CN103290026B - 一种诱导植物雄性不育的线粒体基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种能诱导植物雄性不育线粒体基因orf1471及其应用。该雄性不育线粒体基因全长408bp，该基因经花药特异启动子驱动、线粒体导肽引导，在植物线粒体中表达后能导致植物花粉败育，因而还提供利用所述雄性不育线粒体基因创制花粉败育的方法及其植物遗传转化载体。
Description
技术领域
本发明涉及遗传工程领域，具体涉及一种能诱导植物雄性不育的线粒体基因及其应用。
背景技术
植物细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterility, CMS）是指花粉败育，不能完成授粉受精的一种母性遗传现象，在自然界中广泛存在，是杂种优势利用的重要途径之一。玉米、水稻、高粱、油菜等重要农作物广泛利用杂种优势取得了巨大的社会效益和经济效益，是二十世纪农业科学最重要的成就之一。
小麦作为世界和我国最重要的粮食作物之一，也和其它作物一样具有明显的杂种优势，经过半个多世纪的努力探索，已形成了多途径利用杂种优势的研究格局，但目前优良的杂交小麦亲本匮乏，强优势组合选配难度大，生产成本高、经济效益不明显，以致杂交小麦至今未能在生产上大面积应用。小麦属细胞核可与山羊草属、黑麦属、冰草属等许多细胞质互作产生雄性不育性，其中研究得最多最深入的是具有提莫菲维小麦（Tritium timopheevi）细胞质的T型不育系、粘果山羊草（Aegilops kotschyi）细胞质的K型不育系、易变山羊草（Aegilops variabilis）和偏凸山羊草（Aegilops ventricosa）细胞质的V型不育系的利用。T型不育系因其恢复源窄、恢复度不高、不育系种子皱瘪等至今未能大面积用于生产。而K型和V型不育系具有恢复源广、恢复度高、不育系种子饱满等特点，被认为是极具利用价值的小麦雄性不育资源。自1987年西北农业大学成功育成小麦K型不育系并实现“三系配套”以来，其杂种在生产上已有小面积的推广应用。对玉米、水稻、油菜等的研究表明，细胞质雄性不育性是由于线粒体基因组特异的orf（open reading frame）导致的。有研究发现小麦T型CMS是由cox1上游的orf256导致的，但一粒小麦、大麦、黑麦及多种山羊草的小麦异质材料都具有orf256。一些学者对小麦K型雄性不育与线粒体DNA（mtDNA）的关系的研究发现，K型不育系及相应保持系在mtDNA上表现出差异。如atpA、atp9、coxII、cob等线粒体功能基因在不育系和保持系之间有组织结构上的差异，但由于不育系与保持系间mtDNA差异甚大，难以确定究竟哪些差异与雄性不育有关。
到目前为止，小麦细胞质雄性不育因子还没有被鉴定出来。
发明内容
在前人的研究基础上，本发明人分别测定了小麦细胞质雄性不育系豫麦3号（Ks3）和相应保持系豫麦3号（Km3）的线粒体基因组序列（Genebank登录号分别为GU985444，EU534409），并进行了比较，发现不育系和保持系的线粒体基因组之间有较大差异，不育系有一些特异的开放阅读框（orf），这些orf可能是导致不育系花粉败育的候选基因。经表达分析、共转录分析和遗传转化拟南芥的结果分析发现，只有orf1471能诱导拟南芥植株的花粉败育。
本发明的目的是提供一种能诱导植物雄性不育的线粒体基因，该基因能导致植物花粉败育。
本发明所提供的基因来源于普通小麦K型细胞质雄性不育系豫麦3号，是具有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列组成的基因。SEQ ID No.1所示的DNA长度为408bp, 是线粒体基因，命名为orf1471，编码136个氨基酸残基的蛋白质。
