CN1520882A - 新型溶栓剂kgd-尿激酶原嵌合体，其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新型溶栓剂含KGD序列与尿激酶原的嵌合体及其制备方法与应用。该嵌合体是通过基因工程方法，将以KGD为保守序列的短肽，嵌合于野生型尿激酶原基因。其制备方法包括1.构建嵌合KGD序列的KGD－尿激酶原基因，转染昆虫细胞；2.昆虫细胞的培养与KGD－尿酶原基因在昆虫细胞中的表达；3.KGD－尿激酶原嵌合基因表达产物的分离纯化与鉴定；4.KGD－尿激酶原嵌合重组蛋白生物学活性测定。本发明的嵌合体为一种具有溶栓、抗栓及血小板纤维蛋白原受体专一性的新型多功能溶栓制剂，具有广阔的临床应用前景。

Description

新型溶栓剂KGD-尿激酶原嵌合体，其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更确切地说利用基因工程技术制备新型溶栓剂KGD-尿激酶原嵌合体，其制备方法及应用。

背景技术

心脑血管疾病已经成为现代社会严重危害人类身体健康的一类疾病。包括高血压，冠心病，心肌梗塞，脑血栓等等。血栓的非正常性形成一直是致病的重要原因之一。在治疗这类疾病的过程中，人类一直都在从预防和治疗两个方面努力，把追求更高效、专一、便于大量生产的各类抗栓、溶栓药剂作为防治该类疾病的最佳途径。血栓在血液循环系统中的非正常形成往往是导致此类疾病的直接原因，因此有效地清除堵塞血管的病理性血栓，疏通血管，恢复缺血组织正常的血液流通，实现对组织正常的营养、氧气供应，成为治疗的关键。这对溶栓剂的品质提出了很高的要求，也是科学界，医疗界关注的焦点。目前的治疗主要包括两个方面：手术治疗及药物治疗。作为常规的治疗手段，选用良好的药物一直是治疗方案的首选。药物治疗即采用能够促使血栓溶解的药物实现堵塞血管的再通。目前从临床医疗上看，最行之有效的是纤溶酶原激活剂。纤溶酶原激活剂种类多，有内源性与外源性。目前国内使用最普遍的溶栓剂—尿激酶，属于尿型纤溶酶原激活剂，用于溶解病人体内血管中形成的栓塞组织，再通血管。但在长期医疗实践中发现，此药具有较强的副作用，对血栓的溶解没有选择性，常引起肌体内非预见型的出血症状，增加了治疗的风险；并且此药在体内的半衰期为几分钟，作用时间短，使用后血管常常再次栓塞，重新形成血栓。与尿激酶可以一起划为第一代的纤溶酶原激活剂还有链激酶，它与尿激酶不同的是，它是从溶血性链球菌培养液中提取的；第二代溶栓剂主要是指后期研制开发的纤溶酶原激活剂，主要包括尿激酶原，组织性纤溶酶原激活剂，葡激酶，茴香酰化纤溶酶原链激酶激活剂复合物；随着基因工程科技的发展，人类又研制了基于上述某些溶栓制剂的一些突变体或衍生物，如尿激酶原某些定点突变体，组织性纤溶酶原激活剂衍生物等，有些已成功地应用于临床医疗中。新型复合多功能纤溶酶原激活剂作为溶栓制剂领域研制的前沿，是随着生命科学研究的深入，在了解了某些功能物质的作用机理后，基于现代基因工程及蛋白质工程技术设计研制的。

源自天然蛇毒毒素的去整合素是高效的血小板整合素GPIIb/IIIa的拮抗剂，能与纤维蛋白原竞争性地结合GPIIb/IIIa受体，从而抑制血小板-纤维蛋白原与血小板-血小板之间的相互作用，抑制血小板在血管壁上的粘附与聚集，抑制血栓的形成。此类多肽数目繁多，但它们都具有共同的结构特点与作用机制：(1)皆为短链多肽，分子量小，在10KD以下；(2)都具有共同的保守序列，构成多肽的功能位点。大多数情况为RGD序列(精氨酰—甘氨酰—天冬氨酰)，个别为KGD序列(赖氨酰—甘氨酰—天冬氨酰)。其中含KGD功能序列的去整合素多肽是血小板IIb/IIIa受体专一性的配体。(3)RGD/KGD序列一般都位于短链多肽的突环区顶端，常有β折叠支持，位于分子表面，亲水性较强；(4)多肽分子功能位点区域通常具有两对以上的二硫键，对活性位点区域构象变化有间接调节作用。研究表明，天然去整合素多肽均表现出很高的血小板聚集抑制活性，血小板聚集抑制IC50一般在10^-8～10^-9。含有RGD功能序列的去整合素多肽往往对多种整合素受体识别，不具有受体专一性；含有KGD功能序列的去整合素多肽只对血小板上GP IIb/IIIa受体具有较高的识别能力，根据测算，它们对血小板聚集抑制IC50为2×10^-8M左右，对其它相关种类整合素受体的血小板聚集抑制IC50 10^-6～10^-7M，识别能力一般相差上百倍。血小板细胞表面含量最为丰富的膜上糖蛋白即为GPIIb/IIIa，并且它在血小板参与血栓形成的过程中，起到了至关重要的作用。蛋白质结构分析表明，这种特殊性质与KGD功能序列中氨基端赖氨酸的侧链基因及伸展方向、与羧基端边侧氨基酸序列的分子结构及相互作用直接相关。我们设计将这一特性引入到溶栓制剂中，这不但将赋予溶栓制剂抗栓及受体专一性的特性，使溶栓制剂能富集于富含血小板成分的血栓附近，增强对血栓的溶解效率，降低对正常形成血栓的溶解也有帮助。同时，有助于预防血栓溶解后常发生的血管再栓塞现象。

