CN1509332A - 炎性抑制因子Fwa116 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了炎性抑制因子Fwa116多肽和编码这种多肽的多核苷酸。本发明也公开了用重组技术生产Fwa116多肽的方法和针对这种多肽的抗体和拮抗剂。本发明还公开了含有Fwa116多肽的药物组合物以及Fwa116在治疗脑中风、冠心病、心绞痛、心肌梗塞等心血管炎症性动脉粥样硬化疾病和防治肿瘤方面的用途。本发明还提供了通过检测样品中Fwa116核酸序列中的突变，或者Fwa116多肽含量及Fwa116基因产物自身抗体水平的改变而进行诊断和测定的方法。本发明的炎性抑制因子是人类来源的。
Description
炎性抑制因子 Fwal l6
发明领域
本发明涉及最新鉴定的多核苷酸和由其编码的多肽， 这种多核苷酸和多肽的 生产方法以及这些多核苷酸和多肽的用途。 本发明的多肽已被鉴定为细胞炎性抑制 因子， 下文有时称为 " Fwal l6 "。 本发明的多核苷酸和多肽是人类来源的。 发明背景
心脑血管病是威胁人类健康的重大疾病之一。 据统计， 每年约有 260 万中国 人死于此病， 平均每 12 秒就有一位同胞被该病夺去生命。 在中国， 心脑血管病死 亡人数占总死亡人数的比率从 1957年的 12. 1%上升至 1990年的 35. 8%, 升高了 2. 9 倍。 据世界银行预测： 到 2020 年， 全世界心脑血管病死亡人数占总死亡人数的比 率将从 1990年的 28. 9%升至 36. 3%， 其中 70%的心脑血管病发生在发展中国家。 中 国现有高血压患者 1亿多人， 并以每年 350万人的速度递增； 脑中风致残者 600万 人， 并以每年 150万的速度递增； 冠心病患者 100万人， 并以每年 50万的速度递 增； 此外， 还有心肌病患者 300万人。 因此， 心脑血管病的防治对减轻人类经济负 担， 确保人体健康具有十分重要的意义。
心脑血管病的治疗经历了四个大的阶段： 1920 年代， 循环动力学的研究揭示 了心脏是一个 "泵"， 由此奠定了心力衰竭的治疗基础； 60-70 年代， 对心血管病 危险因素的认识及处理， 使西方国家心脏病的发病率下降了近 40%; 1970年， 对心 肌细胞电生理学的研究， 提供了抗心律失常、 电生理检査及治疗的新方法； 80 年 代末到 90年代初， 对血管生物学的认识， 产生了心脏介入治疗的新方法。
心衰、 抗心律失常、 及介入治疗对抢救心脑血管病人的生命， 提高其生活质 量起到了积极作用。 然而， 由于这些方法仅针对症状进行治疗， 没有从根本上触及 病因， 所以治疗针对性不强。 虽然延长了病人的寿命， 但没有真正达到预防和治愈 的目的。 因此， 在分子生物学的水平进行研究， 査明心脑血管病的致病因素及发病 机理， 有望在该病的治疗方面取得突破性进展， 达到从根本上遏制心脑血管病的目 的。
cDNA文库是生物工程领域的重要研究工具之一。 通常从细胞中提取 mRNA,通过反转录酶合成 mRNA的 DNA拷贝（即 cDNA, Complementary DNA)。 单链 cDNA分子在 DNA聚合酶的作用转变成双链 DNA分子， 然后再插入载体， 转化到宿主菌中长成克隆。 这样的每个克隆只包含特定的 mRNA信息， 这样的一 套克隆就称为 cDNA文库。
由于 cDNA不含内含子， 从 cDNA文库中可以直接筛选到相应的表达基因， 故相对基因库而言， cDNA文库具有操作简单、 使用方便的优点。 人体不同细胞表
达基因的差异决定了其组织和器官表型的差异， 从人主动脉 cDNA文库中分离和鉴 定特异表达基因， 特别是分离和鉴定疾病相关基因， 是研究遗传性心血管病的有效 方法之一。 发明概述
按照本发明的一个方面， 提供了一种新的成熟多肽 Fwal l6 以及具有生物学活 性并在诊断或治疗上有用途的 Fwal l6 的片段、 类似物和衍生物。 本发明的多肽是 人类来源的。
按照本发明的另一个方面， 提供了编码本发明多肽的分离的核酸分子， 包括 mRNA、 DNA、 cDNA、 基因组 DNA， 以及具有生物学活性并在诊断学或治疗学上有用 途的该核酸分子的片段、 类似物和衍生物。
按照本发明的另一个方面， 提供了用重组技术生产 Fwal l6多肽的方法， 该方 法包括培养含有编码本发明多肽的核酸序列的重组原核和 /或真核宿主细胞。
按照本发明的另一个方面， 提供了将 Fwal l6 多肽或编码 Fwal l6多肽的多核 苷酸用于治疗的方法。 例如， 治疗心血管炎症性动脉粥样硬化。
按照本发明的另一个方面， 提供了这些多肽的抗体。
按照本发明的另一个方面， 提供了所述多肽的拮抗剂， 其可用来抑制这些多 肽的作用。
按照本发明的另一个方面， 提供了与本发明核酸序列中的突变、 以及与本发 明的多肽异常表达有关的疾病或疾病易感性的诊断方法。
按照本发明的另一个方面， 提供了将本发明的多肽或编码这种多肽的多核苷 酸、 在体外用于科学研究、 DNA合成以及人工构建 DNA载体的方法。
根据本文的教导， 上述方面及相关方面对本领域的技术人员而言是显而易见 的。 本发明是通过如下技术方案实现的。 提取 mRNA, 反转录成 cDNA， 构建成人主 动脉 cDNA文库。 从文库中获取 Fwal l6的基因片段， 通过 EST拼接得到 Fwal l6的 全长 cDNA序列。 进而研究 Fwal l6基因在不同组织的表达与分布， 研究 Fwal l6多 肽的活性与功能。 发明详述
按照本发明的一个方面， 本发明提供了一种分离的核酸（多核苷酸)序列， 其 编码具有推定的、 如 SEQ ID N0: 2所示氨基酸序列的成熟多肽。 本发明的多核苷酸 是从成人主动脉的 cDNA文库中发现的。 其定位于人体细胞的第 17号染色体上。 其 包含一个开放阅读框架， 可以编码具有 409个氨基酸残基的多肽。 同源性分析表明
Fwal l6多肽与 cdk5激活剂结合蛋白 C53的同源性为 70%。
推测的 Fwal l6多肽由 409个氨基酸组成。 其序列特征为： （A) 从 13至 18 Aa (GVSWAE) ,从 157至 162 Aa (GTEPSV) ，从 193至 198 Aa (GTDSGI ) ， 从 204至 209 Aa (GIDWGI ) , 从 222至 227 Aa (GIDWGD) 为 N—豆蔻酰化位点 (5个）； ( B) 从 15至 18 Aa (SWAE), 从 57至 60 Aa (SRKE), 从 113至 116 Aa (SLGE), 从 131 至 134 Aa (SPTE), 从 150至 153 Aa (TVYE), 从 156至 159 Aa (TGTE), 从 161 至 164 Aa (SVVE), 从 235至 238 Aa (TVLE), 从 255至 258 Aa (TLLE), 从 316 至 319 Aa (SVLE) 为酪蛋白激酶 II位点 （10个）； (C) 从 41至 43 Aa (SLK), 从 57至 59 Aa (SRK), 从 77至 79 Aa (SCK), 从 339至 341 Aa (SPR)， 从 404至 406 Aa (SKR), 从 408至 410 Aa (SGR)为蛋白激酶 C位点（6个）； (D)从 148至 151 Aa (NSTV) 为 N—糖基化位点； （E) 从 270至 291 Aa ( LMELEIFLAQRAVELSEEADVL), 从 277至 298 Aa ( LAQRAVELSEEADVLSVSQFQL ) 为亮氨酸拉链结构 ( 2个）； (F) 从 405至 408 Aa (KRYS) 为 cAMP和 cG P依赖的蛋白激酶位点。
本发明的多核苷酸可以是 RNA形式或 DNA形式， 其中 DNA包括 cDNA、 基因组 DNA 和合成 DNA。 DNA 可以是双链或单链的， 如果是单链的， 则可以是编码链或非 编码（反义)链。 编码成熟多肽的编码序列可以和 SIQ ID N0: 1 (全长 2546 个核苷 酸） 所示的编码序列 （1002至 2261位核苷酸） 相同； 或者， 由于遗传密码的丰余 性或简并性， 编码序列也可以不同与 SIQ ID N0: 1所示的编码序列。
