FR2822157A1

FR2822157A1 - Toxine insecticide de bacillus thuringiensis modifiee sensible a la pepsine

Info

Publication number: FR2822157A1
Application number: FR0103691A
Authority: FR
Inventors: Georges Freyssinet; Cecile Rang; Roger Frutos
Original assignee: Aventis CropScience SA
Current assignee: Bayer CropScience SA
Priority date: 2001-03-19
Filing date: 2001-03-19
Publication date: 2002-09-20
Anticipated expiration: 2021-03-19
Also published as: CN1610744A; WO2002074799A2; AR035696A1; AU2002249311A1; BR0208619A; US20040096934A1; WO2002074799A3; MXPA03008438A; FR2822157B1; EP1370660A2

Abstract

La présente invention concerne la dégradation des protéines Cry de Bacillus thuringiensis dans le tractus digestif des mammifères. Elle a pour objet des protéines Cry de Bacillus thuringiensis dont la séquence peptidique a été modifiée de manière à les rendre sensibles aux enzymes spécifiques du tractus digestif des mammifères, en particulier aux pepsines. Selon cette invention, les protéines Cry sont modifiées par insertion de sites de coupure par la pepsine dans leur séquence peptidique. L'invention concerne également des plantes transformées exprimant ces protéines Cry modifiées.

Description

Toxine insecticide de Bacillus thuringiensis modifiée sensible à la pepsine
La présente invention concerne la dégradation des protéines Cry de Bacillus thuringiensis dans le tractus digestif des mammifères. Elle a pour objet des protéines Cry de Bacillus thuringiensis dont la séquence peptidique a été modifiée de manière à les rendre sensibles aux enzymes spécifiques du tractus digestif des mammifères, en particulier aux pepsines. Selon cette invention, les protéines Cry sont modifiées par insertion de sites de coupure par la pepsine dans leur séquence peptidique. L'invention concerne également des plantes transformées exprimant ces protéines Cry modifiées.

Les bactéries de l'espèce Bacillus thuringiensis (ci-après Bt) sont bien connues pour les toxines insecticides qu'elles produisent. Ces bactéries à Gram-positif forment un cristal protéique parasporal au cours de leur phase de croissance stationnaire, lequel cristal est largement responsable de leur activité insecticide. Le cristal de ces bactéries est constitué d'une toxine insecticide de nature protéique nommée protéine Cry et codée par un gène cry. De par ses propriétés insecticides, cette protéine Cry a été employée en protection des cultures contre les insectes ravageurs, en tant que solution alternative aux insecticides de synthèse. Actuellement, cette utilisation agronomique se réalise essentiellement par deux méthodes, l'épandage direct du produit en tant que biopesticide, et la transformation génétique des plantes cultivées avec un gène codant pour une protéine Cry. Selon les souches de Bt dont elles sont issues, les protéines Cry ont des activités insecticides vis-à-vis de spectres d'insectes différents. Les principaux ordres d'insectes contre lesquels sont actives les toxines Cry sont les Lépidoptères, les Coléoptères et les Diptères, mais certaines toxines sont efficaces vis-à-vis d'autres ordres d'insectes. L'ensemble des protéines Cry isolées des différentes souches de Bt est rassemblé dans une classification en fonction de leurs homologies de séquences, et un code leur est attribué afin de les distinguer (Crickmore et al., 1998, Microbiol. Molec. Biol. Review 62 (3), 807-813). L'intérêt de l'utilisation de ces toxines en agriculture réside donc dans leur spécificité d'action vis-à-vis d'un ou de plusieurs ordres d'insectes donnés, mais aussi dans leur absence de toxicité vis-à-vis des mammifères, des oiseaux, des amphibiens et des reptiles.

Cette absence de toxicité vis-à-vis des mammifères a permis le développement de la culture de plantes transgéniques exprimant une protéine Cry et l'utilisation des graines de ces plantes pour l'alimentation humaine et animale. Toutefois, bien que non toxiques vis-à-vis des

mammifères, certaines de ces protéines sont peu dégradées dans le tractus digestif des mammifères, et cette absence de dégradation conduit à une persistance relativement longue de la toxine dans le tractus digestif desdits mammifères. En outre, l'absence de persistence des protéines Cry dans le tractus digestif des mammifères est un des critères pris en compte par les autorités administratives (par exemple, l'Agence pour la Protection de l'Environnement-EPA- des Etats-Unis) délivrant des autorisations de mise sur le marché alimentaire de graines contenant ces protéines ou de produits issus de ces graines.

La présente invention permet de pallier l'inconvénient ci-dessus mentionné. Cette invention est basée sur le principe selon lequel la stabilité de certaines protéines Cry dans le tractus digestif des mammifères serait due à une absence de sensibilité de ces protéines aux enzymes spécifiques dudit tractus digestif, en particulier aux protéases. La solution à ce problème réside donc dans l'intégration artificielle de sites spécifiques, propres aux enzymes du tractus digestif des mammifères, dans la protéine Cry. La présente invention a donc pour objet des protéines Cry modifiées sensibles aux enzymes spécifiques du tractus digestif des mammifères, en particulier les protéases spécifiques de l'estomac des mammifères, et plus particulièrement les pepsines. La pepsine est une enzyme particulière de la famille des protéases, et elle est majoritairement présente dans l'estomac des mammifères (95% des protéases stomacales). Il s'agit d'une protéase à site aspartique agissant à un pH optimum égal à 2. La pepsine est une enzyme de choix comme source de dégradation des protéines Cry car elle n'est pas présente dans le tube digestif des insectes, en particulier des lépidoptères dont le pH du tube digestif est compris entre 10 et 11 (Terra, W. B. and C. Ferreira. 1994. Insect digestive enzymes : properties, compartimentalization and funcition. Comp. Biochem. Physiol. 109B : 1-62. ). Cette absence de pepsine chez les insectes est donc une garantie que l'introduction de sites spécifiques à la pepsine dans les protéines Cry ne présente pas de risque d'augmentation de leur dégradation dans le tube digestif des insectes. La présente invention est donc une solution au problème technique ci-dessus exposé, à savoir une augmentation de la sensibilité des protéines Cry aux enzymes du tractus digestif des mammifères, sans altération des propriétés insecticides desdites protéines Cry.

Toutefois, la protéine Cry est une protéine très organisée dont la forme activée est composée de trois domaines, et dans laquelle les relations structure-fonction sont très fortes dans et entre les domaines. Ce niveau d'organisation important des protéines Cry ne permet pas l'insertion aléatoire de mutations dans la protéine. En effet, l'insertion de sites de coupure spécifiques aux enzymes stomacales de mammifères ne doit pas altérer les propriétés insecticides

des toxines.

Les protéines Cry sont naturellement produites par la bactérie Bacillus thuringiensis sous forme de protoxines inactives. Le mode d'action naturel de ces protéines implique la solubilisation du cristal protéique dans l'intestin de l'insecte, la dégradation protéolytique de la protoxine libérée, la fixation de la toxine activée sur les récepteurs de l'intestin des insectes, et l'insertion de la toxine dans la membrane apicale des cellules intestinales pour créer des pores ou canaux ioniques. La dégradation protéolytique de la protoxine dans l'intestin des insectes est réalisée sous l'action conjuguée du pH alcalin et des protéases à sites sérines (essentiellement la trypsine) du suc digestif (Schnepf et al., 1998).

Les toxines Cry sont constituées de trois domaines structuraux, le domaine I, le domaine II et le domaine III. Le domaine 1 occupe environ la moitié N-terminale de la toxine activée. Les domaines II et III occupent environ chacun un quart de la toxine activée. Le domaine III est situé à l'extrémité C-terminale de la toxine activée. Chaque domaine de la protéine Cry possède sa propre structure et sa propre fonction.

Le domaine 1 est constitué de sept hélices alpha, 6 hélices amphiphiles et une hélice hydrophobe, reliées entre-elles par des boucles interhélices constituées de quelques acides aminés. Ce domaine est le domaine transmembranaire, responsable de la formation du pore ou

canal ionique (Aronson et al., 1995 ; Chen et al., 1993 ; Manoj-Kumar et Aronson, 1999 ; Masson et al., 1999 ; Rang et al., 1999 ; Coux et al., 1999). La formation du pore transmembranaire par les hélices alpha du domaine 1 implique en fait quatre protéines Cry formant un pore complet avec leurs quatre hélices alpha 4 respectives (Masson et al., 1999). Il se forme donc un pore cylindrique de quatre hélices a 4. L'intérieur de ce pore est constitué par les faces hydrophiles des hélices amphiphiles, les résidus chargés négativement étant présents sur les faces hydrophiles, ils se retrouvent dans la lumière du pore, en milieu aqueux et remplissent leur fonction de transport d'ions. L'extérieur du pore est constitué par les faces hydrophobes qui ancrent le pore dans la membrane lipidique. La formation du pore par les hélices a du domaine 1 implique donc des relations structure-fonction très fortes et des changements de conformation au cours du temps. L'introduction de mutations dans les hélices alpha du domaine 1 présente donc une forte probabilité de perturbation de la fonction de ce domaine, et donc de l'activité de la toxine.

Les domaines II et III de la toxine activée sont constitués de feuillets béta, eux aussi sous une forme très compactée. Ces deux domaines sont impliqués dans la reconnaissance du site récepteur (spécificité) et dans la stabilité de la toxine (Abdul-Rauf et Ellar, 1999 ; Dean et al.,

1996 ; Hussain et al., 1996 ; Lee et al., 1999 ; Rajamohan et al., 1996, 1998 ; Wu et Dean, 1996).

Des échanges de domaines III induisent des changements de spécificité (de Maagd et al., 1999).

Cette région est beaucoup moins conservée, donc plus variable que le domaine 1. Elle est impliquée dans la spécificité de chaque toxine. Cette variabilité et ces interactions propres à chaque toxine interviennent dans la nature du spectre d'hôtes très spécifique de chaque toxine et sont impliqués dans la reconnaissance de sites récepteurs différents. La reconnaissance du récepteur est effectuée par des boucles du domaine II et du domaine III et la conformation de ces boucles varie subtilement d'une toxine à l'autre en fonction de l'arrangement et des interactions entre les domaines II et III. Le domaine 1 interfère aussi avec les deux autres domaines et influence la conformation générale (Rang et al., 1999,2001). En outre, très peu de choses sont connues sur les relations structure-fonction au sein de ces deux domaines et aucune information n'est actuellement disponible sur la conformation nécessaire à la reconnaissance d'un site récepteur. Il est donc très difficile de présager des conséquences de l'introduction de modifications dans les domaines II et III sur la spécificité, la capacité à reconnaître les sites récepteurs et la toxicité des protéines Cry. Par ailleurs, on sait que des mutations générées dans les domaines II et III induisent très souvent une déstabilisation de la toxine chez l'insecte, entraînant une perte de toxicité.

Des ponts salins existent également entre les domaines 1 et II des protéines Cry. Ces ponts jouent un rôle important dans la stabilité de la toxine et dans son fonctionnement.

L'élimination artificielle de ces ponts chez CrylAal montre que les protoxines et toxines activées sont moins stables que la protéine parentale (Vachon et al., 2000). Ces ponts salins sont présents entre le domaine II et l'hélice a7 du domaine I. L'importance reconnue de ces ponts laisse supposer que des mutations dans le domaine II et l'hélice a7 du domaine 1 présentent un risque élevé de perturbation du fonctionnement des protéines Cry.

Description
La présente invention concerne une protéine Cry modifiée sensible à la pepsine, caractérisée en ce qu'elle possède au moins un site de coupure par la pepsine additionnel.

Par protéine Cry, on entend la protéine insecticide produite par une souche de bactérie Bacillus thuringiensis (ci après désignée Bt), dont les différents holotypes existants et à venir sont référencés par le comité de classification de Bt (Crikmore, 2001) et accessibles sur le site Internet http : //www. biols. susx. ac. uk/Home/Neil Crickmore/Bt/index. html. En particulier, cette protéine Cry est codée par un gène cry, soit naturellement par la bactérie Bt, soit de manière recombinante dans un organisme hôte transformé avec un gène cry ou avec un gène comprenant au moins la séquence codante d'une protéine Cry. Les protéines Cry selon l'invention comprennent également des protéines Cry dont la séquence a été artificiellement modifiée de manière à augmenter leur activité insecticide ou leur résistance aux conditions de traitement.

Cette définition inclus également des fragments de protéines Cry conservant l'activité insecticide, telles que les protéines Cry tronquées ne comportant que la partie N-terminale d'une protéine Cry complète, en particulier le domaine 1 de cette protéine (WO 94/05771). Sont également comprises les protéines Cry fusionnées telles que décrites dans la demande de brevet internationale WO 94/24264. De manière préférée, la protéine Cry selon l'invention est sélectionnée parmi les protéines Cryl, Cry3, Cry4, Cry7, Cry8, Cry9, CrylO, Cryl6, Cryl7, Cryl9, ou Cry20. De manière préférentielle, il s'agit de la protéine Cry9C, et de préférence la protéine Cry9Cal (Lambert et al., Appl. Environm. Microbiol. 62, 80-86 ; WO 94/05771). En particulier, la présente invention s'adapte également à toute protéine Cry dont la toxicité a été améliorée, comme par exemple celles décrites dans les demandes de brevets WO 97/49814 ou WO 99/00407.

Selon la présente invention, la protéine Cry est modifiée. On entend par protéine Cry modifiée, une protéine Cry dont la séquence peptidique est différente de la séquence de la protéine Cry native dont elle est issue. Cette différence de séquences est le résultat de modifications artificielles introduites par ingénierie génétique, notamment l'insertion ou la substitution de résidus acides aminés spécifiques dans ladite séquence peptidique. En particulier, la protéine Cry modifiée est produite par modification de la séquence nucléotidique la codant, notamment par la technique de mutagenèse dirigée bien connue de l'homme du métier (Hutchinson C. A et al., 1978, J. Biol. Chem. 253 : 6551). De manière préférée, la modification de la protéine Cry consiste en une substitution de résidus acides aminés.

La protéine Cry modifiée selon l'invention est sensible à la pepsine. La pepsine focalise son action protéolytique au niveau de sites de coupure spécifiques constitués par les acides aminés leucine, phénylalanine et l'acide glutamique. La protéolyse est réalisée du côté C-terminal du résidu concerné. Par sensible à la pepsine, on entend selon l'invention la propriété pour la protéine Cry modifiée de subir une protéolyse par la pepsine. La protéolyse de la protéine Cry conduit à la perte partielle ou totale de l'activité insecticide de ladite protéine. La sensibilité à la pepsine peut donc se mesurer par mise en contact, de préférence in vitro, d'une protéine Cry modifiée selon l'invention avec une pepsine, puis mesure de la perte d'activité insecticide de ladite protéine Cry modifiée en comparaison avec une protéine Cry native, non modifiée selon l'invention. A titre d'exemple, les tests décrits dans les exemples 7 et 8 peuvent être employés pour mesurer la sensibilité à la pepsine d'une protéine Cry selon l'invention. Alternativement, la technique du Western blot peut également être utilisée pour mesurer ladite sensibilité à la pepsine. Par cette technique, la sensibilité est mesurée par l'observation de la dégradation structurelle de la protéine Cry modifiée après contact avec une pepsine. Cette observation consiste en la disparition ou l'atténuation d'intensité d'une bande correspondant à la protéine Cry sur une membrane de transfert d'un gel d'électrophorèse par rapport à une protéine Cry native, non modifiée selon l'invention. La mise en oeuvre de ces techniques fait partie des connaissances générales de l'homme du métier.

La protéine Cry modifiée selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle possède au moins un site de coupure par la pepsine additionnel. Par"site de coupure par la pepsine", on entend un site constitué d'au moins un résidu acide aminé reconnu comme site de protéolyse par la pepsine. Les résidus acides aminés reconnus par la pepsine sont la leucine, phénylalanine ou l'acide glutamique. Par"site de coupure par la pepsine additionnel", on entend un site de coupure supplémentaire par rapport à la protéine Cry native telle que produite par la bactérie Bt.

De manière préférée, le site de coupure par la pepsine additionnel est représenté par un résidu acide aminé sélectionné parmi les résidus leucine, phénylalanine ou acide glutamique. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la protéine Cry modifiée possède plusieurs sites de coupure par la pepsine additionnels représentés par un même résidu acide aminé. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la protéine Cry modifiée possède plusieurs sites de coupure par la pepsine additionnels représentés par des résidus acides aminés différents.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la protéine Cry modifiée selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle possède au moins un site de coupure par la pepsine additionnel dans au moins une des boucles inter-hélices alpha du domaine 1. Par boucles interhélices alpha du domaine I", on entend les chaînes peptidiques reliant les sept hélices alpha du domaine 1 des protéines Cry telles que décrites dans Grochulski et al. (1995) et Li et al. (1991).

Selon l'invention, la protéine Cry doit posséder au moins un site de coupure par la pepsine additionnel. En outre, ledit site de coupure additionnel se trouve dans au moins une des boucles inter-hélices alpha du domaine 1. Le terme additionnel s'entend donc comme supplémentaire par rapport au nombre de sites de coupure par la pepsine naturellement présents dans les boucles inter-hélices alpha du domaine 1 de la protéine Cry native telle que produite par la bactérie Bt.

Cette définition signifie que la protéine Cry modifiée selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle possède un nombre de sites de coupure par la pepsine dans ses boucles inter-hélices alpha du domaine 1 supérieur au nombre de ces sites dans la même protéine Cry native telle que produite par la bactérie Bt, la différence entre lesdits nombres étant au minimum égale à 1.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la protéine Cry modifiée selon l'invention possède au moins un site de coupure par la pepsine dans la boucle inter-hélices alpha reliant les hélices alpha 3 et 4 du domaine I.

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la protéine Cry modifiée est une protéine Cry9C modifiée. De préférence, la protéine Cry modifiée est une protéine Cry9Cal modifiée, possédant un site de coupure par la pepsine positionné sur le résidu acide aminé 164.

En particulier, le résidu arginine naturellement présent en position 164 sur la protéine Cry9Cal est remplacé par un résidu acide aminé choisi parmi les résidus leucine, phénylalanine ou acide glutamique sur la protéine Cry9Cal modifiée selon l'invention. De manière préférée, la protéine Cry9Cal modifiée selon l'invention est sélectionnée parmi les protéines Cry dont les séquences sont représentées par les identificateurs SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6 ou SEQ ID NO : 8.

La présente invention concerne également une protéine Cry modifiée sensible à la pepsine, caractérisée en ce que les sites de coupure par la pepsine additionnels qu'elle possède sont introduits par substitution de résidus acide aspartique par des résidus acide glutamique, substitution de résidus tryptophane par des résidus phénylalanine, et substitution de résidus valine ou isoleucine par des résidus leucine. De préférence, le taux de substitution que possède ladite protéine Cry modifiée est de 25%. Par taux de substitution, on entend le pourcentage de

résidus acides aminés de la protéine Cry native qui sont remplacés par des résidus acides aminés correspondant à des sites de coupure par la pepsine dans la protéine Cry modifiée de l'invention.

La présente invention a également pour objet un procédé d'augmentation de la sensibilité à la pepsine des protéines Cry, caractérisé en ce que l'on introduit au moins un site de coupure par la pepsine additionnel dans lesdites protéines Cry. Par"augmentation de la sensibilité à la pepsine des protéines Cry", on entend un accroissement de la sensibilité à la pepsine des protéines Cry obtenues par ledit procédé par rapport aux protéines Cry natives correspondantes, cet accroissement se traduisant par une destruction protéolytique et une perte d'activité insecticide des protéines Cry, ces effets pouvant être partiels ou totaux.

L'introduction d'au moins un site de coupure par la pepsine est réalisée de manière artificielle par ingénierie génétique. En particulier, il s'agit d'une insertion ou d'une substitution de résidus acide aminés. De préférence, il s'agit d'une substitution. Une telle substitution peut aisément être réalisée par la technique de mutagenèse dirigée bien connue de l'homme du métier.

De manière préférée, la protéine Cry auquel s'applique le procédé selon l'invention est sélectionnée parmi les protéines Cryl, Cry3, Cry4, Cry7, Cry8, Cry9, CrylO, Cryl6, Cryl7, Cryl9, ou Cry20. De manière préférentielle, il s'agit de la protéine Cry9C, et de préférence la protéine Cry9Cal.

