CN1513871A - 制备酪-丝-亮三肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及制备酪－丝－亮三肽的方法，该方法以亮氨酸和两个侧链的羟基未进行保护的丝氨酸和酪氨酸为原料合成所述酪－丝－亮三肽(CMS024)。本发明的方法安全、成本低，适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及多肽的制备方法。更具体地讲，本发明涉及酪-丝-亮三肽(CMS024)的制备方法。
技术背景
在多肽合成方法中，常用的液相合成方法是采用最大保护策略，即对作为单体的氨基酸的相关官能基团，尤其是氨基、羧基和羟基均作出保护，再进行氨基酸间的缩合反应从而合成多肽。关于多肽合成的详细描述可参见文献《多肽合成》，1985年，黄惟德、陈常庆著；《多肽药物化学》，1990年，彭师奇。
例如，在合成酪-丝-亮三肽时，采用最大保护策略方法，可以Boc-Leu-OH为原料制备铯盐，接着将羧端苄酯化，随后用HCl脱去Boc，暴露出氨端，然后按照DCC法(HOBT为辅助缩合剂)和侧链用苄基(Bzl)保护的丝氨酸和2，6-二氯苄基(Dcb)保护的酪氨酸进行逐步接肽，接着采用HCl脱去Boc，最后用HF脱去各种保护基，得到酪-丝-亮三肽。所述采用最大保护策略方法，合成酪-丝-亮三肽方案的简明路线见图1：
最大保护策略采用侧链保护的氨基酸价格昂贵，在合成的最后需要经过剧烈的HF脱保护。由于HF的剧毒性，反应的危险性较大，必须具备专门的HF脱保护装置。而且由于这类脱保护装置的反应容器体积有限，每一次脱保护所得产品数量有限，因此限制了在产业上的应用。
因此，需要一种避免采用强毒性和刺激性的HF进行脱保护、成本便宜且能够在工业上实施的合成CMS024的方法。
发明概述
本发明提供了一种采用最小保护策略合成所述酪-丝-亮三肽(CMS024)的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)使L-Leu-OH与SOCl2在醇溶液中反应，得到L-Leu-OH的酯；
(2)使(1)中制得的L-Leu-OH的酯与氨端保护的L-Ser-OH在缩合剂存在下进行缩合反应，制得氨端保护的丝氨酸和亮氨酸的二肽缩合物的酯；
(3)对(2)中制得的产物进行脱保护，脱除保护基团；
(4)使(3)中制得的产物与氨端保护的L-Tyr-OH在缩合剂存在下进行缩合反应，制得氨端保护的酪氨酸、丝氨酸和亮氨酸的三肽缩合物的酯；
(5)使(4)中制得的产物在醇溶剂中、在碱存在下进行水解，得到保护的H-Tyr-Ser-Leu-OH；
(6)对(5)中制得的产物进行脱保护，脱除保护基团，得到H-Tyr-Ser-Leu-OH。
根据本发明的一个实施方案，将(6)中制得的产物在Sephadex G15中，以5％HOAC水溶液进行纯化，得到H-Tyr-Ser-Leu-OH。
相对于HF的脱保护条件，本发明方法的安全性增大，同时对工业化没有障碍。另外，由于侧链不保护氨基酸的价格较为便宜，因此采用本发明的保护路线的合成成本也较小，而且不需要最大保护路线的昂贵的HF脱保护的装置。
本发明方法在制备过程中通过选择合适的反应条件，有效地防止副反应的发生，制得的产物经薄层层析测定为单点。
发明详述
尽管不希望受任何理论的限制，但是认为本发明是以下面的事实为基础：由于1)CMS024为仅含有三个氨基酸残基的小肽；2)酪氨酸和丝氨酸的侧链的羟基的亲核反应活性相对氨基较小；因此在合成过程中可以不对两个侧链的羟基进行保护。
首先，申请人制备了亮氨酸的酯，与侧链不保护的丝氨酸和酪氨酸进行逐步接肽，皂化脱去酯基，最后脱去Boc保护得到CMS024的盐。图2所示是本发明采用最小保护策略方法合成酪-丝-亮三肽时的简明路线图。
