CN1585765A - 二聚化合物及其作为抗病毒剂的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通式(I)的化合物或其药物学上可接受的盐：其中：R是氨基或胍基；R2是乙酰基或三氟乙酰基；X是CONH、SO2NH、NHCO或NHCONH；m是0或1；n是2－6的整数；q是0－3的整数；以及Y是氢或芳香取代基。本发明还涉及所述化合物的制备方法、包含该化合物的药物制剂或其在预防或治疗病毒感染中的应用。

Description

二聚化合物及其作为抗病毒剂的应用
技术领域
本发明涉及新的化合物及其在药物中的应用。具体而言，本发明涉及新的二聚化合物、其制备方法、包含该化合物的药物制剂以及它们作为抗病毒剂的应用。
背景技术
能够由其他糖类中断裂N-乙酰基神经氨酸(NANA)(也称为唾液酸)的酶存在于许多微生物中。这些微生物包括细菌，如Vibrio cholera、Clostridium perfringens、Streptococcus pneumoniae和Arthrobactersialophilus，以及病毒，如流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、新城疫病毒和仙台病毒。这些病毒中的大多数属于正粘病毒或副粘病毒族，而且在病毒颗粒的表面上携带神经氨酸酶活性。许多这些具有神经氨酸酶的生物是人和/或动物的主要病原体，而且其中一些病毒，如流感病毒和新城疫病毒，可导致重大的疾病发生。
长久以来人们都认为神经氨酸酶的抑制剂可预防由携带神经氨酸酶的病毒导致的感染。大多数已知的神经氨酸酶抑制剂是神经氨酸的类似物，如2-脱氧-2，3-脱氢-N-乙酰基神经氨酸(DANA)及其一些衍生物(Meindl等人，Virology，1974，58，457)。我们的国际专利申请公开WO91/16320描述了许多的DANA类似物，它们对于对抗病毒神经氨酸酶具有活性，而且已具体地证实4-胍基-2-脱氧-2，3-脱氢-N-乙酰基神经氨酸(化合物(A)，编码GG167)可用于治疗甲型和乙型流感(N.Engl.J.Med.，1997，337，874-880)。其他专利申请描述了各种非常相关的唾液酸衍生物(例如PCT申请公开WO 95/18800、WO 95/20583和WO98/06712)，而且还有人描述了GG167的抗病毒大分子结合物(国际专利申请PCT/AU97/00771)
                    化合物(A)
                   Ac代表乙酰基
国际专利申请公开WO 00/55149描述了一种二聚化合物，该化合物包含两个结合神经氨酸酶的分子，例如化合物(A)，该分子连接在长度最高为100个原子的普通间隔基或者连接基上。
我们已经发现一类新的化合物，该化合物落在国际专利申请公开WO00/55149的总范围内，但没有被具体公开，而且表现出非常优异的抗流感活性状态，这包括长的肺部停留时间以及高效力。
不希望囿于任何理论的限制，在肺部长的停留时间的基础被认为是由于化合物的尺寸和分子量阻止了通过紧密连接进入呼吸上皮中，而且化合物的极性使得由细胞膜中通过不能充分地进行。另一种理论是化合物本身与细胞膜中的磷脂或者呼吸上皮中的其他组分相互作用并且增加了在肺部的停留时间。
发明内容
在第一个方面中，本发明提供通式(I)的化合物或其药物学上可接受的衍生物：
其中
R是氨基或胍基，
R2是乙酰基或三氟乙酰基，
X是CONH、SO2NH、NHCO或NHCONH，
m是0或1，
n是2-6的整数，
q是0-3的整数，以及
Y是氢或芳香取代基。
R优选是胍基.
R2优选是乙酰基。
合适的芳香取代基包括烷基、烯基、炔基、芳基、卤素、卤代烷基、卤代烯基、卤代炔基、卤代芳基、羟基、烷氧基、烯氧基、芳氧基、羧基、苄氧基、卤代烷氧基、卤代烯氧基、卤代芳氧基、硝基、叠氮基、氨基、烷基氨基、烯基氨基、炔基氨基、芳基氨基、苄基氨基、酰基氨基、酰基、芳基酰基、酰基氨基、酰氧基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、磺酰基氨基、烷基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、杂环基、杂环氧基、杂环基氨基、卤代杂环基、巯基、磺酸、烷硫基、芳硫基和酰基硫基。
烷基、烯基、炔基和烷氧基取代基优选包含最多6个碳原子。
Y更优选是氢、卤素、C1-4烷基、羟基、C1-4烷氧基、氨基或羧基。
本领域技术人员应认识到，式(I)的化合物可在式(I)化合物的一个或者多个官能团上进行改性以提供其药物学上可接受的衍生物。其中特别重要的此等衍生物是在羧基官能团、羟基官能团或氨基处进行改性的化合物。这些重要的化合物包括烷基酯，如甲基、乙基、丙基或异丙基酯，芳基酯，如苯基、苯甲酰基酯，以及式(I)化合物的酰基酯。
术语“药物学上可接受的衍生物”是指式(I)化合物或者在给药时能够提供式(I)化合物或其具有抗病毒活性的代谢物或残留物的任何其他化合物的任意药物学上可接受的盐、醚、酯或者所述酯的盐。特别令人感兴趣的衍生物是在唾液酸羧基或甘油羟基或者在氨基和胍基处改性的化合物。
式(I)化合物之药物学上可接受的盐包括那些衍生于药物学上可接受的无机和有机酸和碱的盐。
合适的酸的例子包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、甘醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。诸如草酸的其他酸，虽然它们本身不是药物学上可接受的，但也可用于制备作为中间体的盐，该作为中间体的盐则可用于得到本发明的化合物及其药物学上可接受的酸加成盐。
衍生于合适碱的盐包括碱金属(如钠)、碱土金属(如镁)、铵以及NR4 +(其中R是C1-4烷基)盐。
本发明的化合物通过在此描述的方法来制备。对于本领域技术人员显而易见的是，在将单体连接至烷基间隔基上期间，必须使用保护基来保护结合神经氨酸酶的分子的一个或者多个官能团。例如参见：“Protective Groups in Organic Synthesis”，T.W.绿色和P.G.M.Nuts(John Wiley & Sons，1991)。
式(I)化合物之药物学上可接受的盐可根据已知的方法来制备。
为易于处理和制备，式(I)的化合物优选为结晶形式。
因此，本发明还提供制备如上所定义的式(I)化合物的方法，其包括使式(II)化合物脱保护的步骤：
其中R和R2如以上所定义，而P1是羧酸保护基。
式(I)化合物具有抗病毒活性。具体而言，这些化合物是正粘病毒和副粘病毒的病毒神经氨酸酶的抑制剂，例如甲型和乙型流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒和新城疫病毒的病毒神经氨酸酶。
因此，在本发明的第二方面中，其提供式(I)化合物及其药物学上可接受的衍生物在治疗病毒感染、例如正粘病毒和副粘病毒感染中作为活性治疗剂的用途。
在本发明的第三方面中，其提供用于预防或者治疗病毒感染的方法，其包括向需要治疗的患者给药式(I)化合物或其药物学上可接受的盐或衍生物的步骤。
优选地，所述病毒感染是正粘病毒或副粘病毒感染。更优选地，所述病毒感染是甲型或乙型流感感染