迄今为止，国内外尚无任何一种分子，无论是来自天然，或者基因工程技术研制的，具备以上数种特性。所以该嵌合体蛋白质分子将极有希望直接用于溶栓治疗的临床医疗实践上，治病救人。并且可以作为一种特殊的血小板拮抗剂，应用在研究细胞表面受体之间及细胞与细胞外基质相互作用的血液生物学、细胞生物学及受体分子生物学等基础研究中。

以野生型尿激酶原为支架、嵌合KGD序列(赖氨酰-甘氨酰-天冬氨酰)的嵌合体蛋白质国内外文献未见报道，为一种新型溶栓蛋白质分子，不与已知其它功能相关蛋白质及多肽同源。

发明内容

为提供一种兼具溶栓，抗栓及受体专一性的新型溶栓制剂，本发明设计将功能性KGD多肽序列引入至尿激酶原分子的特定区域，组成尿激酶原与含KGD(赖氨酰-甘氨酰-天冬氨酰)序列的嵌合体，其中含KGD的序列为KGDW(赖氨酰-甘氨酰-天冬氨酰-色氨酰)四肽序列。本发明必备的溶栓剂具有如序列表中序列2所示的氨基酸序列。其基因序列为序列表中序列1所示的DNA序列。用于呈递含有KGD序列的位置位于尿激酶原分子Kringle区域的一个伸出分子表面的突环区。KGD序列嵌合位点是第138位氨基酸与第139位氨基酸之间。

我们选择尿激酶原作为支架载体蛋白是基于以下几点原因：(1)尿激酶原蛋白质分子大部分的NMR结构已经测定出来，可以比较清晰地了解尿激酶原分子的空间结构及溶液构象，确定合适的构象条件作为呈递外源肽序列的结构位点，并且，尿激酶原分子详细的结构测定数据可以用来对嵌合体进行同源模建及能量最小化计算，以确定嵌合体蛋白质的结构；(2)尿激酶原属于第二代溶栓剂，较之尿激酶而言，具有更好的作用特点：副作用小，具有选择性溶纤作用。这样，嵌合特异KGD序列的尿激酶原突变体不但具有纤维蛋白专一性，而且还具有血小板上纤维蛋白原受体专一性。双重的专一性有望大大提高尿激酶原作为溶栓剂的品质。所有这些将对嵌合特异KGD序列的尿激酶原突变体的研究十分有利。

本发明利用尿激酶原分子K区含KGD功能区域的相似性：一个伸向分子外的突环，两边由一对β-折叠片层支持，具有多对二硫键，亲水性及柔性较好。将源自天然去整合素功能位点区域的小肽序列，KGDW序列，插入至尿激酶原K区第126位至169位突环区的顶端：第138位氨基酸与139位氨基酸之间，构建一种新型重组嵌合蛋白质，发挥KGDW功能序列特性，同时保留尿激酶原原有的生物活性，制造一种新型、复合多功能的基因工程溶栓制剂。

本项研究开发的目的是结合含KGD序列天然蛇毒抗栓肽与尿激酶原蛋白质功能与结构特点，利用现代基因工程手段构建新型复合型溶解血栓的蛋白质分子，以用于血液生物学、药理学和临床医疗学的基础研究和实际临床应用中。利用基因工程技术制备出的KGD-尿激酶原功能蛋白质是一种兼具高效溶栓、抗栓及血小板受体专一性的多功能溶栓蛋白质，它的化学结构和性质证明它符合我们原定研究的目的。

尿激酶原Kringle区域第126位氨基酸至第169位氨基酸形成的一个伸展向外的突环结构与天然含KGDW序列的去整合素中KGD序列所处的构象条件相似，并且Kringle区域中突环结构远离尿激酶原分子酶活性中心，经过分子结构的模拟，最终确定在该突环结构的第138位嵌合KGDW(赖氨酰-甘氨酰-天冬氨酰-色氨酰)，该序列取自去整合素多肽BARBOURIN中，一种与血小板纤维蛋白原受体GP IIb/IIIa有很强亲和力与专一性的多肽，能表现较强抗栓活性的功能KGD序列。用于构建重组复合型溶栓蛋白质的模板基因为尿激酶原cDNA，它含有尿激酶原编码框与信号肽序列。所应用的基因工程方法为发明人自行设计的多步组合的PCR方法。包括以下步骤：

1.构建嵌合KGDW序列于设计位点的KGDW-尿激酶原基因。首先进行突变体蛋白质分子结构同源模建与结构优化(采用美国Insight功能计算包及SGI工作站)。通过PCR重叠延伸方法，以野生型尿激酶原基因为模板，进行PCR反应，分别合成DNA片段作为上游和下游DNA片段。利用上游DNA片段与下游DNA片段互补粘性区域，搭接扩增，再进行二次PCR反应，形成较大的DNA分子，PCR产物中含有上、下游DNA分子编码框。然后，将其克隆至载体，转化大肠杆菌，筛选并提取重组质粒，经酶切后，将小片段DNA连接入克隆有野生型尿激酶原cDNA的载体上，构建含有全长KGDW-尿激酶原基因的重组克隆载体。然后将KGDW-尿激酶原全长基因回收纯化，亚克隆至杆状病毒载体中，然后提取含有外源基因的重组杆状病毒DNA，将其转染入昆虫细胞Sf9。