1.L-Leu-OH的酯化
采用SOCl2的醇溶液将Leu-OH酯化，以保护Leu的羧端。其中Leu-OH先与SOCl2形成Leu-C1，接着与醇反应成酯。所用的醇溶剂可为甲醇、乙醇或苄醇等。本发明优选使用甲醇。反应先在0℃进行4小时，随后逐步升温至室温，由薄层层析监测，直至原料点消失。一般为约8小时。制得的产物为L-Leu-OH酯的盐酸盐形式。
2.Boc保护的亮氨酸和丝氨酸的二肽缩合物的酯的制备
将上述产物HCl·Leu-OH的酯用溶剂溶解，用有机碱调节pH值至一定值。另一方面，将仅对氨基进行保护(醇羟基呈游离状态)的Boc-L-Ser-OH用溶剂溶解，加入缩合剂，随后在一定温度下与HCl·Leu-OH的酯溶液混合反应，在反应过程中采用有机碱维持pH值在一定范围内。得到Boc保护的亮氨酸和丝氨酸的二肽缩合物的酯。
在该步反应中采用Boc-作为氨基保护剂，此外所述氨基保护剂还可选自常用于多肽合成中的任意保护剂，如苄氧羰基(Z)。
所用的溶剂可选自四氢呋喃、重蒸的DMF、NMP等，优选使用四氢呋喃。
所用的有机碱可选自N-甲基吗啉(NMM)、三乙胺和DIEA(二异丙基乙基胺)等，优选使用NMM。
在该步反应中选用DCC/HOBt作为缩合剂，此外所述缩合剂还可选自DIC、HBTU、BOP等常用于多肽合成中的任意缩合剂。
在反应过程中，当pH低于7时，反应产物的纯度将降低，而pH高于11，将使产率降低。因此，优选将pH控制在7-11，更优选在8-10的范围内。
反应温度可为0℃至室温。当在室温下进行反应时，反应时间较短，但经薄层层析检测为多点，产物纯度下降，产率下降。而先在0℃下反应2小时后，再于室温下反应，则得到经薄层层析检测为纯的产物。
3.脱保护
Boc保护的二肽缩合物的脱保护可采用HCl/乙酸乙酯或TFA/二氯甲烷等脱保护试剂来实施。
采用TFA/二氯甲烷作为脱保护试剂时，虽然其对反应原料的溶解性较好，但得到的产物为粘稠状物质，而且TFA需减压蒸馏才能除去，因此后处理较为困难。
而HCl/乙酸乙酯中由于HCl为挥发性酸，得到的产物容易结晶，通过过滤后处理即可，因此更优选使用HCl/乙酸乙酯作为脱保护试剂。
4.Boc保护的亮氨酸、丝氨酸和酪氨酸的三肽缩合物的酯的制备
Boc保护的亮氨酸、丝氨酸和酪氨酸的三肽缩合物的酯的制备条件的选择与Boc保护的亮氨酸和丝氨酸的二肽缩合物的酯的制备条件的选择类似。
在该步反应中采用Boc作为氨基保护剂，此外所述氨基保护剂还可选自常用于多肽合成中的任意保护剂，如苄氧羰基(Z)。在本发明的一个实施方案中，采用仅对氨基进行保护(酚羟基呈游离状态)的Boc-L-Tyr-OH作为原料进行反应。
所用的溶剂可选自四氢呋喃、重蒸的DMF、NMP等，优选使用四氢呋喃。所用的有机碱可选自N-甲基吗啉、三乙胺和DIEA等，优选使用NMM。缩合剂可选自DCC/HOBt、DIC、HBTU、BOP等，优选使用DCC/HOBt。反应过程的pH控制在7-11，更优选在8-10的范围内。反应温度控制为先在0℃下反应2小时，再于室温下反应。
5.Boc-Tyr-Ser-Leu-OH的制备
将上一步反应产物用醇溶剂溶解，在一定温度下缓慢滴加入碱进行皂化反应，脱去羧酸端的酯基。
反应中使用的溶剂可选自甲醇、乙醇等常用反应溶剂。
反应可在0℃至室温下进行。在室温下进行可缩短反应时间(由0℃下的约5小时缩至2小时)，但发生严重的消旋化，产生较多的包括消旋物在内的副产物。而当在0℃下进行时则得到经薄层层析检测为纯的化合物。因此优选在0℃下实施皂化反应。
6.Boc-Tyr-Ser-Leu-OH的脱保护
与3中的脱保护条件类似，可采用HCl/乙酸乙酯或TFA/二氯甲烷等脱保护试剂来实施。但较优选使用HCl/乙酸乙酯作为脱保护试剂。
7.精制