优选地，所述患者是动物如哺乳动物，更优选是人，或者是马属中的一员，例如马、驴或骡子。最优选的哺乳动物是人。
在第四方面中，本发明提供本发明的化合物在制备用于治疗病毒感染的药物中的应用。
在此所用术语“有效量”是指式I化合物的量能够有效地预防或者治疗病毒感染以产生所希望的治疗应答，例如，为克服或者缓解病毒感染的作用。
术语“治疗有效量”是指式I化合物的量产生所希望的治疗应答，例如治疗或者预防病毒感染。
显然，特定的“治疗有效量”将随以下因素而变化：具体待治疗的病毒感染、或者的身体状况、待治疗的动物的类型、治疗的时间长短、共同治疗(如果有的话)的性质、以及所采用的具体制剂和化合物或其衍生物的结构。
通常情况下，术语“治疗”在本发明中是指影响患者、组织或细胞以得到所希望的药理学和/或生理学作用。所述作用可以是预防性的，即、完全或者部分地预防病毒感染或其病征或症状，和/或可以是治疗性的，即、部分或者完全治愈病毒感染。在此所用术语“治疗”覆盖了在脊椎动物、哺乳动物、特别是人中治疗或预防病毒感染，而且包括(a)预防易染病毒感染但尚未被诊断患有病毒感染的患者中发生病毒感染；(b)抑制病毒感染，即、使其发展停止；或者(c)缓解或改善病毒感染的作用，即、使其症状消退。
本发明的化合物还可用于诊断方法中，特别是用于检测流感病毒的方法中。在用于此等方法时，有利的是将本发明的化合物连接在标记物上，如放射性、荧光或化学发光标记物。
适用于本发明化合物的诊断方法例如描述在我们早期的申请PCT/AU97/00109和PCT/AU97/00771中。
在本发明的第五方面中，其提供一种用于检测病毒感染的方法，该方法包括使本发明的化合物与怀疑包含病毒的样品相互接触的步骤。
应进一步地认识到，用于治疗所需的本发明的化合物的数量不仅随所选择的特定化合物而变，还随给药途径、治疗症状的性质、患者的年龄和症状而变，并最终由值班医师或兽医斟酌决定。但是一般地，适宜的剂量范围为大约0.001-100mg/kg体重/天，优选范围为0.01-10mg/kg/天，最优选范围为0.1-1mg/kg/天。
治疗优选在感染前和感染时开始，并持续至病毒不再存在于呼吸道中。但是所述化合物如果在感染后例如在确定的症状出现之后给予也是有效的。
适宜地，治疗进行一次或两次，优选治疗仅进行一次，而对于预防优选每周进行一次。
化合物可方便地以单位剂量剂型给药，例如每单位剂量剂型包含1-100mg、更方便为1-20mg的活性成分。
尽管在治疗应用中，本发明的化合物可以以原化学药品形式给药，但优选以药物制剂的活性组分形式存在。
因此在第六方面中，本发明提供包含式(I)化合物或其药学可接受的盐或衍生物和一种或多种药学可接受的载体、以及任选其它治疗和/或预防组分的药物组合物。所述载体必须是“可接受的”，意思是与制剂中的其它组分相容的并且对受者无害。
本发明的化合物也可以与其它治疗和/或预防剂例如抗感染剂组合使用。具体而言，本发明的化合物可以与其它抗病毒剂一起使用。因此在第七方面中，本发明提供包含式(I)化合物或其药学可接受的盐或衍生物与另一种活性治疗和/或预防剂、特别是抗病毒剂的组合。
上述组合可以方便地以药物制剂的形式存在而被使用，因此包含如上定义的组合与药学可接受的载体的制剂构成本发明的另一方面。
在所述组合中使用的合适的治疗和/或预防剂包括其它抗感染剂，特别是诸如那些用于治疗呼吸道感染的抗细菌和抗病毒剂。例如，所述组合中可包含其它有效地抗流感病毒的化合物或疫苗，例如上述唾液酸类似物，如扎那米韦、奥塞米韦、金刚烷胺、金刚乙胺和利巴韦林和FluVax。
该组合中的单个组分可以单独或者组合药物制剂的形式单独、顺序或者同时给药。
当本发明的化合物与第二种治疗和/或预防剂一起使用对抗相同的病毒时，各化合物的剂量可以与各化合物单独使用时的剂量相同或不同。合适的剂量是本领域技术人员很容易掌握的。
药物制剂包括那些适用于口服、直肠、经鼻、局部(包括口腔和舌下)、阴道或非胃肠(包括肌内、皮下和静脉内)给药的制剂，或者那些适用于呼吸道(包括鼻通道)给药的制剂，例如通过吸入或吹入给药的制剂。如果需要，所述制剂可以方便地以离散的剂量单位剂型存在，并且可以通过制药领域公知的任何方法制备。这些方法包括以下步骤：将活性化合物与液体载体或细粉固体载体或二者混合，然后如果需要，将产品成形为所需制剂。
适用于口服给药的药物制剂可以方便地以离散单位如各自含预定量活性组分的胶囊剂、扁囊剂或片剂形式存在；以粉剂或颗粒剂形式存在；以溶液剂、混悬剂或乳剂形式存在。活性组分也可以制备成大丸剂、干药糖剂或糊剂形式存在。口服给药的片剂和胶囊剂可以包含常规赋形剂如粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂或润湿剂。片剂可按照本领域公知的方法包衣。例如，口服液体制剂可以是水或油悬浮剂、溶液剂、乳剂、糖浆剂或酏剂的形式，或者可以干产品的形式存在，在使用前与水或其它适宜的载体混合。此等液体制剂可以包含常规添加剂如悬浮剂、乳化剂、包括食用油的非水载体、或防腐剂。
本发明的化合物也可以配制成用于通过注射，例如快速浓注，或连续输注的非胃肠给药，并且可以是在安瓿、预填充注射器、小体积输注或多剂量容器中的加有防腐剂的单位剂量剂型存在。组合物可以为在油或水载体中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可含有赋形剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性组分可以是在使用前与合适的载体如无菌无热原水混合的粉末形式，粉末通过无菌分离灭菌固体或通过冷冻干燥溶液来获得。
为了局部给药于表皮，本发明的化合物可配制成油膏剂、乳膏剂或洗剂，或者是透皮贴剂。油膏和乳膏例如可用水性或油性基质并加入合适的增稠剂和/或凝胶剂来配方。洗剂可用水性或油性基质来配制，并且通常还含有一种或多种乳化剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂或着色剂。
适于局部给药于口腔的制剂包括锭剂，其包含在香味基质中的活性组分，香味基质通常为蔗糖和阿拉伯胶或西黄耆胶；软锭剂，其包含在惰性基质中的活性组分，惰性基质例如是明胶或者蔗糖和阿拉伯胶；和漱口剂，其包含在合适的液体载体中的活性组分。
其中载体为固体的适于直肠给药的药物制剂最优选为单位剂量的栓剂。合适的载体包括可可脂和本领域常用的其它材料，并且栓剂可如下方便地制备：将活性化合物与软化的或熔化的载体混合并冷却，然后在模具中成型。
适于阴道给药的制剂可以是阴道栓、塞子、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾剂，其中除含有活性组分之外还含有本领域已知的合适载体。
在给药于呼吸道时，包括鼻腔内给药，神经氨酸酶抑制剂可通过本领域用于呼吸道给药的任何方法和制剂来给药。
因此，化合物通常以溶液或悬浮液形式或干粉形式来给药。
溶液或悬浮液通常是水性的，如单独由水制备的(例如无菌或无热原水)或水和生理可接受的共溶剂(例如乙醇、丙二醇或聚乙二醇如PEG 400)。
这些溶液或悬浮液可另外含有其它赋形剂例如防腐剂(如苯扎氯铵)、增溶剂/表面活性剂如聚山梨醇酯(例如吐温80、司盘80、苯扎氯铵)、缓冲剂、等渗调节剂(例如氯化钠)、吸收促进剂和增稠剂。混悬剂还可另外含有悬浮剂(例如微晶纤维素、羧甲基纤维素钠)。