本发明还提供扩增上述基因全长的引物对，所述引物对中，正向引物的序列为SEQ ID No.2所示，反向引物的序列为SEQ ID No.3所示。
本发明还提供包含所述基因的表达载体，所述基因可操作连接于花药特异启动子。将所述的表达载体转化到植物中，并筛出花粉败育的植株。优选地，所述植物为小麦。
本发明提供的小麦细胞质雄性不育相关线粒体基因在小麦雄性不育系和F1代植株中表达，而在保持系和恢复系中不表达。利用基因工程技术将其遗传转化到双子叶植物拟南芥中，能导致拟南芥转基因植株的花粉败育。因此，利用orf1471能创制雄性不育材料，这为小麦的杂种优势利用提供了有价值的材料，对小麦的遗传改良具有重要意义。
附图说明
图1为orf1471基因在不同小麦材料中的表达模式，DNA分子量标准从下往上的条带分别为200、500、800、1200、2000、3000和4500bp。
图2为orf1471基因在不同小麦材料中的共转录情况，从左至右上样顺序为：粘果山羊草，保持系，不育系，F1代，恢复系。
图3（1）和图3（2）为双子叶植物双元表达载体的构建流程。
图4为拟南芥转基因植株的PCR和RT-PCR鉴定结果，其中，A为PCR鉴定结果，从左至右上样顺序为：阴性对照、转基因株系1471-1、1471-2；B为RT-PCR鉴定结果，从左至右上样顺序为：阴性对照、转基因株系1471-1的叶、花、整株、1471-2的叶、花、整株。
图5为转基因拟南芥花和果荚的表型观察结果，CK为野生型拟南芥、1471-1和1471-2分别为不同的转基因株系。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 小麦K型细胞质雄性不育相关线粒体基因orf1471的获得
1. 小麦K型细胞质雄性不育系线粒体基因orf1471的分离，具体包括如下步骤：
（1）将小麦K型细胞质雄性不育系豫麦3号（Tritium aestivum L.）的种子（购自河南省农业科学院）浸泡于1%次氯酸钠溶液中消毒20分钟后，用无菌水洗三遍，播于1/2 MS固体培养基（SIGMA产品，调pH5.8）上，在22℃、16小时／8小时（光/暗）条件下培养14天后，取幼苗洗净吸干，用液氮速冻，保存于-80℃冰箱用于总RNA的提取。
（2）用Trizol法（Trizol购于天根公司）提取步骤（1）保存的小麦植株的总RNA，经DNA酶Ⅰ处理后备用。
（3）用随机引物（TAKARA公司产品）和MMLV反转录酶（Promega公司产品）将步骤（2）的总RNA反转录成cDNA。反应体系及参数为：总RNA 2μg，随机引物（10μM）1.25μl，5×MMLV RT Buffer 5μl，dNTP(各10mM) 1.25μl，RNase Inhibitor (40 U/μl) 1μl， MMLV逆转录酶 (200U/μl) 1μl，DEPC水补至25μl，瞬时离心，37℃ 60min，70℃ 15 min灭活逆转录酶。程序结束后将cDNA立即置于冰上冷却或存于-20℃备用。
（4）根据已测序小麦K型细胞质雄性不育系豫麦3号的线粒体基因组序列（Genebank登录号：GU985444）预测的orf1471设计基因特异引物，引物序列为SEQ ID No.2所示（正向引物）和SEQ ID No.3所示（反向引物），以上述步骤（3）所得cDNA为模板，用PCR方法扩增得到orf1471基因全长序列。PCR反应体系为：ddH2O 8.3μl，2×GC Buffer 12.5μl，dNTPs (各10mM) 1.0μl，正向引物 1.0μl，反向引物 1.0μl，cDNA 1.0μl，LA Taq 0.2μl。PCR扩增程序为：95℃预变性3min, [ 95℃ 30s, 55℃ 30s，72℃ 45s]×35个循环，72℃延伸10min。PCR产物经纯化回收后，克隆到T载体（Promega公司产品）中，挑阳性克隆送到北京诺赛基因公司测序，得到如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。该序列长度为408bp, 编码136个氨基酸残基的蛋白质。