将制得的HCl·Tyr-Ser-Leu-OH用去离子水溶解，采用Sephadex G15凝胶柱进行脱盐，终产品为酪丝亮肽H-Tyr-Ser-Leu-OH。
附图说明
图1是采用最大保护策略方法合成酪-丝-亮三肽时的简明路线图。
图2是本发明采用最小保护策略方法合成酪-丝-亮三肽时的简明路线图。
本发明的优选实施方式
下面结合图2，通过非限定性实施例对本发明进行进一步说明。
在本文中，所用试剂的缩写为：
DCC：二环己基碳二亚胺
HOBt：1-羟基苯并三氮唑
NMM：N-甲基吗啉
THF：四氢呋喃
实施例1
1.HCl·Leu-OMe的制备
将20g(0.152mol)的L-LeuOH(Sigma)与事先制备的SOCl2(化学纯，北京化工厂)/CH3OH(化学纯，北京化工厂)溶液(冷至-10℃，由260ml的CH3OH与70ml新蒸SOCl2构成)逐步混合，外温维持-10℃，使L-Leu-OH逐步溶解。得到的反应液于0℃反应4小时，然后逐步升温至室温，再反应8小时，经TLC(氯仿/甲醇，20/1)检测显示原料点消失。将反应液减压浓缩至干，除净游离氯化氢。残留物用少量甲醇溶解，加无水乙醚至浑浊，放置，析晶，过滤得到22.02g(74.8％)目标化合物。在氯仿/甲醇(5/1)展开剂中为单点。熔点：151～153℃[α]D 20＝20°(C＝2 MeOH)
2.Boc-Ser-Leu-OMe的制备(1)
将22.02g(0.121mol)的HCl·Leu-OMe用100ml无水四氢呋喃(分析纯，北京化工厂)溶解，得到的溶液用N-甲基吗啉调pH至7，冷却至0℃备用。
将24.87g(0.121mol)的Boc-Ser-OH(购自扬州宝盛公司)、17.2g(0.127mol)的HOBt(Fluka)用100ml无水四氢呋喃溶解，冷至0℃，缓慢加入26.24g(0.127mol)的DCC(Fluka)，于0℃搅拌5分钟。然后与上面的溶液混合，再于0℃搅拌2小时，用N-甲基吗啉(Fluka)维持PH＝7，于室温搅拌24小时，经TLC(氯仿/甲醇/乙酸，(20/1/0.4))检测显示原料点消失。过滤反应混合物，减压浓缩滤液，用石油醚反复研磨残留物，用400ml乙酸乙酯溶解得到的粘稠状物质，分别用饱和NaHCO3水溶液(75ml×5)、饱和NaCl水溶液(75ml×1)、5％KHSO4水溶液(75ml×5)和饱和NaCl水溶液(15ml×3)洗涤，有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压旋干得到40.0g(100.8％)粘稠状目标化合物。经TLC检测，采用乙酸乙酯/石油醚(1/1)与氯仿/甲醇/乙酸(20/1/0.4)两种系统展开，得到3个点。
3.Boc-Ser-Leu-OMe的制备(2)
将22.02g(0.121mol)的HCl·Leu-OMe用100ml无水四氢呋喃(分析纯，北京化工厂)溶解，得到的溶液用N-甲基吗啉调pH至8，冷却至0℃备用。
将24.87g(0.121mol)的Boc-Ser-OH(购自扬州宝盛公司)，17.2g(0.127mol)的HOBt(Fluka)用100ml无水四氢呋喃溶解，冷至0℃，缓慢加入26.24g(0.127mol)的DCC(Fluka)，0℃搅拌5分钟。然后与上面的溶液混合，0℃搅拌2小时，用N-甲基吗啉(Fluka)维持pH＝8，室温搅拌10小时，氯仿/甲醇/乙酸，(20/1/0.4)显示原料点消失。过滤反应混合物，减压浓缩滤液，残留物用石油醚反复研磨，得到的粘稠状物质，用400ml乙酸乙酯溶解，分别用饱和NaHCO3水溶液(75ml×5)、饱和NaCl水溶液(75ml×1)、5％KHSO4水溶液(75ml×5)和饱和NaCl水溶液(15ml×3)洗涤，有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压旋干得到41.2g(103.8％)粘稠状目标化合物。经TLC检测，采用乙酸乙酯/石油醚(1/1)与氯仿/甲醇/乙酸(20/1/0.4)两种展开系统，均为单点，该产物可直接用于下一步反应。