通过常规方式将溶液剂或混悬剂直接用于鼻腔，例如通过滴管、吸管或喷雾器。制剂可以单剂量或多剂量形式提供。后者需要提供定量装置。使用滴管或吸管时，这可通过给予合适的预定体积的溶液或悬浮液由病人完成。用喷雾器给药时，例如可通过定量雾化喷雾泵的方式来完成。
也可通过气雾剂的方式来给药于呼吸道，在该制剂中化合物在有合适喷射剂的加压包中，并带有喷射剂如氯氟烃(CFC)，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷或二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。气雾剂通常也可含有表面活性剂如卵磷脂。药物的剂量可通过设置定量阀来控制。
或者，本发明的化合物可以以干粉的形式提供，例如化合物在合适粉末基质中的粉末混合物，粉末基质例如是乳糖、淀粉、淀粉衍生物如羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。粉末载体将在鼻腔中适宜地形成凝胶。粉末组合物可以是单剂量剂型，例如由明胶制成的胶囊或药筒，或水泡包装，其中的粉末可通过吸入器来给药。
在打算用于呼吸道给药的制剂中，包括鼻腔内给药的制剂，化合物通常具有小的粒度，例如5微米或更小的程度。可通过本领域已知的方法来获得这样的粒度，例如通过微粉化。
需要时，可采用适于活性组分缓释的制剂。
优选本发明的化合物通过吸入、吹入或鼻内给药或它们的组合而给药于呼吸道。
“Relenza”是通过“Diskhaler”(奥塞米韦)用口吸入自由流动粉末而给药的。类似的制剂将适于本发明。
因此，在第八方面中，本发明提供一种包含上述配方的吸入器。
本领域技术人员可以理解，吸入器还可以是定量气溶胶吸入器的形式。
为本发明的目的，可以清楚地理解术语“包含”是指“包括但不限于”，并且“包括”一词具有同样的意思。
在此引入所有的出版物，包括但不限于本说明书引用的专利和专利申请作为参考，如同具体而单独地显示各单独的出版物以在此如其充分描述的那样引入作为参考。
具体实施方式
本发明现在仅通过参考下列非限制性实施例的方式详细描述。
                                     表1
Figure A0282224700171
化合物编号   芳基取代基Y   芳基取代基   基团m     基团X   基团n
    1     H     1，3     0     CONH     4
    2     H     1，3     1     NHCO     2
    3     H     1，3     0     SO2NH     4
    4     H     1，4     1     NHCO     2
    5     H     1，4     0     CONH     3
    6     H     1，4     0     CONH     6
    7     H     1，2     0     CONH     6
    8     H     1，3     0     CONH     6
    9     5-CO2H     1，3     0     CONH     3
    10     5-CH3     1，3     0     NHCONH     6
    11     H     1，3     0     CONH     3
    12     H     1，2     0     CONH     3
    13     H     1，4     1     CONH     3
    14     H     1，2     1     CONH     3
机器方法
绿色方法(LC/MS)
Micromass Platform II质谱仪，在正离子电喷雾模式下运行，质量范围为100-1000amu。
柱：3.3cm×4.6mm ID，3μm ABZ+PLUS
流速：3ml/min
注射体积：5μl
溶剂A：95％乙腈+0.05％甲酸
溶剂B：0.1％甲酸+10mMol乙酸铵
梯度：0％ A/0.7分钟，0-100％ A/3.5分钟，100％ A/1.1分钟，100-0％ A/0.2分钟
紫色方法(质量相关的自动制备HPLC)
所用的制备柱是Supelcosil ABZplus(10cm×2.12cm)
UV波长：200-320nM
流速：20ml/min
注射体积：1ml
溶剂A：0.1％甲酸
溶剂B：95％乙腈+5％甲酸
梯度：100％ A/1分钟，100-80％ A/9分钟，80-1％ A/3.5分钟，1％ A/1.4分钟，1-100％ A/0.1分钟
青绿色方法(自动制备HPLC)
所用的制备柱是Supelcosil ABZplus(10cm×2.12cm)
UV波长：230nm
流速：4ml/min
注射体积：2ml
溶剂A：乙腈+0.05％TFA
溶剂B：水+0.1％TFA
方法A(LC/MS)
Micromass Platform II质谱仪，在正离子电喷雾模式下运行，质量范围为100-1000amu。
柱：3.3cm×4.6mm ID，3μm ABZ+PLUS
流速：3ml/min
注射体积：5μl
溶剂A：95％乙腈+0.05％甲酸
溶剂B：0.1％甲酸+10mMol乙酸铵
梯度：0％ A/0.7分钟，0-100％ A/3.5分钟，100％ A/1.1分钟，100-0％ A/0.2分钟
方法B(LC/MS)
Waters ZQ质谱仪，在正离子电喷雾模式下运行，质量范围为100-1000amu。
柱：3.3cm×4.6mm ID，3μm ABZ+PLUS
流速：3ml/min
注射体积：5μl
溶剂A：95％乙腈+0.05％甲酸
溶剂B：0.1％甲酸+10mMol乙酸铵
梯度：0％ A/0.7分钟，0-100％ A/3.5分钟，100％ A/1.1分钟，100-0％ A/0.2分钟
方法C(自动制备HPLC)
所用的制备柱是Supelcosil ABZplus(10cm×2.12cm)
UV波长：230nm
流速：4ml/min
注射体积：2ml
溶剂A：乙腈+0.05％TFA
溶剂B：水+0.1％TFA
梯度：0-40％ A/20分钟，40％ A/20分钟，40-100％ A/0.3分钟，100％ A/15分钟，100-0％ A/3分钟
方法D(质量相关的自动制备HPLC)
所用的制备柱是Supelcosil ABZplus(10cm×2.12cm)
UV波长：200-320nM
流速：20ml/min
注射体积：1ml
溶剂A：0.1％甲酸
溶剂B：95％乙腈+5％甲酸
梯度：100％ A/1分钟，100-80％ A/9分钟，80-1％ A/3.5分钟，1％ A/1.4分钟，1-100％ A/0.1分钟
缩写
EtOAc：乙酸乙酯
MeOH：甲醇
HPLC：高压液相色谱
SPE：固相提取
LC/MS：液相色谱/质谱
DMF：N，N-二甲基甲酰胺
WSCDI：1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺甲碘化物
HOBt：1-羟基苯并三唑
DIPEA：N，N-二异丙基乙基胺
MeCN：乙腈
