaa tttatag                           37

<210>114

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸73

<400>114

gctcaattta tagctttaga acttgaattt ttaaatgcta ttccattg               48

<210>115

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸74

<400>115

ccattgtttg cattaaatgg acagcag                                      27

<210>116

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸75

<400>116

ccattgtttg cattaaatgg acagcag                                      27

<210>117

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸76

<400>117

ccattactgt cattatatgc acaagct                                      27

<210>118

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸77

<400>118

tatgcacaag ctttaaattt acatttg                                      27

<210>119

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸78

<400>119

ttattaaaag aagcatctct ttt                                          23

<210>120

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸79

<400>120

tggagaagga tttggattca cacag                                        25

<210>121

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸80

<400>121

cacatattat gaacgtcaat tgga                                         24

<210>122

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸81

<400>122

tactgtgaaa ctttttataa tacaggtt                                     28

<210>123

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸82

<400>123

tacaggttta gaacgtttaa gagga                                        25

<210>124

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸83

<400>124

aatactgaaa gttttttaag atatcatc                                     28

<210>125

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸84

<400>125

gtagagaaat gactttatta ttattagaat tattagcgct atttccatat t           51

<210>126

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸85

<400>126

atattatgaa ttacgacttt atccaac                                      27

<210>127

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸86

<400>127

cttacacgtg agttatatac aga                                          23

<210>128

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸87

<400>128

tatacagaac cgattttatt taatccacc                                    29

<210>129

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸88

<400>129

ccaccagcta atttaggact ttgccgac                                     28

<210>130

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸89

<400>130

ctttgccgac gttttggtac taatccc                                      27

<210>131

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸90

<400>131

catctttttg aaaggctgaa tag                                          23

<210>132

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸91

<400>132

taatcgattt ccattatcat ctaattttat                                   30

<210>133

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸92

<400>133

ctaattttat ggaatatttt tcaggacata cgttac                            36

<210>134

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸93

<400>134

tagttatctg aacgaatcag cattacaaga aga                               33

<210>135

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸94

<400>135

caagaagaaa gttatggcct                                              20

<210>136

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸95

<400>136

caattaatcc cggattagaa ggaacaaacc gcata                             35

<210>137

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸96

<400>137

gagtcaacgg cattagaatt tcgttctgca                                   30

<210>138

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸97

<400>138

ggtatatatg gcttaaatag agcttc                                       26

<210>139

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸98

<400>139

tagagcttct tttttaccag gaggcttgtt                                   30

<210>140

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸99

<400>140

ctgctaatgg aggatgtaga gaactctatg a                                 31

<210>141

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸100

<400>141

ctctatgaaa caaatga                                                 17

<210>142

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸101

<400>142

acaaatgaag aattaccacc                                              20

<210>143

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸102

<400>143

attaccacca gaagaaagta ccggaag                                      27

<210>144

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸103

<400>144

agactatctc atttaacctt ttttagcttt                                   30

<210>145

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸104

<400>145

gctaatgcag gaagtttacc tacttat                                      27

<210>146

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸105

<400>146

cctacttatt tatttacccg tcgtga                                       26

<210>147

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸106

<400>147

acccgtcgtg aattagaact taataatacg att                               33

<210>148

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸107

<400>148

attaccattg ttaaaggcat ctgc                                         24

<210>149

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸108

<400>149

aaggcatctg cacctttatc gggtactacg                                   30

<210>150

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸109

<400>150

tcgggtacta cgttattaaa aggtccagg                                    29

<210>151

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸110

<400>151

acatttggaa cgttaagatt aacgttaaat tcaccattaa                        40

<210>152

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸111

<400>152

cacaacaata tcgcctaaga ttacgttttg cctcaac                           37

<210>153

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸112

<400>153

aaatttcagt ataaggttac tccgtggagg g                                 31

<210>154

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸113

<400>154

ataagggtac tccgtggagg gttatctatc ggtga                             35

<210>155

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸114

<400>155

tctatcggtg aattaagatt agggagcac                                    29

<210>156

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸115

<400>156

caagagattc taacattaaa tgcagaaggt                                   30

<210>157

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸116

<400>157

aatgcagaag gtttaagcac cggtggtgaa ta                                32

<210>158

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸117

<400>158

gtggtgaata ttatatagaa agaattgaaa tt                                32

<210>159

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸118

<400>159

agaattgaaa ttttaccttt aaatccggca cgagaag                           37

<210>160

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸1 19

<400>160

cgagaagcgg aagaggaatt agaagcggcg                                   30

Claims (36)

1.一种胃蛋白酶敏感的修饰的Cry蛋白，其特征在于，所述蛋白有至少一个额外的胃蛋白酶切割位点。

2.如权利要求1所述的修饰的Cry蛋白，其特征在于，所述额外的胃蛋白酶切割位点以选自亮氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸残基的氨基酸残基表示。