4.Boc-Ser-Leu-OMe的制备(3)
将22.02g(0.121mol)的HCl·Leu-OMe用100ml无水四氢呋喃(分析纯，北京化工厂)溶解，得到的溶液用N-甲基吗啉调pH至10，冷却至0℃备用。
将24.87g(0.121mol)的Boc-Ser-OH(购自扬州宝盛公司)，17.2g(0.127mol)的HOBt(Fluka)用100ml无水四氢呋喃溶解，冷至0℃，缓慢加入26.24g(0.127mol)的DCC(Fluka)，于0℃搅拌5分钟。然后与上面的溶液混合，再于0℃搅拌2小时，用N-甲基吗啉(Fluka)维持PH10，于室温搅拌10小时，经TLC检测，采用氯仿/甲醇/乙酸(20/1/0.4)展开，显示原料点消失。过滤反应混合物，减压浓缩滤液，用石油醚反复研磨残留物，得到的粘稠状物质用400ml乙酸乙酯溶解，分别用饱和NaHCO3水溶液(75ml×5)、饱和NaCl水溶液(75ml×1)、5％KHSO4水溶液(75ml×5)和饱和NaCl水溶液(15ml×3)洗涤，有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压旋干得到41.2g(103.8％)粘稠状目标化合物。经TLC检测，采用乙酸乙酯/石油醚(1/1)与氯仿/甲醇/乙酸(20/1/0.4)两种展开系统，均为单点，该产物可直接用于下一步反应。
5.Boc-Ser-Leu-OMe的制备(4)
将22.02g(0.121mol)的HCl·Leu-OMe用100ml无水四氢呋喃(分析纯，北京化工厂)溶解，得到的溶液用N-甲基吗啉调pH至11，冷却至0℃备用。
将24.87g(0.121mol)的Boc-Ser-OH(购自扬州宝盛公司)，17.2g(0.127mol)的HOBt(Fluka)用100ml无水四氢呋喃溶解，冷至0℃，缓慢加入26.24g(0.127mol)的DCC(Fluka)，0℃搅拌5分钟。然后与上面的溶液混合，再于0℃搅拌2小时，用N-甲基吗啉(Fluka)维持PH11，于室温搅拌10小时，经TLC检测，采用氯仿/甲醇/乙酸(20/1/0.4)展开，显示原料点消失。过滤反应混合物，减压浓缩滤液，用石油醚反复研磨残留物，得到的粘稠状物质用400ml乙酸乙酯溶解，分别用饱和NaHCO3水溶液(75ml×5)、饱和NaCl水溶液(75ml×1)、5％KHSO4水溶液(75ml×5)和饱和NaCl水溶液(15ml×3)洗涤，有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压旋干得到32.9g(83％)粘稠状目标化合物。。
6.HCl·Ser-Leu-OMe的制备
将41.2g(0.124mol)的Boc-Ser-Leu-OMe与200ml 4N HCL/乙酸乙酯溶液混合之后在室温下搅拌1小时30分钟，溶液出现大量白色沉淀，经TLC检测，采用TLC(氯仿/甲醇，20/1)展开，显示原料点消失。过滤，用乙酸乙酯反复洗涤滤饼，以除净游离HCl。用无水乙醚反复研磨残留物，得到目标化合物26.23g(78.7％)。经TLC检测，采用氯仿/甲醇(10/1)展开系统，为单点。熔点：128～129℃，[α]D 20＝-18°(C＝2MeOH)
7.Boc-Tyr-Ser-Leu-OMe的制备(1)
将26.23g(0.097mol)的HCl·Ser-Leu-OMe用125ml无水四氢呋喃(分析纯，北京化工厂)溶解，得到的溶液用N-甲基吗啉(Fluka)调pH至8，冷却至0℃备用。