RT：室温
EtOAc：乙酸乙酯
MgSO4：硫酸镁
DMF：二甲基甲酰胺
实施例1：制备化合物1
中间体1
由无水甲苯中共沸3次，由此干燥(4S，5R，6R)-5-乙酰基氨基-4-叠氮基-6-[(S)4-硝基苯氧基羰基氧基]-(2-氧代-[1，3]二氧戊环-4R-基)-甲基]-5，6-二氢-4H-吡喃-2-羧酸甲基酯(参见：Eur.J.Med.Chem.1999，34，563-574)(2.00g，3.8mmol)，然后溶解在无水乙腈(20ml)中并同时添加一些3埃分子筛颗粒。溶液在搅拌下用N-叔丁氧基羰基1，4-二氨基丁烷(0.72g，3.8mmol)和三乙胺(0.43g，4.2mmol)处理。混合物在氮气氛下搅拌16小时。真空除去挥发性成分以得到黄色残留物。该残留物重新溶解在EtOAc(50ml)中，用0.5M HCl(30ml)、然后盐水(30ml)洗涤。干燥溶液(Na2SO4)，然后真空蒸发溶剂以得到乳色泡沫。用Biotage快速色谱做进一步纯制，洗脱剂初始为EtOAc∶环己烷(1∶1)、然后用EtOAc。真空蒸发溶剂产生中间体1(1.26g，58％产率)白色固体的。LC/MS(方法B)显示MH+＝571，TRET＝2.87分钟。
中间体2
Figure A0282224700221
将中间体1(0.76g，1.33mmol)溶解在乙醇(24ml)中，然后在Lindlar催化剂(0.095g)上进行催化氢化16小时。通过过滤除去催化剂，然后真空蒸发溶剂，得到乳色泡沫状的中间体2(0.72g，99％产率)。LC/MS(方法
A)显示MH+＝545，TRET＝2.24分钟。
中间体3
将中间体2(0.72g，1.32mmol)溶解在四氢呋喃(7ml)中，然后用处理N，N′-二-(叔丁氧基羰基)-1-脒基吡唑(0.45g，1.45mmol)处理。在氮气氛下搅拌混合物16小时。真空除去挥发性成分以产生固体残留物，该残留物通过Biotage快速色谱纯制，洗脱剂初始为EtOAc∶环己烷(1∶1)，然后为EtOAc∶环己烷(5∶3)。真空蒸发溶剂得到白色固体的中间体3(0.48g，46％产率)。LC/MS(方法A)显示MH+＝787，TRET＝3.64分钟。
中间体4
Figure A0282224700231
将中间体3(0.48g，0.61mmol)溶解在二氯甲烷(19ml)中。溶液在冰浴中冷却，然后在5分钟的时间内分批添加三氟乙酸(19ml)。在氮气氛下搅拌混合物1小时，然后温热至室温，并继续搅拌16小时。真空除去挥发性成分，由甲苯中共沸蒸馏残留物以除去残余的三氟乙酸。用乙醚(20ml)研磨得到白色固体并进行分离，产生中间体4(0.50g)。LC/MS(方法B)显示(M-H)-＝485，TRET＝0.52分钟。
中间体5
由无水甲苯中共沸蒸馏3次，由此干燥中间体4(0.050g，0.07mmol)，然后溶解在无水乙腈(2ml)和无水DMF(1ml)的混合物中。溶液用间苯二甲酸(0.005g，0.03mmol)、HOBt(0.010g，0.07mmol)、WSCDI(0.013g，0.07mmol)和DIPEA(0.026g，0.20mmol)连续处理。在氮气氛下搅拌混合物16小时。真空除去挥发性成分以得到黄色残留物，该残留物通过质量相关制备性HPLC(方法D)纯制，得到白色固体的中间体5(0.013g)。LC/MS(方法A)显示(M+2H+)/2＝552，TRET＝2.05分钟。
化合物1
将中间体5(0.012g，0.01mmol)溶解在水(0.5ml)和甲醇(0.5ml)的混合物中。所得溶液用三乙胺(0.090g，过量)处理。搅拌混合物50分钟，然后真空中快速除去挥发性成分，得到白色固体残留物。通过制备性HPLC(方法C)纯制，得到白色固体的化合物1(0.002g)。LC/MS(方法B)显示(M+2H+)/2＝512，TRET＝1.77分钟。
实施例2：制备化合物2
中间体6
(4S，5R，6R)-5-乙酰基氨基-4-叠氮基-6-[(S)-4-硝基苯氧基羰基氧基]-(2-氧代-[1，3]二氧戊环-4R-基)-甲基-5，6-二氢-4H-吡喃-2-羧酸甲基酯(参见：Eur.J.Med.Chem.1999，34，563-574)(4.0g)与甲苯(50mL)共沸并溶解在MeCN(40mL)和三乙胺(1.12mL)中，然后添加3-氨基丙酸叔丁基酯盐酸盐(1.396g)。室温下3天后，除去溶剂，残留物用EtOAc(150mL)稀释。该溶液用5％柠檬酸溶液(2×50mL)洗涤，干燥(MgSO4)并浓缩。通过Biotage纯制，其中用1∶1环己烷∶EtOAc、然后60∶40和65∶35环己烷∶EtOAc洗脱，得到无色泡沫状的中间体(3.45g)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ6.72(d，1H)，5.97(d，1H)，5.53(t，1H)，5.40(t，1H)，5.03-4.95(m，2H)，4.92(dd，1H)，4.74-4.64(m，2H)，3.83(s，3H)，3.64-3.54(m，1H)，3.38-3.27(m，2H)，2.65-2.56(m，1H)，2.52-2.43(m，1H)，2.06(s，3H)，1.70(s，1H)，1.48(s，9H)
中间体7
类似于中间体2由中间体6进行制备。LC/MS(绿色方法)MH+ 504，TRET＝2.22分钟
中间体8
类似于中间体3由中间体7制备中间体8。LC/MS(绿色方法)MH+744，TRET＝3.66分钟
中间体9
Figure A0282224700262
在室温下搅拌中间体8(1.44g)、三氟乙酸(20mL)、二氯甲烷(20mL)和茴香醚(2mL)3小时，之后真空除去挥发性成分。残留物用Et2O(2×25mL)研磨，然后真空干燥，得到白色固体的中间体9(1.22g)。LC/MS(绿色方法)MH+488，TRET＝1.25分钟
中间体10
在室温下混合中间体9(0.12g)、DIPEA(0.14mL)、m-亚二甲苯基二胺(0.0132mL)和苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基硫氟磷酸鏻(0.104g)2天，然后真空浓缩。使用质量相关性HPLC(紫色方法)进行纯制，得到中间体10(0.038g)。LC/MS(绿色方法)MH+/2 538，TRET＝1.74分钟
化合物2
在室温下混合中间体10(0.038g)、水(1.5mL)、甲醇(1.5mL)和三乙胺(0.5mL)1小时。真空除去挥发性成分，含水残留物用三氟乙酸酸化至pH＝4。反相HPLC(青绿色方法)用0-17.5％MeCN在30分钟的时间内进行洗脱，得到化合物2(7.6mg)。LC/MS(绿色方法)MH+/2 497，TRET＝1.64分钟。
实施例3：制备化合物3
中间体11
Figure A0282224700281
由无水甲苯中共沸3次，由此干燥中间体4(0.075g，0.11mmol)。将干燥的固体溶解在无水氯仿(2ml)和无水DMF(1ml)以及DIPEA(0.056g，0.43mmol)的混合物中。所得的澄清溶液添加至1，3-苯二磺酰氯(0.014g，0.05mmol)中，并在氮气氛下搅拌混合物1小时。真空除去挥发性成分，所形成的残留物进一步通过反相SPE(洗脱剂15％含水乙腈)纯制以得到白色固体的中间体11(0.020g)。LC/MS(方法B)显示(M+2H+)/2＝588；TRET＝2.09分钟。