编码 SIQ ID N0: 2所示成熟多肽的多核苷酸可以包括： 成熟多肽的编码序列； 成熟多肽的编码序列和附加的编码序列， 如编码多肽前导序列或分泌序列的多核苷 酸； 成熟多肽的编码序列（以及任选的附加编码序列)和非编码序列， 如内含子或成 熟多肽编码序列 5'和 /或 3'端的非编码序列。
因此， 术语 "编码多肽的多核苷酸"包括仅含有多肽编码序列的多核苷酸以 及含有附加的编码和 /或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体， 其编码推定的、 具有 SIQ ID N0 : 2 所 示氨基酸序列的多肽片段、 类似物及衍生物。 所述变异体可以是天然产生的该多核 苷酸的等位基因变异体， 或者是非天然产生的变异体。 正如本领域已知的， 等位基 因变异体是一段多核苷酸的另一种形式， 其可以带有一个或多个核苷酸的取代、 缺 失或添加， 而实质上不改变所编码多肽的功能。
因此， 本发明包括能够编码与 SIQ ID N0: 2 所示成熟多肽具有相同氨基酸序 列的多核苷酸， 还包括能够编码 SIQ ID N0: 2所示成熟多肽之片段、 衍生物和类似 物的多核苷酸变异体。 这些变异体包括缺失变异体、 取代变异体、 添加或插入变异 体。
本发明也包括这样的多核苷酸， 其中成熟多肽的编码序列可以在相同的阅读 框架中，与有助于多肽由宿主细胞表达及分泌的多核苷酸 （如产生前导序列的多核
苷酸） 相融合。 前导序列作为分泌序列而控制多肽从细胞中转运。 具有前导序列的 多肽是前体蛋白（preprotein)， 由宿主细胞切割其前导序列后可以产生成熟多肽。 本发明的多核苷酸也可以编码蛋白原（proprotein)， 蛋白原是具有原序列 (prosequence)的成熟蛋白， 是 5'端附加了氨基酸残基的成熟蛋白， 是一种无活性 形式。 切除原序列后， 可以产生有活性的成熟蛋白。
因此， 本发明的多核苷酸可以编码一种成熟蛋白， 也可以编码具有原序列的 蛋白， 还可以编码既有原序列（prosequence)又有前导序列（presequence)的蛋白 质。
本发明的多核苷酸还包括在同一读框中与标记序列融合的编码序列， 标记序 列可用于纯化本发明的多肽。例如， 当宿主细胞为细菌时， 标记序列可以是由 pQE-9 载体提供的、用于纯化融合产物的六组氨酸。或者，当宿主为哺乳动物细胞 (如 COS - 7 细胞）时， 标记序列可以是血细胞凝集素 (HA)， HA 标记对应于从流感血凝集蛋白 衍生的一个表位 (Wilson, I.， 等， 细胞， 37 : 767 (1984) )。
术语 "基因"是指与产生多肽有关的 DNA 片段， 其包括编码区之前和之后的 区域， 以及在各个编码区段 (外显子)之间的间插序列（内含子）。
本发明全长基因的片段可以用作 cDNA文库的杂交探针， 用来分离全长基因和 与该基因有高度同源性或相似生物活性的其它基因。 所说的探针优选具有至少 30 个碱基， 并且可以含有 50个或更多个碱基。 所述探针也可以用来鉴别相应于全长 转录物的 cDNA 克隆和含有完整基因的一个或多个基因组克隆。 其中， 完整基因包 括调节序列、 启动子序列、 外显子和内含子。 例如可以根据己知的 DNA序列合成寡 核苷酸探针， 进而分离出基因的编码部分。 与本发明基因序列互补的、 标记的寡核 苷酸探针可以用来从人类 cDNA、 基因组 DNA或 mRNA文库中筛选与其杂交的文库成 员。
本发明还涉及与本发明的多核苷酸杂交的核酸序列。 条件是两个序列间具有 至少 85%， 优选至少 90%， 更优选至少 95%的同源性。 本发明特别涉及在严格条件 下与本发明的多核苷酸杂交的多核苷酸。 本文所用术语 "严格条件"是指仅在序列间 具有至少 95%， 优选具有至少 97%的同源性时杂交才会发生。 与上述序列杂交的多 核苷酸可以编码与本发明成熟多肽具有相同生物学功能或活性的多肽。
此外，与本发明的多核苷酸具有同源性并能够杂交的多核苷酸可以具有至少 20 个碱基， 优选至少 30个碱基， 更优选至少 50个碱基， 其可以保留或不保留活性。 这样的多核苷酸可以用作 SEQ ID N0: 1的探针， 用于回收多核苷酸、 作为诊断探针 或作为 PCR引物。
因此， 本发明涉及与编码 SEQ ID N0: 2所示多肽的多核苷酸具有至少 85%, 优 选至少 90%, 更优选至少 95%同源性的多核苷酸及其片段 （所述片段具有至少 30个 碱基， 优选至少 50个碱基）， 以及由这些多核苷酸编码的多肽。
根据本发明的另一个发明， 本发明涉及推定的、 具有 SIQ ID N0:2 所示氨基 酸序列的多肽及其片段、 类似物和衍生物。
术语"片段"、 "衍生物"和"类似物"， 当涉及由 SIQ ID N0: 1编码的多肽或者具 有如 SIQ ID N0: 2所示氨基酸序列的多肽时， 是指基本上保留了所述多肽生物学功 能或活性的多肽。 所说的类似物可以包括蛋白原， 蛋白原经部分切除后可以产生有 活性的成熟多肽。
本发明的多肽可以是重组多肽， 天然多肽或合成多肽， 优选重组多肽。
所说的多肽 (SIQ ID N0: 2)及其片段、 衍生物或类似物可以是：（i)一种多肽， 其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守的氨基酸残基 (优选保守的氨基酸残基） 取代， 并且被取代的氨基酸残基可以是或不是由遗传密码子编码的， 或者（ii) 一 种多肽， 其中一个或多个氨基酸残基包含取代基， 或者（i ii) 一种多肽， 其中成熟 多肽与另一种化合物融合， 如与增加多肽半衰期的化合物 (例如聚乙烯乙二醇） 融 合， 或者（iv) —种多肽， 其中成熟多肽与附加氨基酸残基融合， 例如与前导或分 泌序列融合， 又如与用来纯化成熟多肽的序列融合。 通过本文的教导， 这样的片段、 衍生物及类似物可视为在本领域技术人员的知识范围内。
本发明的多肽和多核苷酸优选以分离形式提供的， 并且优选将其纯化成均一 (同质） 物质。
术语"分离的 "是指所述物质脱离了原始环境 (例如， 如果该物质是天然存在 的， 则指天然环境）。 例如， 一种在活体动物中天然存在的多核苷酸或多肽不是分 离的， 但从天然系统中部分或全部共存物质中分离出同样的多核苷酸或多肽则是分 离的。 这样的多核苷酸可以是载体的一部分， 这样的多核苷酸或多肽可以是组合物 的一部分， 只要这种载体或者组合物不是其天然环境的一部分。
本发明的多肽包括 SEQ ID N0: 2所示的多肽 (特别是成熟多肽）以及与 SEQ ID NO : 2 的多肽具有至少 85%的同源性， 更优选 90%的同源性， 最优选 95%的同源性的 多肽。 本发明还包括上述多肽的片段， 多肽片段通常包含至少 30个， 优选至少 50 个氨基酸。
如本领域所熟知的， 两个多肽之间的 "同源性"是通过将一个多肽的氨基酸 序列及其保守氨基酸取代与另一个多肽比较而确定的。
通过多肽合成， 本发明的多肽片段 （或部分多肽） 可用于生产全长多肽。 此 片段可用作产生全长多肽的中间体。 同样的， 本发明的多核苷酸片段可以用于合成 本发明的全长多核苷酸。
根据本发明的另一个方面， 涉及含有本发明多核苷酸的载体， 用本发明的载 体基因工程化的宿主细胞， 以及通过重组技术产生本发明多肽的方法。
宿主细胞是用本发明的载体经基因工程化 (转导、 转化或转染） 而产生的。 所 说的载体可以是克隆或表达载体。 载体可以是质粒、 病毒颗粒和噬菌体等形式。 工
程宿主细胞可以在经改良适于激活启动子、 筛选转化体或扩增本发明 Fwal l6 基因 的常规营养培养基中培养。 培养条件 （如温度和 pH 值） 是由不同的宿主细胞决定 的， 这些对本领域技术人员而言是显而易见的。