En particulier, le site de coupure par la pepsine additionnel est représenté par un résidu acide aminé choisi parmi les résidus leucine, phénylalanine ou acide glutamique.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce qu'au moins un site de coupure par la pepsine additionnel est introduit dans au moins une des boucles inter-hélices alpha du domaine 1 de ladite protéine Cry.

Selon un autre mode particulier de réalisation de l'invention, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce qu'au moins un site de coupure par la pepsine additionnel est introduit dans la boucle inter-hélices alpha reliant les hélices alpha 3 et 4 du domaine 1.

Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le présent procédé s'applique à une protéine Cry9C. De préférence, il s'applique à une protéine Cry9Cal, et le site de coupure par la pepsine additionnel est introduit par substitution du résidu acide aminé 164. En particulier, le

résidu arginine naturellement présent en position 164 sur la protéine Cry9Cal est remplacé par un résidu acide aminé choisi parmi les résidus leucine, phénylalanine ou acide glutamique.

La présente invention concerne également un procédé d'augmentation de la sensibilité à la pepsine des protéines Cry, caractérisé en ce que les sites de coupure par la pepsine additionnels sont introduits par substitution de résidus acide aspartique par des résidus acide glutamique, substitution de résidus tryptophane par des résidus phénylalanine, et substitution de résidus valine ou isoleucine par des résidus leucine.

De manière préférée, le taux de substitution introduit dans ladite protéine Cry est de 25 %.

La présente invention concerne également un polynucléotide codant pour une protéine Cry modifiée selon l'invention. Selon la présente invention, on entend par"polynucléotide"une séquence nucléotidique naturelle ou artificielle pouvant être de type ADN ou ARN, de préférence de type ADN, notamment double brin.

La présente invention concerne également un gène chimère comprenant au moins, liés entre eux de manière opérationnelle, un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte, un polynucléotide codant pour une protéine Cry modifiée selon l'invention, et un élément terminateur fonctionnel dans ce même organisme hôte. Les différents éléments qu'un gène chimère peut contenir sont, d'une part, des éléments régulateurs de la transcription, de la traduction et de la maturation des protéines, tels qu'un promoteur, une séquence codant pour un peptide signal ou un peptide de transit, ou un élément terminateur constituant un signal de polyadénylation, et d'autre part un polynucléotide codant pour une protéine. L'expression"liés entre eux de manière opérationnelle"signifie que lesdits éléments du gène chimère sont liés entre eux de manière à ce que le fonctionnement d'un de ces éléments est affecté par celui d'un autre.

A titre d'exemple, un promoteur est lié de manière opérationnelle à une séquence codante lorsqu'il est capable d'affecter l'expression de ladite séquence codante. La construction du gène chimère selon l'invention et l'assemblage de ses différents éléments est réalisable par l'emploi de techniques bien connues de l'homme du métier, notamment celles décrites dans Sambrook et al.

(1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Nolan C. ed., New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press). Le choix des éléments régulateurs constituant le gène chimère est essentiellement fonction de l'espèce hôte dans laquelle ils doivent fonctionner, et l'homme du métier est capable de sélectionner des éléments régulateurs fonctionnels dans un organisme hôte donné. Par"fonctionnels", on entend capables de fonctionner dans un organisme hôte donné.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le gène chimère contient un promoteur dit"constitutif. Un promoteur constitutif selon la présente invention est un promoteur qui induit l'expression d'une séquence codante dans tous les tissus d'un organisme hôte et en permanence, c'est-à-dire durant toute la durée du cycle vital dudit organisme hôte.

Certains de ces promoteurs peuvent être tissu-spécifiques, c'est-à-dire exprimer la séquence codante en permanence, mais uniquement dans un tissu particulier de l'organisme hôte. Des promoteurs constitutifs peuvent provenir de tout type d'organisme. Parmi les promoteurs constitutifs qui peuvent être utilisés dans le gène chimère de la présente invention, nous pouvons citer à titre d'exemple, des promoteurs bactériens, comme celui du gène de l'octopine synthase ou celui du gène de la nopaline synthase, des promoteurs viraux, comme celui du gène contrôlant la transcription des ARN19S ou 35S du virus de la mosaïque du Choux-Fleur (Odell et al., 1985, Nature, 313,810-812), ou les promoteurs du virus de la mosaïque de la nervure du Manioc (tels que décrits dans la demande de brevet WO 97/48819). Parmi les promoteurs d'origine végétale on citera le promoteur du gène de la petite sous-unité de ribulose-biscarboxylase/oxygénase (RuBisCO), le promoteur d'un gène d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 507 698, le promoteur du gène EFl-alpha (WO 90/02172), le promoteur d'un gène d'actine (US 5,641, 876), ou le promoteur d'un gène d'ubiquitine (EP 0342926).

Selon un autre mode particulier de réalisation de l'invention, le gène chimère contient un promoteur inductible. Un promoteur inductible est un promoteur qui ne fonctionne, c'est-à-dire qui n'induit l'expression d'une séquence codante, que lorsqu'il est lui-même induit par un agent inducteur. Cet agent inducteur est en général une substance qui peut être synthétisée dans l'organisme hôte suite à un stimulus externe audit organisme, ce stimulus externe pouvant être de nature physique ou chimique, biotique ou abiotique. De tels promoteurs sont connus, comme par exemple le promoteur du gène d'O-méthyltransférase de classe II (COMT II) de plante décrit dans la demande de brevet WO 00/56897, le promoteur PR-1 d'Arabidopsis (Lebel et al., 1998, Plant J. 16 (2) : 223-233), le promoteur EAS4 du gène de la sesquiterpène synthase du Tabac (Yin et al., 1997, Plant Physiol. 115 (2), 437-451), ou le promoteur du gène codant la 3-hydroxy-3methylglutaryl coenzyme A reductase (Nelson et al., 1994, Plant Mol. Biol. 25 (3) : 401-412).

Parmi les éléments terminateurs pouvant être utilisés dans le gène chimère de la présente invention, nous pouvons citer à titre d'exemple l'élément terminateur nos du gène codant la nopaline synthase d'Agrobacterium tumefaciens (Bevan et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11 (2), 369-385), ou l'élément terminateur d'un gène d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 633 317.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le promoteur et l'élément terminateur du gène chimère selon l'invention sont tous les deux fonctionnels dans les plantes.

Il apparaît également important que le gène chimère comprenne aussi un peptide signal ou un peptide de transit qui permet de contrôler et d'orienter la production de la protéine Cry de manière spécifique dans un compartiment cellulaire de l'organisme hôte, comme par exemple le cytoplasme, un compartiment particulier du cytoplasme, la membrane cellulaire, ou dans le cas des plantes dans un type particulier de compartiments cellulaires, par exemple les chloroplastes, ou dans la matrice extracellulaire.

Les peptides de transit peuvent être soit simples, soit doubles. Les peptides de transit doubles sont éventuellement séparés par une séquence intermédiaire, c'est-à-dire qu'ils comprennent, dans le sens de la transcription, une séquence codant pour un peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, une partie de séquence de la partie mature N-terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, puis une séquence codant pour un second peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale. De tels peptides de transit doubles sont par exemple décrits dans la demande de brevet EP 0 508 909.

Comme peptide signal utile selon l'invention, on peut citer en particulier le peptide signal du gène PR-la du tabac décrit par Comelissen et al. (1987, Nucleic Acid Res. 15,6799-6811) en particulier lorsque le gène chimère selon l'invention est introduit dans des cellules végétales ou des plantes.

La présente invention concerne également un vecteur contenant un gène chimère selon l'invention. Un tel vecteur est utile pour transformer un organisme hôte et exprimer dans celui-ci une protéine Cry modifiée selon l'invention. Ce vecteur peut être un plasmide, un cosmide, un bactériophage ou un virus. De manière générale, les principales qualités de ce vecteur doivent être une capacité à se maintenir et à s'autorépliquer dans les cellules de l'organisme hôte, notamment grâce à la présence d'une origine de réplication, et à y exprimer une protéine Cry modifiée. Le choix d'un tel vecteur ainsi que les techniques d'insertion dans celui-ci du gène chimère selon l'invention sont largement décrits dans Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Nonan C. ed., New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press) et font partie des connaissances générales de l'homme du métier. Le vecteur utilisé dans la présente

invention peut également contenir, en plus du gène chimère de l'invention, un gène chimère contenant un marqueur de sélection. Ce marqueur de sélection permet de sélectionner les organismes hôtes effectivement transformés, c'est-à-dire ceux ayant incorporé le vecteur. Parmi les marqueurs de sélection utilisables dans de nombreux organismes hôtes, on peut citer des marqueurs contenant des gènes de résistance aux antibiotiques tel que celui du gène de l'hygromycine phosphotransférase (Gritz et al., 1983, Gene 25 : 179-188). De manière préférentielle, l'organisme hôte à transformer est une plante. Parmi les marqueurs de sélection utilisables dans les plantes, on peut citer des marqueurs contenant des gènes de tolérance aux herbicides tel que le gène bar (White et al., NAR 18 : 1062, 1990) pour la tolérance au bialaphos, le gène EPSPS (US 5,188, 642) pour la tolérance au glyphosate ou encore le gène HPPD (WO 96/38567) pour la tolérance aux isoxazoles. On peut également citer des gènes codant pour des enzymes facilement identifiables comme l'enzyme GUS, des gènes codant pour des pigments ou des enzymes régulant la production de pigments dans les cellules transformées. De tels gènes marqueurs de sélection sont notamment décrits dans les demandes de brevet WO 91/02071 et WO 95/06128.

La présente invention concerne également des organismes hôtes transformés par un vecteur tel que décrit ci-dessus. Par organismes hôtes, on entend tout type d'organismes, en particulier des plantes ou des microorganismes tels que les bactéries, les virus, les champignons ou les levures. On entend par"organisme hôte transformé", un organisme hôte qui a incorporé dans son génome le gène chimère de l'invention, et produit en conséquence une protéine Cry modifiée selon l'invention dans ses tissus. Pour obtenir les organismes hôtes selon l'invention, l'homme du métier peut utiliser une des nombreuses méthodes de transformation connues. Une de ces méthodes consiste à mettre les cellules à transformer en présence de polyéthylène glycol (PEG) et des vecteurs de l'invention (Chang and Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168 (1), 111- 115 ; Mercenier and Chassy, 1988, Biochimie 70 (4), 503-517). L'électroporation est une autre méthode qui consiste à soumettre les cellules ou tissus à transformer et les vecteurs de l'invention à un champ électrique (Andreason and Evans, 1988, Biotechniques 6 (7), 650-660 ; Shigekawa and Dower, 1989, Aust. J. Biotechnol. 3 (1), 56-62). Une autre méthode consiste à directement injecter les vecteurs dans les cellules ou les tissus hôtes par micro-injection (Gordon and Ruddle, 1985, Gene 33 (2), 121-136). De manière avantageuse, la méthode dite de"biolistique"pourra être utilisée. Elle consiste à bombarder des cellules ou des tissus avec des particules sur lesquelles sont adsorbés les vecteurs de l'invention (Bruce et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sei.

USA 86 (24), 9692-9696 ; Klein et al., 1992, Biotechnology 10 (3), 286-291 ; US Patent No.

4,945, 050). De manière préférentielle, la transformation de plantes se fera à l'aide de bactéries du

genre Agrobacterium, de préférence par infection des cellules ou tissus desdites plantes par A.

tumefaciens (Knopf, 1979, Subcell. Biochem. 6, 143-173 ; Shaw et al., 1983, Gene 23 (3) : 315- 330) ou A. rhizogenes (Bevan et Chilton, 1982, Annu. Rev. Genet. 16 : 357-384 ; Tepfer and Casse-Delbart, 1987, Microbiol. Sci. 4 (1), 24-28). De manière préférentielle, la transformation de cellules végétales par Agrobacterium tumefaciens est réalisée selon le protocole décrit par Ishida et al. (1996, Nat. Biotechnol. 14 (6), 745-750).

Ces différentes techniques sont notamment décrites dans les brevets et demandes de brevets suivants : US 4,459, 355, US 4,536, 475, US 5,464, 763, US 5,177, 010, US 5,187, 073, EP 267,159, EP 604 662, EP 672 752, US 4,945, 050, US 5,036, 006, US 5,100, 792, US 5,371, 014, US 5,478, 744, US 5,179, 022, US 5,565, 346, US 5,484, 956, US 5,508, 468, US 5,538, 877, US 5,554, 798, US 5,489, 520, US 5,510, 318, US 5,204, 253, US 5,405, 765, EP 270 615, EP 442 174, EP 486 233, EP 486 234, EP 539 563, EP 674 725, WO 91/02071 et WO 95/06128.

La présente invention concerne également un procédé de production des protéines Cry modifiées selon l'invention. Ce procédé comprend au moins les étapes de : (a) mise en culture d'un organisme hôte transformé selon l'invention dans un milieu de culture adapté à la croissance et à la multiplication dudit organisme (b) extraction des protéines Cry produites par l'organisme transformé cultivé à l'étape (a)
Selon l'organisme hôte choisi pour mettre en oeuvre ce procédé et selon le gène chimère qu'il contient, les protéines Cry produites sont soit produites dans l'organisme hôte, soit sécrétées dans le milieu de culture. Il s'ensuit que l'extraction prévue à l'étape (b) peut nécessiter une étape de destruction des microorganismes, ou au moins des cellules les composant, afin de libérer les protéines Cry si celles-ci ne sont pas sécrétées dans le milieu de culture. L'étape d'extraction commune aux deux possibilités (protéines sécrétées ou non) consiste en une élimination des organismes hôtes ou débris de ces organismes par filtration ou centrifugation du milieu de culture.

Selon un mode de réalisation particulier, ce procédé de production des protéines Cry modifiées peut également comprendre une étape supplémentaire (c) de purification des protéines Cry produites à partir du milieu de culture.

Selon un mode de réalisation préféré, l'organisme hôte est un microorganisme. De manière préférentielle, l'organisme hôte est une bactérie Bacillus thuringiensis et la culture mise en oeuvre à l'étape (a) est poursuivie jusqu'à la phase de sporulation desdites bactéries.

La présente invention comprend également des plantes transformées avec un vecteur selon l'invention, caractérisées en ce qu'elles contiennent un gène chimère selon l'invention intégré de manière stable dans leur génome, et expriment une protéine Cry modifiée dans leurs tissus. L'invention s'étend également aux parties de ces plantes, et la descendance de ces plantes. On entend par"partie de ces plantes", tout organe de ces plantes, qu'il soit aérien ou souterrain. Les organes aériens sont les tiges, les feuilles, les fleurs. Les organes souterrains sont principalement les racines, mais ils peuvent également être des tubercules. Par"descendance", on entend principalement les graines contenant les embryons issus de la reproduction de ces plantes entreelles. Par extension, le terme"descendance"s'applique à toutes les plantes et graines formées à chaque nouvelle génération issues de croisements entre une plante, en particulier une variété végétale, et une plante transformée selon l'invention.

Les plantes transformées selon l'invention peuvent être des monocotylédones ou des dicotylédones. De préférence, ces plantes sont des plantes d'intérêt agronomique. De manière avantageuse, les plantes monocotylédones sont le blé, le maïs, le riz. De manière avantageuse, les plantes dicotylédones sont le colza, le soja, le tabac, le coton.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les plantes transformées selon l'invention contiennent, en plus d'un gène chimère selon l'invention, au moins un autre gène contenant un polynucléotide codant pour une protéine d'intérêt. Parmi les polynucléotides codant pour une protéine d'intérêt, on peut citer des polynucléotides codant une enzyme de résistance à un herbicide, par exemple le polynucléotide codant pour l'enzyme bar (White et al., NAR 18 : 1062,1990) pour la tolérance au bialaphos, le polynucléotide codant pour l'enzyme EPSPS (US 5,188, 642 ; WO 97/04103) pour la tolérance au glyphosate ou encore le polynucléotide codant pour l'enzyme HPPD (WO 96/38567) pour la tolérance aux isoxazoles. Peuvent également être contenus dans ces plantes des polynucléotides de résistance aux maladies, par exemple un polynucléotide codant pour l'enzyme oxalate oxydase tel que décrit dans la demande de brevet EP 0 531 498 ou le brevet US 5,866, 778, ou un polynucléotide codant pour un peptide antibactérien et/ou antifongique tels que ceux décrits dans les demandes de brevets WO 97/30082, WO 99/24594, WO 99/02717, WO 99/53053, et WO99/91089. On peut également citer des polynucléotides codant pour des caractères agronomiques de la plante, en

particulier un polynucléotide codant pour une enzyme delta-6 désaturase tel que décrit dans les brevets US 5,552, 306, US 5,614, 313, et demandes de brevets WO 98/46763 et WO 98/46764, ou un polynucléotide codant pour une enzyme sérine acétyltransférase (SAT) tel que décrit dans les demandes de brevets WO 00/01833 et PCT/FR 99/03179. Les plantes transformées selon l'invention peuvent également contenir un polynucléotide codant pour une autre toxine insecticide, par exemple un polynucléotide codant pour une autre protéine Cry de Bacillus thuringiensis (pour exemple, voir la demande de brevet internationale WO 98/40490).

La présente invention a également pour objet des anticorps monoclonaux ou polyclonaux dirigés contre une protéine Cry modifiée selon l'invention, ou un fragment de celle-ci. Les techniques de production d'anticorps sont largement décrites dans la littérature générale et dans des ouvrages de référence tels que Immunological Techniques Made Easy (1998, O. Cochet, J.- L. Teillaud, C. Sautès eds, John Wiley & Sons, Chichester). De préférence, les anticorps selon l'invention sont mis en oeuvre dans des tests, ou kits, de détection des protéines Cry selon l'invention.

Les exemples ci-après permettent d'illustrer la présente invention, sans toutefois en limiter la portée.

Exemple 1 : Création d'un site de coupure par la pepsine au niveau de l'acide aminé 164 de la toxine Cry9Cal
L'introduction d'un site spécifique à la pepsine dans la toxine Cry9Cal de Bacillus thuringiensis est réalisée par substitution de l'arginine naturellement présente en position 164 chez cette toxine par l'un des trois acides aminés reconnus par la pepsine : leucine, phénylalanine ou acide glutamique. L'acide aminé 164 est présent au niveau de la boucle inter-hélices alpha reliant les hélices alpha 3 et alpha 4 du domaine 1 (ci-après boucle inter-hélice alpha3-alpha4).

La séquence native de la boucle inter-hélice alpha3-alpha4 est comprise entre l'acide aspartique 159 et la valine 168. La séquence de cette boucle est la suivante : DRNDTRNLSV.

Cette séquence d'acides aminés correspond à la séquence ADN suivante s'étendant de la base 475 à la base 504 :
GAT CGA AAT GAT ACA CGA AAT TTA AGT GTT
Asp Arg Asn Asp Thr Arg Asn Leu Ser Val

Le codon 164 (CGA) codant pour l'arginine est modifié en codon codant soit pour la leucine, soit pour la phénylalanine ou soit pour l'acide glutamique. Les possibilités de codons sont les suivantes :
Leucine : TTA, TTG, CTT, CTC, CTA ou CTG Phénylalanine : TTT ou TTC
Acide Glutamique : GAA ou GAG
Le choix des codons préférentiels lors de la mutagenèse dirigée dépend de l'organisme dans lequel le gène cry modifié doit être exprimé et varie donc en conséquence. Ce choix fait partie des connaissances générales de l'homme du métier qui adaptera les codons préférentiels en fonction de l'organisme de production choisi. Dans cet exemple, l'organisme d'expression choisi

est la bactérie B. thuringiensis. Les codons préférentiellement utilisés par B. thuringiensis pour coder la leucine, la phénylalanine ou l'acide glutamique sont, respectivement, TTA (leucine), TTT (phénylalanine) et GAA (acide glutamique).