化合物3
将中间体11(0.020g，0.014mmol)溶解在水(0.5ml)和甲醇(0.5ml)的混合物中。所得溶液用三乙胺(0.090g，过量)处理。搅拌混合物50分钟，然后真空中快速除去挥发性成分得到白色固体残留物。通过制备性HPLC(方法C)纯制，得到白色固体的化合物3(0.006g)。LC/MS(方法A)显示(M+2H+)/2＝548；TRET＝1.99分钟。
实施例4：制备化合物4
中间体12
Figure A0282224700291
类似于中间体10由中间体9和p-亚二甲苯基二胺进行制备以得到中间体12(0.038g)。LC/MS(绿色方法)MH+/2 538，TRET＝1.94分钟。
化合物4
类似于化合物2由中间体12制备化合物4。LC/MS(绿色方法)MH+/2 497，TRET＝1.62分钟。
实施例5：通过中间体13与对苯二甲酸的反应制备化合物5
按照类似于实施例1中对氨基丁基中间体4的描述步骤顺序制备氨基丙基中间体13。
将对苯二甲酸(5.93mg，0.0357mmol)、中间体13(50mg，0.071mmol)和苯并三唑-1-基氧基-三(二甲基氨基)六氟磷酸鏻(BOP)(37.7mg，0.0852mmol)溶解在DMF(2ml)中，然后向其中添加二异丙基乙基胺(DIPEA，91.8mg，0.71mmol)。所得混合物在室温下搅拌5小时。反应混合物通过使用Waters Symmetry C18柱(5微米19×100mm)的反相HPLC进行纯制，而梯度洗脱如以下表中所示，得到经保护的二聚物(19.5mg，51％)，MS 1075(M+H)+。
  时间(分钟)     A％     B％   流速(ml/min)
    0     100     0     6
    2     100     0     6
    22     40     60     6
    32     40     60     6
    35     100     0     6
    42     100     0     6
A＝包含0.1％三氟乙酸的水
B＝包含0.06％三氟乙酸的乙腈
将经保护的二聚化合物(19.5mg，0.0182mmol)溶解在比例为4∶4∶1水/甲醇/三乙基胺的混合物(2ml)中，然后在室温下搅拌1小时，接着降压蒸发至干。
重复添加水并在减压下蒸发，由此除去剩余的三乙胺。残留物通过使用Waters Symmetry C18柱(5微米19×100mm)的反相HPLC进行纯制，而梯度洗脱如以下表中所示，在冻干后得到白色固体的二聚物5(10.8mg，60％)。
  时间(分钟)     A％     B％   流速(ml/min)
0 100 0 6
    2     100     0     6
    22     40     60     6
    32     40     60     6
    35     100     0     6
    42     100     0     6
A＝包含0.1％三氟乙酸的水
B＝包含0.06％三氟乙酸的乙腈
MS 498.3(M+2H)2+，995.2(M+H)+
1H-NMR(D2O)δ(ppm)：1.79(t，4H)；1.90(s，6H)；3.14(t，4H)；3.42(m，6H)；3.62(dd，2H)；3.98(m，2H)；4.08(dd，2H)；4.37(dd，2H)；4.52(dd，2H)；4.88(dd，2H)；5.92(d，2H)；7.79(s，4H)
实施例6：通过中间体14和15的反应制备化合物5
Figure A0282224700321
中间体14
在室温下向对苯二甲酸(141.9mg，0.85mmol)和N-Boc-1，3-二氨基丙烷(300mg，1.72mmole)在DMF(12ml)中的悬浮液内添加三乙胺(392mg，3.88mmol)并同时进行搅拌。向该白色悬浮液中分批地添加BOP(771mg，1.74mmol)。添加第一批的BOP(约300mg)后，反应混合物变为澄清溶液。反应混合物在室温下搅拌16小时，然后真空蒸发，以除去DMF。残留物于室温下在水(10ml)中搅拌3小时，并通过过滤收集固体。该固体用水(4×5ml)洗涤，然后过滤。将滤饼溶解在热甲醇(4ml)中，然后用水(9ml)稀释。在室温下搅拌悬浮液3小时，然后过滤。固体用水(4×5ml)洗涤，然后溶解在沸腾的甲醇(4ml)中，接着冷却至室温。晶体悬浮液在室温下搅拌过夜。过滤出固体，用冷甲醇洗涤，然后空气干燥，得到白色固体的二酰胺基产物(365mg，89.7％)，MS 479(M+H)+。Boc-保护的二酰胺(360mg)在三氟乙酸(TFA)(2ml)和二氯甲烷(2ml)的混合物中于室温下搅拌4小时，然后真空蒸发至干。将残留物溶解在水(6ml)中，然后冻干以除去过量的TFA并得到白色固体的中间体14(TFA盐)(379mg，98％)，MS 279(碱+H)+。
中间体15
在22℃下用4-硝基苯基甲酸酯(199mg，0.987mmol)处理(2R，3R，4S)-3-(乙酰基氨基)-4-({[(叔丁氧基羰基)氨基][(叔丁氧基羰基)亚氨基]甲基}氨基)-2-(S)-羟基[(4R)-2-氧代-1，3-二氧戊环-4-基]甲基}-3，4-二氢-2H-吡喃-6-甲酸甲酯(113mg，0.197mmol)在包含4-二甲基氨基吡啶(120mg，0.982mmol)的无水吡啶(3ml)中的溶液。在22℃下搅拌混合物17小时，然后真空除去吡啶。残留物通过SPE色谱(5g柱)用环己烷-乙酸乙酯(4∶1-2∶1)洗脱进行纯制，得到淡黄色胶状的中间体15(96mg，66％)。
NMR δ(CDCl3)11.3(1Hs，NH)，8.58(1H brd，NH)，8.26(2H，AA′BB′，芳香CH′s)，7.56(2H，AA′BB′，芳香CH′s)，6.82(1H brd，NH)，5.93(1Hd，＝CH)，5.54(1Hdd，CH)，5.20(1Hdt，CH)，5.10(1Hdt，Ch)，4.78(2Hm，2×CH)，4.44(1H brq，CH)，4.28(1Hdd，CH)，3.82(3Hs，CH3)，1.91(3Hs，CH3)，和1.48(18Hs，2×叔丁基)
LCMS Rt＝3.87分钟(MH+＝738，MH-＝736)
化合物5
将中间体14(38.9mg，0.0768mmol)和中间体15(2当量)溶解在吡啶(0.5ml)中，所得的混合物在室温下搅拌16小时，然后真空蒸发至干。残留物在二氯甲烷(15ml)和水(3ml)之间分配。有机层用水(2×2ml)洗涤，蒸发至干，得到胶状残留物，其在硅胶(20g，溶剂乙酸乙酯/甲醇10/1)上进行色谱纯制。分离出保护形式的化合物5，其为白色泡沫(56mg，49％)。如实施例5中所述，经保护的化合物(50mg，0.0339mmol)用TFA、然后含水三乙胺处理，得到化合物5(16.8mg，50％)，MS 995(M+H)+。
实施例7
类似于以上实施例的方法制备本发明的化合物6-14(表1)，以下给出NMR和/或质谱数据。
化合物6
