JP5183853B2 - 二量体化合物および抗ウイルス薬としてのそれらの使用 - Google Patents

Description

発明の背景

発明の分野
本発明は新規な化学化合物およびそれらの医薬における使用に関する。特に、本発明は新規な二量体化合物、それらの製造方法、それらの医薬製剤、および抗ウイルス薬としてのそれらの使用に関する。

背景技術
他の炭水化物から、シアル酸としても知られるＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）を切断する能力を有する酵素が、多くの微生物に存在している。これらとしては、コレラ菌(Vibrio cholera)、ウエルシュ菌(Clostridium perfringens)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)およびアースロバクター・シアロフィルス(Arthrobacter sialophilus)などの細菌、ならびにインフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルスおよびセンダイウイルスなどのウイルスが挙げられる。これらのウイルスのほとんどはオルトミクソウイルスまたはパラミクソウイルス群に属し、ウイルス粒子の表面にノイラミニダーゼ活性を有している。ノイラミニダーゼを有するこれらの生物の多くは、ヒトおよび／または動物の主要な病原体であり、インフルエンザウイルスおよびニューカッスル病ウイルスなどのいくつかのものは、極めて重大な疾病を引き起こす。

長い間、ノイラミニダーゼの阻害剤によってノイラミニダーゼを有するウイルスによる感染を予防し得ると考えられてきた。知られているノイラミニダーゼ阻害剤のほとんどが、２−デオキシ−２，３−デヒドロ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＤＡＮＡ）およびそのいくつかの誘導体などのノイラミン酸類似体である(Meindl et al, Virology, 1974 58 457)。本発明者らの国際特許公開番号ＷＯ９１／１６３２０では、ウイルスノイラミニダーゼに有効であるＤＡＮＡの多くの類似体を記載しており、特に、４−グアニジノ−２−デオキシ−２，３−デヒドロ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（化合物（Ａ）、コード番号ＧＧ１６７）がＡ型およびＢ型インフルエンザの治療に有用であることを示している(N. Engl. J. Med. , 1997 337 874-880)。その他の特許出願では、密接に関連した種々のシアル酸誘導体が記載されており（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／１８８００、同ＷＯ９５／２０５８３および同ＷＯ９８／０６７１２）、またＧＧ１６７の抗ウイルス性高分子複合体についても記述されている（国際特許出願番号ＰＣＴ／ＡＵ９７／００７７１）。

［Ａｃはアセチルを表す］。

国際特許公開ＷＯ００／５５１４９では、１００原子以下の長さの共通のスペーサーまたは連結基と結合した、化合物（Ａ）などの２つのノイラミニダーゼ結合分子を含んでなる二量体化合物を記載している。

本発明者らは今般、本明細書において具体的に開示していないが、国際特許公開ＷＯ００／５５１４９の包括範囲に含まれ、肺滞留時間が長く、強力であるといった驚くほど有利な抗インフルエンザ活性プロフィールを示す新規な化合物種を発見した。

理論に拘束されるものではないが、肺内での滞留時間が長いことについての根拠は、化合物の大きさおよび分子量が気道上皮内での結合が強いために侵入を阻まれていること、および化合物の極性が細胞膜を極めて非効率的にしか通過しないようなものであることによると考えられている。またもう１つの理論として、化合物自体が細胞膜のリン脂質または気道上皮のその他の成分と相互作用し、肺内での滞留時間を延長するというものがある。

発明の概要

第一の態様において、本発明は下記一般式（Ｉ）の化合物、またはその医薬上許容される誘導体を提供する。

［式中、
Ｒは、アミノまたはグアニジノ基であり；
Ｒ^２は、アセチルまたはトリフルオロアセチルであり；
Ｘは、ＣＯＮＨ、ＳＯ_２ＮＨ、ＮＨＣＯまたはＮＨＣＯＮＨであり；
ｍは、０または１のいずれかであり；
ｎは、２〜６の整数であり；
ｑは、０〜３の整数であり；かつ
Ｙは、水素または芳香族置換基である］。

発明の具体的説明

好ましくは、Ｒはグアニジノ基である。

好ましくは、Ｒ^２はアセチル基である。

好適な芳香族置換基としては、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ハロ、ハロアルキル、ハロアルケニル、ハロアルキニル、ハロアリール、ヒドロキシ、アルコキシ、アルケニルオキシ、アリールオキシ、カルボキシ、ベンジルオキシ、ハロアルコキシ、ハロアルケニルオキシ、ハロアリールオキシ、ニトロ、アジド、アミノ、アルキルアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、アリールアミノ、ベンジルアミノ、アシルアミノ、アシル、アリールアシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、スルホニルアミノ、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、ヘテロシクリルアミノ、ハロヘテロシクリル、メルカプト、スルホン酸、アルキルチオ、アリールチオ、およびアシルチオが挙げられる。

好ましくは、アルキル、アルケニル、アルキニルおよびアルコキシ置換基は６個以下の炭素原子を含有する。

より好ましくは、Ｙは水素、ハロゲン、Ｃ_１−４アルキル、ヒドロキシ、Ｃ_１−４アルコキシ、アミノまたはカルボキシである。

式（Ｉ）の化合物を、式（Ｉ）の化合物のいずれかの１以上の官能基において修飾して、その医薬上許容される誘導体とすることができることは、当業者ならば明らかであろう。このような誘導体として特に着目されるものは、カルボキシル官能基、ヒドロキシル官能基において、またはアミノ基において修飾された化合物である。従って、目的の化合物としては、式（Ｉ）の化合物の、メチル、エチル、プロピルまたはイソプロピルエステルなどのアルキルエステル、フェニル、ベンゾイルエステルなどのアリールエステル、およびアセチルエステルが挙げられる。

「医薬上許容される誘導体」とは、 式（Ｉ）の化合物の、医薬上許容される塩、エーテル、エステルもしくはかかるエステルの塩、または受容者へ投与した際に式（Ｉ）の化合物または抗ウイルス的に活性な代謝産物もしくはその残渣を提供することができる他のいずれかの化合物を意味する。誘導体として特に着目されるものは、シアル酸カルボキシもしくはグリセロールヒドロキシ基において修飾された化合物、または、アミノおよびグアニジン基において修飾された化合物である。

式（Ｉ）の化合物の医薬上許容される塩としては、医薬上許容される無機および有機酸ならびに塩基から誘導されたものが挙げられる。好適な酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン−ｐ−スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、蟻酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸およびベンゼンスルホン酸が挙げられる。シュウ酸などのその他の酸はそれ自体では医薬上許容されるものではないが、本発明の化合物およびそれらの医薬上許容される酸付加塩を得る際に中間体として有用な塩の製造において有用であり得る。

好適な塩基から誘導された塩としては、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）、アンモニウム、およびＮＲ_４ ^＋（ここで、ＲはＣ_１−４アルキルである）塩が挙げられる。

本発明の化合物は本明細書に記載の方法によって製造することができる。当業者ならば、単量体をアルキルスペーサー基と結合させる工程中にノイラミニダーゼ結合分子の１以上の官能基を保護するために保護基を用いる必要があることは明らかであろう。例えば、T. W. Green and P. G. M. Nutsによる"Protective Groups in Organic Synthesis"(John Wiley & Sons, 1991)を参照。式（Ｉ）の化合物の医薬上許容される塩は、公知の手法によって製造することができる。