La modification pour expression chez chez Bt peut donc être réalisée en utilisant les oligonucléotides de mutagenèses suivants (dans les oligonucléotides décrits dans les exemples ci-après, le codon en lettres majuscules correspond au codon muté, et les bases et acides aminés en caractères gras correspondent aux bases et acides aminés spécifiquement mutés) : Otigonuctéottden l : 5'-gat cga aat gat aca TTA aat tta agt gtt gtt-3'
Asp Arg Asn Asp Thr Leu Asn Leu Ser Val Val
L'oligonucléotide nol permet le remplacement de l'arginine 164 par une leucine

Oligonucléotide n 2 : 5'-gat cga aat gat aca TTT aat tta agt gtt gtt-3' Asp Arg Asn Asp Thr Phe Asn Leu Ser Val Val L'oligonucléotide n 2 permet le remplacement de l'arginine 164 par une phénylalanine OHgonuctéotiden 3 : 5'-gat cga aat gat aca GAA aat tta agt gtt gtt-3'
Asp Arg Asn Asp Thr Glu Asn Leu Ser Val Val
L'oligonucléotide n 3 permet le remplacement de l'arginine 164 par un acide glutamique
Les caractéristiques des souches bactériennes de Escherichia coli utilisées pour la modification de la séquence du gène cry9Cal sont les suivantes :

- je 109 de génotype recA1 supE44 endo1 hsdR17 gyrA96 relA1 thiD (lac-proAB) F' (traD36 proAB+ lacN lacZ DM15) - BMH 71-18 mut S de génotype thi, supE, A (lac-proAB), (mutS : : TnlO) (F', proAB, lacMZAM15).

L'ADN plasmidique est préparé par minipréparation selon la technique de la lyse alcaline (Birboim and Doly, 1979). Chaque colonie bactérienne est cultivée dans 2 ml de milieu LB additionné de l'antibiotique approprié pendant une nuit à 37 C avec agitation (200 rpm). La culture est ensuite transférée dans un microtube puis centrifugée à 13500 g pendant 5 min. Après

élimination du surnageant, les bactéries sont resuspendues dans 100u.1 d'une solution de 25mM Tris-HCl, pH 8, 10mM EDTA contenant de la Rnase A à la concentration finale de 100 tg/mI.

200 III d'une solution de NaOH 0,2M, 1% SDS sont rajoutés et la suspension est mélangée deux fois par inversion du microtube. 150 III d'une solution d'acétate de potassium 2,55 M, pH 4,5 sont rajoutés et la suspension est incubée 5 min dans la glace. Après une centrifugation de 15 min à 13500 g, le surnageant est transféré dans un microtube contenant 1 ml d'éthanol froid.

Après une centrifugation de 30 min à 13500 g, le surnageant est éliminé et le culot lavé avec 1 ml d'éthanol 70%. Le culot contenant l'ADN est séché quelques minutes sous vide puis repris dans 50 al d'eau distillée stérile. Les échantillons sont ensuite placés à 65 C pendant 30 min.

Les digestions par endonucléases de restriction sont réalisées pour 1 g d'ADN dans un volume final de 20 u. l en présence d'un dixième de volume final de tampon 10X conseillé par le fournisseur pour chaque enzyme et à l'aide de 5 unités d'enzyme. La réaction est incubée pendant 2 à 3 h à la température optimale pour l'enzyme.

La déphosphorylation des extrémités 5'engendrées par une enzyme de restriction est réalisée avec la phosphatase alcaline d'intestin de veau. La réaction se fait en utilisant 5 ni de tampon de déphosphorylation 10X (500 mM Tris-Hcl, pH 9,3, 10 mM Mg12, 1mM ZnCl2, 10 mM spermidine) et une unité d'enzyme par g d'ADN dans un volume final de 50 Fl. La réaction est incubée pendant une heure à 37 C dans le cas d'extrémités 5'sortantes ou à 55 C dans le cas d'extrémités franches ou 3'sortantes. Après la déphosphorylation, l'enzyme est ensuite inactivée

pendant 30 min à 65 C puis éliminée avec deux extractions volume à volume avec un mélange de phénol-chloroforme-alcool isoamylique (25-24-1). Les ligatures se font à l'aide de l'ADN ligase du phage T4. Elles sont réalisées avec une quantité de vecteur égale à 100 ng et un rapport molaire insert/vecteur compris entre 5 et 10. Le volume final de la réaction est de 30 u. l et

comprend 3 III de tampon de ligature 10X (300 mM Tris-Hcl, pH 7,8, 100 mM MgC12, 100 mM DTT, 10 mM ATP) et 3 unités d'enzyme. La réaction est incubée une nuit à 14 cm.

Les oligonucléotides de mutagenèse (oligonucléotide nol, oligonucléotide n 2 et oligonucléotide n 3) sont phosphorylés en 5'afin de permettre la ligature. 100 pmoles d'oligonucléotide sont incubés 30 min à 37 C avec 5 unités de T4 polynucléotide kinase dans un volume final de 25 ul en présence de 2, 5 III de tampon 10X de phosphorylation (700 mM Tris- Hcl, pH 7,6, 100 mM Mg12, 50 mM DTT) en présence d'ATP à la concentration finale de ImM. L'enzyme est ensuite inactivée à 70 C pendant 10 min.

La mutagenèse dirigée est conduite selon une méthode classique décrite ci-après. D'autres procédures connues des experts de l'art sont décrites dans la littérature et donnent des résultats identiques. La méthode de mutagenèse dirigée utilisée est celle décrite par le fabricant pour l'usage du système Altered Sites II commercialisé par la société Promega. Une description détaillée du système de mutagenèse et du protocole peut être trouvée sur le site internet de la société Promega à l'adresse http : //www. promega. com. Le gène cry9Cal est préalablement cloné dans un phagemide pAlter-1 (Promega) portant le gène de résistance à la tétracycline et le gène de résistance à l'ampicilline contenant une mutation ponctuelle. Le fragment d'ADN à muter est au préalable cloné dans le plasmide pAlter-1.0. 5 pmol d'ADN plasmidique sont dénaturés en rajoutant 2 u. l de NaOH

2M, 2 mM EDTA dans un volume final de 20 ul et en incubant 5 min à température ambiante. 2 ul d'acétate d'ammonium 2M, pH 4, 6 et 75 al d'éthanol sont rajoutés et le mélange est incubé à-70 C pendant 30 min. Après une centrifugation à 14000 g pendant 15 min à 4 C, le culot est ensuite rincé avec 200 ! d'éthanol 70% et recentrifugé à 14000 g pendant 15 min à 4 C. Le culot d'ADN dénaturé est alors séché sous vide et resuspendu dans 100 ! d'eau distillée stérile. 10 ul d'ADN dénaturé c'est-à-dire 0,05 pmol sont mélangés avec 0.25 pmol d'oligonucléotide de réparation du gène de résistance à l'ampicilline phosphorylé, 0.25 pmol d'oligonucléotide de destruction du gène de résistance à la tétracycline et 1.25 pmol d'oligonucléotide de mutagenèse (oligonucléotide n l, n 2 ou n 3) phosphorylé en présence de tampon d'hybridation (20 mM Tris-HCI, pH 7,5, 10 mM Mg12, 50 mM NaCl) et incubés à 75 C pendant 5 min puis refroidis lentement jusqu'à température

ambiante. 5 III d'eau distillée stérile, 3 al de tampon de synthèse 1 Ox (100 mM Tris-HCl, pH7, 5, 20 mM DTT, 10 mM ATP, 5mM dNTP), 10 unités d'ADN polymérase T4 et 3 unités d'ADN ligase T4 sont rajoutés et la réaction est incubée 90 min à 37 C. 200 nl de bactéries compétentes E. coli BMH 71-18 sont alors incubées en présence de 1, 5 gel de la réaction précédente dans de la glace pendant 30 min. Un choc thermique est ensuite effectué en plaçant les bactéries 50 sec à 42 C puis 2 min dans la glace. 900 ! de milieu LB sont ensuite rajoutés et la suspension est incubée à 37 C pendant

une heure sous agitation. 4 ml de milieu LB additionné d'ampicilline à la concentration finale de

100 u. g/ml sont alors rajoutés et la culture est incubée une nuit à 37 C sous agitation. Une minipréparation d'ADN plasmidique est réalisée à partir des 4 ml de culture selon le protocole d'extraction d'ADN plasmidique décrit précédemment. 200 III de bactéries compétentes E. coli JM109 sont alors incubées en présence de 1 ng d'ADN plasmidique dans de la glace pendant 30 min. Un choc thermique est ensuite effectué en plaçant les bactéries 50 sec. à 42 C puis 2 min. dans la glace. 900 III de milieu LB sont ensuite rajoutés et la suspension est incubée à 37 C pendant une heure sous agitation. 100 III de suspension bactérienne sont ensuite étalés sur une boîte de Pétri contenant du milieu LB solide additionné d'ampicilline à la concentration finale de 100 u. g/ml. Les recombinants obtenus sont criblés pour trouver le clone d'intérêt. Cette recherche est effectuée en isolant l'ADN plasmidique de plusieurs colonies par la technique de minipréparation décrite précédemment puis par séquençage de cet ADN. La sélection des recombinants se fait alors à l'aide de milieu additionné de tétracycline à la concentration finale de 12,5 g/ml. La justesse de la mutation souhaitée et la vérification de l'absence de mutations indésirables sont contrôlées par séquençage de l'ADN après mutagenèse dirigée. Des échantillons d'ADN pour le séquençage sont purifiés avec le Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega) selon la procédure recommandée par le fournisseur et le séquençage est réalisé sur un séquenceur automatique ABI 377 (Perkin-Elmer) à partir de réactions de séquençage conduite selon la méthode de terminaison de chaîne (Sanger et al., 1977), par PCR en utilisant le système ABI PRISM BigDye terminator Cycle Sequencing Kit. Pour la réalisation des réactions de séquençage et l'analyse automatique des échantillons, les procédures utilisées sont celles recommandées par le fournisseur (Applied Biosystems).

Exemple 2 : Création de sites de coupure par la pepsine au niveau de la boucle inter-hélice alpha 3-alpha 4 de la toxine Cry9Cal
L'introduction de sites spécifiques à la pepsine dans la boucle inter-hélice alpha3-alpha4 de la toxine Cry9Cal est réalisée par substitution d'au moins un acide aminé de cette boucle inter-hélice par un acide aminé reconnu par la pepsine, à savoir la leucine, la phénylalanine et l'acide glutamique. Des codons codant pour ces trois acides aminés seront donc créés en place des codons naturellement présents dans la région s'étendant de la base 475 à la base 504. Les possibilités de codons pour ces trois acides aminés sont décrites dans l'Exemple 1.

Comme dans l'Exemple 1, l'organisme de production de la protéine Cry modifiée choisi est la bactérie B. thuringiensis, et le choix des codons de remplacement est donc identique à celui de l'Exemple 1. En outre, si un autre organisme de production est choisi, l'homme du métier

saura adapter les codons préférentiels en fonction de l'organisme de production choisi.

Diverses séquences alternatives pour la boucle inter-hélice alpha 3-alpha 4 sont possibles, chacune possédant un nombre variable de résidus leucine, phénylalanine ou acide glutamique. Certaines de ces possibilités sont présentées dans le tableau 1. Les possibilités de modification de la boucle inter-hélice alpha 3-alpha 4 ne sont pas limitées à celles présentées dans le tableau 1 cidessous. La liste présentée dans le tableau 1 a pour objectif d'illustrer certaines des possibilités de modification sans limiter la portée de l'invention à ces illustrations. L'homme du métier connaissant les codons spécifiques de chaque acide aminés selon les organismes saura adapter l'enseignement décrit dans cet exemple à toutes les possibilités de modifications de la boucle inter-hélice alpha3-alpha4, en particulier à celles qui ne sont pas décrites dans le tableau 1.

Tableau 1. Exemples de modifications possibles de la boucle inter-hélice alpha 3-alpha 4 de la toxine Cry9Cal

Protéine Séquence en Séquence nucléotidique acides aminés Cry9Cal DRNDTRNLSV gat cga aat gat aca cga aat tta agt gtt Asp Arg Asn Asp Thr Arg Asn Leu Ser Val Mutant no 1 ELNEFLNLSV gaA TTa aat gaA TTT TTa aat tta agt gtt Glu Leu Asn Glu Phe Leu Asn Leu Ser Val Mutant n 2 ELNELLNLSV gaA TTa aat gaA TTa TTa aat tta agt gtt Glu Leu Asn Glu Leu Leu Asn Leu Ser Val Mutant n 3 ELLEFLLLSV gaA TTa TTA gaA TTT TTa TTA tta agt gtt Glu Leu Leu Glu Phe Leu Leu Leu Ser Val Mutant n 4 ELLELLLLSV gaA TTa TTA gaA TTa TTa TTA tta agt gtt Glu Leu Leu Glu Leu Leu Leu Leu Ser Val Mutant n 5 ELLEELLLSV gaA TTa TTA gaA GAa TTa TTA tta agt gtt Glu Leu Leu Glu Glu Leu Leu Leu Ser Val Mutant no 6 ERLEFLLLSV gaA cga TTA gaA TTT TTa TTA tta agt gtt Glu Arg Leu Glu Phe Leu Leu Leu Ser Val Mutant n 7 ERLELLLLSV gaA cga TTA gaA TTa TTa TTA tta agt gtt Glu Arg Leu Glu Leu Leu Leu Leu Ser Val Mutant n 8 ERLEELLLSV gaA TTa GAA gaA TTa TTa TTA tta agt gtt Glu Leu Glu Glu Leu Leu Leu Leu Ser Val Mutant n 9 ELLEEEELSV gaA TTa TTA gaA GAa GAa GAA tta agt gtt Glu Leu Leu Glu Glu Glu Glu Leu Ser Val

La substitution de plusieurs acides aminés au sein de la boucle inter-hélice alpha3-alpha 4 nécessite pour chacun des mutants l'utilisation successive de plusieurs oligonucléotides de mutagenèse. Les oligonucléotides de mutagenèse nécessaires à la création des exemples de mutants présentés dans le tableau 1 sont présentés ci-après (numérotés de 4 à 20).

Oligonucléotide n 4 : cga aat gat aca cga TTA tta agt gtt gtt cgt Arg Asn Asp Thr Arg Leu Leu Ser Val Val Arg Oligonucléotide no : 5 : cga aat gat aca cga GAA tta agt gtt gtt cgt Arg Asn Asp Thr Arg Glu Leu Ser Val Val Arg Oligonucléotide no 6 : ttg gct gat cga aat gaA TTT TTa aat tta agt gtt gtt Leu Ala Asp Arg Asn Glu Phe Leu Asn Leu Ser Val Val Oligonucléotide no 7 : ttg gct gat cga aat gaA TTT TTa tta tta agt gtt gtt Leu Ala Asp Arg Asn Glu Phe Leu Leu Leu Ser Val Val Oligonucléotide no 8 : ttg gct gat cga aat gaA TTa TTa aat tta agt gtt gtt Leu Ala Asp Arg Asn Glu Leu Leu Asn Leu Ser Val Val Oligonucléotide no 9 : ttg gct gat cga aat gaA TTa TTa tta tta agt gtt gtt Leu Ala Asp Arg Asn Glu Leu Leu Leu Leu Ser Val Val Oligonucléotide no 10 : ttg gct gat cga aat gaA GAa GAa gaa tta agt gtt gtt Leu Ala Asp Arg Asn Glu Glu Glu Glu Leu Ser Val Val Oligonucléotide no 11 : ttg gct gat cga aat gaA GAa TTa tta tta agt gtt gtt Leu Ala Asp Arg Asn Glu Glu Leu Leu Leu Ser Val Val Oligonucléotide no12 : caa aat tgg ttg gct gaA TTa aat gaa tta tta aat Gln Asn Trp Leu Ala Glu Leu Asn Glu Leu Leu Asn Oligonucléotide no 13 : caa aat tgg ttg gct gaA TTa aat gaa ttt tta aat Gln Asn Trp Leu Ala Glu Leu Asn Glu Phe Leu Asn Oligonucléotide no 14 : caa aat tgg ttg gct gaA TTa TTA gaa ttt tta tta tta Gln Asn Trp Leu Ala Glu Leu Leu Glu Phe Leu Leu Leu Oligonucléotide no 15 : caa aat tgg ttg gct gaA TTa TTA gaa tta tta tta tta Gln Asn Trp Leu Ala Glu Leu Leu Glu Leu Leu Leu Leu Oligonucléotide no 16 : caa aat tgg ttg gct gaA TTa TTA gaa gaa tta tta tta Gln Asn Trp Leu Ala Glu Leu Leu Glu Glu Leu Leu Leu Oligonucléotide no 17 : caa aat tgg ttg gct gaA cga TTA gaa ttt tta tta tta Gln Asn Trp Leu Ala Glu Arg Leu Glu Phe Leu Leu Leu Oligonucléotide no 18 : caa aat tgg ttg gct gaA cga TTA gaa tta tta tta tta Gln Asn Trp Leu Ala Glu Arg Leu Glu Leu Leu Leu Leu Oligonucléotide no 19 : caa aat tgg ttg gct gaA TTa gaA gaa tta tta tta tta Gln Asn Trp Leu Ala Glu Leu Glu Glu Leu Leu Leu Leu Oligonucléotide n 20 : caa aat tgg ttg gct gaA TTa TTA gaa gaa gaa gaa tta Gln Asn Trp Leu Ala Glu Leu Leu Glu Glu Glu Glu Leu

La procédure de mutagenèses dirigées successives est similaire à la procédure décrite dans l'exemple 1. La seule différence réside dans la combinaison des oligonucléotides. Pour chacun des exemples de mutants décrits dans le tableau 1, les combinaisons successives d'oligonucléotides sont décrites ci-après.

Mutant n 1 : La création du mutant n'l nécessite deux séries successives de mutagenèses dirigées selon le protocole décrit dans l'exemple 1 en utilisant l'oligonucléotide n 6 lors de la première mutagenèse et l'oligonucléotide nu 13 lors de la seconde. L'oligonucléotide n 13 est défini pour reconnaître les modifications apportées lors de la première mutagenèse avec l'oligonucléotide n 6.

Mutant n 2 : La création du mutant n 2 nécessite deux séries successives de mutagenèses dirigées selon le protocole décrit dans l'exemple 1 en utilisant l'oligonucléotide n 8 lors de la première mutagenèse et l'oligonucléotide nu 12 lors de la seconde. L'oligonucléotide n 12 est défini pour reconnaître les modifications apportées lors de la première mutagenèse avec l'oligonucléotide n 8.

Mutant n 3 : La création du mutant n 3 nécessite trois séries successives de mutagenèses dirigées selon le protocole décrit dans l'exemple 1 en utilisant l'oligonucléotide n 4 lors de la première mutagenèse, l'oligonucléotide n 7 lors de la deuxième et l'oligonucléotide n 14 lors de la troisième. L'oligonucléotide n 7 est défini pour reconnaître les modifications apportées lors de la première mutagenèse avec l'oligonucléotide n 4 et l'oligonucléotide nu 14 est défini pour reconnaître les modifications apportées lors des deux premières mutagenèses avec les oligonucléotides n 4 et nu 7.

Mutant n 4 : La création du mutant n 4 nécessite trois séries successives de mutagenèses dirigées selon le protocole décrit dans l'exemple 1 en utilisant l'oligonucléotide n 4 lors de la première mutagenèse, l'oligonucléotide n 9 lors de la deuxième et l'oligonucléotide n 15 lors de la troisième. L'oligonucléotide n 9 est défini pour reconnaître les modifications apportées lors de la première mutagenèse avec l'oligonucléotide n 4 et l'oligonucléotide nu 15 est défini pour reconnaître les modifications apportées lors des deux premières mutagenèses avec les oligonucléotides n 4 et nu 9.

Mutant n 5 : La création du mutant n 5 nécessite trois séries successives de mutagenèses dirigées selon le protocole décrit dans l'exemple 1 en utilisant l'oligonucléotide n 4 lors de la première mutagenèse, l'oligonucléotide nu 11 lors de la deuxième et l'oligonucléotide nu 16 lors de la troisième. L'oligonucléotide nu 11 est défini pour reconnaître les modifications apportées lors de la première mutagenèse avec l'oligonucléotide n 4 et l'oligonucléotide nu 16 est

défini pour reconnaître les modifications apportées lors des deux premières mutagenèses avec les oligonucléotides n 4 et nu 11.

Mutant n 6 : La création du mutant n 6 nécessite trois séries successives de mutagenèses dirigées selon le protocole décrit dans l'exemple 1 en utilisant l'oligonucléotide n 4

lors de la première mutagenèse, l'oligonucléotide n 7 lors de la deuxième et l'oligonucléotide n 17 lors de la troisième. L'oligonucléotide n 7 est défini pour reconnaître les modifications apportées lors de la première mutagenèse avec l'oligonucléotide n 4 et l'oligonucléotide nu 17 est défini pour reconnaître les modifications apportées lors des deux premières mutagenèses avec les oligonucléotides n 4 et nu 7.