通过重组技术， 本发明的多核苷酸可以用于生产多肽。 多核苷酸可以包含在 任何一种适于表达多肽的载体中。 这样的载体包括染色体来源的、 非染色体来源的 和合成的 DNA序列。 例如 SV40衍生物， 细菌质粒， 噬菌体 DNA， 杆状病毒， 酵母 质粒， 从质粒和噬菌体 DNA 结合得到的载体， 病毒 DNA (如牛痘、 腺病毒、 家禽痘 病毒、 和假狂犬病病毒）。 此外， 还可以使用其它载体， 只要其可以在宿主中复制 并存活。
可以用多种方法将合适的 DNA 序列插入到载体中。 一般来说， 是用本领域已 知的方法将 DNA序列插入到适当的限制性核酸内切酶位点中。
表达载体中的 DNA序列可以与适当的表达控制序列（启动子)连接，以指导 mRNA 的合成。 启动子的例子有： LTR 或 SV 40启动子， 大肠杆菌的 ac或 trp, 噬菌体 λ 启动子， 以及已知其它的、 控制原核或真核细胞或其病毒中基因表达的启动子。 表达载体也以包含指导翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。 载体还可以包含 用于扩增表达的合适序列。
此外， 优选的表达载体包含一个或多个选择标记基因， 以便为转化后宿主细 胞的筛选提供表型特征。 例如用于真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗 性， 或者如用于大肠杆菌的四环素和氨苄青霉素抗性。
含有上述合适的 DNA 序列以及合适的启动子或者调控序列的载体可以用于转 化适当的宿主， 以使其表达蛋白质。
作为合适宿主的代表性例子有： 细菌细胞， 如大肠杆菌、 链霉菌、 鼠伤寒沙 门氏菌； 真菌细胞， 如酵母； 昆虫细胞如 Drosorphila 和 Spodoptera Sf9 ； 动物细胞如 CH0、 COS 或 Bowes黑素瘤； 腺病毒； 植物细胞等。 通过本文的教导， 选择合适的宿主可视作在本领域技术人员的知识范围内。
更具体地说， 本发明还包括含有以上广泛描述的一种或多种序列的重组构建 体。 构建体包括正向或反向插入了本发明核酸序列的载体， 如质粒或病毒载体。 在 更为理想的实施方案中， 构建体还包含了可操作地与所述序列连接的调节序列， 如 启动子。 许多合适的载体和启动子是本领域技术人员熟知的， 并可以通过商业途径 获得。 例如， 细菌载体： pQE70、 pQE60、 pQE- 9 (Qiagen)、 pBS、 pD10、 phagescript、 psiX174、 pbluescript SK、 pbsks、 pNH8A、 pNH16a、 pNH18A、 pNH46A (Stratagene)、 ptrc99a、 pKK223- 3、 pKK233- 3、 pDR540、 pRITS (Pharmaca)； 真核载体： pWLNE0、 pSV2CAT、 pOG44、 pXTl、 pSG (Stratagene) > pSVK3、 pBPV、 pMSG、 pSVL (Parmacia)。 此外， 还可以使用其它的质粒或载体,只要它们能够在宿主中复制并存活。
可以用带有 CAT (氯霉素转移酶） 或其它选择标记的载体从基因中选择启动子
区。 两个合适的载体是 PKK232-8和 PCM7。特别提到的细菌启动子包括 lacl、 lacZ、 T3、 T7、 gpt、 λΡΒ、 Ρ 和 trp。 真核启动子包括 CMV立即早期， SV 胸苷激酶， 早 期和晚期 SV40、 来自逆转录病毒的 LTRs和小鼠金属硫蛋白 -1。 选择适当的载体与 启动子可视作在本领域技术人员的知识范围内。
在另一个实施方案中， 本发明涉及包含上述构建体的宿主细胞。 宿主细胞可 以是高等真核细胞 (如哺乳动物细胞）， 或低等真核细胞 (如酵母细胞）， 或者是原核 细胞（如细菌细胞）。 通过磷酸钙转染、 DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔法可以实 现构建体向宿主细胞的导入（Davis, L.， Dibner, M. , Battey, I.， 分子生物学中 的基本方法， （1986) )。
宿主细胞中的构建体可以经由常规方式产生由重组序列编码的产物。 而且， 本发明的多肽可以用常规的多肽合成仪合成。
在合适启动子的控制下， 成熟蛋白可以在哺乳动物细胞、 酵母细胞、 细菌细 胞或其它细胞中表达。 用来源于本发明 DNA 构建体的 RNA, 通过无细胞翻译系统也 可以产生目的蛋白。 Sambrook 等人在 《分子克隆实验室手册》 中 （1989， 第二版， 纽约冷泉港实验室） 描述了可用于原核和真核宿主的、 合适的克隆及表达载体。
通过向载体中插入增强子序列， 可以提高高等真核生物细胞对编码本发明多 肽的 DNA的转录。 增强子是 DNA的顺式作用元件， 一般约 10至 300 bp, 它作用于 启动子以增强其转录。 增强子的例子有： 复制起点上游 100 至 270 bp 的 SV40增 强子、 多形瘤增强子以及腺病毒增强子。
一般地， 重组表达载体包括复制起点和筛选标记基因（如大肠杆菌的氨苄青霉 素抗性基因和啤酒糖酵母的 TRP1 基因）， 以及从高度表达的基因中得到、 能够指 导下游结构基因转录的启动子。 这样的启动子可以从编码糖酵解酶 (例如 3-磷酸甘 油酸激酶 (PGK) )、 α-因子、 酸性磷酸酶或热休克蛋白等的操纵子中得到。 异源序列 以恰当的方式与翻译起始序列及终止序列装配。 优选地， 与能够指导蛋白向细胞周 质或细胞外培养基分泌的前导序列装配。 异源序列可以编码含有 Ν-末端识别肽的 融合蛋白， 该识别肽具有理想的特征， 如稳定表达的重组产物或者简化纯化步骤。
将编码目的蛋白的结构基因， 合适的翻译起始和终止信号， 以及有功能的启 动子一起插入， 可以构建适用于细菌的表达载体。 所说载体包含一个或多个选择标 记和一个复制起点， 以维持载体并在必要时在宿主中扩增载体。 适合转化的原核宿 主包括大肠杆菌、 枯草芽孢杆菌、 鼠伤寒沙门氏菌、 假单胞菌属、 链霉菌属和葡萄 球菌属的多个种。
作为代表性但非限制性的例子， 用于细菌的表达载体可以含有源自市售载体 的选择标记和复制起点， 这些市售载体包含公知的克隆载体 pBR322 (ATCC37017)的 遗传元件。 这样的市售载体包括， pKK223- 3 (Pharmacia Fine化学品公司， Uppsala, 瑞典）和 GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI， 美国）。 这些 BR322 "骨架"部分与
适当的启动子和待表达的结构序列相结合。
转化合适的宿主菌株， 待其生长至合适的细胞密度后， 用恰当的方法 (例如温 度变换或化学诱导）诱导选择的启动子， 并继续培养细胞一段时间。 常用离心法收 获细胞， 用物理或化学方法破碎细胞， 保留得到的粗产物以进一步纯化。 可以用任 一种常规的方法破碎微生物细胞， 所述方法包括冻融法、 超声处理、 机械破碎或使 用细胞裂解剂， 这些方法是本领域技术人员熟知的。
各种哺乳动物细胞培养系统也可用于表达重组蛋白质。 哺乳动物表达系统的 例子有由 Gluzman (细胞， 23 : 175 (1981) )描述的猴肾成纤维细胞 COS- 7细胞系和能 够表达相容载体的其它细胞系， 例如， C127， 3T3, CHO, HeLa和 BHK 细胞系。 哺 乳动物表达载体包含复制起点、 适合的启动子和增强子， 以及任何必需的核糖体结 合位点、 聚腺苷酸化位点、 剪接供体和受体位点、 转录终止序列和 5'侧翼非转录序 列。 从 SV40病毒基因组中得到的 DNA序列， 如 SV40复制起点、 早期启动子、 增强 子、 剪接及多聚腺苷酸化位点可用来提供所需要的非转录遗传元件。
可以用多种方法从重组细胞培养物中回收和纯化本发明的多肽， 所述方法包 括硫酸钕或乙醇沉淀、 酸提取、 阴离子或阳离子交换层析、 磷酸纤维素层析、 疏水 作用层析、 亲和层析、 羟基磷灰石层析、 植物凝集素层析和高效液相色谱层析 (HPLC)。
