CN1548539A - 获得雄性不育小麦的方法及其专用质粒与功能核苷酸片段 - Google Patents

Abstract

本发明公开了获得雄性不育小麦的方法及其专用质粒与功能核苷酸片段，首要目的是提供一个与小麦花粉发育有关的cDNA片段及其编码的多肽序列。本发明所提供的与小麦花粉发育有关的cDNA片段命名为WSK1，是下列核苷酸序列之一：1)序列表中的SEQ ID №：1；2)编码序列表中SEQID №：2多肽序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。4)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列的非编码区具有80％以上同源性的DNA序列。本发明的第二个目的是提供一种获得雄性不育小麦的方法，该方法是将RNAi双元表达载体经农杆菌介导，T－DNA插入并整合到小麦染色体上，获得转化体。本发明的方法在培育小麦育种必需的不育品种中有重要应用价值。

Description

获得雄性不育小麦的方法及其专用质粒与功能核苷酸片段

技术领域

本发明涉及基因工程领域中一种获得雄性不育小麦的方法，实现该方法所用的专用质粒与用该方法抑制表达的目的功能基因。

背景技术

杂种优势是生物界的一种普遍现象。利用杂种优势可以显著提高作物产量，改善作物品质，在农业生产中占有重要的地位。作物雄性不育系的选育是杂种优势利用的关键环节，但利用常规的育种方法来选育不育系存在周期长、见效慢，不育基因单一，对环境因素影响敏感等问题，远不能满足生产发展的需要。近年来，通过基因工程创造植物雄性不育系已在一些作物上获得了成功，为作物杂种优势的利用开创了新的前景。目前利用基因工程创造雄性不育的策略主要是利用花粉发育的特异启动子与外源基因嵌合，构建表达载体，转化植物来阻断花粉发育的过程从而达到雄性不育的目的(张爱民等，2000，中国科学基金3，132-136；Clarke et al.，1991，Plant Cell 3，431-433)。例如利用绒毡层特异启动子在作物花药中表达Barnase基因(汪迎春等，2000，生物工程进展3，132-136；Mascarenhas，1990，Annu.Rev.Plant Physiol.Mol.Biol.41，317-338)，破坏花粉绒毡层；转化与致病性相关基因破坏胼砥质壁(Curtis et al.，1996，Plant Science 113，113-119)以及利用反义基因技术转化绒毡层酶类基因(阎隆飞等，1999，科学通报 44，2471-2475；Meer et al.，1990，Plant Biol.15，95-109)等。但是，上述技术都存在着稳定性差，对温度敏感等缺点。

近年来，在植物减数分裂研究中取得了较大进展。Ming等人(Ming Y et al.，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，11416-11421)证实了拟南芥中ASK1基因的缺失会使花粉母细胞在减数分裂过程中同源染色体异常分离，最后导致花粉败育，从客观上造成了植株的雄性不育，然而该基因的缺失并不影响到大孢子的发育。该基因在包括拟南芥在内的生物中属于同一个基因家族skp1，其编码蛋白参与了多种生物中泛素蛋白连接酶复合体E3的形成(Feldman et al.，1997，Cell 91，221-230；Skowyra et al.，1997，Cell 91，209-219)。

RNA干扰(RNAi)技术是近年来兴起的一种用于研究基因功能的有效手段，其主要原理在于利用在生物体内掺入或表达双链RNA(ds-RNA)，使生物体内内源的与双链RNA核苷酸序列同源的特异mRNA降解，从而获得目的基因功能缺失(loss-of-function)后的表型(Scott et al.，2001，Nature 2，110-119；Phillip，2001，Genes &Development 15，485-490；Bryan，2002，Nature Immunology 3，597-599；Fagard etal.，2000，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol 51，167-194)。该技术与筛选插入失活(gene knock-out)的突变体相比，具有简便易行，工作量小的特点；而与单纯表达反义RNA相比，又具有对目的基因表达抑制显著，获得的转化个体往往可以呈现出与突变体一致的表型。