Mutant n 7 : La création du mutant n 7 nécessite trois séries successives de mutagenèses dirigées selon le protocole décrit dans l'exemple 1 en utilisant l'oligonucléotide n 4

lors de la première mutagenèse, l'oligonucléotide n 9 lors de la deuxième et l'oligonucléotide n 18 lors de la troisième. L'oligonucléotide n 9 est défini pour reconnaître les modifications apportées lors de la première mutagenèse avec l'oligonucléotide n 4 et l'oligonucléotide nu 18 est défini pour reconnaître les modifications apportées lors des deux premières mutagenèses avec les oligonucléotides n 4 et n 9.

Mutant n 8 : La création du mutant n 8 nécessite trois séries successives de mutagenèses dirigées selon le protocole décrit dans l'exemple 1 en utilisant l'oligonucléotide n 4

lors de la première mutagenèse, l'oligonucléotide n 9 lors de la deuxième et l'oligonucléotide n 19 lors de la troisième. L'oligonucléotide n 9 est défini pour reconnaître les modifications apportées lors de la première mutagenèse avec l'oligonucléotide n 4 et l'oligonucléotide nu 19 est défini pour reconnaître les modifications apportées lors des deux premières mutagenèses avec les oligonucléotides n 4 et n 9.

Mutant n 9 : La création du mutant n 9 nécessite trois séries successives de mutagenèses dirigées selon le protocole décrit dans l'exemple 1 en utilisant l'oligonucléotide n 5 lors de la première mutagenèse, l'oligonucléotide nu 10 lors de la deuxième et l'oligonucléotide

nu 20 lors de la troisième. L'oligonucléotide nu 10 est défini pour reconnaître les modifications apportées lors de la première mutagenèse avec l'oligonucléotide n 5 et l'oligonucléotide nu 20 est défini pour reconnaître les modifications apportées lors des deux premières mutagenèses avec les oligonucléotides n 5 et nu 10.

Selon ce protocole, les oligonucléotides sont répartis en trois catégories, oligonucléotides de 1 série, oligonucléotides de 2 série et oligonucléotides de 3ème série. Cette répartition est la suivante : Oligonucléotides de 1 série : Oligonucléotides nu 4, 5, 6 et 8 Oligonucléotides de 2 série : Oligonucléotides n 7, 9,10, 11, 12 et 13 Oligonucléotides de 3 série : Oligonucléotides nu 14, 15,16, 17,18, 19 et 20

Le protocole complet de réalisation de ces mutants est identique à celui décrit dans l'Exemple 1. Ce protocole est commun à chacune des séries de mutagenèses, seuls l'oligonucléotide de mutagenèse et l'oligonucléotide d'inibition/restauration de la résistance à l'antibiotique changent. Le passage à la mutation suivante s'effectue après le criblage du clone d'intérêt ayant intégré la mutation précédente. Si cette étape est la dernière de la première série ou de la deuxième série de mutagenèse, le matériel issu des cette série d'expérimentations est réutilisé comme matériel initial pour respectivement la deuxième ou la troisième série de mutagenèse en utilisant respectivement les oligonucléotides de 2* ou de 3ème série. Un deuxième cycle de mutagenèse peut alors être effectué en utilisant l'ADN plasmidique obtenu comme ADN matrice ainsi que l'oligonucléotide de réparation du gène de résistance à la tétracycline et l'oligonucléotide de destruction du gène de résistance à l'ampicilline et un oligonucléotide de mutagenèse de 2éme série. La sélection des recombinants se fait alors à l'aide de milieu additionné de tétracycline à la concentration finale de 12, 5 u. g/ml. Un troisième cycle de mutagenèse peut être réalisé en utilisant l'ADN plasmidique obtenu à l'issue du deuxième cyle de mutagenèse comme ADN matrice ainsi que l'oligonucléotide de réparation du gène de résistance à l'ampicilline et l'oligonucléotide de destruction du gène de résistance à la trétracycline et un oligonucléotide de mutagenèse de 3éme série. La sélection des recombinants se fait alors à l'aide de milieu additionné d'ampicilline à la concentration finale de 100 ng/ml. Après réalisation de toutes les séries de mutagenèse nécessaires à la réalisation d'un mutant, les étapes de contrôles des mutations sont réalisées comme décrites à l'Exemple 1.

Exemple 3 : Création de sites de coupure par la pepsine dans les boucles inter-hélices alpha 4-alpha 5, alpha 5-alpha 6 et alpha 6-alpha 7 de la toxine Cry9Cal
Les positions des séquences natives des boucles inter-hélices alpha 4-alpha 5, alpha 5-alpha 6 et alpha 6-alpha 7 de la toxine Cry9Cal sont présentées dans le tableau 2 ciaprès. Les séquences nucléotidiques et les positions correspondantes dans le gène cry9Cal sont présentées dans le tableau 3.

Tableau 2. Position et séquences des boucles inter-hélices a4-a5, a5-a6 et a6-a7 de la

toxine Cry9Cal

Boucle Séquence Position Boucle a4-a5 FAVNGQQVPLL Phénylalanine 187 à Leucine 197 Boucle a5-a6 LFGEGWGF Leucine 216 à Phénylalanine 223 Boucle a6-a7 LRGTN Leucine 257 à Asparagine 261

Tableau 3. Position et séquences du gène cry9Cal codant les boucles inter-hélices a4-a5, a5-a6 et a6-a7

Boucle Séquence Position Boucle a4-a5 TTT GCA GTA AAT GGA CAG CAG GTT CCA TTA CTG 559-591 Boucle a5-a6 CTT TTT GGA GAA GGA TGG GGA TTC 646-669 Boucle a6-a7 TTA AGA GGA ACA AAT 769-783

La superposition des séquences nucléotidiques et acides aminés est la suivante : Boucle a4-a5 : TTT GCA GTA AAT GGA CAG CAG GTT CCA TTA CTG
Phe Ala Val Asn Gly Gln Gln Val Pro Leu leu Boucle a5-a6 CTT TTT GGA GAA GGA TGG GGA TTC
Leu Phe Gly Glu Gly Trp Gly Phe Boucle a6-a7 TTA AGA GGA ACA AAT
Leu Arg Gly thr Asn
L'introduction de sites spécifiques à la pepsine dans les boucles inter-hélices alpha4alpha5, alpha5-alpha6 ou alpha6-alpha7 de la toxine Cry9Cal est réalisée par substitution d'au moins un acide aminé de ces boucles inter-hélices par un acide aminé reconnu par la pepsine, à savoir la leucine, la phénylalanine et l'acide glutamique. Des codons codant pour ces trois acides aminés seront donc créés en place des codons naturellement présents dans la région s'étendant des bases 559 à 591 (boucle inter-hélice alpha4-alpha5), 646 à 669 (boucle inter-hélice alpha5alpha6), et 769 à 783 (boucle inter-hélice alpha6-alpha7). Les possibilités de codons pour ces trois acides aminés sont décrites dans l'Exemple 1.

Comme dans l'Exemple 1, l'organisme de production de la protéine Cry modifiée choisi est la bactérie B. thuringiensis, et le choix des codons de remplacement est donc identique à celui de l'Exemple 1. En outre, si un autre organisme de production est choisi, l'homme du métier saura adapter les codons préférentiels en fonction de l'organisme de production choisi.

Diverses séquences alternatives pour les boucles inter-hélice alpha4-alpha5, alpha5alpha6 et alpha6-alpha7 sont possibles, chacune possédant un nombre variable de résidus leucine, phénylalanine ou acide glutamique. Plusieurs de ces diverses possibilités sont présentées dans les tableaux 4, 5 et 6. Les possibilités de modification des boucles inter-hélice alpha4alpha5, alpha5-alpha6 et alpha6-alpha7 ne sont pas limitées à celles présentées dans les tableaux 4, 5 et 6 ci-dessous. La liste présentée dans les tableaux 4, 5 et 6 a pour objectif d'illustrer certaines des possibilités de modification sans limiter la portée de l'invention à ces illustrations.

L'homme du métier connaissant les codons spécifiques de chaque acide aminé selon les organismes saura adapter l'enseignement décrit dans cet exemple à toutes les possibilités de modifications des boucles inter-hélices alpha4-alpha5, alpha5-alpha6 et alpha6-alpha7, en particulier à celles qui ne sont pas décrites dans les tableaux 4, 5 et 6.

Tableau 4. Exemples de modifications possibles de la boucle inter-hélice alpha 4-alpha 5 de la toxine Cry9Cal

Protéine Séquence en Séquence nucléotidique acides aminés Cry9Cal FAVNGQQVPLL ttt gca gta aat gga cag cag gtt cca tta ctg Phe Ala Val Asn Gly Gln Gln Val Pro Leu leu Mutant no 10 FLLNLFFLPLL ttt TTa Tta aat TTa TTT TTT TtA cca tta ctg Phe Leu leu Asn Leu Phe Phe Leu Pro Leu leu Mutant no Il FLLNLEELPLL ttt TTa Tta aat TTa GaA GaA TtA cca tta ctg Phe Leu leu Asn Leu Glu Glu Leu Pro Leu leu Mutant no 12 FEENLEELPLL ttt GAa GAa aat TTa GaA GaA TtA cca tta ctg Phe Glu Glu Asn Leu Glu Glu Leu Pro Leu leu Mutant no 13 FEENFLLFPLL ttt GAa GAa aat TTT TTA TTA Ttt cca tta ctg Phe Glu Glu Asn Phe leu Leu Phe Pro Leu leu Mutant n'14 FEENFEEFPLL ttt GAa GAa aat TTT GaA GaA Ttt cca tta ctg Phe Glu Glu Asn Phe Glu Glu Phe Pro Leu leu Mutant n'15 FLLNFEEFPLL ttt TTa TTa aat TTT GaA GaA Ttt cca tta ctg Phe Leu leu Asn Phe Glu Glu Phe Pro Leu leu Mutant no 16 FLLNEFFEPLL ttt TTa TTa aat GAa TTT TTT gAA cca tta ctg Phe Leu leu Asn Glu Phe Phe Glu Pro Leu leu

Tableau 5. Exemples de modifications possibles de la boucle inter-hélice alpha 5-alpha 6 de la toxine Cry9Cal

Protéine Séquence en Séquence nucléotidique acides aminés Cry9Cal LFGEGWGF ctt ttt gga gaa gga tgg gga ttc Leu Phe Gly Glu Gly Trp Gly Phe Mutant no 17 LFLELFLF ctt ttt TTa gaa TTa tTT TTa ttc Leu Phe Leu Glu Leu Phe Leu Phe Mutant no 18 LFLLLFLF ctt ttt TTa TTa TTa tTT TTa ttc Leu Phe Leu Leu Leu Phe Leu Phe Mutant n'19 LFLEEFEL ctt ttt TTa gaa gAa tTT gAa TTA Leu Phe Leu Glu Glu Phe Glu Leu Mutant nu 20 LFEEEFEL ctt ttt gAa gaa gAa tTT gAa TTA Leu Phe Glu Glu Glu Phe Glu Leu

Mutant no 21 LFEEEFEE ctt ttt gAa gaa TTa tTT gAa GAA Leu Phe Glu Glu Glu Phe Glu Glu

Tableau 6. Exemples de modifications possibles de la boucle inter-hélice alpha 6-alpha 7 de la toxine Cry9Cal

Protéine Séquence en Séquence nucléotidique acides aminés Cry9Cal LRGTN tta aga gga aca aat Leu Arg Gly thr Asn Mutant nu 22 LLELN tta TTa gAa TTa aat Leu Leu Glu Leu Asn Mutant nu 23 LLFLN tta TTa TTT TTa aat Leu Leu Phe Leu Asn Mutant nu 24 LELLN tta GAa TTa TTa aat Leu Glu Leu Leu Asn Mutant nu 25 LLFFN tta TTa TTT TTT aat Leu Leu Phe Phe Asn Mutant nu 26 LEELN tta GAa GAa TTa aat Leu Glu Glu Leu Asn Mutant nu 27 LEFLN tta GAa TTT TTa aat Leu Glu Phe Leu Asn Mutant nu 28 LEFEN tta GAa TTT GAa aat Leu Glu Phe Glu Asn Mutant nu 29 LEEEN tta GAa gAa GAa aat Leu Glu Glu Glu Asn

3-1-Création de sites de coupure par la pepsine dans la boucle inter-hélice alpha4alpha 5 La substitution de plusieurs acides aminés au sein de la boucle inter-hélice alpha4-alpha 5 nécessite pour chacun des mutants l'utilisation successive de plusieurs oligonucléotides de mutagenèse. Les oligonucléotides de mutagenèse nécessaires à la création des exemples de mutants présentés dans le tableau 4 sont présentés ci-après (numérotés de 21 à 34).

Oligonucléotide n 21 : gct att cca ttg ttt TTa Tta aat gga cag cag gtt Ala Ile Pro Leu Phe Leu leu Asn Gly Gln Gln Val Oligonucléotide no 22 : gct att cca ttg ttt GAa GAa aat gga cag cag gtt Ala Ile Pro Leu Phe Glu Glu Asn Gly Gln Gln Val Oligonucléotide no 23 : tta tta aat gga cag cag TtA cca tta ctg tca gta Leu leu Asn Gly Gln Gln Leu Pro Leu Leu Ser Val

Oligonucléotide no 24 : tta tta aat gga cag cag Ttt cca tta ctg tca gta Leu leu Asn Gly Gin Gin Phe Pro Leu Leu Ser Val Oligonucléotide no 25 : tta tta aat gga cag cag gAA cca tta ctg tca gta Leu leu Asn Gly Gin Gin Glu Pro Leu Leu Ser Val Oligonucléotide no 26 : gaa gaa aat gga cag cag TtA cca tta ctg tca gta Glu Glu Asn Gly Gin Gin Leu Pro Leu Leu Ser Val Oligonucléotide no 27 : gaa gaa aat gga cag cag Ttt cca tta ctg tca gta Glu Glu Asn Gly Gin Gin Phe Pro Leu Leu Ser Val Oligonucléotide no 28 : cca ttg ttt tta tta aat TTa TTT TTT tta cca tta ctg tca gta Pro Leu Phe Leu Leu Asn Leu Phe Phe Leu Pro Leu Leu Ser Val Oligonucléotide no 29 : cca ttg ttt tta tta aat TTa GaA GaA tta cca tta ctg tca gta Pro Leu Phe Leu Leu Asn Leu Glu Glu Leu Pro Leu Leu Ser Val Oligonucléotide no 30 : cca ttg ttt gaa gaa aat TTa GaA GaA tta cca tta ctg tca gta Pro Leu Phe Glu Glu Asn Leu Glu Glu Leu Pro Leu Leu Ser Val Oligonucléotide n 31 : cca ttg ttt gaa gaa aat TTT TTA TTA ttt cca tta ctg tca gta Pro Leu Phe Glu Glu Asn Phe Leu Leu Phe Pro Leu Leu Ser Val Oligonucléotide no 32 : cca ttg ttt gaa gaa aat TTT GaA GaA ttt cca tta ctg tca gta Pro Leu Phe Glu Glu Asn Phe Glu Glu Phe Pro Leu Leu Ser Val Oligonucléotide no 33 : cca ttg ttt tta tta aat TTT GaA GaA ttt cca tta ctg tca gta Pro Leu Phe Leu Leu Asn Phe Glu Glu Phe Pro Leu Leu Ser Val Oligonucléotide no 34 : cca ttg ttt tta tta aat GAa TTT TTT gaa cca tta ctg tca gta Pro Leu Phe Leu Leu Asn Glu Phe Phe Glu Pro Leu Leu Ser Val

La procédure de mutagenèses dirigées successives est similaire à la procédure décrite dans l'exemple 2. La seule différence réside dans la combinaison des oligonucléotides. Pour chacun des mutants décrits dans le tableau 4, les combinaisons successives d'oligonucléotides sont décrites ci-après.

Mutant nu 10 : La création du mutant nu 10 nécessite trois séries successives de mutagenèses dirigées selon le protocole décrit ci-après en utilisant l'oligonucléotide n 21 lors de la première mutagenèse, l'oligonucléotide nu 23 lors de la deuxième et l'oligonucléotide nu 28 lors de la troisième. L'oligonucléotide nu 23 est défini pour reconnaître les modifications apportées lors de la première mutagenèse avec l'oligonucléotide nu 21 et l'oligonucléotide nu 28 est défini pour reconnaître les modifications apportées lors des deux premières mutagenèses avec les oligonucléotides nu 21 et nu 23.

Mutant nu 11 : La création du mutant nu 11 nécessite trois séries successives de mutagenèses dirigées selon le protocole décrit ci-après en utilisant l'oligonucléotide n 21 lors de la première mutagenèse, l'oligonucléotide nu 23 lors de la deuxième et l'oligonucléotide nu 29 lors de la troisième. L'oligonucléotide nu 23 est défini pour reconnaître les modifications

apportées lors de la première mutagenèse avec l'oligonucléotide nu 21 et l'oligonucléotide nu 29 est défini pour reconnaître les modifications apportées lors des deux premières mutagenèses avec

les oligonucléotides nu 21 et nu 23.

Mutant nu 12 : La création du mutant nu 12 nécessite trois séries successives de mutagenèses dirigées selon le protocole décrit ci-après en utilisant l'oligonucléotide n 22 lors de la première mutagenèse, l'oligonucléotide nu 26 lors de la deuxième et l'oligonucléotide nu 30 lors de la troisième. L'oligonucléotide nu 26 est défini pour reconnaître les modifications apportées lors de la première mutagenèse avec l'oligonucléotide nu 22 et l'oligonucléotide nu 30 est défini pour reconnaître les modifications apportées lors des deux premières mutagenèses avec

les oligonucléotides nu 22 et nu 26.

Mutant nu 13 : La création du mutant nu 13 nécessite trois séries successives de mutagenèses dirigées selon le protocole ci-après en utilisant l'oligonucléotide n 22 lors de la première mutagenèse, l'oligonucléotide nu 27 lors de la deuxième et l'oligonucléotide nu 31 lors de la troisième. L'oligonucléotide nu 27 est défini pour reconnaître les modifications apportées lors de la première mutagenèse avec l'oligonucléotide nu 22 et l'oligonucléotide nu 31 est défini pour reconnaître les modifications apportées lors des deux premières mutagenèses avec les oligonucléotides nu 22 et n 27.

Mutant nu 14 : La création du mutant nu 14 nécessite trois séries successives de mutagenèses dirigées selon le protocole décrit ci-après en utilisant l'oligonucléotide n 22 lors de la première mutagenèse, l'oligonucléotide nu 27 lors de la deuxième et l'oligonucléotide nu 32 lors de la troisième. L'oligonucléotide nu 27 est défini pour reconnaître les modifications apportées lors de la première mutagenèse avec l'oligonucléotide nu 22 et l'oligonucléotide n 32 est défini pour reconnaître les modifications apportées lors des deux premières mutagenèses avec

les oligonucléotides nu 22 et nu 27.

Mutant nu 15 : La création du mutant nu 15 nécessite trois séries successives de mutagenèses dirigées selon le protocole ci-après en utilisant l'oligonucléotide n 21 lors de la première mutagenèse, l'oligonucléotide n 24 lors de la deuxième et l'oligonucléotide n 33 lors de la troisième. L'oligonucléotide n 24 est défini pour reconnaître les modifications apportées lors de la première mutagenèse avec l'oligonucléotide n 21 et l'oligonucléotide n 33 est défini pour reconnaître les modifications apportées lors des deux premières mutagenèses avec les oligonucléotides n 21 et n 24.

Mutant nu 16 : La création du mutant nu 16 nécessite trois séries successives de mutagenèses dirigées selon le protocole ci-après en utilisant l'oligonucléotide n 21 lors de la première mutagenèse, l'oligonucléotide nu 25 lors de la deuxième et l'oligonucléotide nu 34 lors de la troisième. L'oligonucléotide nu 25 est défini pour reconnaître les modifications apportées

lors de la première mutagenèse avec l'oligonucléotide nu 21 et l'oligonucléotide nu 34 est défini pour reconnaître les modifications apportées lors des deux premières mutagenèses avec les oligonucléotides nu 21 et nu 25.