本发明的多肽可以是天然纯化的， 或是化学合成的， 或是用重组技术从原核 或真核宿主 (例如细菌、 酵母、 高等植物、 培养的昆虫和哺乳动物细胞)制备的。 根 据重组方法中使用的宿主， 本发明的多肽可以是糖基化的或非糖基化的。 本发明的 多肽也可以包含一个起始的甲硫氨酸残基。
本发明的多核苷酸和多肽可以用作人类疾病的治疗和诊断的研究试剂和材 料。 Fwall6 具有抑制炎症的作用， 可以被用于治疗心血管炎症性动脉粥样硬化疾 病， 如脑中风、 冠心病、 心绞痛和心肌梗塞。 还可以被用于防治肿瘤。
根据本发明的另一方面， 提供了鉴定本发明多肽兴奋剂或拮抗剂的方法。 方 法之一是在某种化合物存在的情况下， 将表达 Fwal l6 受体的哺乳动物细胞或膜制 剂与 Fwal l6多肽一起培养， 检测该化合物增强或阻断 Fwal l6多肽与受体相互作用 后产生第二信使的能力。 第二信使系统包括但不限于： 蛋白酪氨酸激酶系统（PTK)、 cAMP、 鸟苷酸环化酶、 离子通道或磷酸肌醇水解作用。 鉴定多肽拮抗剂的另一种方 法是竞争抑制法。 该法将某化合物不存在时， 与受体结合的 Fwal l6 多肽分子数设 为对照， 通过检测该化合物存在时， 与受体结合的 Fwal l6 多肽分子数的变化来确 定潜在的拮抗剂。
潜在的拮抗剂包括抗体， 或者在某些情况下包括与本发明多肽结合的寡肽， 它们与所述多肽结合并有效地消除其功能。
另一个潜在的拮抗剂化合物是用反义技术制备的反义构建体。 通过三股螺旋
形成反义 DNA或 RNA从而控制基因的表达， 上述方法均基于多核苷酸与 DNA或 RNA 的结合。 例如， 可以依据编码本发明成熟多肽的核酸序列 5'端， 设计长约 10至 40 个碱基对的反义 RNA。 又如设计一种与转录涉及的基因区互补的 DNA (三螺旋-参见 Lee等， 核酸研究， 6 : 3073 (1979)； Cooney等， 科学， 241 : 456, (1988)； 和 Dervan 等， 科学， 251 : 1360 (1991) ) , 从而阻止转录以及本发明多肽的产生。 反义 RNA在 体内和 mRNA杂交， 并阻断 mRNA分子翻译成为本发明的多肽（反义 -Okano, J. 神经 化学杂志， 56 : 560 (1991) ; 作为基因表达反义抑制剂的脱氧寡核苷酸 (CRC出版社， Boca Raton , FL (1988) )。 可以将上述寡核苷酸传送至细胞， 从而在体内表达反义 RNA和 DNA以抑制本发明多肽的产生。
拮抗剂还包括一些小分子， 这些小分子通过与本发明的多肽结合而阻止多肽 与其受体的相互作用， 从而阻断其正常的生物活性。 小分子包括但不限于小肽或类 肽分子。 '
本发明的多肽、 其兴奋剂和拮抗剂可以与合适的载体结合形成药物组合物。 这样的组合物包含治疗有效量的多肽和药学上可接受的载体或赋形剂。 载体包括但 不限于盐水、 缓冲液、 葡萄糖、 水、 甘油、 乙醇以及上述物质的组合。 其配方应与 给药的方式相宜。
本发明还提供了一种药物包装或试剂盒， 其内装有一个或多个容器， 容器内 装有本发明药物组合物的一种或多种组分。 与之同时提供的可以是经政府药物管理 机构审核的、 有关药品或生物制品制造、 使用及销售的信息。 本发明的药物组合物 还可以与其它的治疗化合物结合使用。
药物组合物可以按常规方式给药， 如口服、 局部、 静脉内、 腹膜内、 肌内、 皮下、 鼻内或真皮内途径。 以治疗和 /或预防特定疾病有效的剂量施用药物组合物。 通常以至少大约 10微克 /千克体重的量给药。 在大多数情况下， 以不超过每天约 8 毫克 /千克体重的量给药。 在大多数情况之下， 考虑到用药途径和症状等因素， 给 药剂量从每日大约 10微克 /千克到 1毫克 /千克体重。
根据本发明的另一方面， 可以通过在体内表达的方式使用本发明的多肽及其 激活剂和拮抗剂， 这种方式常被称作"基因治疗"。
因此， 可以在体外用编码本发明多肽的核酸 (DNA或者 RNA)对患者细胞进行基 因工程化处理， 再将工程化的细胞提供给需要治疗的患者。 上述方法是本领域熟知 的。 例如， 可以用含有编码本发明多肽的 RNA的逆转录病毒对细胞进行基因工程化 处理。
类似的， 可以通过本领域已知的方法在体内基因工程化细胞， 以便在体内表 达多肽。 例如， 用含有编码本发明多肽的 RNA的逆转录病毒转导包装细胞， 以使其 能够产生含有目的基因的感染性病毒颗粒。 将这种生产细胞用于患者,从而在体内 工程化细胞并表达所说的多肽。 根据本发明的教导， 通过上述方法或其它方式施用
本发明的多肽对本领域技术人员而言是显而易见的。
可以得到逆转录病毒质粒载体的逆转录病毒包括但不限于：莫洛尼氏 (Moloney) 鼠白血病病毒、 脾坏死病毒、 反转录病毒如劳氏（Rous)肉瘤病毒、 Harvey 肉瘤病 毒、 禽白血病病毒、 长臂猿白血病病毒、 人类免疫缺陷病毒、 腺病毒、 骨髓增生肉 瘤病毒和乳房肿瘤病毒。
所述载体包含一个或多个启动子。 可使用的合适启动子包括但不限于： 反转 录病毒 LTR ; SV 40启动子； 人巨细胞病毒 (CMV)启动子 (Miller等， 生物技术， Vol. 7, No. 9, 980-990 (1989)描述）； 或其它启动子（例如真核细胞启动子， 包括但不 限于组蛋白、 pol III 和 β-肌动蛋白启动子）。 其它可采用的病毒启动子包括但不 限于:腺病毒启动子、 胸苷激酶 (ΤΚ)启动子和 B19 细小病毒启动子。 通过本文的教 导， 选择载体上合适的启动子对本领域技术人员而言是显而易见的。
编码本发明多肽的核酸序列应当有合适的启动子控制。 可以使用的合适的启 动子包括但不限于： 腺病毒启动子 (如腺病毒主要晚期启动子）； 或者异源启动子（如 巨细胞病毒 (CMV)启动子）；呼吸合胞体病毒 (RSV)启动子；可诱导的启动子（如 ΜΜΤ启 动子、 金属硫蛋白启动子）； 热休克^动子； 清蛋白启动子； ΑροΑΙ 启动子； 人类 珠蛋白启动子； 病毒胸苷激酶启动子（如单纯疱疹胸苷激酶启动子）； 反转录病毒 LTRs (包括上文描述的修饰的反转录病毒 LTRs) ; β_肌动蛋白启动子和人类生长激 素启动子。 启动子也可以是编码所述多肽的基因的天然启动子。
可以用反转录病毒质粒载体转导包装细胞以产生生产细胞。 可被转染的包装 细胞包括但不限于： ΡΕ501、 ΡΑ317、 ψ- 2、 ψ- ΑΜ、 ΡΑ12、 T19- 14Χ、 VT- 19- 17- Η2、 ψΟ¾Ε、 ij/CRIP、 GP+E- 86、 GP+envAml2和 DNA细胞系（Miller、人类基因治疗， Vol. 1， pgs. 5-14 (1990)描述的， 其全部内容本文一并参考）。 载体可以用任何本领域己知 的方法转导包装细胞。 这些方法包括但不限于： 电穿孔、 使用脂质体和 CaPC 沉淀。 另外， 逆转录病毒质粒载体可以包埋在脂质体中， 或者偶联到脂类上， 然后引入宿 主中。
生产细胞系产生感染性逆转录病毒载体颗粒， 该颗粒包含能够编码所述多肽 的核酸序列。 可以用这些逆转录病毒载体在体内或体外转导真核细胞。 被转导的真 核细胞将表达编码所述多肽的核酸序列。 可以被转导的真核细胞包括但不限于： 胚 胎茎千细胞、 胚胎癌细胞、 以及造血茎干细胞、 肝细胞、 成纤维细胞、 成肌细胞、 角质化细胞、 内皮细胞和支气管上皮细胞。
根据本发明的另一方面， 本发明涉及 Fwal l6基因在诊断或检测中的用途， 通 过检测 Fwal l6核酸序列中的突变可以诊断出相关疾病或对疾病的易感性。
可以用多种技术在 DNA水平上检测出携带 Fwal l6基因突变的个体。 可以从患 者的细胞， 如来自血液， 尿， 唾液， 活组织检查和尸体解剖材料的细胞。基因组 DNA 可以直接用于检测， 或者在分析前可以用 PCR 扩增 (Saiki 等， 自然， 324 : 163-