2. orf1471在不同小麦材料中的表达模式
（1）将不育系豫麦3号、相应保持系豫麦3号、恢复系豫麦2号（R）、不育系与恢复系的杂交F1代及粘果山羊草的种子秋播于实验农场，覆膜防冻害。于第二年春天抽穗期（花粉发育时期为单核至二核期）取样至冰上剥取穗子中部7-8个小穗的花药，液氮速冻后，存于-80℃冰箱用于总RNA的提取。
（2）按步骤1中的（2）和（3）方法提取小麦材料RNA并反转录成cDNA后备用。
（3）以上述cDNA为模板，用orf1471基因的正向引物和反向引物引导，进行PCR扩增反应。反应体系为：2×PCR Taq mix （北京康为世纪生物科技有限公司产品）10μl，正向引物和反向引物(各10μM) 1.0μl， cDNA 1.0μl，ddH2O 8μl。PCR扩增程序为：95℃预变性3min, [ 95℃ 30s, 55℃ 30s，72℃ 45s]×30个循环，72℃延伸5min。以小麦tubulin基因为参照基因（Genebank登录号：DQ435659），其引物序列为：正向引物5’- ACCGCCAGCTCTTCCACCCT-3’，反向引物5’- TCACTGGGGCATAGGAGGAA-3’，PCR反应体系同上，PCR扩增程序为95℃预变性3min, [ 95℃ 30s, 55℃ 30s，72℃ 45s]×25个循环，72℃延伸5min。结果如图1所示，在所有检测的小麦材料中，tubulin基因都能扩增出强弱比较一致的目的带，而orf1471基因只在不育系和F1代花药中扩增出目的带，说明orf1471基因只在不育系和F1代中表达。这跟orf1471基因是不育系特有的基因组测序结果一致。
3. orf1471在不同小麦材料中的共转录情况
利用Northern blot方法检测orf1471基因的共转录情况，具体包括以下步骤：
（1）按上述方法分别提取不育系、保持系、恢复系、F1代及粘果山羊草花药的总RNA；
（2）按常规方法将各材料的RNA进行琼脂糖甲醛变性胶电泳，转膜及烤膜固定，orf1471探针的制备采用Promega公司标记试剂盒Prime-a-Gene Labeling System（货号U1100)，预杂交和杂交用磷酸钠缓冲液配置的杂交液，65℃杂交过夜后，洗膜、压片，最后进行图像扫描保存。结果如图2所示，不育系有一条1900bp和一条500bp的带，F1代只有一条1900bp的带，且比不育系的弱，而保持系和恢复系各有一条1800bp和1300bp的带，粘果山羊草有1800、1300、1000bp三条带，说明orf1471基因在不育系和F1代材料中的转录情况不同于保持系、恢复系和粘果山羊草，F1代材料中因恢复基因的作用其1900bp的带比不育系中的弱，且未出现500bp的带。
实施例2 不育相关基因orf1471的功能
1. 双子叶植物双元表达载体的构建
（1）拟南芥花药特异性启动子A9 启动子的扩增
首先提取拟南芥花组织的DNA（采用北京天根生化科技有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒，货号DP320）, 经分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测后，稀释成浓度为100 ng/μl备用。其次根据拟南芥花药特异性启动子A9序列（Genebank登录号：X61750）设计特异引物，使上下游引物分别带有HindⅢ和PstⅠ酶切位点（A9F: 5’-AAGCTTTATGTTAACCACTAATCAAGCA -3’ HindⅢ，A9R: 5’-CTGCAGTCTAATTAGATACTATATTGTTTGTTTGTACTT-3’ PstⅠ），以拟南芥花药DNA为模板，进行PCR扩增。PCR产物经回收、连接于pMD18-T Vector（TAKARA试剂盒）后送北京诺赛基因公司测序。将测序正确的质粒A9-T及中间载体pBluescriptSK质粒经HindⅢ和PstⅠ酶切后，回收相应片段，连接转化；菌落PCR鉴定为阳性克隆的提取质粒，进一步作酶切鉴定，将鉴定正确的质粒pBluescriptSK-A9保存待用。