Selon ce protocole, les oligonucléotides destinés à créer les mutants nu 10 à nu 16 décrits dans le tableau 4 sont répartis en trois catégories, oligonucléotides de 1 série, oligonucléotides de ime série et oligonucléotides de 3ème série. Cette répartition est la suivante : Oligonucléotides de lèrt série : Oligonucléotides nu 21 et 22 Oligonucléotides de 2ème série : Oligonucléotides nu 23, 24, 25, 26 et 27 Oligonucléotides de 3 série : Oligonucléotides nu 28, 29, 30, 31, 32, 33 et 34 3-2-Création de sites de coupure par la pepsine dans la boucle inter-hélice alpha5alpha 6 La substitution de plusieurs acides aminés au sein de la boucle inter-hélice alpha-alpha 6 nécessite pour chacun des mutants l'utilisation successive de plusieurs oligonucléotides de mutagenèse. Les oligonucléotides de mutagenèse nécessaires à la création des exemples de mutants présentés dans le tableau 5 sont présentés ci-après (numérotés de 35 à 44).

Oligonucléotide no 35 : gat gca tct ctt ttt TTa gaa gga tgg gga ttc Asp Ala Ser Leu Phe Leu Glu Gly Trp Gly Phe Oligonucléotide no 36 : gat gca tct ctt ttt TTa TTa gga tgg gga ttc aca Asp Ala Ser Leu Phe Leu Leu Gly Trp Gly Phe Thr Oligonucléotide no 37 : gat gca tct ctt ttt gAa gaa gga tgg gga ttc Asp Ala Ser Leu Phe Glu Glu Gly Trp Gly Phe Oligonucléotide no 38 : tta gaa gga tgg gga TTa aca cag ggg gaa att Leu Glu Gly Trp Gly Leu Thr Gln Gly Glu Ile Oligonucléotide no 39 : gga gaa gga tgg gga GAA aca cag ggg gaa att Gly Glu Gly Trp Gly Glu Thr Gln Gly Glu Ile Oligonucléotide no 40 : gca tct ctt ttt tta gaa TTa tTT TTa ttc aca cag ggg gaa att Ala Ser Leu Phe Leu Glu Leu Phe Leu Phe Thr Gln Gly Glu Ile Oligonucléotide no 41 : gca tct ctt ttt tta tta TTa tTT TTa ttc aca cag ggg gaa att Ala Ser Leu Phe Leu Leu Leu Phe Leu Phe Thr Gln Gly Glu Ile Oligonucléotide no 42 : gca tct ctt ttt tta gaa TTa tTT TTa ttc aca cag ggg gaa att Ala Ser Leu Phe Leu Glu Glu Phe Glu Leu Thr Gln Gly Glu Ile Oligonucléotide no 43 : gca tct ctt ttt gaa gaa TTa tTT TTa ttc aca cag ggg gaa att Ala Ser Leu Phe Glu Glu Glu Phe Glu Leu Thr Gln Gly Glu Ile Oligonucléotide no 44 : gca tct ctt ttt gaa gaa TTa tTT TTa gaa aca cag ggg gaa att Ala Ser Leu Phe Glu Glu Glu Phe Glu Glu Thr Gln Gly Glu Ile

La procédure de mutagenèses dirigées successives est similaire à la procédure décrite dans l'exemple 2. La seule différence réside dans la combinaison des oligonucléotides. Pour chacun des mutants décrits dans le tableau 5, les combinaisons successives d'oligonucléotides sont décrites ci-après.

Mutant nu 17 : La création du mutant n 17 nécessite deux séries successives de mutagenèses dirigées selon le protocole décrit ci-après en utilisant l'oligonucléotide nu 35 lors de la première mutagenèse et l'oligonucléotide nu 40 lors de la seconde. L'oligonucléotide nu 40 est défini pour reconnaître les modifications apportées lors de la première mutagenèse avec l'oligonucléotide n 35.

Mutant nu 18 : La création du mutant nu 18 nécessite deux séries successives de mutagenèses dirigées selon le protocole décrit ci-après en utilisant l'oligonucléotide nu 36 lors de la première mutagenèse et l'oligonucléotide nu 41 lors de la seconde. L'oligonucléotide nu 41 est défini pour reconnaître les modifications apportées lors de la première mutagenèse avec l'oligonucléotide n 36.

Mutant nu 19 : La création du mutant nu 19 nécessite trois séries successives de mutagenèses dirigées selon le protocole ci-après en utilisant l'oligonucléotide nu 35 lors de la

première mutagenèse, l'oligonucléotide nu 38 lors de la deuxième et l'oligonucléotide nu 42 lors de la troisième. L'oligonucléotide nu 38 est défini pour reconnaître les modifications apportées lors de la première mutagenèse avec l'oligonucléotide nu 35 et l'oligonucléotide nu 42 est défini pour reconnaître les modifications apportées lors des deux premières mutagenèses avec les oligonucléotides n 35 et n 38.

Mutant nu 20 : La création du mutant nu 20 nécessite trois séries successives de mutagenèses dirigées selon le protocole ci-après en utilisant l'oligonucléotide n 37 lors de la première mutagenèse, l'oligonucléotide nu 38 lors de la deuxième et l'oligonucléotide nu 43 lors de la troisième. L'oligonucléotide nu 38 est défini pour reconnaître les modifications apportées lors de la première mutagenèse avec l'oligonucléotide nu 37 et l'oligonucléotide nu 43 est défini pour reconnaître les modifications apportées lors des deux premières mutagenèses avec les oligonucléotides no 37 et no 38.

Mutant nu 21 : La création du mutant nu 21 nécessite trois séries successives de mutagenèses dirigées selon le protocole ci-après en utilisant l'oligonucléotide nu 37 lors de la première mutagenèse, l'oligonucléotide n 39 lors de la deuxième et l'oligonucléotide n 44 lors de la troisième. L'oligonucléotide n 39 est défini pour reconnaître les modifications apportées lors de la première mutagenèse avec l'oligonucléotide n 37 et l'oligonucléotide n 44 est défini

pour reconnaître les modifications apportées lors des deux premières mutagenèses avec les oligonucléotides nu 37 et nu 39.

Selon ce protocole, les oligonucléotides destinés à créer les mutants nu 17 à nu 21 décrits dans le tableau 5'sont répartis en trois catégories, oligonucléotides de 1 série, oligonucléotides de 2ème série et oligonuclétides de 3ème série. Cette répartition est la suivante : Oligonucléotides de 1 série : Oligonucléotides n 35, 36 et 37 Oligonucléotides de 2ème série : Oligonucléotides n 38, 39, 40 et 41 Oligonucléotides de 3 série : Oligonucléotides nu 42, 43 et 44 3-3-Création de sites de coupure par la pepsine dans la boucle inter-hélice alpha6alpha 7 La substitution de plusieurs acides aminés au sein de la boucle inter-hélice alpha 6-alpha 7 ne nécessite pour chacun des mutants qu'une seule mutagenèse. Les oligonucléotides de mutagenèse nécessaires à la création des exemples de mutants présentés dans le tableau 6 sont présentés ci-après (numérotés de 45 à 52).

Oligonucléotide no 45 : ggt tta gat cgt tta TTa gAa TTa aat act gaa agt tgg Gly Leu Asp Arg Leu Leu Glu Leu Asn Thr Glu Ser Trp Oligonucléotide no 46 : ggt tta gat cgt tta TTa TTT TTa aat act gaa agt tgg Gly Leu Asp Arg Leu Leu Phe Leu Asn Thr Glu Ser Trp Oligonucléotide no 47 : ggt tta gat cgt tta GAa TTa TTa aat act gaa agt tgg Gly Leu Asp Arg Leu Glu Leu Leu Asn Thr Glu Ser Trp Oligonucléotide no 48 : ggt tta gat cgt tta TTa TTT TTT aat act gaa agt tgg Gly Leu Asp Arg Leu Leu Phe Phe Asn Thr Glu Ser Trp Oligonucléotide no 49 : ggt tta gat cgt tta GAa GAa TTa aat act gaa agt tgg Gly Leu Asp Arg Leu Glu Glu Leu Asn Thr Glu Ser Trp Oligonucléotide no 50 : ggt tta gat cgt tta GAa TTT TTa aat act gaa agt tgg Gly Leu Asp Arg Leu Glu Phe Leu Asn Thr Glu Ser Trp Oligonucléotide no 51 : ggt tta gat cgt tta GAa TTT GAa aat act gaa agt tgg Gly Leu Asp Arg Leu Glu Phe Glu Asn Thr Glu Ser Trp Oligonucléotide no 52 : ggt tta gat cgt tta GAa gAa GAa aat act gaa agt tgg Gly Leu Asp Arg Leu Glu Glu Glu Asn Thr Glu Ser Trp

L'oligonucléotide nu 45 est utilisé pour créer le mutant nu 22. L'oligonucléotide nu 46 est utilisé pour créer le mutant nu 23. L'oligonucléotide nu 47 est utilisé pour créer le mutant nu 24. L'oligonucléotide nu 48 est utilisé pour créer le mutant nu 25.

L'oligonucléotide nu 49 est utilisé pour créer le mutant nu 26. L'oligonucléotide nu 50 est utilisé pour créer le mutant nu 27.

L'oligonucléotide nu 51 est utilisé pour créer le mutant nu 28.

L'oligonucléotide nu 52 est utilisé pour créer le mutant nu 29.

Le protocole complet de réalisation de ces mutants est identique à celui décrit dans l'Exemple 2. Ce protocole est commun à chacune des séries de mutagenèses, seuls l'oligonucléotide de mutagenèse et l'oligonucléotide d'inibition/restauration de la résistance à l'antibiotique changent.

Exemple 4 : Création de sites de coupure par la pepsine au niveau des boucles inter-hélices alpha 3-alpha 4, alpha 4-alpha 5, alpha 5-alpha 6 et alpha 6-alpha 7 de diverses toxines Cry
Plusieurs groupes de protéines Cry présentent des similitudes de structure. Il s'agit

notamment des protéines appartenant aux familles Cryl, Cry3, Cry4, Cry7, Cry8, Cry9, CrylO, Cry 16, Cry 17, Cry 19 ou Cry20. Ces similitudes sont démontrées dans la littérature (Schnepf et al., 1998). D'autres protéines Cry non citées dans la littérature peuvent également présenter des similitudes de structure et de séquence avec ces familles. L'Exemple 4 a pour but de démontrer l'applicabilité de l'enseignement de la présente invention, tel qu'exemplifié sur la protéine Cry9Cal dans les Exemples 2 et 3, à toutes ces familles de structures similaires.

Les modifications dans les boucles inter-hélices décrites dans les Exemples 2 et 3 peuvent être réalisées de façon équivalente pour toutes les protéines Cry chez lesquelles on peut identifier des boucles inter-hélices similaires à celles présentes dans le domaine I de la toxine Cry9Cal. Si la localisation et la séquence de ces boucles inter-hélices sont définies pour ces diverses toxines Cry, il est très facile pour un expert dans l'art de réaliser des modifications similaires à celles présentées dans les exemples 2 et 3 à partir des détails techniques fournis dans ces mêmes exemples 2 et 3. Dans le présent exemple, les éléments sont donnés pour permettre la création de sites spécifiques de dégradation par la pepsine chez les toxines Cry autres que la toxine Cry9Cal et notamment les protéines Cryl, Cry3, Cry4, Cry7, Cry8, Cry9, Cry 10, Cry 16, Cry 17, Cry 19 et Cry20. La modification de ces boucles inter-hélices pour créer des sites de dégradation par la pepsine chez les toxines Cryl, Cry3, Cry4, Cry7, Cry8, Cry9, Cry 10, Cry 16, Cry 17, Cry 19 ou Cry20 nécessite de suivre les étapes suivantes :

1) Etablir, d'après les séquences et les localisations des boucles inter-hélices présentées dans les tableaux 6 à 13 ci-dessous, des listes de mutants possibles possédant un ou plusieurs résidus leucine, phénylalanine ou acide glutamique comme présenté dans les tableaux 1,4, 5 et 6 et dans les exemples 2 et 3.

2) Etablir les séquences des gènes mutants en tenant compte de la préférence de codons de l'organisme hôte, et si cet organisme est B. thuringiensis en utilisant préférentiellemnt les codons TTA, TTT et GAA pour la leucine, la phénylalanine et l'acide glutamique, respectivement.

3) Synthétiser des oligonucléotides de mutagenèse pour modifier la séquence des gènes codant pour les toxines sélectionnées sur le modèle de ceux présentés dans les exemples 2 et 3.

4) Utiliser des statégies de mutagenèses simples ou multiples telles que décrites dans les exemples 2 et 3 et suivant les protocoles expérimentaux décrits en détail dans les exemples 2 et 3.

La localisation des boucles inter-hélices a3-a4, a4-a5, a5-a6 et a6-a7 du domaine 1 et leurs séquences sont présentées pour les toxines Cryl, Cry3, Cryl, Cry3, Cry4, Cry7, Cry8, Cry9, CrylO, Cry16, Cry17, Cry19 et Cry20 dans les tableaux 7,8, 9,10, 11, 12 et 13 ci-dessous.

Ces séquences sont présentées pour chacune des protéines holotypes telles que définies par le comité de classification de Bacillus thuringiensis (Crickmore et al., 2001). Toutefois, les homologies de séquences intra-holotypes, c'est-à-dire à entre les différents sous-types d'un même holotype, étant très élevées, l'homme du métier saura adapter l'enseignement du présent Exemple 4 à tous les sous-types de protéines Cry.

Tableau 7. Localisation et séquence de la boucle inter-hélice alpha 3-alpha 4 chez les

protéines Cryl

Protéine Séquence en Position sur Séquencenuctéotidique Position Acide aminé la protéine sur le gène Cry 1 Aa DPTN 120 à 123 gatcctactaat 358 à 369 CrylAb DPTN 120 à 123 gatcctactaat 358 à 369 CrylAc DPTN 120 à 123 gatcctactaat 358 à 369 CrylAd DPTN 120 à 123 gatcctactaat 358 à 369 CrylAe DPTN 120 à 123 gatcctactaat 358 à 369 CrylAf DPTN 120 à 123 gatcctactaat 358 à 369

CrylAg DPTN 120 à 123 gatcctactaat 358 à 369 CrylBa NRDD 139 à 142 aaccgtgatgat 415 à 426 CrylBb NRND 144 à 147 aaccgaaatgat 430 à 441 CrylBc NRND 144 à 147 aaccgaaatgat 430 à 441 CrylBd NRND 144 à 147 aaccgaaatgat 430 à 441 CrylCa DPNN 119 à 122 gatcctaataat 355 à 366 CrylCb DPDN 119à122 gatcctgataat 355 à 366 CrylDa DPTN 119 à 122 gatcctactaat 355 à 366 CrylDb DPSN 119 à 122 gatccgtctaat 355 à 366 CrylEa DPTN 118à121 gatcctactaat 352 à 363 CrylEb DPTN 117 A 120 gatcctactaat 349 à 360 CrylFa NPNN 118 à 121 aatcctaataat 352 à 363 CrylFb NPNN 118 à 121 aatcctaataat 352 à 363 CrylGa DPNN 118 à 121 gatcctaataat 352 à 363 CrylGb DPDN 118 à 121 gatcctgataac 352 à 363 CrylHa SPNN 122 à 125 tctcctaataat 364 à 375 CrylHb SPNN 121 à 124 tctcctaataat 361 à 372 Crylla NRNN 148 à 151 aatcgtaataac 442 à 453 Cryllb NRNN 148 à 151 aatcgtaataac 442 à 453 CrylIc NRNN 148 à 151 aatcgtaataac 442 à 453 Crylid NRNN 148 à 151 aatcgcaataac 442 à 453 Crylle NRNN 148 à 151 aatcgcaacaac 442 à 453 Cry Ua DPDN 119 à 122 gatcctgataac 355 à 366 CrylJb TPDN 119 à 122 actccagataac 355 à 366 CrylKa NRND 145 à 148 aaccgaaatgat 433 à 444

Tableau 8. Localisation et séquence de la boucle inter-hélice alpha 4-alpha 5 chez les protéines Cryl

Protéine Séquence en Position sur Séquence nucléotidique Position acides aminé s la protéine sur le gène CrylAa LAVQNYQVPLL 148 à 158 ttggcagttcaaaattatcaagttcotcmta 442 à 474 FLAVQNYQVPLL 148àà 158 tttgcagttcaaaattatcaagttcctctttta 442 à 474 CrylAb FA VQNYQVPLL 148 à 158 tttg cagttcaaaattatcaagttcct ctttta 442 à 474 CrylAc FAVQNYQVPLL 148 à 158 tttgcagttcaaaattatcaagttcctctttta 442 à 474 LAVQNYQVPLL 148 à 158 ttggcagttcaaaattatcaagttcctctttta 442 à 474 CrylAd FTVQNYQVPLL 148 à 158 tttacagttcaaaattatcaagtacctcttcta 442 à 474 CrylAe FTVQNYQVPLL 148 à 158 tttacagttcaaaa ttatcaagtacctcttcta 442 à 474 Cry 1 Af FAVQNYQVPLL 148 à 158 tttgcagttcaaaattatcaagttcctctttta 442 à 474 CrylAg LA VQNYQVPLL 148 à 158 ttgg c agttcaaaattatcaagttcctctttta 442 à 474 CrylBa FAIRNQEVPLL 167 à 177 ttcgcaattagaaaccaagaagttccattattg 499 à 531 CrylBb FRIRNEEVPLL 172 à 182 ttcagaatacgaaatgaagaagttccattatta 514 à 546

CrylBc FRIRNEEVPLL 172 à 182 ttcagaatacgaaatgaagaagttccattatta 514à546 CrylBd FRIRNEEVPLL 172 à 182 ttcagaatacgaaatgaagaagttccattatta 514à546 CrylCa FRISGFEVPLL 147 à 157 tttcgaatttctggatttgaagtacccctttta 439 à 471 CrylCb FRIAGFEVPLL 147 à 157 tttcgaattgctggatttgaagtacccctttta 439à471 CrylDa FRVQNYEVALL 147 à 157 tttagagttcaaaattatgaagttgctctttta 439 à 471 CrylDb LRVRNYEVALL 147 à 157 ttaagagttcgtaattatgaagttgctctttta 439 à471 CrylEa LFSVQNYQVPFL 145 à 156 cttttttcagttcaaaattatcaagtcccattttta 433 à 468 CrylEb LFSVQGYEIPLL 144 à 155 cttttttcagttcaaggttatgaaattcctctttta 430 à 465 CrylFa NFTLTSFEIPLL 145 à 156 aattttacacttacaagttttgaaatccctctttta 433 à 468 CrylFb NFTLTSFEIPLL 145 à 156 aattttacacttacaagttttgaaatccctctttta 433 à 468 CrylGa TLAIRNLEVVNL 145 à 156 actttggcaattcggaatcttgaggtagtgaattta 433 à 468 CrylGb LMAIPGFELATL 145 à 156 cttatggcaattccaggttttgaattagctacttta 433 à 468 CrylHa LREQGFEIPLL 150 à 160 ctgagagaacaaggctttgaaattcctctttta 448 à 480 CrylHb LREQGFEIPLL 149 à 159 ctgagagaacagggctttgaaattcctctttta 445 à 477 CrylIa FAVSGEEVPLL 176 à 186 tttgcagtgtctggagaggaggtaccattatta 526 à 558 Cry I Ib FAVSGEEVPLL 176 à 186 tttgcagtatctggtgaggaagtaccattatta 526 à 558 CrylIc FAVSGEEVPLL 176 à 186 tttgcagtatctggtgaggaagtaccattatta 526 à 558 Crylld FA VSGEEVPLL 176à186 ttlgcagttlctggagaagaggtgccgctatta 526 à 558 Crylle FAVSGEEVPLL 176 à 186 tttgcagtatcaggtgaggaagtaccattattg 526 à 558 Cry I Ja FRIIGFEVPLL 147 à 157 tttcggataattggatttgaagtgccactttta 439 à 471 CrylJb FRIPGFEVPLL 147 à 157 tttcggattcccggatttgaagtgccacttcta 439 à 471 CrylKa FSIRNEEVPLL 173 à 183 ttcagcatacgaaacgaagaggttccattatta 517 à 549

Tableau 9. Localisation et séquence de la boucle inter-hélice alpha 5-alpha 6 chez les protéines Cryl