MS 540.6(M+2H)2+
1H-NMR(D2O)δ(ppm)；1.43(br，8H)；1.51(br，4H)；1.65(br，4H)；2.00(s，6H)；3.12(m，4H)；3.41(m，4H)；3.43(dd，2H)；3.70(dd，2H)；4.07(dd，2H)；4.18(dd，2H)；4.46(dd，2H)；4.58(dd，2H)；4.98(dd，2H)；5.98(d，2H)；7.85(s，4H)
化合物7
MS 1079(M+2H)2+，540.6(M+2H)2+，360.5(M+3H)3+
化合物8
MS 1079.5(M+2H)2+，540.25(M+2H)2+，360.5(M+3H)3+
1H-NMR(CD3OD)δ(ppm)：1.35(br，8H)；1.45(br，4H)；1.55(br，4H)；1.90(s，6H)；3.03(m，4H)；3.35(m，4H)；3.44(dd，2H)；3.56(dd，2H)；3.95(m，2H)；4.15(dd，2H)；4.35(dd，2H)；4.52(dd，2H)；4.90(dd，2H)；5.82(d，2H)；7.48(t，1H)；7.88(d，2H)；8.19(s，1H)
化合物9
MS 1039.1(M+H)+，520.3(M+2H)2+
1H-NMR(D2O)δ(ppm)：1.79(t，4H)；1.90(s，6H)；3.19(t，4H)；3.46(m，6H)；3.60(dd，2H)；4.00(m，2H)；4.08(dd，2H)；4.37(dd，2H)；4.47(dd，2H)；4.88(dd，2H)；5.88(d，2H)；8.28(s，1H)；8.49(s，2H)
化合物10
MS 1123.7(M+H)+，562.3(M+2H)2+
1H-NMR(CD3OD)δ(ppm)：1.40(br，8H)；1.51(br，8H)；1.93(s，6H)；2.19(s，3H)；3.08(br，4H)；3.19(br，4H)；3.52(dd，2H)；3.65(dd，2H)；4.01(m，2H)；4.16(dd，2H)；4.35(dd，2H)；4.53(dd，2H)；4.98(dd，2H)；5.89(d，2H)；7.10(dd，2H)；7.40(s，1H)
化合物11
MS 995.1(M+H)+，498.3(M+2H)2+
1H-NMR(D2O)δ(ppm)：1.75(t，4H)；1.90(s，6H)；3.15(t，4H)；3.45(m，6H)；3.60(dd，2H)；3.98(m，2H)；4.05(dd，2H)；4.35(dd，2H)；4.45(dd，2H)；4.92(dd，2H)；5.91(d，2H)；7.50(t，1H)；7.92(d，2H)；8.07(s，1H).
化合物12
MS 995.3(M+H)+，498.3(M+2H)2+
1H-NMR(D2O)δ(ppm)：1.78(t，4H)；1.92(s，6H)；3.15(t，4H)；3.40(t，4H)；3.46(dd，2H)；3.60(dd，2H)；3.95(m，2H)；4.00(dd，2H)；4.35(dd，2H)；4.50(dd，2H)；4.93(dd，2H)；5.83(d，2H)；7.62(dd，4H).
化合物13
MS 1023.1(M+H)+，512.3(M+2H)2+
1H-NMR(D2O)δ(ppm)：1.65(t，4H)；1.85(s，6H)；3.02(t，4H)；3.15(t，4H)；3.42(dd，6H)；3.52(s，4H)；3.59(dd，2H)；3.98(m，2H)；4.12(dd，2H)；4.40(dd，2H)；4.50(dd，2H)；4.90(dd，2H)；5.90(d，2H)；7.30(s，4H)
化合物14
MS 1023.3(M+H)+，512.4(M+2H)2+
1H-NMR(D2O)δ(ppm)：1.61(t，4H)；1.91(s，6H)；3.00(t，4H)；3.13(t，4H)；3.40(dd，6H)；3.57(s，4H)；3.58(dd，2H)；3.99(m，2H)；4.10(dd，2H)；4.40(dd，2H)；4.50(dd，2H)；4.90(dd，2H)；5.88(d，2H)；7.32(m，4H)
实施例8：大规模制备和纯制化合物5
TFA盐至HCl盐
将在实施例6中制得的化合物5的2TFA盐(10g)溶解在MeOH/水(1∶1 v/v)(150ml)，然后添加至经过预先洗涤的Amberlite IRA-410(氯化物形式)离子交换柱(4×50cm)上。用MeOH/水(1∶1 v/v)从该柱中洗脱出化合物5的2HCl盐。包含2HCl盐的部分真空浓缩，得到白色泡沫。
脱保护
将2HCl盐(10.4g)溶解在甲醇(144ml)和水(144ml)中，然后在冰中冷却。在10分钟的时间内分三批添加三乙胺(7.75ml)。通过反相HPLC监测反应。当反应完成时，真空蒸发反应混合物至干。
包含三乙胺的不纯化合物5蒸发至干，得到一固体(10.5g)。将该固体溶解在80ml的水中，并添加5ml的正磷酸以确保样品溶液的pH为2。该溶液(约100ml)通过制备性HPLC用7微米Kromasil C8柱(25cm×5cm id.)进行纯制。通过离子对梯度洗脱对化合物5进行色谱拆分，其中起始流动相A是添加有8g/L月桂基硫酸钠(SLS)和2ml/L磷酸的水。最终的流动相B是添加有8g/L月桂基硫酸钠(SLS)和2ml/L磷酸的60％CH3CN/H2O。梯度时间为70分钟的时间内0-100％B，在100％B时保持20分钟。流速设定为80ml/min。进行每次25ml注射共4次。检测器设定在260nm。根据用HPLC测定的分析纯度收集每次50ml的流出物，规定大于97.5％。在4次色谱分离中，总共收集的体积为约1800ml。为除去绝大多数的磷酸根和月桂基硫酸根离子，将含水部分添加至1200ml氯化物形式的IRA 410离子交换树脂中，并搅拌该溶液1小时。过滤除去树脂，并用400ml混合有滤液的水洗涤。含水相由氯化物形式的IRA 410柱(15cm×2.5cm id.)中通过，以除去任何残余的磷酸根或月桂基硫酸根离子污染物。该柱用50ml的水洗涤，然后合并滤液。在40℃下进行旋转蒸发，由此除去CH3CN，将pH调节至7.0。将含水相分为2份。第一份由Amberchrom CG 161柱(25cm×2.5cm)中通过，以吸附化合物5。该柱是用作反相填充材料的聚苯乙烯二乙烯基苯树脂。该柱用300ml的水洗涤至洗出液中没有氯离子，这可通过与AgNO3溶液的反应来检查。该柱用30％CH3CN/H2O(500ml)洗脱。对第二份重复该过程并合并洗脱物。通过旋转蒸发除去溶剂(1升)，得到5.7g的固体。
经纯制的材料溶解在水(300ml)中，并用二氯甲烷(3×200ml)洗涤。水溶液然后冻干，得到标题化合物。
1H-NMR(D2O)δ7.85(s，4H，4×ArH)，5.67，5.57(2×d，2H，J＝2.1Hz，2×CH)，4.95(dd，2H，J＝9.0，1.6Hz，2×CH)，4.52(dd，2H，J＝10.5，1.6Hz，2×CH)，4.42(dd，2H，J＝9.3，2.2Hz，2×CH)，4.14-4.04(m，4H，4×CH)，3.67(dd，2H，J＝12，3Hz，2×CH)，3.54-3.44(m，6H，2×CH+2×CH2)，3.21(t，4H，J＝6.7Hz，2×CH2)，1.96(s，6H，2×CH3)，1.85(m，4H，2×CH2)元素分析：