（2）酵母线粒体基因coxⅣ导肽编码序列的扩增
根据酵母线粒体基因coxⅣ的序列（Genebank登录号：X01418）设计特异引物，使上下游引物分别带有PstⅠ和SpeⅠ酶切位点（coxF: 5’-CTGCAGATGCTTTCACTACGTCAATCTATAAGAT -3’ PstⅠ，coxR: 5’-ACTAGTACCCTCTTTAGCACCAGGACC- 3’ SpeⅠ），以酵母菌株EGY48的菌液为模板，进行PCR扩增。PCR产物经回收、连接于pMD18-T Vector后送北京诺赛基因公司测序。将测序正确的质粒coxⅣ-T及连有A9启动子的中间载体pBluescriptSK-A9质粒经PstⅠ和SpeⅠ酶切后，回收相应片段，连接转化；菌落PCR鉴定为阳性克隆的提取质粒，进一步作酶切鉴定，将鉴定正确的质粒命名为pBluescriptSK-A9- coxⅣ保存待用。
（3）双子叶植物双元表达载体的构建
将orf1471基因的上下游引物分别加上XbaⅠ和SacⅠ酶切位点（1471F’：5’-AACTCTAGAGTGCTTCTCAATCGTTCCAGTCCCA-3’ XbaⅠ，1471R’：5’-AACGAGCTCTAATAGACGAAAGAACGATAGGGAG-3’ SacⅠ），以orf1471全长T载体质粒为模板，进行PCR扩增。PCR产物经回收、连接于pMD18-T Vector后送北京诺赛基因公司测序。将测序正确的质粒orf1471-T和双元表达载体pCAMBIA1300-35S–GFP4（简称p1300-GFP）质粒经XbaⅠ和SacⅠ酶切后，回收相应片段，连接转化；菌落PCR鉴定为阳性克隆的提取质粒，进一步作酶切鉴定，将鉴定正确的质粒p1300-GFP-orf1471保存待用。
将质粒p1300-GFP-orf1471经HindⅢ和XbaⅠ酶切，质粒pBluescriptSK-A9-coxⅣ经HindⅢ和SpeⅠ酶切后，回收相应片段，连接转化；菌落PCR鉴定为阳性克隆的提取质粒，送北京诺赛基因公司进行测序，测序正确的菌提取质粒命名为p1300-A9-coxⅣ-orf1471，保存待用。
双子叶植物双元表达载体构建流程如图3所示。
双子叶植物双元表达载体转化农杆菌
（1）农杆菌感受态细胞的制备
挑取根癌农杆菌GV3101单菌落接种于3ml 的新鲜YEB液体培养基中，28℃振荡培养过夜；按1：10的比例接种于50ml YEB（利福平Rif 60mg/L）的培养基中扩大培养，28℃继续培养至OD600=0.4-0.6。将菌液置于冰上。5,000rpm，4℃离心5min，弃上清，将菌体悬于10ml 0.15 mol/L NaCl中。5,000rpm, 4℃离心5min，弃上清。菌体用1ml 预冷的20 mmol/L CaCl2（4℃）轻轻悬浮细胞，每管200μl，加入终浓度为20%的无菌甘油，液氮中速冻1分钟，置-70℃保存备用。
（2）转化农杆菌
将10μl构建好的质粒DNA（p1300-A9-coxⅣ-orf1471）加入200μl 农杆菌感受态细胞中，混匀；冰浴30min，液氮迅速冷冻3-5min，37℃水浴5min；加入1ml YEB培养基，28℃振荡培养4h；5000rpm离心3min，弃去部分上清，重新悬浮细胞，涂布于YEB（Kan 50mg/L 和Rif 60mg/L）培养基上，28℃培养2-3天。