Protéine Séquence en Position sur Séquence nucléotidique Position Acide aminé la protéine sur le gène CrylAa FGQRWGFD 178 à 185 tttggacaaaggtggggatttgat 532 à 555 Cry ! Ab FGQRWGFD 178 à 185 tttggacaaaggtggggatttgat 532 à 555 CrylAc FGQRWGFD 178 à 185 tttggacaaaggtggggatttgat 532 à 555 CrylAd FGQRWGFD 178 à 185 tttggacaacgttggggatttgat 532 à 555 CrylAe FGQRWGLD 178 à 185 tttggacaacgttggggacttgat 532 à 555 CrylAf CGQRSGFD 175 à 182 tgtggacaaaggtcgggatttgat 523 à 546 CrylAg FGQRWGFD 178 à 185 tttggacaaaggtggggatttgat 532 à 555 Cry 1 Ba FGSEFGLT 197 à 204 tttggtagtgaatttgggcttaca 589 à 612 CrylBb FGSEWGMA 202 à 209 tttggtagtgaatgggggatggca 604 à 627 CrylBc FGSEWGMA 202 à 209 tttggtagtgaatgggggatggca 604 à 627 CrylBd FGSEWGMA 202 à 209 tttggtagtgaatgggggatggca 604 à 627 CrylCa FGERWGLT 177 à 184 tttggagaaagatggggattgaca 529 à 552 FGERWGVT 177 à 184 tttggagaaagatggggagtgaca 529 à 552 CrylCb FGARWGLT 177 à 184 tttggagcaagatggggattgaca 529 à 552 CrylDa FGERWGYD 177 à 184 ttcggagaaagatggggatatgat 529 à 552

CrylDb YGQRWGFD 177 à 184 tacggtcagagatggggetttgac 529 à 552 CrylEa FGQAWGFD 176 à 183 tttgggcaggcttggggatttgat 526 à 549 CrylEb FGQRWGFD 175 à 182 tttggacaacgttggggatttgat 523 à 546 CrylFa FGQGWGLD 176 à 183 tttgggcagggttggggactggat 526 à 549 CrylFb FGQGWGLD 176 à 183 tttgggcagggttgggggctggat 526 à 549 CrylGa FGERWGLT 176 à 183 tttggagaaagatggggattaaca 526 à 549 CrylGb FGERWGLT 176 à 183 tttggggagagatggggattgaca 526 à 549 CrylHa FGQRWGLD 180 à 187 tttgggcaaagatggggacttgac 538 à 561 CrylHb FGQRWGLD 179 à 186 tttggacagagatggggacttgat 535 à 558 Crylla FGKEWGLS 206 à 213 tttggaaaagagtggggattatca 616à639 Cryllb FGKEWGLS 206 à 213 tttggaaaagaatggggattatca 616à639 Cry I Ic FEKNGGLS 206 à 213 tttgaaaagaatgggggattatca 616à639 Crylïd FGKEWGLS 206 à213 tttggaaaagaatggggattgtca 616à639 Crylle FGKEWGLS 206 à213 tttggaaaagagtggggattatct 616à639 CrylJa FGERWGLT 177 à 184 tttggagagagatggggattgacg 529 à 552 CrylJb FGERWGLT 177 à 184 ttcggagagagatggggattgacg 529 à 552 CrylKa FGSEWGMS 203 à 210 tttggtagtgaatgggggatgtca 607 à 630

Tableau 10. Localisation et séquence de la boucle inter-hélice alpha 6-alpha 7 chez les protéines Cryl

Protéine Séquence en Position sur Séquence nucléotidique Position Acide aminé la protéine sur le gène CrylAa VWGPD 218à222 gtatggggaccggat 652 à 666 CrylAb VWGPD 218à222 gtatggggaccggat 652 à 666 CrylAc VWGPD 218à222 gtatggggaccggat 652 à 666 CrylAd VWGPD 218à222 gtatggggaccggat 652 à 666 CrylAe VWGPD 218à222 gtatggggaccggat 652 à 666 CrylAf VWGPD 215à219 gtatggggaccggat 643 à 657 CrylAg VWGPD 218à222 gtatggggaccggat 652 à 666 CrylBa LRGTN 237 à 241 ttgagagggacaaat 709 à 723 CrylBb LRGTN 242 à 246 ttaagagggacaaat 724 à 738 CrylBc LRGTN 242 à 246 ttaagagggacaaat 724 à 738 CrylBd LRGTN 242 à 246 ttaagagggacaaat 724 à 738 CrylCa LPKST 217 à 221 ttaccgaaatctacg 649 à 663 Cry 1 Cb LPKST 217 à 221 ttaccaaaatctacg 649 à 663 CrylDa LEGRF 2t7à221 ttggaaggtcgtttt 649 à 663 CrylDb LEGSR 217à221 ttagagggatctcga 649 à 663 CrylEa LPRTGG 216à221 ttaccacgaactggtggg 646 à 663 CrylEb LPRNEG 215 à 220 ttaccacgtaatgaaggg 643 à 660 CrylFa LRGTNT 216à221 ttaagaggtactaatact 646 à 663 CrylFb LRGTNT 216à221 ttaagaggtactaatact 646 à 663 CrylGa IGGIS 216à220 attggagggataagt 646 à 660

CrylGb LNVIR 216 à 220 Kaaatguataaga 646 à 660 CrylHa FGGVS 220 à 224 tttggtggtgtgtca 658 à 672 CrylHb FGVVT 219à223 tttggtgttgtaaca 655 à 669 Crylla LRGTN 246 à 250 ttgaggggtacaaat 736 à 750 CrylIb LRGTN 246 à 250 ttgaggggtacaaat 736 à 750 CrylIc LRATN 246 à 250 ttgagggctacaaat 736 à 750 Crylid LRGTN 246 à 250 ttgaggggaacaaat 736 à 750 Crylle LRGTN 246 à 250 ttgagaggtacaaat 736 à 750 Cry Ua LGFRS 217à221 ctagggtttagatct 649 à 663 CrylJb LGFTS 217à221 ctagggtttacttct 649 à 663 CrylKa LRGTT 243 à 247 ttaagagggacaact 727 à 741

Tableau 11. Localisation et séquence de la boucle inter-hélice alpha 3-alpha 4 chez les protéines Cry3, Cry4, Cry7, Cry8, Cry9, CrylO, Cryl6, Cryl7, Cryl9 et Cry20

Protéine Séquence en Position sur Séquence nucléotidique Position acide aminé la protéine sur le gène Cry3Aa NPVSSRN 153 à 159 aatcctgtgagttcacgaaat 457 à 477 Cry3Ba APVNLRS 154 à 160 gcgcetgtaaatttacgaagt 460 à 480 Cry3Bb TPLSLRS 154 à 160 acacctttaagtttgcgaagt 460 à 480 Cry3Ca TPLTLRD 151 à 157 actcctttgactttacgagat 451 à 471 Cry4Aa NNPNPQNTQD 160 à 169 aataatccaaacccacaaaatactcaggat 478 à 507 Cry4Ba EPNNQSYRTA 136 à 145 gagcctaataaccagtcctatagaacagca 406 à 435 Cry7Aa KQDDPEAILS 147 à 156 aaacaagatgatccagaagctatactttct 439 à 468 Cry7Ab NPDDPATITR 147 à 156 aatcctgatgatccagcaactataacacga 439 à 468 Cry8Aa NRNDARTRSV 158 à 167 aatcgcaatgatgcaagaactagaagtgtt 472 à 501 Cry8Ba NPNGSRALRD 159 à 168 aatccaaatggttcaagagccttacgagat 475 à 504 Cry8Ca NPHSTRSAAL 159 à 168 aacccacacagtacacgaagcgcagcactt 475 à 504 Cry9Aa NPNSASAEEL 146 à 155 aatcctaattctgcttctgctgaagaactc 436 à 465 Cry9Ba RPNGVRANLV 134 à 143 agaccaaacggcgtaagagcaaacttagtt 400 à 429 Cry9Ca DRNDTRNLSV 159 à 168 gatcgaaatgatacacgaaatttaagtgtt 475 à 504 Cry9Da RPNGARASLV 159 à 168 agaccaaatggcgcaagggcatccttagtt 475 à 504 Cry9Ea RPNGARANLV 159 à 168 agaccgaacggagcaagagctaacttagtt 475 à 504 Cry I OAa ARTHANAKAV 162 à 171 gcacgtacacacgctaatgctaaagcagta 484 à 513 Cryl6Aa NYNPTSIDDV 109 à 118 aattataatccaacttctatagacgatgta 325 à 354 Cry17Aa NKDDPLAIAEL 127 à 137 aataaagatgaccccttggctatagctgaatta 379 à 411 Cryl9Aa DPKSTGNLSTL 159 à 169 gatccaaaatctacaggtaatttaagcacctta 475 à 507 Cryl9Ba NKNNFASGEL 151à 160aataaaaataatttcgcaagtggtgaactt 451 à 480 Cry20Aa ERNRTRENGQ 141 à 150 gaacgtaatagaactcgtgaaaacggacaa 421 à 450

Tableau 12. Localisation et séquence de la boucle inter-hélice alpha 4-alpha 5 chez les protéines Cry3, Cry4, Cry7, Cry8, Cry9, CrylO, Cryl6, Cryl7, Cryl9 et Cry20

Protéine Séquence en Position Séquence nucléotidique Position acide aminé surla protéine sur le gène Cry3Aa ISGYEVL 186 à 192 atttctggatacgaggttcta 556 à 576 Cry3Ba VSKFEVL 187 à 193 gtttccaaattcgaagttctg 559 à 579 Cry3Bb VSKFEVL 187 à 193 gtttccaaattcgaagtgctg 559 à 579 Cry3Ca VSGYEVL 184 à 190 gtctctggatacgaagttcta 550 à 570 Cry4Aa LVNSCPPNPSDCDYYNILVL 188 à 207 cttgtaaactcttgtcctcctaatcctagtgattgcgattactataacatactagtatta 562 à 621 Cry4Ba FSNLVGYELLLL 164 à 175 tttagcaacttagtaggttatgaattattgttatta 490 à 525 Cry7Aa FKVTGYEIPLL 175 à 185 tttaaggttactggatatgaaataccattacta 523 à 555 Cry7Ab FRVAGYEIPLL 175 à 185 tttagggttgctggatatgaaataccattacta 523 à 555 Cry8Aa FAVSGHEVLLL 186 à 196 tttgcagtatccggacacgaagtactattatta 556 à 588 Cry8Ba FRVTNFEVPFL 187 à 197 tttcgagtgacaaattttgaagtaccattcctt 559 à 591 Cry8Ca FSQTNYETPLL 187 à 197 ttttctcaaacgaattatgagactccactctta 559 à 591 Cry9Aa LTNGGSLARQNAQILLL 175 à 191 ttaacgaatggtggctcgttagctagacaaaatgcccaaatattattatta 523 à 571 Cry9Ba FGSGPGSQRFQAQLL 161 à 175 tttggtagtggccctggaagtcaaaggtttcaggeacaattgttg 481 à 525 Cry9Ca FAVNGQQVPLL 187 à 197 tttgeagtaaatggacagcaggttccattactg 559 à 591 Cry9Da FGSGPGSQNYATILL 186 à 200 tttggctctggtcctggaagtcaaaattatgcaactatattactt 556 à 600 Cry9Ea FGTGPGSQRDAVALL 186 à 200 tttggtacgggtcctggtagtcaaagagatgcggtagcgttgttg 556 à 600 CrylOAa LKNNASYRIPTL 189 à 200 ttaaaaaataatgctagctatcgaataccaacactc 565 à 600 Cryl6Aa FKVKNYEVTVL 136 à 146 tttaaggttaaaaattatgaagtaacagtgtta 406 à 438 Cryl7Aa FKRANYEVLLL 155 à 165 tttaaaagggcgaattatgaagtcttactatta 463 à 495 Cryl9Aa VNNQGSPGYELLLL 187 à 200 gttaataatcaggggagtccaggttatgagttacttttattg 559 à 600 Cryl9Ba FSLGGYETVLL 180 à 190 ttctcattaggaggttatgaaacagtattatta 538 à 570 Cry20Aa LSRRGFETLLL 173 à 183 ctttctcgcagaggattcgaaactcttttatta 517 à 549

Tableau 13. Localisation et séquence de la boucle inter-hélice alpha 5-alpha 6 chez les protéines Cry3, Cry4, Cry7, Cry8, Cry9, CrylO, Cry16, Cryl7, Cryl9 et Cry20

Protéine Séquence en Position sur Séquence nucléotidique Position Acide aminé la protéine sur le gène Cry3Aa GEEWGYE 215à221 ggagaagaatggggatacgaa 643 à 663 Cry3Ba GEEWGYS 216à222 ggagaagaatggggatattct 646 à 666 Cry3Bb GEEWGYS 216à222 ggagaagaatggggatattct 646 à 666 Cry3Ca GTDWGYS 213 à 219 ggaacggattggggatattct 637 à 657 Cry4Aa FEAYLKNNRQFDYLE 227 à 241 tttgaagcgtatttaaaaaacaatcgacaattcgattatttagag 679 à 723 Cry4Ba LINAQEWSL 193 à 201 ctcataaatgcacaagaatggtcttta 577 à 603 PHKCTRMVY 1930201 cctcataaatgcacaagaatggtctat 577 à 603 Cry7Aa GDKWGF 206 à 211 ggagataaatggggattc 616 à 633 GDKWEF 206 à 211 ggagataaatgggaattc 616 à 633 Cry7Ab GDKWGF 206 à 211 ggagataaatggggattc 616à633 Cry8Aa GEEWGF 217à222 ggagaagagtggggattt 649 à 666 Cry8Ba GEEWGL 218 à 223 ggagaagaatggggattg 652 à 669 Cry8Ca GKEWGY 218 à 223 gggaaggaatggggatat 652 à 669 Cry9Aa RYGTNWGL 210 à 217 agatatggcactaattgggggcta 628 à 651 Cry9Bal KYGARWGL 194 à 201 aagtatggggcaagatggggactc 5 80 à 603 Cry9Ca LFGEGWGF 216à223 ctttttggagaaggatggggattc 646 à 669 Cry9Da IYGARWGL 219à226 atttatggagctagatgggggctg 655 à 678 Cry9Ea IYGARWGL 219à226 atctatggggcaagatggggactt 655 à 678 CrylOAa TYYNIWLQ 219à226 acctattacaatatatggctgcaa 655 à 678 Cryl6Aa IYGDAWNLYRELGF 165 à 178 atttatggagatgcatggaatttatatagagaattaggattt 493 à 534 Cryl7Aa LLNKVIDNF 184 à 192 cttttaaataaagttatagataatttt 550 à 576 Cryl9Aa IYGDKWWSA 219 à 227 atttatggagataaatggtggagcgca 655 à 681 Cryl9Ba IYGKELG 209 à 215 atttacggaaaagaattagga 625 à 645 Cry20Aa LYRNQWL 202 à 208 ctttatagaaatcaatggtta 604 à 624

Tableau 14. Localisation et séquence de la boucle inter-hélice alpha 6-alpha 7 chez les protéines Cry3, Cry4, Cry7, Cry8, Cry9, CrylO, Cryl6, Cryl7, Cryl9 et Cry20

Protéine Séquence en Position sur Séquence nucléotidique Position Acide aminé la protéine sur le gène Cry3Aa RGSS 255 à 258 agaggttcatct 763 à 774 Cry3Ba RGST 256 à 259 agaggttcaact 766 à 777 Cry3Bb RGST 256 à 259 agaggttcaact 766 à 777 Cry3Ca RGST 253 à 256 agaggttcgact 757 à 768 Cry4Aa LIKTTPD 274 à 280 ttaattaaaacgacgcctgat 820 à 840 Cry4Ba LRNKS 235 à 239 cttagaaataaatct 703 à 717 Cry7Aa LNGST 245 à 249 ttgaacggttccact 733 à 747 Cry7Ab LNGST 245 à 249 ttgaacggttccact 733 à 747 Cry8Aa LKGTT 256 à 260 ttgaaaggtaccact 766 à 780 Cry8Ba LKGSS 257 à 261 ttaaaaggctcgagc 769 à 783 Cry8Ca LRGTG 257 à 261 ttaagaggaacgggt 769 à 783 Cry9Aa LRQRGTS 252 à 258 ctaagacaacgaggcactagt 754 à 774 Cry9Bal LRGTS 236 à 240 ttacgaggaacgagc 706 à 720 Cry9Ca LRGTN 257 à 261 ttaagaggaacaaat 769 à 783 Cry9Da LRGTT 260 à 264 ttaagaggcacaacc 778 à 792 Cry9Ea VRGTN 260 à 264 gtaagaggaacaaat 778 à 792 CrylOAa IRTNT 267 à 271 attagaactaatact 799 à 813 Cry16Aa LKLDPN 210à215 ttaaaactagatccgaat 628 à 645 Cry17Aa IKNKTRDF 224 à 231 ataaaaaataaaactagggatttt 670 à 693 Cry19Aa FRTAG 261 à 265 tttagaacagcaggt 781 à 795 Cry19Ba KKQIG 250 à 254 aaaaaacaaatagga 748 à 762 Cry20Aa DRSS 245 à 248 gatcgttcaagt 733 à 744

Des mutants peuvent être préparés pour chacun des gènes cry cités dans cet exemple sur le modèle des exemples 1, 2 et 3. Les procédures techniques utilisables pour la mise en oeuvre de la mutagenèse sont similaires celles présentées dans les exemples 1, 2 et 3.

Exemple 5 : Augmentation globale du contenu en leucine, phénylalanine et acide glutamique des protéines Cry L'augmentation globale du contenu en leucine, phénylalanine et acide glutamique des protéines Cry est décrite ci-après pour la toxine Cry9Cal. Bien que cet exemple soit réalisé sur la protéine Cry9Cal et le gène cry9Cal, son enseignement est applicable à toutes les toxines Cry et tous les gènes cry. Cet enseignement s'applique notamment a toutes les toxines Cry dont la séquence est connue et déposée dans la base de données Genbank :

http ://www. ncbi. nlm. nih. gov/Genbank/index. html.

Les numéros d'accession de Genbank des gènes cry sont disponibles sur le site suivant : http : //www. biols. susx. ac. uk/Home/Neil Crickmore/Bt/index. html.

Cet enseignement s'applique également à toutes les toxines Cry et gènes cry dont la séquence n'est pas divulguèe sur Genbank.

A la différence des stratégies décrites dans les exemples 1 à 4, l'objectif n'est pas de modifier une région précise de la toxine pour intégrer des acides aminés reconnus par la pepsine mais d'augmenter globalement le nombre de ces sites par augmentation du taux de leucine, de phénylalanine et d'acide glutamique dans ladite toxine. Cette stratégie permet de rendre la toxine Cry plus sensible à la pepsine en augmentant le pourcentage de résidus reconnus par la pepsine. L'acide glutamique (E-Glu) est préférentiellement substitué à l'acide aspartique (D-Asp), la

phénylalanine (F-Phe) remplace préférentiellement le tryptophane (W-Trp) et la leucine (L-Leu) remplace de préférence la valine (V-Val) ou l'isoleucine (I-Ile). Cette stratégie a nécessité la création d'un modèle tridimensionnel de la toxine Cry9Cal activée créé à partir de la séquence primaire de la protéine par comparaison avec les structures tridimensionnelles de CrylAal et Cry3Aal. Le modèle a été créé en utilisant le serveur Swiss-Model Protein Modelling Server (Peitsch, 1995 ; Peitsch, 1996 ; Guex and Peitsch, 1997). L'adresse du serveur est la suivante : (http : //www. expasy. ch/swissmod/swiss-model. html).

De façon préférentielle, les substitutions doivent atteindre un niveau maximum de 25 %. La toxine Cry9Cal activée contient 31 acides aspartiques, 9 tryptophanes et 47 valines. Il y a naturellement 26 acides glutamiques, 35 phénylalanines et 61 leucines. En tenant compte d'un maximum de 25% de substitution pour chacun des acides aminés, les rapports relatifs sont les suivants :

Acide aminé Nombre de résidus Nombre de résidus dans Cry9Cal native dans Cry9Cal modifiée Asp (D) 31 24 Glu (E) 26 33 Trp (W) 9 7 Phe (F) 35 37 Val (V) 47 36 Leu (L) 61 72

La substitution de l'isoleucine (I-Ile) par la leucine peut également être envisagée en place ou en plus de la substitution de la valine par la leucine. Il y a naturellement 27 isoleucines dans la toxine Cry9Cal. En tenant compte d'un taux de substitution préférentiel de 25%, il suffit de remplacer 6 résidus isolecine par des leucines.