166 (1986) )。 RNA或 cDNA也可用于相同目的。 例如， 与本发明多核苷酸互补的 PCR 引物可于鉴别和分析突变。 如通过与正常的基因型相比较， 根据扩增产物的大小改 变来检测缺失及插入。 可以经与可以用放射性标记的 RNA 或反义 DNA 与扩增后的 核酸序列杂交， 以鉴别点突变。 用 RNaseA 消化或通过解链温度的差异， 可以辨别 完全配对序列和错配的双链。
通过 DNA测序可以直接揭示对照基因和携带突变基因之间的序列差异。 此外， 克隆的 DNA片段可以作为探针检测特异的 DNA区段。 当与 PCR结合使用时， 这种方 法的灵敏性大大提高， 例如， 将测序引物和双链 PCR产物、 或者由改良的 PCR法产 生的单链模板分子一起使用。 常规的自动测序法用放射性标记或荧光标记来确定核 酸序列。
基于 DNA序列差异的遗传试验可以通过检测在含有或不含变性剂的凝胶中， DNA 片段电泳迁移率的变化来实现。 小的序列缺失和插入可以由高分辨率凝胶电泳显 示。 不同序列的 DNA片段可以在变性甲酰胺梯度凝胶上进行区分， 根据其特定的熔 点或部分解链温度， 不同的 DNA片段将停滞在凝胶的不同位置 (参见 Myers 等， 科 学， 230 : 1242 (1985) )
用 RNase和 S1保护的核酸酶保护分析法或化学裂解法也可以检测特殊位置上 的序列变化， （如 Cotton等， PNAS, 美国， 85 : 4397-4401 (1985) )。
因此， 可以用杂交、 核糖核酸酶保护、 化学裂解、 直接 DNA测序、 或使用限 制酶（如限制性片段长度多态性（RFLP) )和基因组 DNA的 Southern印迹法来检测 DNA 序列的差异。
除了更常规的凝胶电泳和 DNA测序之外， 突变也可以用原位分析法检测。 根据本发明的另一方面， 本发明涉及一种通过检测不同组织中 Fwal l6多肽含 量的改变而进行的诊断分析方法。 这是基于与正常对照组织相比， 某组织中该多肽 的过量表达可以检测疾病或疾病易感性的存在。 检测取自宿主的样品中本发明多肽 之含量的分析方法是本领域技术人员熟知的， 方法包括放射免疫测定、 竞争结合测 定、 Western 印迹分析、 酶联免疫吸附 ( ELISA ) 测定和 "夹心"测定， 优选 ELISA 检测。 ELISA 测定包括首先制备本发明多肽的特异性抗体， 优选单克隆抗体。 然后 制备该单克隆抗体的报导抗体。 将报导抗体与一种可检测试剂相结合， 所说试剂如 放射性试剂、 荧光试剂或者辣根过氧化物酶。 从宿主取样， 并将其在与样品中蛋白 质结合的固体支持物（如聚苯乙烯皿）中温育。 通过和非特异性蛋白质 (如牛血清清 蛋白）一起温育， 将覆盖皿中任何自由的蛋白质结合位点。 接下来， 在单克隆抗体 和结合到聚苯乙烯皿上的本发明任何多肽结合期间， 将单克隆抗体在皿中温育。 用 缓冲液将所有未结合的单克隆抗体洗掉。 此时， 将和辣根过氧化物酶连接的受体抗 体放入皿中， 结果导致受体抗体和任何结合到本发明多肽上的单克隆抗体结合。 然 后将未结合的单克隆抗体洗掉。接着向皿中加入过氧化物酶底物， 和标准曲线比较，
在给定时间内产生的颜色的量即是给定体积的患者样品中存在的蛋白质的量。 也可以用竞争测定法检测多肽含量。 方法包括将 Fwal l6多肽的特异性抗体结 合到固相支持物上， 然后标记 （如放射性标记） 本发明的多肽， 将取自宿主的样品 通过固相支持物， 然后通过检测标记量， 确定样品竞争性结合抗体的量， 从而确定 样品中本发明多肽的含量。
本发明的多核苷酸序列对染色体的鉴别也极有价值。 该序列特异性地靶向于 人染色体的特定位置， 并与之杂交。 目前， 仅有少数几种基于实际序列数据（重复 多形性）的染色体标识试剂可用于标记染色的体位置。 基于本发明 DNA 的染色体作 图是将这些序列和疾病相关基因关联的首要的步骤。
简言之， 通过由 cDNA制备 PCR引物 (优选 15-25bp) 可以进行序列的染色体定 位。 通过计算机分析基因的 3'非翻译区， 可以快速选择引物。 引物不应跨越基因组 DNA的第一个外显子， 否则将使扩增复杂化。 然后， 将引物用于 PCR 以筛选含有单 个的人染色体的体细胞杂和体。 只有含有与该引物相应的基因的杂和体才会产生扩 增片段。
体细胞杂合体的 PCR作图是将特定 DNA 定位于特定染色体的快捷方法。 根据 本发明， 用相同的寡核苷酸引物和来自特定染色体或大基因组克隆的一组片段， 依 照类似方法可以完成亚定位。 可以用于染色体作图的其它作图方法包括原位杂交、 用标记的、 经流式分选的染色体进行预筛选以及用杂交进行预筛选， 从而构建染色 体特异性的 cDNA文库。
cDNA 克隆与中期染色体涂片的荧光原位杂交 (FISH)可以实现更精确的染色体 位置。 该技术可以采用 50或 60个碱基长短的 cDNA。 详见 Verma等人的综述， 人 类染色体：基本技术手册， Pergamon 出版社， 纽约（1988)。
一旦完成了基因在染色体上的精确定位， 则可以将该基因在染色体上的物理 位置与遗传图谱数据联系起来。 这些数据可以在例如 V. McKusick, 人类孟德尔式 遗传中找到 （可通过互联网在 Johns Hopkins 大学的 Welch 医学文库中得到）。 然 后通过连锁分析 (物理相邻基因的共遗传）， 确定基因与己定位到染色体相同区域的 疾病之间的关系。
随后需要确定患病个体和正常个体之间 cDNA或者基因组序列的差异。 如果在 部分或全部患病个体中观察到突变， 但在正常个体中观察不到， 则所述突变可能是 疾病的病因。
所说的多肽、 其片段、 其衍生物或类似物， 或表达上述物质的细胞可用作免 疫原而产生抗体。 抗体可以是多克隆或单克隆抗体。 本发明也包括嵌合的、 单链和 人源化的抗体， 以及 Fab片段或 Fab表达文库的产物。 本领域已知的多种方法均可 用于产生这些抗体和片段。
通过向动物体（优选非人体)直接注射或者施用本发明的多肽可以获得相应的
抗体。 这样获得的抗体会与所述多肽结合。 这样， 即使是编码多肽片段的序列也可 以产生能够结合整个天然多肽的抗体。 进而用这种抗体从表达该多肽的组织中分离 多肽。
为了制备单克隆抗体， 可以采用任何一种通过连续的细胞系培养而生产抗体 的技术。 例如杂交瘤技术（Kohler 和 Milstein, 1975, 自然， 256 : 495-497)、 三 体杂交瘤技术、 人 B-细胞杂交瘤技术 (Kozbor等， 1983， 今日免疫学， 4 : 72)和 EBV- 杂交瘤技术 (Cole, 等， 1985， 单克隆抗体和癌癌症治疗， Alan R. Liss， Inc. , pp. 77-96)。
可以将所述生产单链抗体的技术 (美国专利 4， 946, 778)加以改进， 以生产抗 本发明多肽（具免疫原性）的单链抗体。也可以用转基因小鼠表达抗本发明多肽（具 免疫原性） 的人源化抗体。
为了更清楚地理解本发明的实质， 现参照下列附图和实施例对其进行解释。 附图和实施例是为了说明而不以任何方式限制本发明。 附图简述
图 1显示了 Fwal l6在正常组织的分布。 β- actin作对照。其中 A、 Fwal l6; B、 β- actin。
图 2显示了 Fwal l6在不同肿瘤细胞株中的分布。其中 Α、 Fwal l6; Β、β- actir 图 3 显示了氧化低密度脂蛋白和金雀异黄素浓度对内皮细胞表达 Fwall6的影 响。 A、 反应结果； B、 上样量。
图 4显示了 Fwal l6在正常、亚急性心衰和慢性心衰动物主动脉中的表达情况。 A、 正常动物主动脉； B、 亚急性心衰动物主动脉； （：、 慢性心衰动物主动脉。
图 5 显示了 Fwal l6在正常、 亚急性心衰和慢性心衰动物心脏血管中的表达情 况。 A、 正常动物心脏血管； B、 亚急性心衰动物心脏血管； （：、 慢性心衰动物心脏 血管。
图 6显示了 Fwal l6在人正常心肌组织和急性心肌梗塞室壁瘤组织中的表达情 况。 A、 人正常心肌组织； B、 人急性心肌梗塞室壁瘤组织。