（3）重组农杆菌鉴定
挑取转化平板上长出的单菌落，接种于YEB（Kan 50mg/L 和Rif 60mg/L）液体培养基中，28℃振荡培养过夜。取2μl过夜菌液作为模板进行PCR，引物为原来相应的引物组合。
PCR反应体系（25μl）为：ddH2O 7.3μl，2×GC Buffer Ⅰ12.5μl，dNTPs 1.0μl，正向引物 1.0μl，反向引物 1.0μl，菌液 2.0μl，LA Taq 0.2μl。PCR扩增程序为：95℃预变性5min, [ 95℃ 30s, 56℃ 30s，72℃ 1min]×35个循环，72℃延伸10min。菌落PCR鉴定为阳性的克隆保存备用。
拟南芥的转化及筛选
（1）拟南芥植株的培养
首先取约100μl的拟南芥哥伦比亚野生型种子置于2ml 的无菌离心管中，加入1ml 无菌水，表面浸润2min，吸弃上清；加入1ml 70%乙醇，重悬种子，表面消毒1min,，小心吸弃乙醇，加入1ml 无菌水，重悬种子，吸弃上清(水洗重复3次)；加入1ml 20%花王漂白水，重悬种子，深度消毒10min, 10000rpm 离心1min，小心吸弃花王漂白水，用无菌水重悬种子，冲洗3次以上；用无菌水重悬种子，用移液器移至MS培养基上，均匀平铺，4℃春化3d；移至培养室，23℃，16h/8h（光/暗）条件培养；10天后，当幼苗长出2-4片真叶时，移栽到盆中（蛭石：营养土＝2：1）中继续培养，培养条件为：22-23℃，16h/8h（光/暗）培养。拟南芥生长大约2周后进入花期，待其抽苔至10-15cm，形成1-2个角果时，即可用于转化，此时花蕾状态最佳；转化前将角果及已完全开放的花蕾剪去，仅留下刚刚露白及幼嫩的花蕾。
（2）农杆菌培养
接种单个菌落于5ml YEB（Kan 50mg/L 和Rif 60mg/L）培养基中，过夜培养后，按1：1000接种到200ml YEB的锥形瓶中，继续培养10-12h，当菌液生长至OD600值为1.0左右时，5000g离心15min收集菌体，用转化介质悬浮菌体至OD600值为0.7-0.8。转化介质成分为：1/2 MS培养基，5%蔗糖，0.03% SilwetL-77，pH5.7（KOH调）。
（3）农杆菌介导的拟南芥转化
采用浸花法转化拟南芥（Clough SJ, 1998）：将含有农杆菌的转化介质倒入200ml烧杯中，将上述带有花蕾的拟南芥倒置其上，使整个花序都进入转化介质，浸泡30s后取出拟南芥，将叶、茎、花上多余的水珠抖落，侧卧放在干净的塑料盆中，并用薄膜覆盖避光保湿培养24h。揭开薄膜，将拟南芥置于光下，用水浇透后，正常培养。转化后植株正常生长、开花、结果，2-3周后，待角果完全枯黄、欲开裂时，即可收获种子。种子储存在2ml的离心管中，常温短期保存，或于4℃，-20℃长期保存。
（4）拟南芥转基因植株筛选
将转化后的种子消毒后播种在含有Hyg 20μg/ml的MS培养基上，4℃春化3天，然后正常光照培养。约10天后即可辨认出转入外源基因的拟南芥幼苗（T1代）。由于双元载体上具有Hyg抗性位点，所以抗性苗子叶为绿色，下胚轴较长，并长出4片真叶；而非转化体没有抗性，只有2片真叶。移栽出抗性植株，继续培养，收取T2代种子。将T2代种子播种在含Hyg 20μg/ml的培养基上继续筛选，根据其后代（T2代）的分离比，可以判定是否为纯合体和外源基因插入的拷贝数。选取单基因插入的转基因植株移栽，单株收取种子（T3代），继续在含Hyg 20μg/ml的培养基上筛选，后代不发生分离（全为绿苗）的即为纯合体。
（5）拟南芥转基因植株的鉴定
对上述筛选出的T1代、T2代拟南芥阳性植株，按常规方法小量提取其基因组DNA，取1μl基因组DNA为模板，用引物对（SEQ ID No.2所示和SEQ ID No.3所示），通过常规PCR扩增，以野生型拟南芥基因组DNA为对照，进一步检测阳性植株。同时还对T3代转基因植株小量提取RNA，进行RT-PCR检测转基因的表达情况，以野生型拟南芥RNA为对照。结果如图4所示，绝大部分潮霉素抗性苗为转基因阳性植株，且能正常表达orf1471基因。