Il est possible de modifier la séquence du gène cry9Cal comme montré ci-après. La démonstration ci-après n'a pour seul objectif que d'illustrer l'exemple et ne limite en rien la portée de l'invention. Cette démonstration porte sur le remplacement de résidus acides aspartique, phénylalanines et valines. Un homme du métier peut très facilement adapter cette approche à tout autre gène cry dont il connaîtrait la séquence et notamment à partir des séquences disponibles sur Genbank et dont les numéros d'accessions sont mentionnés sur le site suivant : http : //www. biols. susx. ac. uk/Home/Neil Crickmore/Bt/index. html
Les gènes cry généralement exprimés dans les plantes transgéniques sont des gènes tronqués, c'est à dire que seule la séquence du gène codant pour la toxine activée est introduite dans ces plantes. Les séquences présentées dans cet exemple correspondent à cette version tronquée et s'étendent selon le cas, gène ou protéine, du codon d'initiation ou de la première méthionine à 15 codons ou acides aminés en aval du bloc conservé 5 qui limite la toxine activée.

La séquence du gène cry9Cal natif et tronqué est présentée dans la SEQ ID NO 1.

La séquence de la protéine Cry9Cal native et tronquée est présentée dans la SEQ ID NO 2.

La séquence d'un gène cry9Cal modifié dans lequel tous les codons codant pour les résidus valine, acide glutamique et phénylalanine ont été modifié est présentée dans la figure 1 (SEQ ID NO 9). Cette séquence modifiée est utilisable comme base pour la définition des divers oligonucléotides de mutagenèse pouvant être utilisés. Les bases modifiées sont représentées en caractères gras.

La séquence d'une protéine Cry9Cal modifiée dans laquelle tous les résidus valine, acide glutamique et phénylalanine ont été modifiés est présentée dans la figure 2 (SEQ ID NO 10) es acides aminés modifiés sont représentées en caractères gras.

L'ensemble des oligonucléotides de mutagenèse pouvant permettre de remplacer les résidus valine, phénylalanine et acide glutamique sont présentés dans la figure 3 (SEQ ID NO 94 à 160).

Les bases modifiées sont représentées en caractères gras.

Une possibilité d'utilisation de certains oligonucléotides pour créer un gène cry9Cal modifié dont le remplacement des codons codant pour les résidus valine, phénylalanine et acide glutamique a été réalisé à hauteur de 25% est présentée ci-après à titre illustratif. Cette illustration a pour objectif d'exemplifier la stratégie développée sans limiter la portée de l'invention. Sur la base de l'enseignement de cet exemple et des figures 1 à 3 (SEQ ID NO 9 et 10), l'homme du métier saura

adapter d'autres combinaisons des oligonucléotides présentés dans la figure 5 (SEQ ID NO 94 à 160) ou d'autres oligonucléotides préparés sur le même principe, en particulier pour le remplacement des résidus isoleucine.

La séquence d'un gène cry9Cal modifié par remplacement des codons codant pour les résidus valine, phénylalanine et acide glutamique à hauteur de 25% est présentée dans la figure 4 (SEQ ID NO 11). Les bases modifiées sont en gras.

La séquence d'une protéine Cry9Cal modifiée par remplacement des résidus valine, phénylalanine et acide glutamique à hauteur de 25% est présentée dans la figure 5 (SEQ ID NO 12).

Les acides aminés modifiés sont en gras.

La création d'un gène cry9Cal modifiés dans lequel 25% des codons valine, phénylalanine et acide glutamique sont modifiés et dont la séquence est présentée en figure 4 (SEQ ID NO 11) peut être réalisée en utilisant, parmi ceux présentés dans la figure 5 (SEQ ID NO 94 à 160), les oligonucléotides suivants :

Oligonucléotide n 60 Oligonucléotide n 62 Oligonucléotide n 67 Oligonucléotide n 72 Oligonucléotide n 77 Oligonucléotide n 78 Oligonucléotide n 80 Oligonucléotide n 82 Oligonucléotide n 83 Oligonucléotide n 88 Oligonucléotide n 90 Oligonucléotide n 92 Oligonucléotide n 96 Oligonucléotide n 97 Oligonucléotide n 103 Oligonucléotide n'l 11

La méthode préférentiellement utilisée est une mutagenèse multiple avec un mélange des oligonucléotides mentionnés immédiatement ci-dessus. La procédure de mutagenèse dirigée est similaire celle décrite dans l'exemple 1 à la seule différence qu'un mélange d'oligonucléotides de mutagenèse est utilisé dans cet exemple alors qu'un seul oligonucléotide de mutagenèse est utilisé dans l'exemple 1. Le protocole employé est celui décrit dans les exemples 1 à 4. Il est commun à

chacune des séries de mutagenèses, seuls l'oligonucléotide de mutagenèse et l'oligonucléotide d'inibition/restauration de la résistance à l'antibiotique changent.

Exemple 6 : Production des protéines Cry modifiées dans B. thuringiensis et purification

Les gènes natifs et modifiés sont insérés avec leurs séquences promotrices et terminatrices dans le vecteur navette E. coli-B. thuringiensis pHT3101 (Lereclus et al., 1989).

L'ADN plasmidique est préparé par minipréparation selon la technique de la lyse alcaline (Birboim et Doly, 1979). Chaque colonie bactérienne est cultivée dans 2 ml de milieu LB additionné de l'antibiotique approprié pendant une nuit à 37 C avec agitation (200 rpm). La culture est ensuite transférée dans un microtube puis centrifugée à 13500 g pendant 5 min. Après élimination du surnageant, les bactéries sont resuspendues dans 100u.1 d'une solution de 25mM TrisHCI, pH 8, 10mM EDTA contenant de la Rnase A à la concentration finale de 100 ug/ml. 200 gel d'une solution de NaOH 0, 2M, 1% SDS sont rajoutés et la suspension est mélangée deux fois par inversion du microtube. 150 al d'une solution d'acétate de potassium 2, 55 M, pH 4, 5 sont rajoutés et la suspension est incubée 5 min dans la glace. Après une centrifugation de 15 min à 13500 g, le surnageant est transféré dans un microtube contenant 1 ml d'éthanol froid. Après une centrifugation de 30 min. à 13500 g, le surnageant est éliminé et le culot lavé avec 1 ml d'éthanol 70%. Le culot contenant l'ADN est séché quelques minutes sous vide puis repris dans 50 u. l d'eau distillée stérile.

Les échantillons sont ensuite placés à 65 C pendant 30 min.

Les digestions par endonucléases de restriction sont réalisées pour 1 g d'ADN dans un volume final de 20 al en présence d'un dixième de volume final de tampon 10X conseillé par le fournisseur pour chaque enzyme et à l'aide de 5 unités d'enzyme. La réaction est incubée pendant 2 à 3 h à la température optimale pour l'enzyme.

La déphosphorylation des extrémités 5'engendrées par une enzyme de restriction est réalisée

avec la phosphatase alcaline d'intestin de veau. La réaction se fait en utilisant 5 al de tampon de déphosphorylation IOX (500 mM Tris-Hcl, pH 9, 3, 10 mM MgCh, ImM ZnCl2, 10 mM spermidine) et une unité d'enzyme par ig d'ADN dans un volume final de 50 ul. La réaction est incubée pendant une heure à 37 C dans la cas d'extrémités 5'sortantes ou à 55 C dans la cas d'extrémités franches ou 3'sortantes. Après la déphosphorylation, l'enzyme est ensuite inactivée pendant 30 min. à 65 C puis éliminée avec deux extractions volume à volume avec un mélange de phénol-chloroforme-alcool isoamylique (25-24-1). Les ligatures se font à l'aide de l'ADN ligase du phage T4. Elle est réalisée avec une quantité de vecteur égale à 100 ng et un rapport molaire insert/vecteur compris entre 5 et 10. Le volume final de la réaction est de 30 u. l et comprend 3 al de tampon de ligature IOX (300 mM Tris-Hcl, pH 7, 8, 100 mM Mg12, 100 mM DTT, 10 mM ATP) et 3 unités d'enzyme. La réaction est incubée une nuit à 14 cm.

La construction est insérée dans une souche acristallophore de B. thuringiensis selon une méthode dérivée de celle décrite en 1989 par Lereclus et al et décrite par ailleurs (Rang et al.,

1999,2000). Une préculture de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-1 acristallophore est incubée une nuit à 37 C sous agitation dans 10 ml de milieu BHI (Difco). 250 ml de milieu BHI sont ensuite inoculés avec 5 ml de préculture et incubés à 37 C sous agitation jusqu'à ce que la DO à 600 nm de la culture atteigne la valeur de 0,3. La culture est alors centrifugée à 1000g à

4 C pendant 10 min. Le surnageant est éliminé et le culot bactérien est rincé avec 50 ml d'eau distillée stérile froide. Les bactéries sont centrifugées à nouveau pendant 10 min à 1000g à 4 C. Le culot est repris dans 4 ml d'une solution froide et stérile de PEG-6000 40% et placé dans de la glace. 200 III de bactéries sont alors mélangés avec 5 jlg d'ADN plasmidique puis placées dans une cuvette d'electroporation de diamètre 0,2 cm. La cuvette est alors placée dans la chambre d'électroporation et un courant correspondant aux caractéristiques suivantes : 2,5 kV, 1000 Q, 25 uF est délivré. Les bactéries sont ensuite récupérées, placées 10 min. dans de la glace avant d'être additionnées à 2 ml de milieu BHI et incubées à 37 C sous agitation pendant 90 min. 200 III de culture sont alors étalés sur des boîtes de Pétri contenant du milieu usuel (IEBC, 1994) solide additionné d'érythromycine à la concentration finale de 25 u. g/ml et incubés toute une nuit à28 C.

Les souches recombinantes de Bacillus thuringiensis exprimant le gène natif ou les gènes

mutés sont cultivées dans 250 ml de Milieu Usuel contenant de 25 u-g/ml d'érythromycine sous agitation à 28 C. La croissance des bactéries est vérifiée par observation en microscopie optique à contraste de phase. Les bactéries sont cultivées jusqu'à la lyse bactérienne après sporulation. La culture est alors centrifugée à 5000 g pendant 10 min. Le culot est lavé avec 125 ml de NaCl 1 M et la suspension est à nouveau centrifugée à 5000g pendant 10 min. Le culot est alors repris dans

15 ml d'eau distillée stérile contenant ImM de PMSF, incubé dans la glace et traité aux ultrasons (100W) pendant 1 min afin de dissocier les amas entre les spores et les cristaux. La suspension est ensuite déposée sur un gradient discontinu de NaBr composé d'une couche de 4 ml de concentration 38,5%, de 4 couches de 6 ml de 41,9%, 45,3%, 48,9% et 52,7% et d'une couche de 3 ml de 56,3%. Le gradient est alors centrifugé à 20000 g pendant 90 min à 20 C. Les différentes composantes de la suspension (spores, débris cellulaires, corps parasporaux) se positionnent dans le gradient à différents niveaux selon leur densité. Chaque bande est récupérée et lavée trois fois à l'aide d'un volume d'eau distillée stérile. Chaque bande est observée en microscopie optique à contraste de phase. La fraction contenant les corps d'inclusion est conservée à-20 C dans de l'eau distillée stérile contenant 1 mM de PMSF pour analyse ultérieure.

Exemple 7 : Analyse de la stabilité des protéines aux protéases
La première analyse de stabilité réalisée est la vérification de la stabilité à la trypsine. Les protéines présentes dans le corps d'inclusion parasporal sont solubilisées pendant une heure à 37 C dans le tampon de solubilisation (50 mM Na2CO3, pH 10,8, 14,6 mM 2-mercapthoethanol). La suspension est ensuite centrifugée à 14000 g pendant 10 min afin d'éliminer le matériel non

soluble. Le surnageant est alors additionné d'un dixième du volume total de trypsine 0,05% et incubé 2 h à 37 C. L'état des protéines après traitement à la trypsine est vérifié par analyse en gels de polyacrylamide-SDS selon la méthode de Laemmli (1970). Cette technique permet la séparation des protéines selon leur masse moléculaire grâce à la présence de SDS qui confere une charge globale négative à toutes les protéines. L'échantillon est d'abord traité en rajoutant un volume de solution de traitement 2X (125 mM Tris-HCl, 20% glycérol, 4% SDS, 10% 2mercaptoéthanol, 0,01 % bleu de bromophénol) puis est dénaturé 5 min dans de l'eau bouillante.

L'échantillon est ensuite déposé sur le gel et traverse d'abord un premier gel de tassement composé d'un mélange acrylamide-bisacrylamide 4%, 0,1% SDS, et de Tris-HCl 125mM, pH 6,8. L'échantillon traverse ensuite le gel de séparation composé d'acrylamide-bisacrylamide 12%, 0, 1% SDS, et de Tris-HCI 375mM, pH 8,8 et qui permet la séparation des différentes protéines en fonction de leur taille. L'électrophorèse est réalisée à 100V dans du tampon de migration (25 mM Tris-HCI, pH 8,3, 192 mM glycine, 0, 1% SDS) jusqu'à ce que le bleu de bromophénol sorte du gel. Le gel est ensuite coloré une heure à l'aide d'une solution de méthanol 40%-acide acétique 7% contenant 0,025% de bleu de Coomassie puis décoloré à l'aide d'une solution méthanol 50%-acide acétique 10%. Le gel est définitivement fixé dans une solution de méthanol 5%-acide acétique 7%.

La seconde analyse est la vérification de la stabilité aux sucs digestifs d'insectes. Les toxines stables à la trypsine sont purifiées par FPLC (Pharmacia) à l'aide d'une colonne échangeuse d'anions (Q-Sepharose) équilibrée avec une solution de 40 mM de Na2C03, pH 10,7. L'élution est réalisée à l'aide d'un gradient de 50 à 500 mM de NaCl. La DO à 280 nm des fractions est mesurée et les fractions contenant les protéines sont analysées par électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS. Les fractions contenant la toxine sont rassemblées et dialysées à 4 C contre de l'eau distillée pendant environ 48h jusqu'à la précipitation des protéines. La suspension protéique est ensuite centrifugée à 8000 g et à 4 C pendant 30 min. Les toxines contenues dans le culot sont resuspendues dans de l'eau distillée puis dosées selon Bradford (1976). Elles sont ensuite réparties en fractions aliquotes de 100 u. g, lyophilisées puis stockées à 4 C. Avant leur utilisation, les toxines sont solubilisées et placées à la concentration de 10 mg/ml à l'aide de Tris 25mM, pH 9,5 en vue de tester leur stabilité aux sucs digestifs de larves d'Ostrinia nubilalis. Le suc digestif des larves d'O. nubilalis peut être prélevé soit par régurgitation induite par un choc électrique selon la procédure de Ogiwara et al. (1992), soit par dissection des larves et collecte du jus intestinal avec une pipette selon la méthode décrite par Baines et al. (1994). Dans les deux cas entre 100 et 200 individus sont nécessaires à la collecte du suc digestif. Le suc collecté est centrifugé à 15000 g pendant 15 minutes à 4 C avant

utilisation. La concentration en protéine du suc digestif est déterminée par la méthode de Bradford (BioRad). La réaction est conduite pendant 15 minutes à 37 C avec un rapport 1 : 1 (basé sur la concentration en protéine du suc digestif) de toxine et de suc digestif. La réaction est arrêtée avec un cocktail d'inhibiteurs de protéases (Protease Inhibitors Set, Roche Diagnostics) mélangée avec un volume équivalent de solution de traitement 2X (125 mM Tris-HCl, 20% glycérol, 4% SDS, 10%, 2-mercaptoéthanol, 0,01 % bleu de bromophénol), puis incubée 5 minutes dans de l'eau bouillante. Les protéines sont alors analysées par SDS-PAGE selon la procédure décrite ci-dessus pour déterminer leur résistance aux sucs digestifs des larves et leur état de dégradation éventuel.

Le dernier type d'analyse de stabilité réalisé est celui de la stabilité à la pepsine. Les toxines natives et modifiées lyophilisées sont dissoutes dans un tampon gastrique (0,5 mg NaCl, 1,75 ml HCI IM dans 250 ml H20, pH 2.0) simulant le fluide stomacal des mammifères et contenant 0,32% de pepsine. Des échantillons sont retirés après 0,5, 15,60 et 240 minutes d'incubation à 37 C puis analysés par électrophorèse en gels de polyacrylamide-SDS comme décrit ci-dessus. Ces conditions sont identiques celles décrites dans le rapport d'évaluation de l'EPA (United States Environmental Protection Agency) nu 4458108.

Cette série d'analyses permet de visualiser l'état de conservation des protéines natives et mutées, et donc leur stabilité, à diverses protéases présentes chez les insectes (trypsine et sucs digestifs) et par conséquent de vérifier que les protéines mutées ont effectivement conservé leur stabilité chez l'insecte. Ces analyses permettent également de vérifier que les protéine mutées sont effectivement dégradées par la pepsine dans les conditions similaires à celles présentes dans l'estomac des mammifères.

Exemple 8 : Analyse des propriétés insecticides
L'analyse de propriétés insecticides est réalisée au travers de deux types d'expérimentations permettant de tester les deux étapes du processus de toxicité chez l'insecte : la reconnaissance du site récepteur et l'évaluation de la toxicité in vivo.

L'analyse de l'affinité des toxines pour le site récepteur est réalisée à l'aide de toxine radiomarquées à l'iode 125 (1). Les toxines activées purifiées par FPLC et lyophilisées sont reprise dans du tampon de stockage (Tris-HCI 20 mM, pH 8.6) et analysées par SDS-PAGE pour vérifier leur état. Une fraction aliquote est dosée selon la méthode de Bradford (1976). Les toxines sont iodinylées selon la méthode de la chloramine-T (Markwell, 1982). 25 ug de toxine

sont incubés pendant 5 min à température ambiante avec 0.25 mCi de Na-125 et une lodo- bead (Pierce) dans 50 III de tampon sodium carbonate (50 mM Na2C03, pH 10). La réaction de iodinylation est ensuite déposée à la surface d'une colonne de dessalage au dextran (Pierce) équilibrées avec du tampon CBS (50 mM Na2CO3, pH 10,8, 150 mM NaCl) pour éliminer l'iode libre. Le marquage et la qualité de la protéine sont vérifiés par analyse par SDS-PAGE suivie d'une autoradiographie. L'activité spécifique moyenne d'une toxine marquée est de 100000 cpm/pmol.

Afin de préparer les vésicules de membrane de la bordure en brosse (BBMV) sur lesquels l'étude de l'affinité des toxines pour les récepteurs est réalisée, les insectes sont élevés jusqu'au dernier stade larvaire. L'insecte utilisé est Ostrinia nubilalis, mais la méthodologie mise en oeuvre est applicable à toute autre espèce d'insecte. L'utilisation d'une autre espèce d'insecte nécessite d'adapter les conditions d'élevage et le milieu nutritif à chacune des espèces envisagées, ce qui est facilement réalisable par toute personne experte dans l'art. Les larves d'Ostrinia nubilalis sont élevées sur milieu nutritif artificiel meridie (Lewis et Lynch, 1969 ;

Reed et al., 1972 ; Ostlie et al., 1984). La méthode d'élevage des larves d'Ostrinia nubilalis est celle décrite par Huang et al. (1997). Les larves sont élevées individuellement dans des plateaux à 128 puits (Bio-Ba-128, C-D International). Chaque puits contient 2 ml de milieu artificiel.

Après dix jours les larves sont transférées dans des boîtes plus larges (18,4 cm de diamètre et 7,6 cm de hauteur) contenant 300 ml de milieu nutritif artificiel. Du carton ondulé est placé à l'intérieur en guise de site de pupaison. Lors de la phase larvaire la température de la cellule d'élevage est de 25 C avec un éclairage constant (24 h). Les cartons contenant les chrysalides sont transférés dans des cages grillagées pour l'émergence et l'élevage des adultes. Du papier ciré est déposé dans la cage pour recevoir les pontes. Les pontes sont prélevées et maintenant en attente à 15 C. L'élavage des adultes est conduit à 25 C avec 75% d'humidité relative et 14 h de photopériode.

Pour la conduite des tests d'affinité des toxines pour les sites récepteurs, les larves sont collectées en début de 5ème stade larvaire et mises à jeûner pendant 6 heures. Elles sont alors prélevées et déposées sur de la glace pendant 5 minutes. Les larves sont disséquées et le tube digestif et retiré. Les tubes digestifs disséqués sont groupés par 20, déposés dans un cryotube dontenant du tampon MET (300mM mannitol, 5mM EGTA, 17mM Tris-HCI, pH 7.5), congelés dans de l'azote liquide et conservés à-80C.