処理および製造を容易にするため、式（Ｉ）の化合物は結晶状であることが好ましい。

従って、本発明はまた上記の式（Ｉ）の化合物の製造方法であって、下記式（II）の化合物を脱保護することを含んでなる方法も提供する：

［式中、ＲおよびＲ^２は上記の通りであり、かつＰ_１はカルボン酸保護基である］。

式（Ｉ）の化合物は抗ウイルス活性を有する。特に、これらの化合物はオルトミクソウイルスおよびパラミクソウイルスのウイルスノイラミニダーゼ、例えば、Ａ型およびＢ型インフルエンザ、パラインフルエンザ、流行性耳下腺炎およびニューカッスル病のウイルスノイラミニダーゼの阻害剤である。

よって、第二の態様において、本発明は、ウイルス感染症、例えば、オルトミクソウイルス感染症およびパラミクソウイルス感染症の治療に有効な治療薬として用いる式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される誘導体を提供する。

第三の態様において、本発明は、ウイルス感染症の予防または治療方法であって、式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩もしくは誘導体の有効量を、それを必要とする被験体へ投与することを含んでなる方法を提供する。

好ましくは、ウイルス感染症はオルトミクソウイルス感染症またはパラミクソウイルス感染症である。より好ましくは、ウイルス感染症はＡ型またはＢ型インフルエンザ感染症である。

好ましくは、被験体は哺乳類などの動物であり、より好ましくは、ヒト、またはウマ属に属するもの、例えば、ウマ、ロバまたはラバである。最も好ましくは、哺乳類はヒトである。

第四の態様において、本発明は、ウイルス感染症の治療用の医薬の製造のための、本発明の化合物の使用を提供する。

本明細書において「有効量」とは、所望の治療応答を得るための、例えば、ウイルス感染症の影響を克服または軽減するための、ウイルス感染症の予防または治療に有効な式（Ｉ）の化合物の量を意味する。

「治療上有効な量」とは、所望の治療応答を得るための式（Ｉ）の化合物の量、例えば、ウイルス感染症を治療または予防するための式（Ｉ）の化合物の量を意味する。

具体的な「治療上有効な量」は、治療するウイルス感染症、被験体の健康状態、治療する動物の種類、治療期間、(実施する場合には)併用療法の性質、ならびに用いる製剤および化合物またはその誘導体の構造などの因子によって明らかに異なる。

一般に、「治療する」、「治療」などは、本明細書においては、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得るために被験体、組織または細胞に作用するという意味で用いられる。この効果はウイルス感染症またはその徴候もしくは症状を完全にまたは部分的に防止するという点からは予防的であることができ、かつ／または、ウイルス感染症の部分的または完全治癒という点からは治療的であることができる。本明細書おいて「治療する」は、脊椎動物、哺乳類、特にヒトにおけるウイルス感染症の治療または予防のいずれをも含み、さらに（ａ）そのウイルス感染症にかかりやすいと思われるが、まだウイルス感染症についての診断を行っておらず、まだウイルス感染症とは診断されていない被験体においてウイルス感染症の発生を予防すること；（ｂ）ウイルス感染症を抑止すること、すなわち、その進行を止めること；または（ｃ）その影響を緩和または改善すること、すなわち、ウイルス感染症の症状の緩解をもたらすことを包含する。

また、本発明の化合物は診断方法、特にインフルエンザウイルスの検出方法においても用いることができる。かかる方法において使用する場合には、本発明の化合物に放射性標識、蛍光標識または化学発光標識などの標識を付けることが有利であることがある。

本発明の化合物が好適である診断方法は、例えば、本発明者らの先行する出願ＰＣＴ／ＡＵ９７/００１０９およびＰＣＴ／ＡＵ９７／００７７１に記載されている。

第五の態様において、本発明は、本発明の化合物を、ウイルスを含んでいる疑いがあるサンプルと接触させることを含んでなる、ウイルス感染症の検出方法を提供する。

さらに、治療用に必要な本発明の化合物の量は選択された化合物だけでなく、投与経路、治療する症状の性質、ならびに患者の年齢および状態によって異なり、最終的には医師または獣医の判断によって行われることが分かるであろう。しかしながら、一般的には好適な用量は１日あたり約０．００１〜１００ｍｇ／体重ｋｇの範囲、好ましくは、０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲、最も好ましくは、０．１〜１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。

処置は、好ましくは、感染前または感染時に開始してウイルスが気道に存在しなくなるまで続ける。しかしながら、本発明の化合物は感染後、例えば、確立された症状の出現後に施与した場合でも有効である。

好適には、処置は１回または２回行い、好ましくは、治療だけならば１回だけ、好ましくは、予防には週１回行う。

本発明の化合物は便宜には、例えば、単位投与形あたり１〜１００ｍｇ、より便宜には、１〜２０ｍｇの有効成分を含有する単位投与形で投与する。

治療に用いる場合には、本発明の化合物を原料化学物質として投与してもよいが、医薬製剤としての有効成分であることが好ましい。

よって、第六の態様において、本発明は、式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩もしくは誘導体を、１種以上の医薬上許容される担体、および必要に応じて、他の治療および／または予防成分とともに含んでなる医薬製剤を提供する。担体は製剤の他の成分と適合し、その受容者に有害ではないという意味において「許容される」ものでなければならない。

また、本発明の化合物は、他の治療薬および／または予防薬、例えば、他の抗感染症薬と併用してもよい。特に、本発明の化合物は他の抗ウイルス薬と併用してもよい。よって、本発明は、第七の態様において、式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩もしくは誘導体を、別の治療上および／または予防上有効な薬剤、特に、抗ウイルス薬とともに含んでなる組み合わせ物を提供する。

上記の組み合わせ物は、便宜には、医薬製剤の形態で用いるために提供され、よって、上記の組み合わせ物をその医薬上許容される担体とともに含んでなるかかる製剤は、本発明のさらなる態様をなす。

かかる組み合わせ物に用いるのに好適な治療薬および／または予防薬としては、他の抗感染症薬、特に、抗菌薬および抗ウイルス薬、例えば、呼吸器感染症の治療に用いられるものが挙げられる。例えば、インフルエンザウイルスに有効である、上記のシアル酸類似体、例えば、ザナミビル(zanamivir)、オセルタミビル(oseltamivir)、アマンタジン(amantadine)、リマンタジン(rimantadine)およびリバビリン(rivavirin)、ならびにＦｌｕＶａｘなどの他の化合物またはワクチンをかかる組み合わせ物に含めてもよい。

かかる組み合わせ物の個々の成分は個別に投与してもよいし、逐次投与してもよいし、または個別の医薬製剤もしくは組み合わせ医薬製剤として同時に投与してもよい。

本発明の化合物を同じウイルスに有効な第２の治療薬および／または予防薬と併用する場合、各化合物の用量は各化合物を単独で用いる際に使用する用量と同じ場合もあるし、異なる場合もある。当業者であれば、適当な用量が容易に分かるであろう。

医薬製剤としては、経口、直腸、経鼻、局所（口内および舌下など）、膣または非経口（筋肉内、皮下および静脈内など）投与に好適なもの、または気道（鼻腔など）への投与、例えば、吸入法または通気法による投与に好適な形態のものが挙げられる。製剤は、必要に応じて、便宜には、個別投与単位で提供してもよく、製薬分野では十分に公知のいずれの方法によって製造してもよい。これらの方法としては、活性化合物を液体担体または微粉固体担体、もしくはその両方と会合させた後、必要に応じて、生成物を所望の製剤に成形する工程が含まれる。