发明内容

本发明的目的是提供一个与小麦花粉发育有关的基因的cDNA 3’端片段及其编码的多肽。

本发明所提供的与小麦花粉发育有关基因的cDNA片段命名为WSK1，是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)编码序列表中SEQ ID №：2多肽序列的多核苷酸；

3)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。

4)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列的非编码区具有80％以上同源性的DNA序列。

与小麦花粉发育有关的蛋白WSK1，是包含序列表中序列2氨基酸序列的多肽，或者是将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的多肽。

序列表中序列1的DNA序列由528个碱基组成，其中前面的第3～236个碱基编码序列表中序列2的多肽，序列2由78个氨基酸组成。序列1的237位以后的292个碱基为该cDNA的非编码区。含有序列表中SEQ ID №：1的质粒及细胞系均属于本发明的保护范围。

本发明的第二个目的是提供一种利用RNAi技术获得雄性不育小麦中所应用的新质粒。

本发明所提供的质粒为RNAi双元表达载体，含有玉米泛素蛋白(Ubiquitin)基因的启动子、WSK1正义序列-内含子-WSK1反义序列、终止子。

为了使转化体便于筛选，所述质粒上还含有抗生素筛选标记和/或报告基因。

本发明的第三个目的是提供一种有效、方便地获得雄性不育小麦的方法。

一种获得雄性不育小麦的方法，是将RNAi双元表达载体经农杆菌介导，T-DNA插入并整合到小麦染色体上，获得转化体。

所述RNAi双元表达载体含有玉米泛素蛋白基因的启动子、WSK1正义序列-内含子-WSK1反义序列、终止子。

用本发明的方法，当RNAi表达载体经农杆菌介导，T-DNA插入并整合到小麦染色体上之后，小麦体内可稳定的产生与WSK1序列一致的ds-RNA，从而引导植物固有的转录后基因沉默(PTGS，Post-Transcriptional Gene Silencing)，使小麦内源编码WSK1的mRNA降解，得到由于减数分裂异常而造成的可稳定遗传的小麦雄性不育突变体。在培育小麦育种必需的不育品系中将得到广泛应用。

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述。

附图说明

图1为RNAi植物表达载体的结构图谱

具体实施方式

本发明的试验材料均为冬小麦京冬一号。

实施例1.WSK1cDNA片段的克隆

以温室种植的小麦京冬1号(Triticum aestivum L. cv Jingdong No 1)为材料，待幼穗长2.1cm时，镜检显示生活史处于减数分裂期。取这一时期的小花为材料构建小麦减数分裂期cDNA文库。文库构建选用CLONTECH公司的SMART cDNA Library ConstructionKit(Catalog#：k1051-1)，按照试剂盒说明书进行。该试剂盒最终将双链cDNA插入在载体pTriplEx2之上。

利用已得到的W3712片段为探针在文库中做杂交筛选，得到3’完整的长度为528bp的cDNA片段，序列为序列表中的序列1。将此cDNA的基因命名为WSK1。

实施例2.RNAi植物表达载体的构建

利用已得到的WSKlcDNA序列，设计两条引物：引物I(5’- ATC GAT GGT ACC ACC TCAAGA ACT GGG ACG CCG A-3’)和引物II(5’- TCT AGA CTC GAG TAA ACA AGC AAA GCATTC CAC T-3’)并在这两条引物的5’端分别加上了ClaI/KpnI和XbaI/XhoI位点(划线部分)，以含有WSK1片段的质粒为模板按照以下反应程序进行PCR扩增：94℃ 4min；94℃ 1min，61℃ 30s，72℃ 1min，30个循环；72℃ 10min。