计算值：C45.02％；H6.23％；N15.75％
实测值：C44.80％；H6.68％；N14.89％
LC-MS(方法A)显示(M+2H)2+＝498；TRET＝1.67分钟
实施例9：式(I)化合物的评价-对流感病毒复制的抑制
基本上如Watanabe等人(J.Virological Methods，1994  48 257)所述进行细胞病变效应(CPE)分析。在本发明化合物的连续稀释液存在下，用确定的病毒接种体(通过实验确定为足以在72小时后产生足够的CPE并易于将化合物控制在认为与公开的标准一致的浓度的最小量)感染MDCK细胞。将培养物于37℃和5％CO2气氛下培养至多72小时。根据公开的方法(例如参见Watanabe等人，1994)，通过病毒染料3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)测定CPE的程度及其导致的病毒复制。使用用于曲线拟合的计算机程序计算CPE抑制50％时的化合物浓度(ID50)。分析流感A/Sydney/5/97和B/Harbin/7/95病毒，结果如表2所示。关于WO 00/55149中具体公开的化合物和化合物A的参照数据也示于表2中。
                          表2
    ID50 μg/ml     ID50 μg/ml
    描述     A/Sydney/5/97+     B/Harbin/7/95
    化合物A     0.023+/-0.024     0.013+/-0.011
    化合物2     0.0002     0.0004
    化合物3     0.0001     0.00007
    化合物4     0.0003     0.0004
    化合物5     0.0002     0.0007
    化合物6     0.0002     0.0009
    化合物7     0.0007     0.0008
    化合物8     0.0004     0.0009
    化合物9     0.0001     0.0003
    化合物10     0.0002     0.0006
    化合物11     0.0001     0.0001
    化合物12     ＞0.1     0.0001
    化合物13     0.0001     0.0003
    化合物14     0.0002     0.0003
    化合物8*     0.0007，0.0005     0.0007+/-0.01
    化合物10*     0.057     ＞0.1
*参考WO 00/55149
+在WO 00/55149中提供的数据涉及病毒H3N2分离体A/Victoria/3/75，而不是A H3N2分离体A/Sydney/5/97。在比较这些数据时，本领域的普通技术人员将认识到，当针对多种不同的病毒进行体外分析时，抗病毒效力之间的差异对于一个特定的化合物是常见的。例如，Woods等人(Antimicrob Agents Chemother 1993 37：1473-9)已报道化合物A在涉及最近临床分离体的体外分析中表现出宽范围的EC50值(由0.02到0.16μM)。因此，发现化合物8在涉及最近流感病毒A H3N2分离体A/Sydney/5/97的CPE分析中比更早的H3N2分离体A/Victoria/3/75具有更高的效力。
表2中的数据表明，除效力大大高于高活性的化合物A外，化合物2-14比WO 00/55149的化合物8和10对A/Sydney/5/97具有甚至更高的效力，而且对最近的流感病毒B分离体B/Harbin/7/95具有大大高于后者的效力。
实施例10：空斑减少试验
将Madin Darby犬肾(MDCK)细胞接种到六孔组织培养板上，并通过标准方法使其生长至融合。用最小体积的补充0.2％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水稀释流感病毒以得到每孔50-100空斑形成单位(pfu)的估计滴度。在37℃和5％CO2大气下在MDCK上吸附一小时后，吸入病毒接种物，并用含有充足的琼脂或琼脂糖(一般1-2％)的病毒生长培养基(补充最佳浓度的BSA、胰蛋白酶和胰岛素/铁传递蛋白/硒的最低Eagle培养基)代替，以使培养基在室温和37℃及5％CO2气氛下胶凝至空斑形成(一般2-4天)。在计数前采用适宜的染色(例如在甲醛生理盐水中的0.4％结晶紫)使空斑可视。抗病毒效力表示为将未治疗的对照值(EC50)的空斑数减少50％的试验物的浓度。
                             EC50ng/ml
                               -PRA
  实施例   A/WSN*      A/Vic*      A/Syd* A/New*        A/Pan*   A/Bay*
  化合物A5金刚烷胺奥塞米韦   56，＞100    5.5+/-8.2     2.4     0.27，0.23     2.7，3    350.02         0.003         0.05    0.06           0.03      0.009220                   11             1570.11                  0.23           0.3
*A/WSN/33 BVLV09(H1N1)
A/Victoria/3/75 BVLV017(H3N2)
A/Sydney/5/97 BVLV015(H3N2)
A/Naw Caledonia/20/99 BVLV008(H1N1)
A/Panama/2007/99 BVLV008(H3N2)
A/Bayern/7/95 BVL006(H1N1)
      EC50 ng/ml
        PRA
  实施例   B/HongK*  B/Yam*
    A5金刚烷胺Tamiflu   21+/-6     0.2，3.10.316      0.022＞10000    206132         0.7
*B/Victoria/1/67
B/Hong Kong/5/72 BVLV012
B/Harbin/7/95 BVLV008
B/Yamanashl/166/98 BVLV007
实施例11：长期作用的评估
将啮齿动物麻醉，并通过气管内途径使其服用剂量体积为0.8ml/kg的令人感兴趣的化合物。然后将啮齿动物保持在垂直位置，直至获得完全恢得。在不同的时间点，例如给药后2、8、24和48小时，通过分析方法评价肺中化合物的水平。可以使用任何适于检测这种类型化合物的分析方法。化合物水平下降至分析鉴定技术的灵敏度以下的时间决定化合物在肺组织中的停留时间。
关于所选择的化合物在大鼠肺中的停留数据如下所示。请注意，所有的实验包括共同给药的内标，即国际专利公开WO 02/20514的化合物3，以进行比较。数据表示为相对于此化合物的比率，此化合物的结构如以下所示。