経口投与に好適な医薬製剤は、便宜には、各々が所定量の有効成分を含むカプセル剤、カシェ剤もしくは錠剤などの個別単位として；粉末もしくは顆粒剤として；液剤、懸濁剤としてまたは乳剤として提供してもよい。また、有効成分はボーラス、舐剤またはペースト剤として提供してもよい。経口投与用の錠剤およびカプセル剤には、結合剤、増量剤、滑沢剤、崩壊剤、または湿潤剤などの通常の賦形剤を含めてもよい。錠剤は当技術分野では十分に公知の方法に従ってコーティングしてもよい。経口液体製剤は、例えば、水性もしくは油性懸濁剤、液剤、乳剤、シロップ剤またはエリキシル剤の形態であってもよいし、または使用前に水もしくはその他の好適なビヒクルを用いて構成する乾燥製品として提供してもよい。かかる液体製剤には、沈殿防止剤、乳化剤、非水性ビヒクル（食用油を含んでもよい）、または防腐剤などの慣用の添加剤を含んでもよい。

また、本発明の化合物は、注射、例えば、ボーラス注射、または点滴による非経口投与用に調製してもよく、アンプルに入った単位投与形、充填済みシリンジ、少量注入剤として、または防腐剤を添加した多容量型容器で提供してもよい。組成物は油性もしくは水性ビヒクル中の懸濁剤、液剤、乳剤などの形態をとってもよく、沈殿防止剤、安定剤および／または分粉末などの配合剤を含んでいてもよい。あるいは、有効成分は使用前に好適なビヒクル、例えば、滅菌、パイロジェンフリー水を用いて構成する、滅菌固体の無菌単離によってまたは溶液からの凍結乾燥によって得た粉末形態であってもよい。

表皮への局所投与には、本発明の化合物を軟膏、クリーム剤もしくはローション剤として、または経皮パッチとして調剤してもよい。軟膏およびクリーム剤は、例えば、好適な増粘剤および／またはゲル化剤を添加した水性または油性基剤を用いて調剤してもよい。ローション剤は水性または油性基剤を用いて調剤してよく、また一般には１種以上の乳化剤、安定剤、分粉末、沈殿防止剤、増粘剤、または着色剤も含む。

口腔内局所投与に好適な製剤としては、香味基剤、通常、スクロースおよびアラビアガムまたはトラガカントガム、中に有効成分を含んでなるトローチ剤；ゼラチンまたはスクロースおよびアラビアガムなどの不活性基剤中に有効成分を含んでなる芳香錠；ならびに好適な液体担体中に有効成分を含んでなる口内洗浄剤が挙げられる。

直腸投与に好適な、担体が固体である医薬製剤は、単位用量坐剤として提供するのが最も好ましい。好適な担体としては、ココア脂および当技術分野で一般に用いられるその他の材料が挙げられ、坐剤は、便宜には、活性化合物を軟化または融解した担体と混合した後に冷却し、成形することによって作製すればよい。

膣投与に好適な製剤は、有効成分の他、当技術分野で好適であることが知られている担体を含む膣坐剤、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、フォーム剤またはスプレー剤とし提供してもよい。

経鼻投与をはじめとする気道への投与には、ノイラミニダーゼ阻害剤を、当技術分野において気道への投与に用いられる方法および製剤のいずれによって投与してもよい。

従って、一般的に、本化合物は液剤もしくは懸濁剤の形態または乾燥粉末として投与してもよい。

液剤および懸濁剤は、一般的に、例えば、水単独（例えば、滅菌またはパイロジェンフリー水）または水および生理学上許容される補助溶媒（例えば、エタノール、プロピレングリコールまたはＰＥＧ４００などのポリエチレングリコール）から調製された水性のものである。

かかる液剤または懸濁剤は、その他の賦形剤、例えば、防腐剤（塩化ベンザルコニウムなど）、可溶化剤／界面活性剤、例えば、ポリソルベート（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｓｐａｎ ８０、塩化ベンザルコニウム）、緩衝剤、等張性調整剤（例えば、塩化ナトリウム）、吸収促進薬および増粘剤をさらに含んでもよい。懸濁剤は、沈殿防止剤（例えば、微晶質セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム）をさらに含んでもよい。

液剤または懸濁剤は、慣用の手段により、例えば、ドロッパー、ピペットまたはスプレーを用いて鼻腔に直接適用される。これらの製剤は単回または多回投与形で提供してもよい。後者の場合には計量手段が提供されることが望ましい。ドロッパーまたはピペットの場合には、患者が所定量の適当な液剤または懸濁剤を投与することによってなされる。スプレーの場合には、例えば、定量噴霧式噴霧ポンプによってなされる。

また、気道への投与は、化合物がクロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタンまたはジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素またはその他の好適なガスなどの好適な噴射剤を加えた加圧パックで提供されるエアゾール製剤によって行ってもよい。また、エアゾールは、便宜には、レシチンなどの界面活性剤を含んでもよい。薬剤の量は定量バルブを設けることで制御することができる。

また、本化合物は乾燥粉末の形態、例えば、化合物とラクトース、デンプン、デンプン誘導体、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびポリビニルピロリジン（ＰＶＰ）などの好適な粉末基剤との粉末混合物の形態で提供してもよい。便宜には、粉末担体は鼻腔内でゲルを形成する。この粉末組成物は単位投与形、例えば、カプセルもしくはカートリッジ（例えば、ゼラチン）、またはブリスターパック（これから粉末が吸入器によって投与される）として提供してもよい。

経鼻投与製剤をはじめとする気道への投与を目的とする製剤では、化合物の粒径は一般に小さく、例えば、５ミクロン以下のオーダーである。かかる粒径は当技術分野では公知の手段によって、例えば、微粉末化によって得られる。

所望により、有効成分に徐放性を与えるようにした製剤を用いてもよい。

好ましくは、本発明の化合物を吸入法、通気法または経鼻投与、もしくはその組み合わせによって気道に投与する。

「リレンザ(Relenza)」は「ディスクへラー(Diskhaler)」を介してフリーフロー粉末として経口吸入によって投与される(オセルタミビル)。類似の製剤が本発明に好適であろう。

よって、本発明の第八の態様によれば、上記の製剤を含有する吸入器が提供される。

また、吸入器は定量式エアゾール吸入器の形態であってもよいことは明らかであろう。

本明細書の目的では、「含んでなる(comprising)」とは、「限定されるものではないが、含む(including but not limited to)」を意味すること、「含んでなる(comprises)」も相当の意味を持つことは明らかであろう。

限定されるものではないが、本明細書の中で引用した特許および特許出願をはじめとする刊行物は総て、その個々の刊行物が、参照により、その全内容を示して具体的かつ個々に示されるように本明細書の一部とされる。

発明の詳しい説明
以下、本発明を、単に参照として以下の限定されない実施例により詳細に説明する。

装置による方法
グリーン(green)法（ＬＣ／ＭＳ）
ＭｉｃｒｏｍａｓｓプラットフォームII質量分析計を、陽イオンエレクトロスプレーモードで使用、質量範囲１００〜１０００ａｍｕ（原子質量単位）。
カラム：３．３ｃｍ×４．６ｍｍ ＩＤ、３μｍ ＡＢＺ＋ＰＬＵＳ、
流速：３ｍｌ／分、
注入量：５μｌ、
溶媒Ａ：９５％アセトニトリル＋０．０５％蟻酸、
溶媒Ｂ：０．１％蟻酸＋１０ｍＭ酢酸アンモニウム、
勾配：０％ Ａ／０．７分、０〜１００％ Ａ／３．５分、１００％ Ａ／１．１分、１００〜０％ Ａ／０．２分。