将27.45g(0.097mol)的Boc-Tyr-OH(购自四川三高生化有限公司)，13.85g(0.102mol)的HOBt(Fluka)用125ml无水四氢呋喃溶解，冷至0℃，缓慢加入21.13g(0.102mol)的DCC(Fluka)，于0℃搅拌5分钟。然后与上面的溶液混合，再于0℃搅拌2小时，用N-甲基吗啉维持PH＝8，于室温搅拌28小时，经TLC检测，采用氯仿/甲醇/乙酸(20/1/0.4)展开，显示原料点消失。过滤反应混合物，减压浓缩滤液，用石油醚反复研磨残留物，得到的固体用400ml乙酸乙酯溶解，分别用饱和NaHCO3水溶液(75ml×3)、饱和NaCl水溶液(75ml×1)、5％KHSO4水溶液(75ml×3)和饱和NaCl水溶液(15ml×3)洗涤，用无水硫酸钠干燥有机层，过滤，滤液减压旋干得到49.12g(101.6％)目标化合物。经TLC检测，采用乙酸乙酯/石油醚(1/1)与氯仿/甲醇/乙酸(20/1/0.4)两种展开系统，均为单点。熔点：147.4～147.8℃[α]D 20＝-22°(C＝2 MeOH)
8.Boc-Tyr-Ser-Leu-OMe的制备(2)
将26.23g(0.097mol)的HCl·Ser-Leu-OMe用125ml无水四氢呋喃(分析纯，北京化工厂)溶解，得到的溶液用N-甲基吗啉(Fluka)调pH至10，冷却至0℃备用。
将27.45g(0.097mol)的Boc-Tyr-OH(购自四川三高生化有限公司)，13.85g(0.102mol)的HOBt(Fluka)用125ml无水四氢呋喃溶解，冷至0℃，缓慢加入21.13g(0.102mol)的DCC(Fluka)，于0℃搅拌5分钟。然后与上面的溶液混合，再于0℃搅拌2小时，用N-甲基吗啉维持PH＝8，于室温搅拌28小时，经TLC检测，采用氯仿/甲醇/乙酸(20/1/0.4)展开，显示原料点消失。过滤反应混合物，减压浓缩滤液，用石油醚反复研磨残留物，得到的固体用400ml乙酸乙酯溶解，分别用饱和NaHCO3水溶液(75ml×3)、饱和NaCl水溶液(75ml×1)、5％KHSO4水溶液(75ml×3)和饱和NaCl水溶液(15ml×3)洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压旋干得到48.30g(100.0％)目标化合物。经TLC检测，采用乙酸乙酯/石油醚(1/1)与氯仿/甲醇/乙酸(20/1/0.4)两种展开系统，均为单点。熔点：147.4～147.8℃[α]D 20＝-22°(C＝2 MeOH)
9.Boc-Tyr-Ser-Leu-OH的制备(1)
将49.12g(0.099mol)的Boc-Tyr-Ser-Leu-OMe，用400ml CH3OH(化学纯，北京化工厂)溶解，0℃下缓慢滴入120ml 2N的NaOH(化学纯，北京化工厂)/H2O，于0℃搅拌5小时，经TLC检测，采用氯仿/甲醇(10/1)展开，显示原料点消失。反应液用KHSO4/H2O调至中性，减压蒸干甲醇，KHSO4/H2O继续酸化至PH值1～2，用乙酸乙酯(150ml×3)萃取，合并有机层，并用H2O(20ml×3)反复洗涤至中性，经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压旋干，得目标化合物48.32g(100.8％)。经TLC检测，采用氯仿/甲醇/乙酸(5/1/0.4)展开系统，为单点，Rf＝0.31，可直接用于下一步反应。
熔点：103.2～105.1℃。[α]D 20＝-7°(C＝2 MeOH)
10.Boc-Tyr-Ser-Leu-OH的制备(2)