图 Ί显示了过度表达 Fwall6基因诱发 ECV304细胞增殖的情况。 实施例
实施例一、 成人主动脉 cDNA文库的构建 1.1 R A的提取
RNA gents® Total RNA Isolation System kit购自美国 Promega公司 （Cat
No.Z5110)。 操作如下： 称取 0.3g液氮中保存的成人主动脉组织， 加入 10ml变性液 (4M异硫氰酸胍、 25mM柠檬酸三钠） 和 1ml 2M乙酸钠 （pH4.0) 匀浆。 加入等 体积水饱和酚和 0.2倍体积氯仿， 剧烈振荡 15秒， 冰上放置 15分钟。 lOOOOrpm, 4 °C离心 20分钟。 取上清， 加等体积异丙醇， -20Ό放置 2小时， 离心。 再用变性液 5ml悬浮沉淀， 重复上述步骤。 用 lml冰预冷的 75%乙醇洗涤沉淀，室温下蒸发痕量 乙醇 5-10分钟， 用焦碳酸二乙脂 （diethyl pyrocarbonate, 以下简称 DEPC) 处理的 去离子水溶解 RNA。
1.2 mRNA的分离 成熟的 mRNA的 3'端有一条由 20-250个腺苷酸组成的 Poly(A)。 根据该特征， 可用亲和层析法分离 mRNA和其它的 RNA。 本实验使用的 oligo(dT)纤维素含有 12-18个核苷酸（ T )的多聚链。在多盐条件下，带有 oligo(A)尾巴的 mRNA与 oligo(dT) 结合并留在柱子上， 而无 oligo(A)尾巴的 rRNA与 tRNA被洗掉， 然后用低盐液洗 脱挂在柱子上的 mR A。
Quick prep ® micro mRNA purification kit购自瑞典 Pharmacia公司。 在 1.5ml 无 R A酶的离心管 1#内加入 lml oligo(dT)纤维素悬液； 另取 1.5ml离心管 2#, 加 入用上样缓冲液稀释的总 RNA lml; 管 2#和管 2#室温离心 1分钟， 12, OOOrpm; 吸去管 1#上清，将管 2#的上清加入管 Is,轻摇 5-10分钟；室温离心 10秒， 12, OOOrpm; 用 lml高盐缓冲液 （lOmM Tris-HCl pH7.5， ImM EDTA, 0.5M NaCl) 洗涤 5次， 离心； 用 lml低盐缓冲液 （10mM Tris-HCl pH7.5, ImM EDTA， 0.1M NaCl) 洗 涤 5次， 离心; 用 0.3ml低盐缓冲液悬浮 oligo(dT)沉淀并转移到微量离心柱， 12， OOOrpm, 离心 5秒； 用 0.5ml低盐缓冲液洗涤 3次， 离心； 用 2 X 0.2ml洗脱液收集 mRNA; 用分光光度计测定光密度， 计算 OD260/280的比值； 得到 300 μ ΐ mRNA, 加入 7.5 μ 1糖原， 30 μ 1 2.5Μ乙酸钾 (ρΗ5.0)， 750 u l无水乙醇在 -70°C保存备用； 使用前离心 5分钟， 75 %乙醇洗涤， DEPC水溶解 mRNA。 1.3 cDNA的合成 合成步骤参照 ZAP ExpressTmcDNA Synthesis Kit*and ZAP ExpressTmcDNA Gigapack® II Gold Cloning Kit* (美国 Stregene公司， Catalog No.200403和 200404) 的说明书。
在 0.5ml离心管中依次加入 5 μ 110Χ第一链缓冲液，3 μ 1甲基化的 dNTP混合 物， 2 μ 1 Xho I连接子 oligo(dT)18引物 （1.4 w g/ y l)， 32.5 μ 1用 DEPC处理的去 离子水， l y lRNA酶抑制剂 （40υ/ μ 1)， 5 u g mRNA, 置室温 10分钟。 再加入 1.5 μ ΐ莫洛尼氏鼠白血病病毒 （MMLV) 反转录酶 （50ΐ!/ μ 1)， 总反应体积 50 μ 1。 从
中取出 5 μΐ转入另一离心管，加入 0.5 μΐ α-32Ρ三磷酸脱氧腺苷 (dATP)(800ci/mmol) 以鉴定第一链合成质量。 上述反应均在 37°C进行。 得到的 DNA7RNA杂交分子在 DNA聚合酶 I的作用下， 以第一链为模板合成 第二链。在冰浴中依次加入 45 μΐ第一链 cDNA，20PllOX第二链缓冲液， 6μ1(1ΝΤΡ 混合物， 114μ 1去离子水， 2μ 1[ α ·32ρ](1ΑΤΡ(800οί/πιιηο1), 2μ 1 RNA酶 H(1.5u/ μ 1)， ΐμΐ DNA聚合酶 1(9.0 u/μΐ), 总体积 200μ1。 混匀， 16°C孵育 2.5小时。 反应结束 后， 用酚： 氯仿 （1: 1) 抽提， 乙醇沉淀。
1.4 cDNA与载体的连接 从试剂盒中取出 9μ 1 EcoRI连接子 （序列分别为 5'_AATTCGGCACGAG— 3' 和 3'— GCCGTGCTC— 5') 溶解沉淀。 取 Ιμΐ电泳， 鉴定第一和第二链合成质量。 在剩余的 8 u 1第二链 cDNA中依次加入 1 μ 110 X连接酶缓冲液， 1 μ 110mmol/L Y -三磷酸腺苷（Y -ATP)， 1 1 T4DNA连接酶 (4u/ul), 8°C水浴 16小时后， 7(TC孵 育 30分钟。 用限制酶 Xhol消化 1.5小时。 琼脂糖凝胶 (SepharOSe)Cl-2B过柱分离， 除去小于 400碱基的核苷酸， 以提高全长 cDNA在 cDNA文库中的比例。 1.5 cDNA克隆入 ZAP噬菌体载体
ZAP噬菌体载体 （美国 Stratagene公司） 上的多克隆位点允许插入长达 10Kb 的核酸片段， 进入宿主后质粒部分可从载体上切开， 形成质粒载体 BlUeScript。 该 载体多克隆位点两侧有丁7和 T3噬菌体的启动子， 可以用于序列分析和探针合成。 插入载体的 cDNA片段可以表达具抗原性和生物活性的融合蛋白。 实验详述如下： 在离心管内加入 100ngcDNA， 0.5 μ 110X连接酶缓冲液， 0.5 μ 110mmol/L Υ -
ATP (pH7.5), lul ZAP噬菌体载体 (lug/ul)， o.5ul T4 DNA连接酶（4u/ul)， 加去离子 水至总体积 5 μ 1。 12°C连接 16小时。 连接产物需包装外壳蛋白以产生有转染活性的重组噬菌体。 快速从 -70°C取出 包装蛋白， 溶解后， 在 25ul包装蛋白内加 lul连接反应物， 混匀， 22°C反应 2小时， 加入 500ul SM缓冲液 （0.1M NaCl, 0.08M MgS04.7H20, 0.05M Tris-HCl, 0.01% 明胶）， 20ul氯仿。 此混合物即为原始的 cDNA文库。
1.6计算阳性克隆的效价 取 5ul原始的 cDNA文库， 用 45ul SM缓冲液稀释。 将 10ul稀释后的溶液， 加入 200ul感受态 XL Blue MRF宿主菌中 （OD600=0.5)。 37°C水浴 20-30分钟， 加入 3ml上层琼脂糖， 混匀， 铺于 NZY (0.09M NaCl, 0.08M MgS04.7H20, 0.5% 酵母提取液， 1%NZY) 平板上， 倒置， 37°C培养过夜， 计算平板上的克隆数。
cDNA文库的效价用噬菌斑成斑数 （pf ml ) 表示。 pfu/ml= (噬菌斑数 X稀释 倍数） X 1000/稀释液用量 (ul)。 容量大于 1 X 106个克隆的 cDNA文库， 能够保证其 中含有每一个单拷贝的 mRNA.本发明成人主动脉 cDNA文库的库容量为 2.4X 106 个独立重组克隆。 1.7 cDNA文库的扩增和保存 构建的 cDNA文库可直接用于筛选， 但不稳定。 因为非野生型的噬菌体易失 活， 故需要扩增以方便多次筛选。 取 5 X 104个噬菌体转染 XLl-Blue MRF宿主菌， 铺板， 37°C孵育 8-10小时， 然后在 150mm平皿中加入 8ml SM缓冲液， 4°C培养过 夜。 离心， 收集上清， 即得到扩增后的 cDNA文库。 加入 0.3%氯仿， 4°C 保存。 长期保存需加入 7%的二甲基亚砜 （DMSO)， -70°C冻存。