パープル(purple)法（マス用自動分取ＨＰＬＣ）
使用した分取カラムはSupelcosil ABZplus（１０ｃｍ×２．１２ｃｍ）であった。
ＵＶ波長：２００〜３２０ｎＭ、
流速：２０ｍｌ／分、
注入量：１ｍｌ、
溶媒Ａ：０．１％蟻酸、
溶媒Ｂ：９５％アセトニトリル＋５％蟻酸、
勾配：１００％ Ａ／１分、１００〜８０％ Ａ／９分、８０〜１％ Ａ／３．５分、１％ Ａ／１．４分、１〜１００％ Ａ／０．１分。

ターコイズ(turquoise)法（自動分取ＨＰＬＣ）
使用したプレップカラムはSupelcosil ABZplus（１０ｃｍ×２．１２ｃｍ）であった。
ＵＶ波長：２３０ｎｍ、
流速：４ｍｌ／分、
注入量：２ｍｌ、
溶媒Ａ：アセトニトリル＋０．０５％ＴＦＡ、
溶媒Ｂ：水＋０．１％ＴＦＡ。

Ａ法（ＬＣ／ＭＳ）
ＭｉｃｒｏｍａｓｓプラットフォームII質量分析計を、陽イオンエレクトロスプレーモードで使用、質量範囲１００〜１０００ａｍｕ。
カラム：３．３ｃｍ×４．６ｍｍ ＩＤ、３μｍ ＡＢＺ＋ＰＬＵＳ、
流速：３ｍｌ／分、
注入量：５μｌ、
溶媒Ａ：９５％アセトニトリル＋０．０５％蟻酸、
溶媒Ｂ：０．１％蟻酸＋１０ｍＭ酢酸アンモニウム、
勾配：０％ Ａ／０．７分、０〜１００％ Ａ／３．５分、１００％ Ａ／１．１分、１００〜０％ Ａ／０．２分。

Ｂ法（ＬＣ／ＭＳ）
Ｗａｔｅｒｓ ＺＱ質量分析計を、陽イオンエレクトロスプレーモードで使用、質量範囲１００〜１０００ａｍｕ。
カラム：３．３ｃｍ×４．６ｍｍ ＩＤ、３μｍ ＡＢＺ＋ＰＬＵＳ、
流速：３ｍｌ／分、
注入量：５μｌ、
溶媒Ａ：９５％アセトニトリル＋０．０５％蟻酸、
溶媒Ｂ：０．１％蟻酸＋１０ｍＭ酢酸アンモニウム、
勾配：０％ Ａ／０．７分、０〜１００％ Ａ／３．５分、１００％ Ａ／１．１分、１００〜０％ Ａ／０．２分。

Ｃ法（自動分取ＨＰＬＣ）
使用したプレップカラムはSupelcosil ABZplus（１０ｃｍ×２．１２ｃｍ）であった。
ＵＶ波長：２３０ｎｍ、
流速：４ｍｌ／分、
注入量：２ｍｌ、
溶媒Ａ：アセトニトリル＋０．０５％ＴＦＡ、
溶媒Ｂ：水＋０．１％ＴＦＡ、
勾配：０〜４０％ Ａ／２０分、４０％ Ａ／２０分、４０〜１００％ Ａ／０．３分、１００％ Ａ／１５分、１００〜０％ Ａ／３分。

Ｄ法（マス用自動分取ＨＰＬＣ）
使用したプレップカラムはSupelcosil ABZplus（１０ｃｍ×２．１２ｃｍ）であった。
ＵＶ波長：２００〜３２０ｎＭ、
流速：２０ｍｌ／分、
注入量：１ｍｌ、
溶媒Ａ：０．１％蟻酸、
溶媒Ｂ：９５％アセトニトリル＋５％蟻酸、
勾配：１００％ Ａ／１分、１００〜８０％ Ａ／９分、８０〜１％ Ａ／３．５分、１％ Ａ／１．４分、１〜１００％ Ａ／０．１分。

略語
ＥｔＯＡｃ 酢酸エチル
ＭｅＯＨ メタノール
ＨＰＬＣ 高圧液体クロマトグラフィー
ＳＰＥ 固相抽出
ＬＣ／ＭＳ 液体クロマトグラフィー／質量分析
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＷＳＣＤＩ １−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドメチオジド
ＨＯＢｔ １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＤＩＰＥＡ Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＭｅＣＮ アセトニトリル
ＲＴ 室温
ＥｔＯＡｃ 酢酸エチル
ＭｇＳＯ_４ 硫酸マグネシウム
ＤＭＦ ジメチルホルムアミド

例１：化合物１の製造
中間体１

（４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−５−アセチルアミノ−４−アジド−６−［（Ｓ）−４−ニトロフェノキシカルボニルオキシ）−（２−オキソ−［１，３］ジオキソラン−４Ｒ−イル）−メチル］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピラン−２−カルボン酸メチルエステル（Eur. J. Med. Chem. 1999, 34, 563-574参照）（２．００ｇ，３．８ｍｍｏｌ）を、無水トルエンとの共沸を３回行うことによって乾燥させた後、３オングストロームのモレキュラーシーブペレット数個を添加して無水アセトニトリル(２０ｍｌ）に溶かした。この攪拌溶液をＮ−ｔ−ブトキシカルボニル１,４−ジアミノブタン（０．７２ｇ，３．８ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．４３ｇ，４．２ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を窒素雰囲気下にて１６時間攪拌した。揮発性物質を真空除去し、黄色の残渣を得た。これをＥｔＯＡｃ（５０ｍｌ）に再び溶かし、０．５Ｍ ＨＣｌ（３０ｍｌ）、次ぎにブライン（３０ｍｌ）で洗浄した。溶液を乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、溶媒を真空蒸発させ、クリーム色の泡沫物質を得た。さらなる精製はＢｉｏｔａｇｅフラッシュクロマトグラフィーにより、最初にＥｔＯＡｃ：シクロヘキサン（１:１）、次ぎにＥｔＯＡｃを溶離液として行った。溶媒を真空蒸発させ、白色の固体として中間体１（１．２６ｇ，５８％収率）を得た。ＬＣ／ＭＳ（Ｂ法）では、ＭＨ^＋＝５７１；Ｔ_ＲＥＴ＝２．８７分であった。

中間体２

中間体１（０．７６ｇ，１．３３ｍｍｏｌ）をエタノール(２４ｍｌ）に溶かし、リンドラー触媒（０．０９５ｇ）上で１６時間、触媒による水素化を行った。触媒を濾去し、溶媒を真空蒸発させ、クリーム色の泡沫物質として中間体２（０．７２ｇ，９９％収率）を得た。ＬＣ／ＭＳ（Ａ法）では、ＭＨ^＋＝５４５；Ｔ_ＲＥＴ＝２．２４分であった。

中間体３

中間体２（０．７２ｇ，１．３２ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（７ｍｌ）に溶かし、Ｎ，Ｎ’−ビス−（ｔ−ブトキシカルボニル）−１−グアニルピラゾール（０．４５ｇ，１．４５ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を窒素雰囲気下にて１６時間攪拌した。揮発性物質を真空除去して固体残渣を得、これをＢｉｏｔａｇｅフラッシュクロマトグラフィーにより、最初にＥｔＯＡｃ：シクロヘキサン（１:１）、次ぎにＥｔＯＡｃ：シクロヘキサン（５:３）を溶離液として精製した。溶媒を真空蒸発させ、白色の固体として中間体３（０．４８ｇ，４６％収率）を得た。ＬＣ／ＭＳ（Ａ法）では、ＭＨ^＋＝７８７；Ｔ_ＲＥＴ＝３．６４分であった。