（6）转基因拟南芥表型观测
首先进行花的表型观测：以一朵花为单位，在洁净的载玻片上滴一滴ddH2O，将转基因拟南芥的花粉抖落到水滴上，由于水的表面张力，花粉会滑落至水滴边缘，在普通光学显微镜下观察转基因拟南芥花粉形状有无异常，以野生型拟南芥花粉作为对照组，统计花粉畸形比例。对于形状出现异常的转基因拟南芥的花粉进一步进行染色观察，选用甲苯胺蓝对花粉进行染色，甲苯胺蓝是一种碱性染料，对被染色样品的着色深浅与染色时间密切相关。
其次进行果荚的表型观测：以拟南芥单株为单位，对转基因拟南芥的果荚进行观察，以野生型拟南芥果荚作为对照组，统计果荚畸形比例。结果如图5所示，相较于野生型拟南芥，部分转基因植株的花粉粒明显畸形，花粉畸形的比例为30%以上，且果荚空瘪没有饱满的种子。说明转基因拟南芥植株发生了花粉败育现象，来自小麦的不育相关线粒体基因orf1471能导致拟南芥植株的花粉败育。
<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120>一种诱导植物雄性不育的线粒体基因及其应用
<160> 3
<210> 1
<211> 408
<212> DNA
<213>小麦属，普通小麦（TriticumaestivumL）
<400> 1
1 GTGCTTCTCA ATCGTTCCAG TCCCATCCTT GCGTCTCTCT CCCGGTCATG
51 CCGTCTTCTT CGAATCCTCC TTTACGATGG TGGTATTTTA GATAGCCTGA
101 AAGGCCCCGT CAGCGATAGA AGCAATGGGT TTTTTACTTG CGGTAGACTG
151 TACCTTTTTG ATTTATTTCT TACCAAGACT CTCTTCTACG GAATTCCTGG
201 CGTAACCCCC CGGAGGGCGT GCCCCGCAGG GCGTTTGTTC AACATAACAA
251 GAGCAGAGCT TCAAATCAGC TCATTTTCTT TCTCATGTAA AAATGGGTAC
301 TCCGCTGCTT TGTTTTTTCC TGAGGATACC AACTTAACCG ATGGAATGGA
351 ATGCATTCAT CATCGGTATG GATTTGATAC CAACTCCCTA TCGTTCTTTC
401 GTCTATTA
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<400> 2
GTGCTTCTCA ATCGTTCCAG T
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<400> 3
TAATAGACGA AAGAACGATA GGGAG
Claims (5)
1.一种植物雄性不育基因，其特征在于：所述基因是SEQ ID No.1所示核苷酸序列组成。
2.包含权利要求1所述基因的表达载体。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于：将权利要求1所述基因可操作连接于花药特异型启动子。
4.扩增权利要求1所述的基因的引物对，其特征在于：正向引物的序列为SEQ ID No.2所示，反向引物的序列为SEQ ID No.3所示。
5.根据权利要求1所述的基因在植物中导致花粉败育的应用，其特征在于：将权利要求3所述的表达载体转化到植物中，并筛出花粉败育的植株；所述植物是小麦。
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