实施例二、 新全长 cDNA的克隆
2.1 随机克隆的多聚酶链反应 （PCR) 扩增 cDNA文库铺盘， 噬菌斑密度为 200-500个克隆 /培养皿 （150mm)， 挑取清亮 的单个噬菌斑转入含有 75ul SM缓冲液和 5ul氯仿的无菌离心管中， 置于 4°C。 用 前混匀离心， 取上清液 5ul， 用 ZAP 噬菌体载体 3'端引物 （ 5' CCAAGCTCGAAATTAACCCTCAC 3' ) 禾口 5' 端 弓 I 物 ( 5' CAGTCAATTGTAATACGACTCACT 3') 进行 PCR扩增， 反应总体积 50ul。 扩增参 数为 94°C预变性 3分钟； 再 94Ό45秒， 55°C30秒， 72°C3分钟， 共 30个循环； 72 °C延伸 5-10分钟。 根据 1%琼脂糖凝胶中电泳带的亮度估算 PCR产物的产量。
2.2表达序列标签 （EST) 的序列测定
ABI377 自动测序仪 （ABI PRISM™377DNA sequencer) 和自动测序试剂盒 (BigDye™ Terminator Ready Reaction Mix) 购自美国 PE公司。 依照推荐的使用条 件， 用双脱氧链终止法测序。 用非放射性 CY5荧光素（CY5-fluoroscein)作标记物，通用测序引物 Τ3 (5' ATT
AAC CCT CAC TAA AGG GA 3') 禾口 Τ7 (5' TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG3') 进行测序， 每份样品中引物用量为 5pmol/ul。 测序模板为 PCR产物， 用量约 30-100 ng。 PCR扩增参数为 94°C 3-5分钟； 再 94°C 30秒， 50°C 15秒， 72°C 1分钟， 20 个循环； 94°C 30秒， 72°C 1分钟， 15个循环； 再 72°C 延伸 5分钟。 DNA产物在 8mol/L尿素、 6%聚丙烯酰胺凝胶板上电泳。 电压 1500V, 功率 34W, 电泳 250-300 分钟 （ ALF Express™ DNA sequence， 瑞典 Pharmacia公司）。
2.3 EST的生物信息学分析 用美国生物信息中心的 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 软件， 将 每个 cDNA 克隆的 EST 与 GenBank/EMBL/DDBJ 数据库进行同源性比较 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov ) .根据 BLAST的判断标准 （国内外大多数实验室的 通用标准）： 同源序列小于 100—200个碱基， Score值小于 100的序列为新的 EST。 本发明 Fwal l6的 EST为新 EST。
2.4 EST引物步移法测序
2.4.1 ZAP噬菌体的体内环化
ZAP噬菌体载体能将目的片段在宿主内直接从 λ噬菌体载体转移到质粒， 环 化为 PBK-CMV (带有 CMV病毒早期启动子） 噬菌粒。 环化步骤参照说明书 （ZAP Express cDNA Synthesis kit and ZAP Express cDNA Gigapack"11 Gold Doning kit)。 用 3 ul保存在 4 °C携带新 EST的噬菌体和 lul辅助噬菌体 （一类自身复制能 力极低的噬菌体突变体， 可以为寄主细胞中质粒 DNA的 复制与包装提供蛋白酶和 外壳蛋白质）共转染 300ul大肠杆菌 XL1 -Blue MRF株（ OD600-1.0)。获得单链 DNA 后， 再转染大肠杆菌 XLOLR株 （试剂盒提供）， 在试管内加 5ml LB培养液， 25ul 卡那霉素， 37°C培养 12— 16小时。
2.4.2质粒的提取和鉴定 用德国 QIAGEN公司的 "QIAPrep Spin Miniprep kit"提取质粒。 2400rpm， 4°C 离心 10分钟，收集过夜培养的细菌。弃上清，加入 25ul缓冲液 PK lOOul/ml RNaseA, 50mM Tris/HCl , lOmM EDTA, pH8.0) 悬浮细菌， 移至灭菌的 1.5ml离心管内。 加 250ul缓冲液 P2 (200mM NaOH, 1% SDS)， 颠倒上清几次， 充分混匀。 力 B 350ul 缓冲液 P3 ( 3.0M KAc,pH5.5 )，立刻摇管 4-6次。 12000rpm，离心 10分钟（SORVALL® Mcl2V台式离心机）。收集上清， 将其移至底部套有收集管的微型纯化柱（QIA prep Spin Miniprep ) 内， 12000rpm, 离心 30-60秒。 加 0.75ul缓冲液 TE ( lOmM Tris HCl, ImM EDTA, pH8.0) , 离心 30-60秒。 去掉收集管， 在 QLAprep微型纯化柱底部套 一个灭菌的离心管， 加 50ul缓冲液 EB ( lOmM Tris-HCl pH8.5 ) 或去离子水， 在柱 床内保留 1分钟后离心 1分钟， 收集纯化的 DNA。
在离心管内加入 3ul酶切缓冲液（10 X )， lul Notl内切酶（15u/ ul)， lul ECoRI 内切酶 ( 15u/ul ) , lul BSA, 2ul DNA, 22ul去离子水， 总体积 30ul。 37 °C温育 4-6 小时。 酶切后鉴定质粒大小。
2.4.3新的全长 cDNA的测定
用美国 PE公司的 ABI 377自动测序仪和测序试剂盒 BigDye™ Terminator Ready Reaction Mix测定 PBK-CMV阳性克隆的序列。 反应液中有 BD 4ul, BOB 2ul (400mM Tris-HCl, pH9.0, lOmM MgCl2), 引物 2 ul(5pmol/ ul), DNA模板 30-100 ng， 用 H20补足至终体积 20ul。 用步移法 （逐级 引物法） 测定 cDNA 全长序列， 即下一轮的测序引物由上轮测序所得产物的末端碱 基确定。 用 oligo 14. 0软件设计 PCR引物。 结果：
如 SEQ ID NO: 1所示， Fwal l6 cDNA全长 2546个碱基对。 根据 kozak规律， 推测其起始密码子为 1002至 1004位核苷酸 （ATG)。 终止密码子为 2259至 2261位 核苷酸 （TGA), 其开放读码框架为 1002至 2261位核苷酸。 BLAST分析的结果表明 该基因定位于 17号染色体。
蛋白同源性分析显示： Fwall6成熟多肽与 cdk5激活剂结合蛋白 C53蛋白的同 源性为 70%。 推测的 Fwal l6蛋白由 409个氨基酸组成。 其序列特征为： （A) 从 148 151 Aa (NYTV) 为 N-糖基化位点。 (B) 从 405至 408 Aa (KRYS ) 为 cAMP和 cGMP 依赖的蛋白激酶位点。 （C) 从 13至 18 Aa GVSWAE) , 157至 162 Aa (GTEPSV), 193 至 198Aa (GTDSGI ), 204至 209 Aa (GIDWGI ), 222至 227 (GIDWGD) 为豆蔻酰化 位点。 （D) 从 41 至 43 Aa (SLK), 57 至 59 Aa (SRK), 77 至 79 Aa (SCK), 339 至 341 Aa (SPR)， 404至 406 Aa (SKR), 408至 410 Aa (SGR) 为蛋白激酶 C位点。 ( E) 从 15至 18 Aa (SWAE), 57至 60 Aa (SR E), 113至 116 Aa (SLGE)， 131至 134 Aa (SPTE), 150至 153 Aa (TVYE), 156至 159 Aa (TGTE), 161至 164 Aa (SVVE), 235至 238 Aa (TVLE), 255至 258 (TLLE), 316至 319 (SVLE) 为酪蛋白激酶 II 位点。 （F) 270至 291 Aa ( LMELEIF， LAQRAVE, LSEEADVL)及 277至 29 8 Aa (LAQRAVE, LSEEADV, LSVSQFQL) 为亮氨酸拉链结构。 实施例三、 Fwal l6在正常组织的分布