Figure A0282224700421
为比较目的纳入化合物A的数据。如果将停留表示成化合物浓度与标准浓度的比率，则本发明的化合物在7天的停留明显大于化合物A。
大鼠肺停留试验结果
  时间点     化合物    剂量   [cmpd]  平均[cmpd]     [PCT AU01/01128化合物3] 平均[PCT AU01/01128化合物3]     比率平均值[lung]
    hrs    mg/kg    ng/g     ng/g     ng/g     ng/g [cmpd]/PCT AU01/01128化合物3
    48     化合物5     0.1     1325     1888
    48     化合物5     0.1     750     951     1138     1403     0.68
    48     化合物5     0.1     776     1184
    168     化合物5     0.1     636     1479
    168     化合物5     0.1     300     403     761     984     0.41
    168     化合物5     0.1     272     712
    48     化合物1     0.1     2281     4802
    48     化合物1     0.1     650     1278     1408     2874     0.44
    48     化合物1     0.1     902     2413
    168     化合物1     0.1     280     629
    168     化合物1     0.1     611     372     1568     915     0.41
    168     化合物1     0.1     227     549
    48     化合物3     0.1     2457     4802
    48     化合物3     0.1     675     1410     1408     2874     0.49
    48     化合物3     0.1     1097     2413
    168     化合物3     0.1     245     629
    168     化合物3     0.1     544     329     1568     915     0.38
    168     化合物3     0.1     199     549
    48   化合物A(扎那米韦)     0.1     421     698
    48   化合物A(扎那米韦)     0.1     369     352     1901*     1368     0.28
    48   化合物A(扎那米韦)     0.1     267     1507
    168   化合物A(扎那米韦)     0.1     91     815
    168   化合物A(扎那米韦)     0.1     47     61     925     750     0.08
    168   化合物A(扎那米韦)     0.1     45     512
实施例12：肺长期作用和效力的可选择的评价
用于感染小鼠的方案已在前面描述(1-4)。将流感病毒接种到适度麻醉的小鼠的外鼻孔。
治疗方法和方案
在确定的时间点对单一剂量的化合物进行给药，直至感染前第10天，优选感染前4-7天，或者感染之后给药，优选在感染后立即给药直至感染后48小时。在大部分的实验中，使用非致命的流感株，并由肺病毒滴度的减小来评价效力。对于在感染前给予化合物的小鼠，在感染后取出肺，可以在感染后一天或数天内取出，优选在感染后1-4天取出。使用确定的方法分析均化的肺样品的病毒，评价病毒负载的滴度，并与未治疗小鼠的肺病毒的滴度作比较。
在使用小鼠适应的致命流感病毒株的实验中，通过与未治疗的小鼠相比的存活率和/或存活者数的增加来评价效力。
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Claims (24)

1、通式(I)的化合物或其药物学上可接受的盐：
其中：
R是氨基或胍基；
R2是乙酰基或三氟乙酰基；
X是CONH、SO2NH、NHCO或NHCONH；
m是0或1；
n是2-6的整数；
q是0-3的整数；以及
Y是氢或芳香取代基。
2、如权利要求1所述的化合物，其中R是胍基。
3、如权利要求1或2所述的化合物，其中R2是乙酰基。
4、如前述权利要求之一所述的化合物，其中Y是氢、卤素、C1-4烷基、羟基、C1-4烷氧基、氨基或羧基。
5、如前述权利要求之一所述的化合物，其是在羧基官能团、羟基官能团、氨基官能团或者胍基官能团处改性的衍生物。
6、如前述权利要求之一所述的化合物，其中所述衍生物是烷基酯、芳基酯或乙酰基酯。
7、制备如权利要求1-6之一所述的式(I)化合物的方法，其包括使以下式(II)化合物脱保护的步骤：
其中R和R2如权利要求1中所定义，而P1是羧酸保护基。
8、一种药物制剂，其包括如权利要求1-6之一所述的式(I)化合物或其药物学上可接受的盐或衍生物以及一种或多种药物学上可接受的载体。
9、如权利要求8所述的药物制剂，其进一步包括一种或者多种其他治疗成分和/或预防成分。
10、如权利要求9所述的药物制剂，其中所述其他治疗成分和/或预防成分是抗感染药物。
11、如权利要求10所述的药物制剂，其中所述抗感染药物是抗病毒或杀菌剂。
12、如权利要求11所述的药物制剂，其中所述杀菌剂或抗病毒剂是那些用于治疗呼吸感染的药物。
13、如权利要求12所述的药物制剂，其中所述药物是扎那米韦、奥塞米韦、金刚烷胺、金刚乙胺和利巴韦林和/或FluVax
14、一种包含如权利要求1-6之一所述的化合物或如权利要求8-13之一所述的制剂的吸入器。
15、如权利要求14所述的吸入器，其适于作为自由流动粉末口服。
16、如权利要求14所述的吸入器，其是定量气溶胶吸入器。
17、一种用于预防或治疗病毒感染的方法，其包括给需要的患者施用有效量的如权利要求1-6之一所述的式(I)化合物的步骤。
18、如权利要求17所述的方法，其中所述病毒感染是正粘病毒或副粘病毒感染。
19、如权利要求17或18的方法，其中所述病毒感染是甲型或乙型流感病毒感染、副流感病毒、腮腺炎或新城疫病毒。
20、如权利要求17-19之一所述的方法，其中所述给药是通过吸入、吹入或鼻内或它们的组合对呼吸道进行给药。
21、如权利要求1-6之一所述的式(I)化合物在制备用于预防或治疗病毒感染的药物中的应用。
22、如权利要求1-6之一所述的式(I)化合物在预防或治疗病毒感染中的应用。
23、如权利要求1-6之一所述的式(I)化合物作为抗病毒剂的应用。
24、一种检测病毒感染的方法，其包括使如权利要求1-6之一所述的式(I)化合物与怀疑含有病毒的样品接触的步骤。
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