2.昆虫细胞的培养与KGDW-尿酶原基因在昆虫细胞中的表达。KGDW-尿激酶原是一种新型基因工程重组多功能溶栓蛋白质，本发明首先对昆虫细胞Sf9系列进行无血清条件下的培养适应，获得能够在Sf900II型无血清无蛋白培养基中良好生长的昆虫细胞。本发明的嵌合体在宿主细胞昆虫细胞SF9中直接表达，并分泌至培养基中，为分泌型昆虫细胞表达体系，表达产物能够直接以可溶性的，活性构象形式存在于培养上清中。本发明采用昆虫细胞的培养及昆虫细胞瞬时表达技术生产KGDW-尿激酶原重组蛋白质。昆虫细胞类型为SF9，表达载体为杆状病毒BACMID，转染SF9昆虫细胞后培养获得KGDW-尿激酶原基因的昆虫细胞，以无蛋白培养基SF900II进行贴壁或者悬浮培养。培养过程中，温度恒定，空气湿度较高，通气良好，一般培养至第四天时，收集昆虫细胞培养基上清。重组KGD-尿激酶原基因编码框前有一段序列负责编码信号肽，辅助KGD-尿激酶原基因表达产物穿膜，分泌到细胞培养基上清液中。

3.KGD-尿激酶原嵌合基因表达产物的分离纯化与鉴定。从一级结构看，KGD-尿激酶原重组蛋白质基本上与野生型尿激酶原相同，仅在尿激酶原K区多出四个氨基酸残基；从高级结构看，根据KGD-尿激酶原重组蛋白质结构的同源模建结果，KGD-尿激酶原基本上保持了天然尿激酶原的立体空间结构。Western blotting分析及抗体中和抑制实验结果都表明，KGD-尿激酶原重组嵌合体分子保留了尿激酶原分子上的免疫决定簇结构，能够被抗尿激酶原抗体识别并结合。所以，利用这一特性，制备偶联尿激酶原抗体的亲和层析柱，对昆虫细胞中目的基因表达产物KGD-尿激酶原进行亲和层析纯化。首先用足够量的HCl洗涤凝胶，用布氏漏斗抽干，加入含有尿激酶原抗体的含NaHco₃，NaCl的溶液洗涤，再以NaHco₃缓冲溶液洗涤，封闭凝胶中未偶联抗体的活性基因。分别用NaAc，NaCl溶液以及Tvis-HCl，NaCl溶液充分洗涤，最后用磷酸缓冲溶液平衡凝胶柱，收集含有目的基因表达产物KGD-尿激酶原重组蛋白质的细胞培养上清溶液，离心，上清溶液过抗尿激酶抗体偶联的亲和吸附柱，与凝胶介质充分接触后，使用磷酸缓冲溶液以及盐酸-甘氨溶液洗涤，除去非特异吸附成分，然后用盐酸-甘氨溶液洗脱结合于抗体亲和柱中的目的基因表达产物KGD-尿激酶原重组蛋白质，收集洗脱液。根据上样量确定收集的洗脱溶液总体积，最后以Tris溶液中和。分别检测每个流出管中溶液的溶纤活性，绘制洗脱溶液的活力单位变化曲线。收集KGD-尿激酶原主要集中的部分洗脱溶液，透析浓缩后冷冻干燥，即为纯净的产品。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及质谱分析实验进行验证。

4.KGD-尿激酶原嵌合重组蛋白生物学活性测定。采用纤维蛋白平板法(溶解圈法)测定KGD-尿激酶原重组蛋白质纤溶酶原激活剂溶纤活性。在琼脂糖凝胶溶液中加入预热的纤维蛋白原和凝血酶溶液，混匀后倒板。待凝胶凝固后，打孔，在孔中先后加入不同稀释度的尿激酶原标准品以及已知浓度的被检样品溶液，在带盖的潮湿容器中37℃水浴，5～20小时左右观察，并测定溶解圈直径。以不同稀释度尿激酶原标准品产生的溶解圈直径大小为横坐标，以尿激酶原标准单位为纵坐标作图，计算被检样品中纤溶酶原激活剂活力单位数，并计算待测突变体蛋白比活。

采用血小板聚集抑制实验研究KGD-尿激酶原的抗栓活性。该方法为测定药剂抗栓活性的常规方法，为卫生部规定和国际通用，用光浊度计监测反应过程中溶液系中血小板聚集情况，透射光强度将随着血小板聚集率的下降而降低，用双蒸水溶解KGD-尿激酶原重组蛋白质，并配制不同浓度，用于监测对ADP刺激下血小板聚集的抑制情况。实验对照为不含任何多肽或蛋白质的双蒸水。整个反应过程用光浊度仪监测溶液透射光信号，并把光能转化为电信号，用笔描记录仪记录。

上述重组KGD-尿激酶原复合型多功能溶栓剂的化学结构不同于目前已知的所有天然溶栓以及国内外迄今为止已经研制成功及正在研究的基因工程溶栓剂。其特点如下：

1.KGD-尿激酶原嵌合体具有较强的纤溶酶原激活剂活性；

2.KGD-尿激酶原有较强的抑制血小板聚集活性；

3.以人源性尿激酶原分子为支架，尿激酶原全长为431氨基酸(包括20个氨基端信号肽序列)，KGDW四肽仅为功能活性位点，相对很短，所以KGD-尿激酶原嵌合体对人体而言，无免疫原性或很低；

4.通过基因工程方法制造，来源为昆虫细胞真核表达体系，保持了尿激酶原糖蛋白的性质，并能正确地进行表达蛋白质的折叠，以保持尿激酶原的纤溶活性及KGDW多肽的生物学性能。同时，KGD-尿激酶原的生产可以不受天然资源的限制，便于大量生产。昆虫细胞的培养相对来说，所需的培养条件较为简单，适合于大量培养。