将49.12g(0.099mol)的Boc-Tyr-Ser-Leu-OMe，用400ml CH3OH(化学纯，北京化工厂)溶解，于室温下缓慢滴入120ml 2N的NaOH(化学纯，北京化工厂)/H2O，在室温下搅拌2小时，经TLC检测，采用氯仿/甲醇(10/1)展开，显示原料点消失。反应液用KHSO4/H2O调至中性，减压蒸干甲醇，KHSO4/H2O继续酸化至PH值1～2，用乙酸乙酯(150ml×3)萃取，合并有机层，并用H2O(20ml×3)反复洗涤至中性，经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压旋干，得目标化合物47.50g(99.1％)。经TLC检测，采用氯仿/甲醇/乙酸(5/1/0.4)展开系统，为多点，表明发生了严重的消旋化。
11.HCl·Tyr-Ser-Leu-OH的制备
于0℃下，向48.32g的Boc-Tyr-Ser-Leu-OH中缓慢加入250ml4NHCl/乙酸乙酯，于0℃搅拌1小时30分钟，反应液出现大量沉淀，经TLC检测，采用氯仿/甲醇(10/1)展开，显示原料点消失，过滤，沉淀用乙酸乙酯反复洗涤至无HCl，用100ml乙醇溶解，放置析晶，过滤，收集沉淀。再向母液中加入石油醚进行重结晶，过滤，收集结晶。合并得目标化合物35.5g(85.1％)。[α]D 20＝-6°(C＝2 H2O)
12.酸根离子的转换及脱盐
将35.5g HCl·Tyr-Ser-Leu-OH用少量去离子水溶解，采用SephadexG 15进行换盐，洗脱剂为5％HOAc水溶液，紫外检测仪215nm在线检测以及茚三酮显色方法检测，收集主成分，冻干，得31.0gHOAC·Tyr-Ser-Leu-OH[α]D 20＝+19°(C＝2 冰醋酸)
已经通过非限定性实施例对本发明作出了举例说明。但本领域的技术人员会理解，在没有偏离本发明的宗旨和范围下，可以对本发明作出各种修改、替换和变更。
Claims (10)
1.一种制备具有以下结构的三肽化合物的方法：
(H-Tyr-Ser-Leu-OH)
所述方法包括以下步骤：
(1)使L-Leu-OH与SOCl2在醇溶液中反应，得到L-Leu-OH的酯；
(2)使(1)中制得的L-Leu-OH的酯与氨端保护的L-Ser-OH在缩合剂存在下进行缩合反应，制得氨端保护的丝氨酸和亮氨酸的二肽缩合物的酯；
(3)对(2)中制得的产物进行脱保护，脱除保护基团；
(4)使(3)中制得的产物与氨端保护的L-Tyr-OH在缩合剂存在下进行缩合反应，制得氨端保护的酪氨酸、丝氨酸和亮氨酸的三肽缩合物的酯；
(5)使(4)中制得的产物在醇溶剂中、在碱存在下进行水解，得到保护的H-Tyr-Ser-Leu-OH；
(6)对(5)中制得的产物进行脱保护，脱除保护基团，得到H-Tyr-Ser-Leu-OH。
2.权利要求1的方法，还包括在步骤(6)后将制得的产物经Sephadex G15、以5％HOAC水溶液洗脱进行纯化。
3.权利要求1的方法，其中保护的L-Ser-OH为Boc-Ser-OH，且保护的L-Tyr-OH为Boc-Tyr-OH。
4.权利要求1的方法，其中在步骤(1)中所用的醇为甲醇。
5.权利要求1的方法，其中在步骤(2)和步骤(4)中所用的缩合剂均为DCC/HOBt。
6.权利要求1的方法，其中在步骤(2)和步骤(4)的反应中pH值均为7-11。
7.权利要求6的方法，其中在步骤(2)和步骤(4)的反应中pH值均为8-10。
8.权利要求1的方法，其中在步骤(2)和步骤(4)的反应均先在0℃下进行，再于室温下进行。
9.权利要求1的方法，其中在步骤(3)中的脱保护采用HCl/乙酸乙酯进行。
10.权利要求1的方法，其中在步骤(5)的水解反应在0℃下实施。
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