中間体４

中間体３（０．４８ｇ，０．６１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１９ｍｌ）に溶かした。溶液を氷浴で冷却し、トリフルオロ酢酸（１９ｍｌ）を５分かけて少量ずつ加えた。次いで、混合物を窒素雰囲気下にて１時間攪拌した後、周囲温度まで温め、さらに１６時間攪拌した。揮発性物質を真空除去し、残渣をトルエンと共沸し、残留するトリフルオロ酢酸を除去した。ジエチルエーテル（２０ｍｌ）でトリチュレートして白色の固体を得、これを分離し、中間体４（０．５０ｇ）を得た。ＬＣ／ＭＳ（Ｂ法）では、（Ｍ−Ｈ）⁻＝４８５；Ｔ_ＲＥＴ＝０．５２分であった。

中間体５

中間体４（０．０５０ｇ，０．０７ｍｍｏｌ）を、無水トルエンとの共沸を３回行うことによって乾燥させた後、無水アセトニトリル（２ｍｌ）および無水ＤＭＦ（１ｍｌ）の混合物に溶かした。この溶液をイソフタル酸（０．００５ｇ，０．０３ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．０１０ｇ，０．０７ｍｍｏｌ）、ＷＳＣＤＩ（０．０１３ｇ，０．０７ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．０２６ｇ，０．２０ｍｍｏｌ）で連続的に処理した。この混合物を窒素雰囲気下にて１６時間攪拌した。揮発性物質を真空除去して黄色の残渣を得、２６れをマス用分取ＨＰＬＣ（Ｄ法）により精製し、白色の固体として中間体５（０．０１３ｇ）を得た。ＬＣ／ＭＳ（Ａ法）では、（Ｍ＋２Ｈ^＋）／２＝５５２；Ｔ_ＲＥＴ＝２．０５分であった。

化合物１

中間体５（０．０１２ｇ，０．０１ｍｍｏｌ）を水（０．５ｍｌ）およびメタノール（０．５ｍｌ）の混合物に溶かした。得られた溶液をトリエチルアミン（０．０９０ｇ，過剰）で処理した。この混合物を５０分間攪拌した後、揮発性物質を迅速に真空除去し、白色の固体残渣を得た。分取ＨＰＬＣ（Ｃ法）により精製し、白色の固体として化合物１（０．００２ｇ）を得た。ＬＣ／ＭＳ（Ｂ法）では、（Ｍ＋２Ｈ^＋）／２＝５１２；Ｔ_ＲＥＴ＝１．７７分であった。

例２：化合物２の製造
中間体６

（４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−５−アセチルアミノ−４−アジド−６−［（Ｓ）−４−ニトロフェノキシカルボニルオキシ）−（２−オキソ−［１，３］ジオキソラン−４Ｒ−イル）−メチル］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピラン−２−カルボン酸メチルエステル（Eur. J. Med. Chem. 1999, 34, 563-574参照）（４．０ｇ）をトルエン（５０ｍＬ）と共沸し、ＭｅＣＮ（４０ｍＬ）およびトリエチルアミン（１．１２ｍＬ）に溶かし、３−アミノプロピオン酸ｔ−ブチルエステルヒドロクロリド（１．３９６ｇ）を添加した。室温にて３日後、溶媒を除去し、残渣をＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ）で希釈した。これを５％クエン酸溶液（２×５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳ０_４）、濃縮した。１：１シクロヘキサン：ＥｔＯＡｃ、次ぎに６０：４０、続いて６５：３５シクロヘキサン：ＥｔＯＡｃで溶出するＢｉｏｔａｇｅにより精製し、無色の泡沫物質として中間体６（３．４５ｇ）を得た。
¹H-NMR (400MHz, CDCl₃) δ 6.72 (d, 1H), 5.97 (d, 1H), 5.53 (t, 1H), 5.40 (t, 1H), 5.03-4.95 (m, 2H), 4.92 (dd, 1H), 4.74-4.64 (m, 2H), 3.83 (s, 3H), 3.64-3.54 (m, 1H), 3.38-3.27 (m, 2H), 2.65-2.56 (m, 1H), 2.52-2.43 (m, 1H), 2.06 (s, 3H), 1.70 (s, 1H), 1.48 (s, 9H).

中間体７

中間体２と同様に、中間体６から製造した。
ＬＣ／ＭＳ（グリーン法）ＭＨ^＋ ５０４，Ｔ_ＲＥＴ＝２．２２分

中間体８

中間体８は中間体３と同様に、中間体７から製造した。
ＬＣ／ＭＳ（グリーン法）ＭＨ^＋ ７４４，Ｔ_ＲＥＴ＝３．６６分

中間体９

中間体８（１．４４ｇ）、トリフルオロ酢酸（２０ｍＬ）、ジクロロメタン（２０ｍＬ）およびアニソール（２ｍＬ）を室温にて３時間攪拌し、その後、揮発性物質を真空除去した。残渣をＥｔ_２Ｏ（２×２５ｍＬ）でトリチュレートした後、真空乾燥し、白色の固体として中間体９（１．２２ｇ）を得た。
ＬＣ／ＭＳ（グリーン法）ＭＨ^＋ ４８８，Ｔ_ＲＥＴ＝１．２５分

中間体１０

中間体９（０．１２ｇ）、ＤＩＰＥＡ（０．１４ｍＬ）、ｍ−キシリレンジアミン（０．０１３２ｍＬ）およびヘキサフルオロリン酸ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリスピロリジノホスホニウム（０．１０４ｇ）を室温にて２日間混合した後、真空濃縮した。マス用ＨＰＬＣ（パープル法）により精製し、中間体１０（０．０３８ｇ）を得た。
ＬＣ／ＭＳ（グリーン法）ＭＨ^＋／２ ５３８，Ｔ_ＲＥＴ＝１．７４分

化合物２

中間体１０（０．０３８ｇ）、水（１．５ｍＬ）、メタノール（１．５ｍＬ）およびトリエチルアミン（０．５ｍＬ）を室温にて１時間混合した。揮発性物質を真空除去し、水性残渣をトリフルオロ酢酸を用いてｐＨ４に酸性化した。３０分かけて０〜１７．５％ＭｅＣＮで溶出する逆相ＨＰＬＣ（ターコイズ法）により、化合物２（７．６ｍｇ）を得た。
ＬＣ／ＭＳ（グリーン法）ＭＨ^＋／２ ４９７，Ｔ_ＲＥＴ＝１．６４分

例３：化合物３の製造
中間体１１

中間体４（０．０７５ｇ，０．１１ｍｍｏｌ）を、無水トルエンとの共沸を３回行うことによって乾燥させた。乾燥させた固体をＤＩＰＥＡ（０．０５６ｇ，０．４３ｍｍｏｌ）を添加した無水クロロホルム（２ｍｌ）および無水ＤＭＦ（１ｍｌ）の混合物に溶かした。得られた透明溶液を塩化１，３−ベンゼンジスルホニル（０．０１４ｇ，０．０５ｍｍｏｌ）に添加し、混合物を窒素雰囲気下にて１時間攪拌した。揮発性物質を真空除去して残渣を得、これを逆相ＳＰＥ（溶離液１５％水性アセトニトリル）によりさらに精製し、白色の固体として中間体１１（０．０２０ｇ）を得た。ＬＣ／ＭＳ（Ｂ法）では、（Ｍ＋２Ｈ^＋）／２＝５８８；Ｔ_ＲＥＴ＝２．０９分であった。