回收PCR产物后，经双酶切消化分别以正义和反义的方式插入到质粒pHANNIBAL的两个多克隆位点上。再用XhoI将包含有“正义-内含子-反义”结构的片段切下，插入中间载体pTriplEx2质粒的XhoI位点上，采用部分酶切的方法获得带有KpnI和SacI粘性末端的“WSK1正义-内含子-WSK1反义”片段，最终将此片断插入到玉米泛素蛋白启动子Ubi的下游，构建完成了Ubi∷sense-intron-antisense的植物表达载体，命名为pUNiwsk，结构图谱如图1所示。

实施例3、农杆菌介导的T-DNA转化

用电转化的方式将质粒pUNiwsk转入农杆菌EHA105，借助农杆菌转化小麦愈伤组织，经在含有潮霉素的培养基上筛选初步得到抗性愈伤组织，经在分化培养基上继代分化出组培苗，通过GUS报告基因检测得到小麦阳性苗，移栽后从中筛选到减数分裂异常、不结实的转化体。

                                 序列表

<160>2

<210>1

<211>528

<212>DNA

<213>小麦属小麦(Triticum aestivum L.)

<400>1

acctcaagaa ctgggacgcc gagttcgtca aggtcgacca ggccaccctc ttcgacccca     60

tcctggctgc caactacctg aacatcaagg ggctgctgga cctgacctgc cagactgttg    120

ctgacatgat caagggcaag accccagagg agatccgcaa gactttcaac atcaagaacg    180

actttacgcc cgaggaggag gaggagatcc gcagggagaa ccagtgggcc tttgagtaga    240

ggagcatcta ggcaggcgat gccgccgccg cgttgaatga acgaacaacg cttagtattc    300

gtcatgtctg catttcagcg ctcttcttta tgtctgtcgt aatgggttgt aattatcctg    360

gagtctatga ggtggtgtcg gtgaacatgt tcggtcagtg gttatgtttg cgacaacaag    420

aaaaacctat cgtggtcagt ggtcatcact tgtcaaactg aatcttaatc gtcaagtgga    480

atgctttgct tgtttaccaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa                 528

<210>2

<211>78

<212>PRT

<213>小麦属小麦(Triticum aestivum L.)

<400>2

Leu Lys Asn Trp Asp Ala Glu Phe Val Lys Val Asp Gln Ala Thr

 1              5                   10                  15

Leu Phe Asp Pro Ile Leu Ala Ala Asn Tyr Leu Asn Ile Lys Gly

                20                  25                  30

Leu Leu Asp Leu Thr Cys Gln Thr Val Ala Asp Met Ile Lys Gly

                35                  40                  45

Lys Thr Pro Glu Glu Ile Arg Lys Thr Phe Asn Ile Lys Asn Asp

                50                  55                  60

Phe Thr Pro Glu Glu Glu Glu Glu Ile Arg Arg Glu Asn Gln Trp

                65                  70                  75

Ala Phe Glu

        78

Claims (8)

1、与小麦花粉发育有关基因的cDNA片段WSK1，是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)编码序列表中SEQ ID №：2多肽序列的多核苷酸；

3)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。

4)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列的非编码区具有80％以上同源性的DNA序列。

2、根据权利要求1所述的cDNA片段，其特征在于：所述与小麦花粉发育有关的基因WSK1之cDNA片段是序列表中序列1的DNA序列。

3、与小麦花粉发育有关的蛋白WSK1，是包含序列表中序列2氨基酸残基序列的多肽，或者是将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的包含由序列2衍生的多肽。

4、根据权利要求3所述的多肽，其特征在于：它是包含序列表中序列2氨基酸残基序列的多肽。

5、含有权利要求1所述cDNA片段的表达载体pUNiwsk。

6、根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于：所述载体为RNAi双元表达载体，含有玉米泛素蛋白基因启动子、WSK1正义序列-内含子-WSK1反义序列、终止子。

7、一种获得雄性不育小麦的方法，是将RNAi双元表达载体pUNiwsk经农杆菌介导，T-DNA插入并整合到小麦染色体上，获得转化体。

8、含有权利要求3所述基因的细胞系。