5.整个过程不使用有毒物质，不污染环境。

KGDW-尿激酶原嵌合体同时兼具KGDW功能序列的活性及尿激酶原的溶栓活性。因为KGDW序列对血小板上参与血栓形成的糖蛋白受体GP IIb/IIIa的专一性识别，所以可以预见，相比于应用于临床上的尿激酶原而言，KGDW-尿激酶原具有血小板受体GP IIb/IIIa的导向性。因为梗塞血管的血栓(如位于心血管位置)含有较之正常血栓更多的血小板成分，所以KGD-尿激酶原嵌合体能够较多地富集于梗塞血管血栓附近，提高尿激酶原用于病人时的安全性，优化尿激酶原的溶栓效果，降低非预期性溶栓情况的发生，在临床上间接降低病人脑出血的危险。同时，KGDW功能序列的抗栓活性，可以降低治疗期间常发生的血管再栓塞风险，对保护病人的生命安全大大有利。本发明的KGDW-尿激酶原嵌合体可以作为最新一代溶栓制剂在基础研究和临床上使用。

附图说明

图1.嵌合KGD特异序列的尿激酶原突变体基因构建方法示意图。其中^****为Lys-Gly-Asp-Trp序列。

图2.为嵌合KGDW序列的KGD-尿激酶原基因测序图谱。序列显示完全符合预期设计。

图3.重组Bacmid DNA琼脂糖凝胶电泳(0.4％)图谱。泳道1，2为从含有重组Bacmid DNA的E.coli DH10BAC中提取的DNA；泳道3为λ/HindIIIDNA marker。

图4.(a)为正常状态的Sf9昆虫细胞，(b)为转染重组杆状病毒DNA后的Sf9昆虫细胞。

图5.纤维蛋白平板法测定KGDW-尿激酶原转染昆虫细胞72小时后细胞胞浆及培养基中蛋白质纤溶活性。A排为proUK标准品，A1、A2、A3、A4孔中所加的proUK量分别为2.0IU、1.0IU、0.5IU、0.2IU；B排为KGDW-proUK表达检测。其中1为培养基，2为细胞胞浆。

图6.转染72小时后昆虫细胞Sf9的SDS-PAGE分析。1为表达产物的Westem bloting分析。2泳道为昆虫细胞Sf9全蛋白；3泳道为培养基组分；4泳道为低分子量蛋白marker。

图7.纤维蛋白平板法测定不同时间(96～120小时)培养基的纤溶活性测定。其中1、2为120小时，3、4为96小时，上样量均为10μl，5、6、7为proUK标准品，0.5IU。

图8.重组病毒转染昆虫细胞后的不同培养时间里，采用纤维蛋白平板法测定KGDW-尿激酶原嵌合蛋白质表达产物的位置。A为培养基溶液的纤溶酶活性，B为昆虫细胞胞浆的纤溶酶活性。

图9.为利用偶联尿激酶原抗体的亲和层析柱分离纯化KGDW-尿激酶原嵌合蛋白质层析图谱，其中A峰为KGDW-尿激酶原所在峰。

图10.为SDS-PAGE检测纯化后的表达产物。其中1为低分子量蛋白marker；2为纯化后的KGDW-proUK蛋白质；3为Western-blotting检测纯化的KGDW-proUK蛋白质。

图11.在不同浓度KGDW-proUK下的血小板凝集率。A为0.9％NaCl溶液对照。B，C，D为不同浓度的KGDW-proUK(10⁵、2×10⁵、5×10⁵units/L)。

图12.在ADP(1μmol/L)诱导后，随着KGDW-proUK(B)或野生型proUK(A)浓度的增加，上层血浆中血小板凝集率的变化。

图13.在KGDW-proUK嵌合体作用下血小板凝集率随时间变化曲线图(A)0.9％NaCl为实验对照；(B)KGDW-proUK嵌合体(19.2μM)。

图14.不同样品的血小板凝集效果1.野生型proUK；2.突变体KGDW-proUK；3.0.9％NaCl溶液

图15.在ADP诱导下嵌合体的血小板凝集抑制作用。A为0.9％NaCl溶液对照；B为突变体嵌合蛋白IC50(9.6μM)，为半抑制血小板凝集强度时的抑制浓度。

具体实施方式

          实施例1.嵌合KGDW序列的KGDW-尿激酶原基因

                 的构建及对昆虫细胞Sf9的转染

实验材料：

菌株：E.coli DH5α，BL21(DE3)，JM109均为市售产品，PUC19-proUKcDNA为本室构建。昆虫杆状病毒表达系统Sf9( Spodoptera frugiperda-9)细胞和Sf21细胞购自美国Invitrogen公司。

引物：寡核苷酸引物DNA片段为北京赛百盛公司合成。引物1：5’CCCAAG CTT GAT ATC ATG A3’；引物2：5’GACAAGCGGCTTTA GCCAGTCCCCTTTGCCC ACCTGC ACATA 3’；引物3：5’CTA AAG CCG CTT GTC 3’；引物4：5’GTG GCG CTG ATC ACCC 3’。

化学试剂与酶类：常用限制性内切酶类、T4DNA连接酶、Klenow片段、T4DNA聚合酶、T4多核苷酸激酶、Taq DNA polymerase、RNase、ATP、dNTPs等购自Promega公司、New England Biolab公司、华美生物技术公司或Takara生物技术公司。DNA Wizard plus Miniprep DNA purification system购自Promega公司。超纯尿素、聚丙烯酰胺、甲叉聚丙烯酰胺及Tris均为上海生工进口分装(U.S.A)。二硫苏糖醇为Takara生物技术公司产品。昆虫细胞培养基为Gibco/BRL产品。人纤维蛋白原、凝血酶购自北京药物及生物制品检定所。硝酸纤维素膜购自北京华美生物技术公司。CNBr活化Sepharose凝胶及Sephadex G75凝胶购自瑞典Pharmacia Biotech公司。Amicon Centricon 30微量离心管为Millipore公司产品。其他化学试剂均为国产分析纯产品。尿激酶原标准品为本所自制。ADP为Sigma公司产品。

常用分子生物学溶液按《分子克隆》实验手册配制。

实验设备：SGI工作站、InsightII(ver2000)软件包：美国SGI公司产品；微量蛋白电泳仪、蛋白转膜电泳仪为Bio-Rad公司产品；Chrono-LOG双道检测仪为美国Col-parmer公司产品；