化合物３

中間体１１（０．０２０ｇ，０．０１４ｍｍｏｌ）を水（０．５ｍｌ）およびメタノール（０．５ｍｌ）の混合物に溶かした。得られた溶液をトリエチルアミン（０．０９０ｇ，過剰）で処理した。この混合物を５０分間攪拌した後、揮発性物質を迅速に真空除去し、白色の固体残渣を得た。分取ＨＰＬＣ（Ｃ法）により精製し、白色の固体として化合物３（０．００６ｇ）を得た。ＬＣ／ＭＳ（Ａ法）では、（Ｍ＋２Ｈ^＋）／２＝５４８；Ｔ_ＲＥＴ＝１．９９分であった。

例４：化合物４の製造
中間体１２

中間体１０と同様に、中間体９およびｐ−キシリレンジアミンから製造し、中間体１２（０．０３８ｇ）を得た。
ＬＣ／ＭＳ（グリーン法）ＭＨ^＋／２ ５３８，Ｔ_ＲＥＴ＝１．９４分

化合物４

化合物４は化合物２と同様に、中間体１２から製造した。
ＬＣ／ＭＳ（グリーン法）ＭＨ^＋／２ ４９７，Ｔ_ＲＥＴ＝１．６２分

例５：中間体１３とテレフタル酸との反応による化合物５の製造

アミノプロピル中間体１３は、例１で類似のアミノブチル中間体４に関して記載したものと同様の一連の工程に従って製造した。

テレフタル酸（５．９３ｍｇ，０．０３５７ミリモル）、中間体１３（５０ｍｇ，０．０７１ミリモル）およびヘキサフルオロリン酸ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム（ＢＯＰ）（３７．７ｍｇ，０．０８５２ミリモル）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶かし、これにジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ，９１．８ｍｇ，０．７１ミリモル）を添加した。得られた混合物を室温にて５時間攪拌した。反応混合物をWaters Symmetry Ｃ１８カラム（５ミクロン １９×１００ｍｍ）、および下表に示す勾配溶出を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、保護された二量体（１９．５ｍｇ，５１％）、ＭＳ １０７５（Ｍ＋Ｈ）^＋を得た。

Ａ＝０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水
Ｂ＝０．０６％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル

保護された二量体化合物（１９．５ｍｇ，０．０１８２ミリモル）を水／メタノール／トリエチルアミンの４：４：１比混合物（２ｍｌ）に溶かし、室温にて１時間攪拌した後、減圧下にて蒸発乾固させた。残留するトリエチルアミンを、水を添加し、減圧下にて蒸発させることを繰り返して除去した。残渣をWaters Symmetry Ｃ１８カラム（５ミクロン １９×１００ｍｍ）、および下表に示す勾配溶出を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥後、白色の固体として二量体５（１０．８ｍｇ，６０％）を得た。

Ａ＝０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水
Ｂ＝０．０６％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル
ＭＳ ４９８．３（Ｍ＋２Ｈ）^２＋，９９５．２（Ｍ＋Ｈ）^＋
1H-nmr (D₂O) δ (ppm): 1.79 (t, 4H); 1.90 (s, 6H); 3.14 (t, 4H); 3.42 (m, 6H); 3.62 (dd, 2H); 3.98 (m, 2H); 4.08 (dd, 2H); 4.37 (dd, 2H); 4.52 (dd, 2H); 4.88 (dd, 2H); 5.92 (d, 2H); 7.79 (s, 4H).

例６：中間体１４と１５との反応による化合物５の製造

中間体１４
ＤＭＦ（１２ｍｌ）中のテレフタル酸（１４１．９ｍｇ，０．８５ミリモル）およびＮ−Ｂｏｃ−１，３−ジアミノプロパン（３００ｍｇ，１．７２ミリモル）の懸濁液に室温にて攪拌しながらトリエチルアミン（３９２ｍｇ，３．８８ミリモル）を添加した。この白色の懸濁液にＢＯＰ（７７１ｍｇ，１．７４ミリモル）を数回に分けて添加した。１回目のＢＯＰ（約３００ｍｇ）を添加した後、反応混合物は透明溶液となった。反応混合物を室温にて１６時間攪拌した後、真空蒸発させてＤＭＦを除去した。残渣を水(１０ｍｌ）中で、室温にて３時間攪拌した後、固体を濾過により回収した。固体を水(４×５ｍｌ）で洗浄し、濾過した。濾過ケークを温メタノール（４ｍｌ）に溶かした後、水（９ｍｌ）で希釈した。懸濁液を室温にて３時間攪拌した後、濾過した。固体を水(４×５ｍｌ）で洗浄した後、沸騰メタノール（４ｍｌ）に溶かし、室温まで冷却した。結晶懸濁物を室温にて一晩振盪した。固体を濾別し、冷メタノールで洗浄し、風乾し、白色の固体としてビス−アミド生成物（３６５ｍｇ，８９．７％）を得た、ＭＳ ４７９（Ｍ＋Ｈ）^＋。Ｂｏｃ保護したビス−アミド（３６０ｍｇ）をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（２ｍｌ）およびジクロロメタン（２ｍｌ）の混合物中で、室温にて４時間攪拌した後、真空下にて蒸発乾固させた。残渣を水（６ｍｌ）に溶かし、凍結乾燥して過剰なＴＦＡを除去し、白色の固体として中間体１４（ＴＦＡ塩）（３７９ｍｇ，９８％）、ＭＳ ２７９（Ｂａｓｅ ＋Ｈ）＋を得た。

中間体１５
４−ジメチルアミノピリジン（１２０ｍｇ，０．９８２ｍｍｏｌ）を含有する乾燥ピリジン（３ｍｌ）中、（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−３−（アセチルアミノ）−４−（｛［（ｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］［（ｔ−ブトキシカルボニル）イミノ］メチル｝アミノ)−２−｛（Ｓ）−ヒドロキシ［（４Ｒ）−２−オキソ−１，３−ジオキソラン−４−イル］メチル｝−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−６−カルボン酸メチル（１１３ｍｇ，０．１９７ｍｍｏｌ）の溶液を２２℃にてクロロ蟻酸４−ニトロフェニル（１９９ｍｇ，０．９８７ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を２２℃にて１７時間攪拌した後、ピリジンを真空除去した。残渣をシクロヘキサン−酢酸エチル（４：１〜２：１）で溶出するＳＰＥクロマトグラフィー（５ｇカートリッジ）により精製し、淡黄色のガム質として中間体１５（９６ｍｇ，６６％）を得た。
NMR δ (CDCl₃) 11.3 (1Hs, NH), 8.58 (1H brd, NH), 8.26 (2H, AA'BB', 芳香族 CH's), 7.56 (2H, AA'BB', 芳香族 CH's), 6.82 (1H brd, NH), 5.93(1Hd, =CH), 5.54 (1Hdd, CH), 5.20 (1Hdt, CH), 5.10 (1Hdt, Ch), 4.78 (2Hm, 2xCH), 4.44 (1H brq, CH), 4.28 (1Hdd, CH), 3.82 (3Hs CH3), 1.91 (3Hs, CH3), and 1.48 (18Hs, 2x tert butyl).
ＬＣＭＳ Ｒ_ｔ＝３．８７分．（ＭＨ^＋＝７３８，ＭＨ⁻＝７３６）