3.如权利要求1或2所述的修饰的Cry蛋白，其特征在于，它选自Cry1，Cry3，Cry4，Cry7，Cry8，Cry9，Cry10，Cry16，Cry17，Cry19和Cry20蛋白。

4.如权利要求3所述的修饰的Cry蛋白，其特征在于，它是Cry9C蛋白。

5.如权利要求4所述的修饰的Cry蛋白，其特征在于，它是Cry9Ca1蛋白。

6.如权利要求1-5中任一项所述的修饰的Cry蛋白，其特征在于，它在至少一个域I的间-α-螺旋环中有至少一个额外的胃蛋白酶切割位点。

7.如权利要求1-6中任一项所述的修饰的Cry蛋白，其特征在于，它在至少一个域I的连接α3和α4螺旋的间-α-螺旋环中有至少一个额外的胃蛋白酶切割位点。

8.如权利要求5-7中任一项所述的修饰的Cry蛋白，其特征在于，它在164位有额外的胃蛋白酶切割位点。

9.如权利要求8所述的修饰的Cry蛋白，其特征在于，它选自Cry蛋白，其序列以标识符SEQ ID No.4，SEQ ID No.6或SEQ ID No.8表示。

10.如权利要求1-5中任一项所述的修饰的Cry蛋白，其特征在于，所述额外的胃蛋白酶切割位点是通过用谷氨酸残基取代天冬氨酸残基，苯丙氨酸残基取代色氨酸残基和亮氨酸残基取代缬氨酸或异亮氨酸残基引入的。

11.如权利要求11所述的修饰的Cry蛋白，其特征在于，所述Cry蛋白的取代程度为25％。

12.增加Cry蛋白胃蛋白酶敏感性的方法，其特征在于，至少一个额外的胃蛋白酶或切割位点被引入所述Cry蛋白。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述被引入的额外的胃蛋白酶切割位点以选自亮氨酸，苯丙氨酸和谷氨酸残基的氨基酸表示。

14.如权利要求12和13所述的方法，其特征在于，它被用于选自Cry1，Cry3，Cry4，Cry7，Cry8，Cry9，Cry10，Cry16，Cry17，Cry19和Cry20蛋白。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，它被用于Cry9C蛋白。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，它被用于Cry9Ca1蛋白。

17.如权利要求12-16中任一项所述的方法，其特征在于，至少一个额外的胃蛋白酶切割位点被引入所述Cry蛋白和至少一个域I的间-α-螺旋环。

18.如权利要求12-17中任一项所述的方法，其特征在于，至少一个额外的胃蛋白酶切割位点被引入至少一个域I的连接α和α4螺旋的间-α-螺旋环。

19.如权利要求16-18中任一项所述的方法，其特征在于，额外的胃蛋白酶切割位点被引入164位。

20.如权利要求12-16中任一项所述的方法，其特征在于，所述额外的胃蛋白酶切割位点是通过用谷氨酸残基取代天冬氨酸残基，苯丙氨酸残基取代色氨酸残基和亮氨酸残基取代缬氨酸或异亮氨酸残基引入的。

21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述Cry蛋白的取代程度为25％。

22.一种编码如权利要求1-11中任一项所述的修饰的Cry蛋白的多核苷酸。

23.一种嵌合基因，其特征在于，它至少含有功能性相互连接的以下成分：

(a)在宿主生物中有功能的一个启动子

(b)如权利要求22所述的多核苷酸

(c)在宿主生物中有功能的终止子元件。

24.如权利要求23所述的嵌合基因，其特征在于，所述启动子和终止子元件在植物中有功能。

25.含有权利要求23或24所述的嵌合基因的表达载体或转化载体。

26.如权利要求27所述的载体，其特征在于，它是质粒、噬菌体或病毒。

27.扩被权利要求25或26所述载体转化的宿主生物。

28.如权利要求27所述的宿主生物，其特征在于，它是植物。

29.如权利要求28所述的植物，其特征在于，除权利要求23或24所述的嵌合基因外，它还含有至少一个其它的嵌合基因，所述嵌合基因含有编码感兴趣的蛋白质的多核苷酸。

30.如权利要求29所述的植物部分。

31.来自如权利要求29所述植物的种子。

32.产生如权利要求1-11中任一项所述修饰的Cry蛋白的方法，其特征在于，所述方法至少包括以下步骤：

(a)将本发明的转化的宿主生物培养在适合所述生物生长和繁殖的培养基中，

(b)提取由步骤(a)中培养的转化的生物产生的Cry蛋白。

33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，它包括纯化步骤(b)中提取的Cry蛋白的纯化步骤(c)。

34.如权利要求32或33所述的方法，其特征在于，所述宿主生物是微生物。

35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述宿主生物苏云金芽孢杆菌。

36.单克隆或多克隆载体，其特征在于，它抗权利要求1-11中任一项所述的修饰的Cry蛋白。

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