实验方法与结果：

1.突变体蛋白质分子结构同源模建与结构优化(计算机分子结构模建参见相应软件包及SGI工作站使用手册)

2.PCR重叠延伸方法：构建嵌合KGDW序列的KGD-尿激酶原基因，其路线图如图1所示。以野生型尿激酶原基因为模板，使用引物1和引物2进行PCR反应，合成DNA片段作为上游DNA片段；同样，以野生型尿激酶原基因为模板，使用引物3和引物4进行PCR反应，合成DNA片段作为下游DNA片段。利用上游DNA分子与下游DNA分子的互补粘性区域，搭接扩增，使用引物1和引物4进行二次PCR反应，PCR产物中含有上、下游DNA分子编码框。形成长约700bp的DNA分子。将其克隆至pMDT18载体，然后转化大肠杆菌，筛选重组克隆，经Bcl I/Hind III酶切，回收酶切小片段DNA，连接入克隆有野生型尿激酶原cDNA的pUC19载体，构建含有全长KGDW-尿激酶原基因的重组克隆载体pUC-KGDW-proUK。嵌合KGDW序列的尿激酶原基因测序图谱如图2所示。测序结果显示与设计完全一致。

3.克隆外源基因的杆状病毒重组表达载体的构建与筛选(参见Invitrogen公司BAC-TO-BAC表达系统实验手册)

4.外源基因对转座载体的克隆与筛选(参见Invitrogen公司BAC-TO-BAC表达系统实验手册)

5.杆状病毒DNA的分离纯化(参见Invitrogen公司BAC-TO-BAC表达系统实验手册)

6.外源基因转座入Bacmid。将构建的KGDW-尿激酶原基因克隆入含有同源重组位点区域的pFTBAC载体中，分别将1ng pFTBAC-KGDW-尿激酶原重组质粒DNA与100μl DH10BAC感受态细胞混匀，冰浴30分钟；42℃热休克45秒，加入900μl S.O.C.培养基，于37℃振摇培养4-6小时，分别取100μl 10^-1、10^-2、10^-3稀释的菌液涂于含有Tet、Kan、Gen、IPTG和X-gal的选择性检测平板上，37℃培养24-36小时。挑取白色单菌落，扩大培养后提取Bacmid DNA，电泳检测，如图3所示，分子量大于23kb的DNA即为重组杆状病毒DNA分子。

7.重组Bacmid DNA对昆虫细胞Sf9的转染。接种1×10⁶cells于35mm培养皿中或3×10⁶ cells于25cm²培养瓶中。取10μl重组Bacmid DNA于100μlSF-900II SFM培养基中，同样取6μl Cellfectin试剂(用前充分混匀)于100μlSF-900II SFM中稀释，将两种溶液轻轻混匀，室温放置15～45分钟。将Sf9细胞用SF-900II SFM洗两遍。加入800μl SF-900II SFM于lipid-DNA混合物中，轻轻混匀，加入培养皿或培养瓶中，于28℃培养箱中温育3～8小时。除去转染混合物，加入2ml SF-900II SFM(可加抗生素)，28℃温育。显微镜下观察Sf9细胞变化，如图4所示，转染前的细胞形态均一，细胞膜光滑，转染后细胞生长速度变缓，形状变大，细胞内折光性颗粒增多，透明度降低，有的细胞边缘模糊，甚至呈现破碎细胞形态，并可观察到细胞破碎后的残迹。

8.昆虫细胞Sf9的感染。将密度达到约80％(25cm2)的细胞吸去旧的培养基，加入5ml新鲜的培养基，再加入病毒贮液，调整MOI值(病毒感染指数，multiplicity of infection)，27℃保温1小时，去掉上清，加入新鲜的5ml培养基，27℃培养3～5天，分别收集上清和细胞，用于提取病毒DNA和细胞的总DNA。保存1ml病毒上清留作贮液。

     实施例2.转染KGDW-尿激酶原嵌合基因的昆虫细胞Sf9的

            培养及KGDW-尿激酶原嵌合蛋白的诱导表达

采用昆虫细胞分泌型表达方式生产KGD-尿激酶原嵌合蛋白。首先对昆虫细胞Sf9系列进行无血清条件下的培养适应，获得能够在Sf900II型无血清无蛋白培养基中良好生长的昆虫细胞，以Sf900II型SFM培养基进行昆虫细胞培养，以便于对目的基因表达产物的纯化。重组KGD-尿激酶原基因编码框前有一段序列负责编码信号肽，辅助KGD-尿激酶原基因表达产物穿膜，分泌到细胞培养基上清液中。

昆虫细胞的培养方式有两种：贴壁培养与悬浮培养。两种培养方式都可以较好地表达外源基因。昆虫细胞的培养要求恒温，在27±0.5℃范围内，培养环境温度较高，同时保证有足够的氧气供应。细胞互相接触达到80％左右时，应传代培养，细胞快速生长时，要适时更换或补充新鲜培养基。含有KGDW-尿激酶原嵌合基因的杆状病毒DNA转染昆虫细胞Sf9后，补充新鲜的Sf900II型培养基，继续在至27±0.5℃条件下培养。至第四至五天，取出细胞培养物，1000rpm离心，收获上清液，作为分离纯化目的基因表达产物的原液。重组蛋白表达条件的确定：对于不同生长状态或传代次数的昆虫细胞，收集MOI值(5或10)感染和感染后不同时间点(24、48、60、72、84、96小时)的无血清表达上清，根据适时的Western blotting蛋白印迹实验或纤维蛋白平板法测定纤溶活性(见图5)，以确定最佳收获期，确定表达产物达到最大量的时间，收集含有表达产物的培养基及培养细胞，获得KGD-尿激酶原重组蛋白的最大表达产量。SDS-PAGE及Western blotting结果见图6，所用SDS-PAGE凝胶浓度为12％，图5和图6结果表明表达72小时，KGDW-尿激酶原表达产物主要存在于昆虫细胞内，并且主要以单链全长分子形式存在。