化合物５
中間体１４（３８．９ｍｇ，０．０７６８ミリモル)および中間体１５（２当量）をピリジン（０．５ｍｌ）に溶かし、得られた混合物を室温にて１６時間攪拌した後、真空下にて蒸発乾固させた。この残渣をジクロロメタン（１５ｍｌ）と水（３ｍｌ）とで分液した。有機層を水（２×２ｍｌ）で洗浄した後、蒸発乾固させてガム状残渣を得、これをシリカゲルクロマトグラフィー（２０ｇ、溶媒 酢酸エチル／メタノール １０／１）に付した。このようにして、保護された形の化合物５を白色の泡沫物質として単離した（５６ｍｇ，４９％）。
この保護された化合物（５０ｍｇ，０．０３３９ミリモル）を、例５で記載したようにＴＦＡ、次ぎに水性トリエチルアミンで処理し、化合物５（１６．８ｍｇ，５０％）、ＭＳ ９９５（Ｍ＋Ｈ）^＋を得た。

例７：
本発明の化合物６〜１４（表１）を上記の例と同様の方法で製造し、ＮＭＲおよび／またはマススペクトルデータを以下に示す。

例８：化合物５の大規模製造および精製
ＴＦＡ塩からＨＣｌ塩へ
例６で製造した化合物５の２ＴＦＡ塩（１０ｇ）をＭｅＯＨ／水（１：１ ｖ／ｖ）（１５０ｍｌ）に溶かし、予洗したAmberlite ＩＲＡ−４１０（塩化物型）イオン交換カラム（４×５０ｃｍ）に注入した。ＭｅＯＨ／水（１：１ ｖ／ｖ）を用いてこのカラムから化合物５の２ＨＣｌ塩を溶出させた。２ＨＣｌ塩を含有する画分を真空濃縮し、白色の泡沫物質を得た。

脱保護
２ＨＣｌ塩（１０．４ｇ）をメタノール（１４４ｍｌ）および水（１４４ｍｌ）に溶かし、氷冷した。トリエチルアミン（７．７５ｍｌ）を３回に分け、１０分かけて添加した。この反応を逆相ＨＰＬＣによりモニタリングした。反応が完了したら、反応混合物を真空にて蒸発乾固させた。

トリエチルアミンを含有する不純な化合物５の溶液を蒸発乾固させ、固体（１０．５ｇ）を得た。この固体を８０ｍｌの水に溶かし、５ｍｌのオルトリン酸を添加してサンプル溶液がｐＨ２となるようにした。この溶液（約１００ｍｌ）を７ミクロンのKromasil Ｃ８カラム（２５ｃｍ×５ｃｍ内径）を用いた分取ＨＰＬＣに付した。化合物５のクロマトグラフィー分離は、イオン対勾配溶出（最初の移動相Ａは８ｇ／ｌのラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）および２ｍｌ／ｌのＨ_３ＰＯ_４を添加したＨ_２Ｏとした）を用いて行った。最終移動相Ｂは８ｇ／ｌのＳＬＳおよび２ｍｌ／ｌのＨ_３ＰＯ_４を添加した６０％ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏであった。グラジエント時間は０〜１００％Ｂを７０分とし、１００％Ｂで２０分間保持した。流速は８０ｍｌ／分に設定した。合計４回、各２５ｍｌを注入した。検出器は２６０ｎｍに設定した。各５０ｍｌの画分をＨＰＬＣにより測定されたそれらの分析純度に従って量を見積もったところ、＞９７．５％であった。４回のクロマトグラフィー分離でのこの見積もり量は約１８００ｍｌであった。大部分の硫酸およびラウリル硫酸イオンを除去するため、塩化物型のＩＲＡ ４１０イオン交換樹脂１２００ｍｌに水性バルクを添加し、この溶液を１時間攪拌した。樹脂を濾別し、４００ｍｌのＨ_２Ｏで洗浄し、これを濾液と合わせた。次いで、水相を塩化物型ＩＲＡ ４１０カラム（１５ｃｍ×２.５ｃｍ内径）に通し、残留する硫酸またはラウリル硫酸イオンの夾雑物を除去した。次いで、カラムを５０ｍｌのＨ_２Ｏで洗浄し、濾液と合わせた。４０℃での回転蒸発によりＣＨ_３ＣＮを除去した後、ｐＨを７．０に調整した。水相を２分した。一方の画分をAmberchrom ＣＧ １６１カラム（２５ｃｍ×２.５ｃｍ）に通し、化合物５を吸着させた。このカラムは逆相充填材料としての機能を果たすポリスチレンジビニルベンゼン樹脂である。このカラムを、洗液に塩化物イオンが存在しなくなるまで（これはＡｇＮＯ_３溶液との反応が起こらないことで確認した）、３００ｍｌのＨ_２Ｏで洗浄した。カラムを３０％ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ（５００ｍｌ）で溶出した。この工程をもう一方の画分でも繰り返し、溶出物を合わせた。回転蒸発により溶媒（１ｌ）を除去し、５．７ｇの固体を得た。

精製した材料を水（３００ｍｌ）に溶かし、ジクロロメタン（３×２００ｍｌ）で洗浄した。次いで、この水性溶液を凍結乾燥し、標題の化合物を得た。
¹H NMR (D₂0) δ 7.85 (s, 4H, 4x ArH), 5.67, 5.57 (2xd, 2H, J=2.1Hz, 2xCH), 4.95 (dd, 2H, J=9.0, 1.6Hz, 2xCH), 4.52 (dd, 2H, J=10.5, 1.6Hz, 2xCH), 4.42 (dd, 2H, J=9.3, 2.2Hz, 2xCH), 4.14-4.04 (m, 4H, 4xCH), 3.67 (dd, 2H, J=12, 3Hz, 2xCH), 3.54-3.44 (m, 6H, 2xCH +2xCH₂), 3.21 (t, 4H, J=6.7Hz, 2xCH₂), 1.96 (s, 6H, 2x CH₃), 1.85 (m, 4H, 2xCH₂).

微量分析
理論値： C 45.02% ；H 6.23% ；N 15.75%
測定値： C 44.80% ；H 6.68% ；N 14.89%
ＬＣ−ＭＳ（Ａ法）では、（Ｍ＋２Ｈ）^２＋＝４９８；Ｔ_ＲＥＴ＝１．６７分であった。

例９：式（Ｉ）の化合物の評価−インフルエンザウイルス複製の阻害
細胞変性作用（ＣＰＥ）アッセイを、基本的にはWatanabe et al.(J. Virological Methods, 1994 48 257)によって記載されたように行った。ＭＤＣＫ細胞を本発明の化合物の連続希釈物の存在下で所定の接種量のウイルス（試験によって、７２時間以内に十分なＣＰＥを引き起こすに足る最少量であり、公開された標準と一致すると考えられる濃度で対照化合物に感受性を示すと判断されたもの）に感染させた。培養物を５％ＣＯ_２雰囲気下、３７℃にて最大７２時間インキュベートした。公開された方法（例えば、Watanabe et al. , 1994参照）に従って、ウイルス染色剤、臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）の代謝を介して、ＣＰＥの程度、さらにはウイルス複製を調べた。ＣＰＥを５０％阻害した化合物濃度（ＩＤ_５０）を曲線の当てはめに関するコンピュータープログラムを用いて算出した。インフルエンザＡ／シドニー／５／９７およびＢ／ハルビン／７／９５ウイルスをアッセイし、その結果を表２に示している。また、ＷＯ００／５５１４９にて明示された化合物および化合物Ａとの比較データも下記表２に示す。