Les BBMV sont préparés selon la méthode de précipitation différentielle au magnésium (Wolfersberger egal., 1987 ; Nielsen-LeRoux et Charles, 1992). Les BBMV sont repris dans du tampon TBS (20mM Tris-Hel, pH 8.5, 150mM NaCl) et la concentration totale en protéine est déterminée par la méthode de Bradford utilisant le kit Biorad et de la sérumalbumine bovine (BSA) comme standard (Bradford, 1976).

Les tests de reconnaissance de récepteurs in vitro sont réalisés dans des microtubes de 1,5 ml en polyéthylène dans du tampon phosphate de sodium 20 mM pH 7.4 contenant 0.15 M de NaCl et 0. 1% de serumalbumin bovine (PBS/BSA). Les tests sont réalisés, en double exemplaires, à température ambiante dans un volume total de 100 ul, avec 10 ug de protéine de BBMV. Les toxine fixées sur les BBMV sont séparées des toxines libres par centrifugation à 14,000 x g pendant 10 min, à température ambiante. Les culots de chaque échantillon, contenant la toxine fixé sur la membrane, sont rincés deux fois avec 200 al de tampon PBS/BSA (20 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, 0. 1% BSA, pH 8.5) froid puis centrifugés. Les culots sont finalement resuspendus dans 200 al de tampon PBS/BSA et ajoutés à 3 ml de cocktail scintillant HiSafe 3 (Pharmacia) dans une fiole à scintillation. Le comptage est réalisé dans un compteur à scintillation liquide.

Les tests de fixation directe sont conduit selon le protocole de Nielsen-LeRoux et Charles (1992). 30 ug de BBMV par microtube sont incubés avec une série de concentrations de 1 à 100 mM de toxine marquée à l'iode 1251 dans du tampon Tris/BSA buffer (20 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, 0. 1% BSA, pH 8.5). Le taux d'accrochage non spécifique est déterminé dans des expériences parallèles en présence d'un excès de 300 fois de toxine non marquée. Après 90 minutes d'incubation à température ambiante les échantillons sont centrifugés à 14000 g pendant 10 minutes à 4 cm. Les culots sont rincés deux fois avec du tampon Tris/BSA froid et ressuspendus dans 150 al du même tampon et ajoutés à 3 ml de cocktail scintillant HiSafe 3 (Pharmacia) dans une fiole à scintillation.

Chaque expérience est réalisée en double et chaque point expérimental est compté deux fois dans un compteur à scintillation liquide. Les donnés sont analysées à l'aide du logiciel LIGAND (Munson and Rodbard, 1980) commercialisé par la Société Biosoft.

* Les expériences de compétition homologue sont réalisées comme décrit précédemment pour les expériences d'accrochage direct avec 10 ag de BBMV dans un volume total de 100 al pendant 90 min à température ambiante. Les BBMV sont incubés dans une concentration fixe de 10 nM de toxine marquée à l'iode 1251 en présence d'une série de concentrations (de 0.1 à 300 fois la concentration de la toxine marquée) dans du tampon Tris/BSA. La valeur de l'accrochage

non spécifique (l'accrochage toujours présent en présence d'un excès de 300 fois de la toxine non marquée) est soustrait de la valeur totale comptée. Chaque expérience est réalisée en double et chaque point expérimental est compté deux fois dans un compteur à scintillation liquide. Les données sont analysées à l'aide du logiciel LIGAND (Munson and Rodbard, 1980) commercialisé par la Société Biosoft.

Les tests de toxicité in vivo sont réalisés selon la procédure décrite par Lambert et al.

(1996). La toxine activée et solubilisée est incorporée dans le milieu nutritif à diverses concentrations encadrant la dose létale 50% (DLso) de Cry9Cal pour Ostrinia nubilalis qui est de 96,6 ng de toxine par cm2 de surface de milieu. Six doses de 0,1 ng/cm2, 1 ng/cm2, 10 ng/cm2, 100 ng/cm2, 1000 ng/cm2 et 10000 ng/cm2 sont utilisées pour évaluer la DLso des toxines natives et modifiées. Les tests de toxicité sont réalisés sur des larves néonates dans des plaques de 24 puits de 2 cm (Multiwell-24 plates, Coming Costar Corp. ). 50 l de chacune des dilutions de toxine sont étalés sur le milieu et séchés sous une hotte à flux. Une larve est déposée dans chaque puis et un total de 24 larves est utilisé pour chaque dose (une plaque par dose). Pour chaque dose le test est répété au moins trois fois. Un contrôle est réalisé avec de

l'eau distillée. Les plaques sont couvertes et déposées à 25 C, 70% d'humidité relative et avec un photopériode 16 h. La mortalité est contrôlée après 7 jours est la DLso est calculée selon la méthode des probits (Finney, 1971).

Références bibliographiques Abdul-Rauf, M. and Ellar, D. J. 1999. Mutations of loop 2 and loop 3 residues in domain II of Bacillus thuringiensis CryC 8-endotoxin affect insecticidal specificity and initial binding to

Spodoptera littoralis and Aedes aegypti midgut membranes. Current Microbiology. 39 : 94-98. Aronson, A. I., D. Wu, and C. Zhang. 1995. Mutagenesis of specificity and toxicity regions of a Bacillus thuringiensis protoxin gene. J. Bacteriol. 177 : 4059-4065.

Baines, D., A. Brownright and J. L. Schwartz. 1994. Establishment of primary and continuous cultures of epithelial cells from larval lepidopteran midguts. J. Inseet. Physiol. 40 : 347-357.

Birnboim, H. C. and J. Doly. 1979. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic. Acids Res. 7 : 1513.

Bradford, M. M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72 : 248-254.

Chen, X. J., Lee, M. K. and Dean, D. H. (1993) Site-directed mutations in a highly conserved region of Bacillus thuringiensis 8-endotoxin affect inhibition of short circuit current across Bombyx mori midguts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 9041-9045.

Coux, F., V. Vachon, C. Rang, K. Moozar, L. Masson, M. Royer, M., Bes, S. Rivest, J. L. Schwartz, R. Laprade and R. Frutos. 1999. Role of interdomain salt bridges in the pore-forming ability of insecticidal toxin CrylAa of Bacillus thuringiensis. 32nd Annual Meeting of the Society for Invertebrate Pathology. 22-27 August 1999, Irvine, Californie, USA.

Crickmore, N. 2001. http ://epunix. biols. susx. ac. uk/Home/Neil Crickmore/Bt/list. html

Crickmore, N.,. Zeigler, D. R., Feitelson, J., Schnepf, E., van Rie, J., Lereclus, D., Baum, J., and Dean, D. H. 1998. Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal proteins. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 : 807-813. de Maagd, R. A., P. Bakker, N. Staykov, S. Dukiandjiev, W. Stiekema, and D. Bosch. 1999. Identification of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin CrylC domain III amino acid residues involved in insect specificity. Appl. Environ. Microbiol. 65 (10) : 4369-4374.

Dean, D. H., Rajamohan, F., Lee, M. K., Wu, S. J., Chen, X. J., Alcantara, E., Hussain, S. R. 1996.

Probing the mechanism of action of Bacillus thuringiensis insecticidal proteins by site-directed mutagenesis-a minireview. Gene. 179 : 111-117.

Finney, D. J. 1971. Probit analysis. A statistical treatment of the sigmoid response curve.

University Press, Cambridge.

Gazit, E. and Shai, Y. 1993. Structural and functional characterization of the α5 segment of Bacillus thuringiensis 8-endotoxin. Biochemistry. 32 : 3429-3436.

Grochulski, P., Masson, L., Borisova, S., Pusztai-Carey, M., Schwartz, J. -L., Brousseau, R. and Cygler, M. (1995) Bacillus thuringiensis CryIA (a) insecticidal toxin : crystal structure and channel formation. J. Mol. Biol. 254 : 447-464.

Guex, N. and Peitsch, M. C. 1997. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer : An environment for comparative protein modelling. Electrophoresis. 18 : 2714-2723.

Huang, F. R. A. Higgins and L. L. Buschman. 1997. Baseline susceptibility and changes in susceptibility to Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki under selection pressure in European com borer (Lepidoptera : Pyralidae). J Econ. Entomol. 90 : 1137-1143.

Hussain, S. R. A., A. 1. Aronson, and D. H. Dean. 1996. Substitution of residues on the proximal side of CrylA Bacillus thuringiensis delta-endotoxins affects irreversible binding to Manduca sexta midgut membrane. Biochemical and Biophysical Research Communications. 226 (1) : 8-14.

Hutchinson C. A., S. Phillips, M. H. Edgell, S. Gillam, P. Jahnke, and M. Smith. 1978.

Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J. Biol. Chem. 253 : 6551.

IEBC. 1994. Collection of Bacillus thuringiensis and Bacillus sphaericus (classified by serotypes). Intitut Pasteur Paris Laemmli, U. K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 : 680-685.

Lambert, B., Buysse, L., Decock, C. Jansen, S. Piens, C., Saey, B., Seurinck, J., Van Audenhove, K., van Rie, J., van Vliet, A. and Peferoen, M. 1996. A Bacillus thuringiensis insecticidal crystal protein with a high activity against members of the family Noctuidae. Appl.

Environ. Microbiol. 62 : 80-86.

Lee, M. K., You, T. H., Gould, F. L., and Dean D. H. 1999. Identification of residues in domain III of Bacillus thuringiensis CrylAc toxin that affect binding and toxicity. Appl. Environ.

Microbiol. 65 : 4513-4520.

Lereclus, D., Arantes, S. O., Chauffaux, J. and Lecadet, M. M. 1989. Transformation and expression of a cloned delta-endotoxin gene in Bacillus thuringiensis. FEMS Microbiol. Lett.

60 : 211-217.

Lewis, L. C. and R. E. Lynch. 1969. Rearing the European com borer on diets containing com leaf and wheat germ. Iowa Stae J Sci. 44 : 9-14.

Li, J., Carroll, J. and Ellar, D. J. (1991) Crystal structure of insecticidal 8-endotoxin from Bacillus thuringiensis at 2.5 resolution. Nature 353 : 815-821.

Manoj Kumar, A. S. and Aronson, A. I. 1999. Analysis of mutations in the pore-forming region

essential for insecticidal activity of a Bacillus ://M MMM Q-endotoxin. c/o/. 181 : 6103-6107.

Markwell, M. A. K. 1982. A new solid-state reagent to iodinate proteins. I-Conditions for the efficient labelling of antiserum. Anal. Biochem. 125 : 427-432.

Masson, L., B. E. Tabashnik, Y. B. Liu, R. Brousseau, and J. L. Schwartz. 1999. Helix 4 of the Bacillus thuringiensis CrylAa toxin lines the lumen of the ion channel. J. Biol. Chem.

274 : 31996-32000.

Munson, P. J. & Rodbard, D. 1980. LIGAND : a versatile computerized approach for characterization ofligand-binding systems. Anal. Biochem. 107,220-239.

Nielsen-LeRoux, C. ; Charles, J. F. 1992. Binding of Bacillus sphaericus binary toxin to a specific receptor on midgut brush border membranes from mosquito larvae. Eur.. . Biochem. 210 : 585- 590.

Ogiwara, K., L. S. Indrasith, S. Asano and H. Hori. 1992. Processing of 6-endotoxin from Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-1 and HD-73 by gut-juices of various insect larvae. J Invert. Pathol. 60 : 121-126.

Ostlie, K. R., G. L. Hein, L. G. Higley, L. V. Kaster and Showers, W. B. 1984. European com borer (Lepidoptera : Pyralidae) development, larval survival, and adult vigor on meridic diets containing marker dies. J. Econ. Entomol. 77 : 118-120.

Peitsch, M. C. 1995. Protein modeling by E-mail. Bio/Technology. 13 : 658-660.

Peitsch, M. C. 1996. ProMod and Swiss-Model : Intemet-based tools for automated comparative protein modelling. Biochem. Soc. Trans. 24 : 274-279.

Rajamohan, F., Alcantara, E., Lee, M. K., Chen, X. J., Curtiss, A. and Dean, D. H. (1996) Single amino acid changes in domain II of Bacillus thuringiensis CrylAb 5-endotoxin affect irreversible binding to Manduca sexta midgut membrane vesicles. J Bacteriol. 177 : 2276-2282.

Rajamohan, F., M. K. Lee, and D. H. Dean. 1998. Bacillus thuringiensis insecticidal proteins : molecular mode of action. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 60 : 1-27.

Rang, C., L. Lacey, and R. Frutos. 2000. The crystal proteins from Bacillus thuringiensis subsp.

thompsoni display a synergistic activity against the codling moth, Cydia pomonella. Current Microbiology 40 : 200-204.

Rang, C., Vachon, V., Coux, F., Carret, C., Moar, W. J., Brousseau, R., Schwartz, J. L., Laprade, R. and Frutos, R. 2001. Exchange of domain 1 from Bacillus thuringiensis Cryl toxins influences protoxin stability and crystal formation. Current Microbiology. In Press.

Rang, C., Vachon, V., de Maagd, R. A., Villalon, M., Schwartz, J. -L., Bosch, D., Frutos, R. and Laprade, R. 1999. Interaction between functional domains of Bacillus thuringiensis insecticidal crystal proteins. Appl. Environ. Microbiol. 65 : 2918-2925.

Reed, G. L., W. B. Showers, J. L. Huggans and S. W. Carter. 1972. Improved procedures for mass rearing the European com borer. J. Econ. Entomol. 65 : 1472-1476.

Sambrook, J., E. F. Fritch and T Maniatis. 1989. Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Nolan C. ed., New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, A. R. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 : 5463-5467.

Schnepf, E., N. Crickmore, J. van Rie, D. Lereclus, J. Baum, J. Feitelson, D. R. Zeigler, and D.

H. Dean. 1998. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiol. Mol. Biol.

Rev. 62 : 775-806.

Terra, W. B. and C. Ferreira. 1994. Insect digestive enzymes : properties, compartimentalization and funcition. Comp. Biochem. Physiol. 109B : 1-62.

Vachon, V. F. Coux, F., G. Pr fontaine, C. Rang, L. Marceau, L. Masson, R. Brousseau, R.

Frutos, J. L. Schwartz, and R. Laprade, R. 2000. Role of a-helix three charged residues in pore

formation by the Bacillus thuringiensis insecticidal toxin CrylAa. 33rd Annual Meeting of the Society for Invertebrate Pathology. 13-18 August 2000, Guanajuato, Mexico.

Wolfersberger, M. G. ; Luthy, P. ; Maurer, A. ; Parenti, P. ; Sacchi, V. ; Giordana, B. ; Hanozet, G. 1987. Preparation and partial characterisation of amino acid transporting brush border membrane vesicles from the larval midgut of the cabbage butterfly (Pieris brassicae). Comp.

Biochem. Physiol. 86 : 301-308.

Wu, S. J. and Dean D. H. 1996. Functional significance of loops in the receptor binding domain of Bacillus thuringiensis CrylIIA a-endotoxin. J Mol. Biol. 255 : 628-640

Claims

Revendications

1-Protéine Cry modifiée sensible à la pepsine, caractérisée en ce qu'elle possède au moins un site de coupure par la pepsine additionnel

2-Protéine Cry modifiée selon la revendication 1, caractérisée en ce que le site de coupure par la pepsine additionnel est représenté par un résidu acide aminé choisi parmi les résidus leucine, phénylalanine ou acide glutamique

3-Protéine Cry modifiée selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée parmi les protéines Cryl, Cry3, Cry4, Cry7, Cry8, Cry9, CrylO, Cryl6, Cryl7, Cryl9, ou Cry20

4-Protéine Cry modifiée selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle est une protéine Cry9C

5-Protéine Cry modifiée selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle est la protéine Cry9Cal

6-Protéine Cry modifiée selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle possède au moins un site de coupure par la pepsine additionnel dans au moins une des boucles inter-hélices alpha du domaine 1

7-Protéine Cry modifiée selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle possède au moins un site de coupure par la pepsine additionnel dans la boucle inter-hélices alpha reliant les hélices alpha 3 et 4 du domaine 1

8-Protéine Cry modifiée selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisée en ce qu'elle possède un site de coupure par la pepsine additionnel en position 164

9-Protéine Cry modifiée selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée parmi les protéines Cry dont les séquences sont représentées par les identificateurs SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6 ou SEQ ID NO : 8

10-Protéine Cry modifiée selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que les sites de coupure par la pepsine additionnels sont introduits par substitution de résidus acide aspartique par des résidus acide glutamique, substitution de résidus tryptophane par des résidus phénylalanine, et substitution de résidus valine ou isoleucine par des résidus leucine

11-Protéine Cry modifiée selon la revendication 10, caractérisée en ce que le taux de substitutions que possède ladite protéine Cry est de 25 %

12-Procédé d'augmentation de la sensibilité à la pepsine des protéines Cry, caractérisé en ce que l'on introduit au moins un site de coupure par la pepsine additionnel dans lesdites protéines Cry

13-Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le site de coupure par la pepsine additionnel introduit est représenté par un résidu acide aminé choisi parmi les résidus leucine, phénylalanine ou acide glutamique

14-Procédé selon l'une des revendications 12 ou 13, caractérisé en ce qu'il s'applique aux protéines Cry sélectionnées parmi les protéines Cryl, Cry3, Cry4, Cry7, Cry8, Cry9, CrylO, Cryl6, Cryl7, Cryl9, ou Cry20

15-Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il s'applique à la protéine Cry9C

16-Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il s'applique à la protéine Cry9Cal

17-Procédé selon l'une des revendications 12 à 16, caractérisé en ce qu'au moins un site de coupure par la pepsine additionnel est introduit dans au moins une des boucles inter-hélices alpha du domaine 1 desdites protéines Cry

18-Procédé selon l'une des revendications 12 à 17, caractérisé en ce qu'au moins un site de coupure par la pepsine additionnel est introduit dans la boucle inter-hélices alpha reliant les hélices alpha 3 et 4 du domaine 1

19-Procédé selon l'une des revendications 16 à 18, caractérisé en ce qu'un site de coupure par la pepsine additionnel est introduit en position 164

20-Procédé selon l'une des revendications 12 à 16, caractérisé en ce que les sites de coupure par la pepsine additionnels sont introduits par substitution de résidus acide aspartique par des résidus acide glutamique, substitution de résidus tryptophane par des résidus phénylalanine, et substitution de résidus valine ou isoleucine par des résidus leucine

21-Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que le taux de substitution que possède ladite protéine Cry est inférieur ou égal à 25 %

22-Polynucléotide codant une protéine Cry modifiée selon l'une des revendications 1 à 11

23-Gène chimère comprenant au moins, liés entre eux de manière opérationnelle : (a) un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte (b) un polynucléotide selon la revendication 22 (c) un élément terminateur fonctionnel dans un organisme hôte

24-Gène chimère selon la revendication 23, caractérisé en ce que le promoteur et l'élément terminateur sont fonctionnels dans les plantes

25-Vecteur d'expression ou de transformation contenant un gène chimère selon l'une des revendications 23 ou 24

26-Vecteur selon la revendication 25, caractérisé en ce qu'il est un plasmide, un phage ou un virus

27-Organisme hôte transformé avec l'un des vecteurs selon l'une des revendications 25 ou 26

28-Organisme hôte selon la revendication 27, caractérisé en ce qu'il est une plante

29-Plante selon la revendication 28, caractérisée en ce qu'elle contient, en plus d'un gène chimère selon l'une des revendications 23 ou 24, au moins un autre gène chimère contenant un polynucléotide codant pour une protéine d'intérêt

30-Partie d'une plante selon la revendication 29

31-Graines d'une plante selon la revendication 29

32-Procédé de production des protéines Cry modifiées selon l'un des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes de : (a) mise en culture d'un organisme hôte transformé selon la revendication 27 dans un milieu de culture adapté à la croissance et à la multiplication dudit organisme (b) extraction des protéines Cry produites par l'organisme transformé cultivé à l'étape (a)

33-Procédé selon la revendication 32, carcatérisé en ce qu'il comprend une étape (c) de purification des protéines Cry extraites à l'étape (b)

34-Procédé selon l'une des revendications 32 ou 33, caractérisée en ce que l'organisme hôte est un microorganisme

35-Procédé selon la revendication 34, caractérisée en ce que l'organisme hôte est une bactérie Bacillus thuringiensis

36-Anticorps monoclonaux ou polyclonaux, caractérisés en ce qu'ils sont dirigés contre une protéine Cry modifiée selon l'une des revendications 1 à 11