Western blotting蛋白印迹分析表明目的基因诱导表达产物在第四天后大量存在于培养基上清液中。如图7所示。纤维蛋白平板测活法表明每毫升含尿激酶原活力单位在1000IU以上。在Sf9细胞中诱导表达并分泌至培养基上清中的目的基因表达产物不仅保留了尿激酶原抗体识别区域，而且保留了尿激酶原的溶栓活力。如图8所示。

          实施例3.KGDW-尿激酶原嵌合重组蛋白的分离纯化

从一级结构看，KGD-尿激酶原重组蛋白质基本上与野生型尿激酶原相同，仅在尿激酶原K区多出四个氨基酸残基；从高级结构看，根据KGD-尿激酶原重组蛋白质结构的同源模建结果，KGD-尿激酶原基本上保持了天然尿激酶原的立体空间结构。Western blotting分析及抗体中和抑制实验结果都表明，KGD-尿激酶原重组嵌合体分子保留了尿激酶原分子上的免疫决定簇结构，能够被抗尿激酶原抗体识别并结合。所以，利用这一特性，制备偶联尿激酶原抗体的亲和层析柱，对昆虫细胞中目的基因表达产物KGDW-尿激酶原进行亲和层析纯化。

用于制备亲和层析柱的介质为溴化氰活化的SepHarose 4B凝胶(瑞典pharmacia公司出品，fine Particle)，CNBr活化的Sepharose凝胶偶联抗尿激酶原抗体亲和层析柱的制备参见《分子克隆》第二版582-590页及相应产品实验手册。

首先用足够量的1mM HCl(100ml：1克干胶)洗涤15分钟，用布氏漏斗抽干凝胶，加入含有尿激酶原抗体的0.1M NaHco₃，0.5M NaCl，pH8.3溶液洗涤凝胶，再以0.1M NaHco₃，pH8.0缓冲溶液洗涤，封闭凝胶中未偶联抗体的活性基因，充分洗涤4小时后，分别用0.1M NaAc，pH4.0，0.5MNaCl溶液充分洗涤以及0.1M Tvis-HCl，pH8.3，0.5M NaCl溶液充分洗涤，如此反复3次，最后用1×磷酸缓冲溶液平衡柱子收集含有目的基因表达产物KGD-尿激酶原重组蛋白质的细胞培养上清溶液，2000g离心，离心后上清溶液过抗尿激酶抗体偶联的亲和吸附柱，与凝胶介质充分接触后，使用1×磷酸缓冲溶液洗涤柱子，再用0.2M，pH4.0盐酸-甘氨溶液洗涤，约5～10个柱床体积，除去非特异吸附成分，流速0.2～0.5ml/min，然后用0.2M，pH2.0盐酸-甘氨溶液洗涤柱子，洗脱结合于抗体亲和柱中的目的基因表达产物KGDW-尿激酶原重组蛋白质，流速0.2～0.5ml/min，收集洗脱液，每20滴一管，约0.5ml/管，根据上样量确定收集的洗脱溶液总体积，收集30管左右停止。最后以1M Tris溶液中和至pH7.0。分别检出每个流出管中溶液的溶纤活性，绘制洗脱溶液的活力单位变化曲线，见附图9，其中A峰所示即为KGDW-尿激酶原主要集中的洗脱溶液体积。收集该部分洗脱溶液，透析浓缩后冷冻干燥，即为纯净的产品。用上述方法得到的KGDW-尿激酶原用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为大小为50KD的一条主带(KGDW-尿激酶原嵌合体)及大小为约33KD的一条双带(嵌合体的降解产物)，如图10所示。

     实施例4.纤维蛋白平板法(溶解圈法)测定KGDW-尿激酶原

               重组蛋白质纤溶酶原激活剂溶纤活性

用磷酸缓冲液配制10mg/5ml一管的纤维蛋白原和10IU/0.1ml一管的凝血酶，37℃预热。同时，取5ml已降温至70～80℃琼脂糖凝胶溶液(1.4％浓度)，加入预热的纤维蛋白原和凝血酶溶液，混匀，迅速倒板，使混合液均匀铺展，避免气泡产生。待凝胶混合液凝固后，根据测定样品数目均匀等距打孔，先加入不同稀释度的尿激酶原标准品于孔中，并标记加样顺序，然后加入已知浓度的被检样品溶液，每孔10μl，加样后放入带盖的潮湿容器中置37℃水浴，5～20小时左右观察，并测定溶解圈直径。以不同稀释度尿激酶原标准品产生的溶解圈直径大小为横坐标，以尿激酶原标准单位为纵坐标做图，计算被检样品中纤溶酶原激活剂活力单位数，并计算待测突变体蛋白比活。如图13所示，实验结果表明，构建的嵌合KGDW序列的尿激酶原重组蛋白质具有较强的纤溶酶原激活剂活性，比活为80,000IU/mg，与天然尿激酶原纤溶比活100,000～120,000IU/mg相比，KGDW-尿激酶原嵌合蛋白较好地保留了尿激酶原本身的酶解活性。

     实施例5.血小板激活剂ADP刺激下的血小板聚集抑制实验

                研究KGDW-尿激酶原的抗栓活性

实验用富含血小板血浆(简称PRP，Platelet-rich Plasma)取自Wistar小鼠与兔。测定由北京医科大学药理学研究室进行，该方法为测定药剂抗栓活性的常规方法，为卫生部规定和国际通用，用光浊度计监测反应过程中溶液系中血小板聚集情况，透射光强度将随着血小板聚集率的下降面降低，用双蒸水溶解KGDW-尿激酶原重组蛋白质，并配制不同浓度，用于监测对ADP刺激下血小板聚集的抑制情况。