^＊ ＷＯ００／５５１４９から引用
^＋ ＷＯ００／５５１４９に記載のデータはウイルスＡ型Ｈ３Ｎ２単離株Ａ／シドニー／５／９７ではなく、Ｈ３Ｎ２単離株Ａ／ビクトリア／３／７５に関するものである。このようなデータを比較することで、in vitroにおいて数種類の異なるウイルスに対して分析する際、当業者ならば、ある化合物の抗ウイルス力価が異なることが珍しくないことが分かるであろう。例えば、Woods et al(Antimicrob Agents Chemother 1993 37: 1473-9)は、最近の臨床単離株に関するin vitroアッセイにおいて化合物Ａが広範なＥＣ５０値（０．０２〜０．１６μＭ）を示すことを報告している。よって、化合物８がこれまでのＨ３Ｎ２単離株Ａ／ビクトリア／３／７５よりも最近のインフルエンザＡ型Ｈ３Ｎ２単離株Ａ／シドニー／５／９７に関するＣＰＥアッセイにおいて有効であることが分かった。

表２に示したデータは、化合物２〜１４が、極めて有効な化合物Ａよりも実質的に有効であることに加え、ＷＯ００／５５１４９の化合物８および１０よりもＡ／シドニー／５／９７に対していっそう有効であり、かつ最近のインフルエンザＢ単離株Ｂ／ハルビン／７／９５に対しても実質的に有効であることを示している。

例１０：プラーク減少アッセイ
Mardin Darbyイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞を６ウェル組織培養プレートに播種し、常法によって密集するまで増殖させる。インフルエンザウイルスを最少量の０．２％ウシ血清アルブミンを添加したリン酸緩衝生理食塩水で希釈し、各ウェル当たり推定力価５０〜１００プラーク形成単位（ｐｆｕ）とした。５％ＣＯ_２雰囲気下、３７℃にて１時間、ＭＤＣＫ細胞に吸着させた後、ウイルス接種材料を吸引し、プラークが形成されるまで（一般に２〜４日）５％ＣＯ_２雰囲気下、３７℃にて、室温で培地を固化するのに十分な寒天またはアガロース（一般に１〜２％）を含有するウイルス増殖培地（至適濃度のＢＳＡ、トリプシンおよびインスリン／トランスフェリン／セレンを添加した最少イーグル培地）で置き換える。プラークは計数前に好適な染色剤（例えば、ホルマリン加生理食塩水中０．４％クリスタルバイオレット）を用いて可視化することができる。抗ウイルス力価はプラーク数を未処理の対照値を５０％減少させる被験物質の濃度として表される（ＥＣ_５０）。

^＊Ａ／ＷＳＮ／３３ ＢＶＬＶ０９（Ｈ１Ｎ１）
Ａ／ビクトリア／３／７５ ＢＶＬＶ０１７（Ｈ３Ｎ２）
Ａ／シドニー／５／９７ ＢＶＬＶ０１５（Ｈ３Ｎ２）
Ａ／ニューカレドニア／２０／９９ ＢＶＬＶ００８（Ｈ１Ｎ１）
Ａ／パナマ／２００７／９９ ＢＶＬＶ００８（Ｈ３Ｎ２）
Ａ／バイエルン／７／９５ ＢＶＬ００６（Ｈ１Ｎ１）

^＊Ｂ／ビクトリア／１／６７
Ｂ／ホンコン／５／７２ ＢＶＬＶ０１２
Ｂ／ハルビン／７／９５ ＢＶＬＶ００８
Ｂ／山梨／１６６／９８ ＢＶＬＶ００７

例１１：長時間作用性の評価
齧歯類を麻酔し、目的化合物を気管内経路によって０．８ｍｌ／ｋｇの用量で投与する。次いで、完全に回復するまで齧歯類を垂直位に保つ。投与後、種々の時点、例えば、２、８、２４および４８時間の時点で肺組織における化合物のレベルを分析法によって評価する。この種の化合物の検出に好適なものであればいずれの分析法を用いてもよい。化合物のレベルが特定の分析法の感度の範囲を下回った時間によって肺組織における化合物の滞留時間を決定する。

選択された化合物のラット肺滞留データを以下に示す。全ての試験では、比較のため、同時投与した内部標準、すなわち、国際特許公開ＷＯ０２／２０５１４の化合物３が含まれることに留意のこと。データは以下に示す構造を持つこの化合物に対する比率として表される。

比較のため、化合物Ａのデータも示している。標準濃度に対する化合物濃度の比率として表した場合、本発明の化合物は７日時点での滞留が化合物Ａよりも有意に高い。

例１２：長時間作用性および効果の別の評価
マウス感染プロトコールについてはこれまでに記載した（１〜４）。軽く麻酔したマウスの外鼻孔にインフルエンザウイルスを接種する。
処置法および管理 一用量の化合物を所定の時点で、感染最大１０日前、好ましくは、感染４〜７日前、または感染後、好ましくは、感染直後および感染後最大４８時間の時点で投与する。ほとんどの試験では、効果は、非致死株のインフルエンザを用い、肺におけるウイルス力価の低下によって評価する。感染前に化合物を投与したマウスでは、感染後１日で、または感染後数日で、好ましくは、感染１〜４日後に肺を摘出する。ホモジナイズした肺サンプルを確立された方法によりウイルスについて評価し、ウイルス量の力価を推定し、未処置マウスの肺のウイルス力価と比較する。

マウス馴化致死株のインフルエンザを用いる試験では、効果は、未処置のマウスと比べた場合の生存率および／または生存数の増加によって評価する。

参照文献

Claims (10)

1. 下記一般式（Ｉ）の化合物、またはその医薬上許容される塩：
   

   

   ［式中、
   Ｒは、グアニジノ基であり；
   Ｒ^２は、アセチルであり；
   Ｘは、ＣＯＮＨ、ＳＯ_２ＮＨ、ＮＨＣＯまたはＮＨＣＯＮＨであり；
   ｍは、０または１のいずれかであり；
   ｎは、２〜６の整数であり；
   ｑは、０〜３の整数であり；かつ
   Ｙは、水素、ハロゲン、Ｃ _１−４ アルキル、ヒドロキシ、Ｃ _１−４ アルコキシ、アミノまたはカルボキシである］。
2. 請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物の製造方法であって、
   下記式（II）の化合物を脱保護することを含んでなる、方法：
   

   

   ［式中、Ｒ、Ｒ^２ 、Ｘ、ｍ、ｎ、ｑ、およびＹは請求項１に記載の通りであり、かつＰ_１はカルボン酸保護基である］。
3. 請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩を、１種以上の医薬上許容される担体とともに含んでなる、医薬製剤。
4. １種以上の他の治療および／または予防成分をさらに含んでなる、請求項３に記載の医薬製剤。
5. 請求項１に記載の化合物、または請求項３または４のいずれか一項に記載の医薬製剤を含んでなる、吸入器。
6. 請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩を含んでなる、医薬剤。
7. ウイルス感染症の予防または治療に用いられる、請求項６に記載の医薬剤。
8. ウイルス感染症が、Ａ型もしくはＢ型インフルエンザ感染症、パラインフルエンザ、流行性耳下腺炎またはニューカッスル病である、請求項７に記載の医薬剤。
9. 請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物を、ウイルスを含んでいる疑いがあるサンプルと接触させることを含んでなる、ウイルス感染症のインビトロ検出方法。
10. 下記化合物１〜１４から選択される、請求項１に記載の化合物。