首先抽取5ml 3.8％的枸橼酸钠，然后取新鲜血液45ml混匀，注入到硅化的无菌离心管中，1000rpm离心15min，小心吸去上层血浆(PRP，PlateletRich Plasma)，计数血小板并调至3×10⁸个/ml。将剩余的血液以3000rpm离心20min，上层较为透明的即为PPP(Platelet Poor Plasma)。将PRP 300μl与缓冲液(对照)或待测样品加入测试管中，混匀，在37℃保温3min，加入搅拌磁棒，首先用PPP调节零点，之后将对照管(含PPP)和测试管放入测试孔中，在测试管中加入诱导剂ADP(终浓度为10μM)，开始搅拌，记录聚集波型，3min后结束记录，血小板聚集仪自动给出样品的最大聚集率。样品对血小板聚集的抑制率＝(对照的最大聚集率—样品的最大聚集率)/对照的最大聚集率×100％。IC50的测定是将不同浓度的样品与PRP37℃保温3min，加入诱导剂ADP(终浓度为10μM)，测定样品的最大聚集率。以抑制率对样品浓度作曲线，当抑制率达50％时待测样品的浓度为其IC50。

KGDW-尿激酶原蛋白质溶液与富含血小板血浆PRP混合，ADP是一种血小板刺激剂，能激活血小板上纤维蛋白原受体GP IIb/IIIa的活性构象，与细胞外基质中的受体配体结合，促使血小饭与血小板之间，血小板与细胞外基质之间发生相互作用与聚集。而拮抗整合素受体的行为会阻止血小板聚集现象的发生，因此表现出明显ADP刺激下的血小板聚集抑制效果。本文将其作为评价抗凝活性的一个重要参数。显示KGDW-尿激酶原对血小板聚集有相当强的抑制效果在体外实验状态下，KGDW-尿激酶原对ADP引起的血小板聚集速率有下降趋势。即血小板成分对刺激剂的应激性下降，这似乎与血小板上受体拮抗性有关。当以生理盐水作为实验对照，实验图谱如附图11(A)所示。以突变体蛋白质为检测样品，实验图谱如附图11(B，C，D)所示。从图中可以测定，当加入突变体蛋白质时，血小板聚集的速率减弱程度。突变体蛋白质的浓度对速度影响见附图12。尿激酶原对血小板聚集速率没有影响。在富含血小板溶液体系中，当加入突变体蛋白质时，ADP刺激下的血小板聚集程度明显下降，实验结果如附图13所示。天然尿激酶原纯品对血小板聚集影响不大，如附图14所示。以对照样品透射光强为100％，根据纯化的KGDW-尿激酶原突变体蛋白质产生的血小板聚集强度，估算突变体蛋白质达到最大半抑制时的浓度，如附图15所示。突变体蛋白质IC50。值约为9.6μM左右。作为对照的纯品天然尿激酶原则没有抑制作用。

血小板聚集主要是通过血小板上纤维蛋白原受体GPIIb/IIIa与细胞外基质的相互作用发生的，GPIIb/IIIa受体被强烈桔抗时，血小板与血小板之间、以及血小权与细胞外基质之间的相互作用被抑制。血小板聚集抑制实验间接地表明KGDW-尿激酶原具有与受体GPIIb/IIIa相互作用的能力。应当说，这一能力的表现是嵌合于尿激酶分子上的KGDW功能序列表现出来的。这也说明，KGDW-尿激酶原突变体蛋白质中的KGDW序列初步表现出它的功能活性构象，它在尿激酶原载体支架蛋白上得到了较好的结构呈递。研究符合预期主要目的。

                       序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所

<120>新型溶栓剂KGD-尿激酶原嵌合体，其制备方法及应用

<130>

<160>2

<170>PatentIn version3.1

<210>1

<211>1308

<212>DNA

<213>

<400>1

atgagagccc tgctggcgcg cctgcttctc tgcgtcctgg tcgtgagcga ctccaaaggc  60

agcaatgaac ttcatcaagt tccatcgaac tgtgactgtc taaatggagg aacatgtgtg  120

tccaacaagt acttctccaa cattcactgg tgcaactgcc caaagaaatt cggagggcag  180

cactgtgaaa tagataagtc aaaaacctgc tatgagggga atggtcactt ttaccgagga  240

aaggccagca ctgacaccat gggccggccc tgcctgccct ggaactctgc cactgtcctt  300

cagcaaacgt accatgccca cagatctgat gctcttcagc tgggcctggg gaaacataat  360

tactgcagga acccagacaa ccggaggcga ccctggtgct atgtgcaggt gggcaagggc  420

gactggctaa agccgcttgt ccaagagtgc atggtgcatg actgcgcaga tggaaaaaag  480

ccctcctctc ctccagaaga attaaaattt cagtgtggcc aaaagactct gaggccccgc  540

tttaagatta ttgggggaga attcaccacc atcgagaacc agccctggtt tgcggccatc  600

tacaggaggc accggggggg ctctgtcacc tacgtgtgtg gaggcagcct catcagccct  660

tgctgggtga tcagcgccac acactgcttc attgattacc caaagaagga ggactacatc  720

gtctacctgg gtcgctcaag gcttaactcc aacacgcaag gggagatgaa gtttgaggtg  780

gaaaacctca tcctacacaa ggactacagc gctgacacgc ttgctcacca caacgacatt  840

gccttgctga agatccgttc caaggagggc aggtgtgcgc agccatcccg gactatacag  900

accatctgcc tgccctcgat gtataacgat ccccagtttg gcacaagctg tgagatcact  960

ggctttggaa aagagaattc taccgactat ctctatccgg agcagctgaa gatgactgtt  1020

gtgaagctga tttcccaccg ggagtgtcag cagccccact actacggctc tgaagtcacc  1080

accaaaatgc tgtgtgctgc tgacccacag tggaaaacag attcctgcca gggagactca  1140

gggggacccc tcgtctgttc cctccaaggc cgcatgactt tgactggaat tgtgagctgg  1200

ggccgtggat gtgccctgaa ggacaagcca ggcgtctaca cgagagtctc acacttctta  1260

ccctggatcc gcagtcacac caaggaagag aatggcctgg ccctctga               1308

<210>2

<211>436

<212>PRT

<213>

<400>2

Met Arg Ala Leu Leu Ala Arg Leu Leu Leu Cys Val Leu Val Val Ser

1               5                   10                  15

Asp Ser Lys Gly Ser Asn Glu Leu His Gln Val Pro Ser Asn Cys Asp

            20                  25                  30

Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Val Ser Asn Lys Asp Phe Ser Asn Ile

        35                  40                  45

His Trp Cys Asn Cys Pro Lys Lys Phe Gly Gly Gln His Cys Glu Ile

    50                  55                  60

Val Lys Ser Lys Thr Cys Tyr Glu Gly Asn Gly His Phe Asp Arg Gly

65                  70                  75                  80

Lys Ala Ser Thr Asp Thr Met Gly Arg Cys Cys Leu Pro Trp Asn Ser

                85                  90                  95

Ala Thr Val Leu Gln Gln Thr Tyr His Ala His Arg Ser Asp Ala Leu

            100                 105                 110

Gln Leu Gly Leu Gly Lys His Lys Gly Asp Trp Asn Tyr Cys Arg Asn

        115                 120                 125

Pro Asp Asn Arg Arg Arg Pro Trp Cys Tyr Val Gln Val Gly Leu Lys

    130                 135                 140

Pro Leu Val Gln Glu Cys Met Val His Asp Cys Ala Asp Gly Lys Lys

145                 150                 155                 160

Pro Ser Ser Pro Pro Glu Glu Leu Lys Phe Gln Cys Gly Gln Lys Thr

                165                 170                 175

Leu Arg Pro Arg Phe Lys Ile Ile Gly Gly Glu Leu Thr Thr Ile Glu

            180                 185                 190

Asn Gln Pro Trp Phe Ala Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser

        195                 200                 205

Val Thr Tyr Val Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile

    210                 215                 220

Ser Ala Thr His Cys Phe Ile Asp Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile

225                 230                 235                 240

Val Tyr Leu Gly Arg Ser Arg Leu Asn Ser Asn Thr Gln Gly Glu Met

                245                 250                 255

Lys Phe Glu Val Glu Asn Leu Ile Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala Asp

            260                 265                 270

Thr Leu Ala His His Asn Asp Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys

        275                 280                 285

Glu Gly Arg Cys Ala Gln Pro Ser Arg Thr Ile Gln Thr Ile Cys Leu

    290                 295                 300

Pro Ser Met Tyr Asn Asp Pro Gln Phe Gly Thr Arg Cys Glu Ile Thr

305                 310                 315                 320

Gly Phe Gly Lys Glu Asn Ser Thr Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gln Leu

                325                 330                 335

Lys Met Thr Val Val Lys Leu Ile Ser His Arg Glu Cys Gln Gln Pro

            340                 345                 350

His Tyr Tyr Gly Ser Glu Val Thr Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp

        355                 360                 365

Pro Gln Trp Lys Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu

Val Cys Ser Leu Gln Gly Arg Met Thr Phe Thr Gly Ile Val Ser Trp

385                 390                 395                 400

Gly Arg Gly Cys Ala Leu Lys Asp Lys Pro Gly Leu Tyr Thr Arg Val

                405                 410                 415

Ser His Phe Phe Pro Trp Ile Arg Arg Ser His Thr Lys Lys Glu Asn

            420                 425                430

Gly Leu Ala Leu

        435

Claims (10)

1.一种新型溶栓剂，其特征在于它为尿激酶原与含KGD(赖氨酰-甘氨酰-天冬氨酰)序列的嵌合体。

2.根据权利要求1所述的新型溶栓剂，其特征在于所说的含KGD的序列为KGDW(赖氨酰-甘氨酰-天冬氨酰-色氨酰)。

3.根据权利要求2所述的新型溶栓剂，它具有如序列表中序列2所示的氨基酸序列。

4.权利要求1或2所述溶栓剂的表达基因，它具有如序列表中序列1所示的DNA序列。

5.根据权利要求1或2所述的溶栓剂，其用于呈递含有KGD序列的位置位于尿激酶原分子Kringle区域的一个伸出分子表面的突环区。

6.根据权利要求1或2所述的溶栓剂，其中KGD序列嵌合位点是第138位氨基酸与第139位氨基酸之间。

7.制备权利要求1或2所述嵌合体的方法，包括以下步骤：

(1)将含有KGD的序列嵌合于尿激酶原基因的设计位点，构建KGD-尿激酶原基因；

(2)通过同源重组技术将KGD-尿激酶原基因连接至真核表达载体昆虫细胞杆状病毒DNA多角体蛋白启动子，转染昆虫细胞；

(3)昆虫细胞的培养与KGD-尿酶原基因在昆虫细胞中的表达；

(4)KGD-尿激酶原嵌合基因表达产物的分离纯化与鉴定；

(5)KGD-尿激酶原嵌合重组蛋白生物学活性测定。

8.根据权利要求7所述方法，其中真核表达载体为杆状病毒Bacmid，所转染的昆虫细胞为Sf9。

9.权利要求1或2所述的嵌合体，在制备预防和治疗心脑血管疾病药物中的应用。

10.权利要求9的用途，其特征在于所说的心脑血管疾病为血栓性疾病。

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