3. 1 实验材料
含 12种组织 mRNA的多组织膜 （MTN膜） 购自美国 Clontech公司， 用其检测 Fwall6基因在正常组织中的分布。 β-actin是一种管家基因， 在多种组织中表达均 一， 本实验中用作对照。
3. 2 Northern杂交
方法参照 《现代分子生物学实验技术》 （卢圣栋主编， 中国协和医科大学出版 社， 第二版， 1999) 147-149, 202-205， 207- 213页。 详述如下：
3. 2. 1 总 RNA提取
N02/00127 称取 0.5g正常成人心脏组织于 50ml离心管中， 加入 10ml GTC, 匀浆。 加等 体积水饱和酚及 0.2体积氯仿， 剧烈振荡 15秒， 冰上放置 20分钟。 4°C， 12000rpm 离心 25分钟。 取上清置于另一离心管， 加等体积异丙醇， - 2CTC沉淀 1 小时。 4°C 12000rpm离心 25分钟， 弃上清。 用 5ml GTC重新溶解沉淀后， 重复其它操作。 用 lml 预冷的 75%乙醇洗涤， 晾干， 用 DEPC处理过的水溶解。 测 0D (光密度） 260及
3.2.2 甲醛变性凝胶电泳
称取 0.6g琼脂糖凝胶加入 52.2ml DEPC处理过的水中， 加热溶解， 待胶冷到 65 °C, 加入 6.0ml 10XM0PS, 1.8ml 甲醛， 灌胶。 取 4.5ul (40- 60ug) 总腿, 加 入 2. OullOXMOPS, 3.5ul 甲醛， 10ul 甲酰胺， 混匀， 65°C变性 15 分钟， 冰上冷 却 2分钟。 加入 2.0ul上样缓冲液， 混勾。 50伏预电泳 5分钟， 上样。 待染料全 部进入胶后， 电压降为 40伏， 每 10分钟混合电泳缓冲液 1次。
3.2.3转膜
待溴酚兰泳动到凝胶底部， 停止电泳， 照相。 用 DEPC处理过的水洗胶数次， 用 50mM NaOH处理 45分钟， 用 20XSSC处理 45分钟。 尼龙膜先用去离子水浸湿， 再用 20XSSC处理 45分钟。 在胶托上铺一层滤纸， 用 20XSSC浸湿， 除去气泡； 将胶倒置于胶托上， 其上面放一中间挖空的塑料薄片。 小心将膜置于胶上， 除去气 泡， 在膜上铺两张 20XSSC浸湿的滤纸， 除去气泡。 在滤纸上铺上 10cm高的吸水 纸， 压一 500克的重物。 转膜 16小时， 中间换吸水纸 2- 3次。 小心取下膜， 照相， 用 6XSSC泡膜 5分钟。 紫外交联， 80°C烤膜 1小时， 4°C保存备用。
3.2.4 制备杂交模板
上游引物： 5' -C GTCGAC GCTCTTCACCACCACAAAGGATG-3 ' , 斜体所示为保护碱 基， 黑体所示为 Sail酶切位点， 划线部分与 Fwall6核酸序列 982-1001位互补； 下游引物： 5' -AA GCGGCCGC TGTCACAGAGAGGTTCCCATCA- 3，， 斜体所示为保护碱基， 黑体所示为 Notl酶切位点， 划线部分与 Fwall6核酸序列 2242-2263位互补。
PCR反应体系： 10倍缓冲液 5.0ul, 脱氧核糖核酸 2.0ul， 上游、 下游引物各 3.0ul， Taq酶 l.Oul, Fwall6测序质粒 (模板) 2.0ul, 无菌水 34ul。 PCR 参数： 94Ό预变性 3分钟； 94Ό 3分钟， 94°C 20秒， 60°C 30秒， 72°C 80秒， 30个循 环。 72°C 7分钟。 用醋酸铰 /乙醇 （1: 5) 纯化 PCR产物， 溶于 50ul TE, 用琼脂 糖定量， 将其稀释至 25ng/yl。
3.2.5杂交
标记探针： 在 0.5ml离心管中加入 PCR产物 （在 98°C加热 4分钟变性， 冰上 冷却 2分钟） 25ng， 5X标记缓冲液 lOul, dNTP (无 dCTP)2.0ul， BSA 2. Oul, Klenow 酶 l.Oul, [a -32P]dCTP 5. Oul, 用无核酸酶的水补至总体积 50ul。 室温反应 1-3 小时。 ■
预杂交： 将膜用 6 X SSC浸 5分钟， 贴于杂交管壁， 除去气泡。 加入 6ml购于 Clontech的杂交液， 68 °C 1小时。
杂交： 倒掉杂交液， 加入预热的杂交液 6ml， 加入探针 （探针需在 98°C加热 4 分钟变性， 冰上冷却 2分钟）， 68°C 3小时。
洗膜： 先用 200ml洗液 I (2 X SSC, 0. 05% SDS) 在室温洗膜四次， 每次 10分 钟。 再用2001!11洗液11 (0. 1 33(， 0. 1% 505)在50°。洗20分钟, 56°C洗 20分钟。
压片： 用滤纸吸去液体， 用保鲜膜包好， 贴于一张与 X 光片相同大小的滤纸 上， 压片。 - 7CTC曝光适当时间。 洗片。
结果: 如图 1所示， Fwal l6基因广泛分布于各种组织， 上面的带为 3. 4kb转 录本，下面的为 1. 8kb转录本。 3. 4kb转录本在肝脏，外周血白细胞中高表达， 1. 8kb 转录本在心脏， 骨骼肌， 肾脏， 肝脏中相对高表达。 实施例四、 Fwal l6基因在不同肿瘤细胞株中的分布
4. 1 实验材料
含 8种肿瘤细胞系的 mRNA的杂交膜购自美国 Clontech公司，用其检测 Fwal l6 基因在不同肿瘤细胞株中的分布。 β-actin作为本实验的对照。
4. 2 Northern 杂交
参见实施例 3. 2。
结果: 如图 2所示： β-actin在若干种肿瘤组织中的表达水平均一 （图 2B); 在所检查的 8种肿瘤细胞株中， 均表达 Fwal l6基因， 最高的三种依次为成淋巴白 血病细胞株， Burkitt's淋巴瘤 Raji株和早幼粒白血病。 实例五、 氧化低密度脂蛋白对人血管内皮细胞表达 Fwal l6的影响
氧化低密度脂蛋白 （ox- LDL) 是导致动脉粥样硬化的分子危险因素， 可诱发 多种基因表达， 造成血管内皮损害及炎症反应。 本实验拟研究 ox- LDL 与人血管内 皮细胞中 Fwal l6表达的关系。
5. 1 氧化低密度脂蛋白 （ox-LDL) 的制备
采用密度梯度离心， 获取密度在 1. 019-1. 063 之间的低密度脂蛋白 （LDL), 用 Cu2+氧化 24小时， 0. 22um滤膜过滤， 4°C避光保存。 测 TBARS值并进行琼脂 糖电泳， TBARS值大于 10nmol/mg以及电泳迁移率增加表明氧化成功。
5. 2 人内皮细胞培养
将人血管内皮细胞冻存管从液氮中取出， 迅速放入 37°C水浴，待其完全融化， 将细胞悬液接种于 25cm培养瓶中。 瓶内预先加入 5ml含 10% FES的 RPMI或 DMEM。
37°C， C02浓度 5 % , 孵育箱内培养过夜， 次日更换培养液。
5. 3 传代培养
待细胞生长至基本融合覆盖率约为 80%) 时， 弃原培养液， 用 l X PBS (pH7. 4) 冲洗细胞表面 2次， 加入 0. 125%胰蛋白酶， 37°C消化 5- 10分钟。 显微镜下观察， 待细胞回缩变圆并有部分漂浮时， 加入少许含 10% FBS的培养液终止消化。 并用吸 管反复吹打细胞表面， 收集消化液， lOOOrpm离心 30秒， 弃上清， 加入含 10% FBS 的培养液吹打。 混匀， 取出 0. lml用 1 X PBS稀释至 1. 0ml , 计数， 按每毫升 100， 000个细胞将细胞悬液接种于培养瓶内， 瓶内预先加入 5ml含 10% FBS的 RPMI或 DMEM。 37°C， C02浓度为 5%， 孵育箱内培养。 按此法将细胞传 3代至所需数量。 待 细胞生长至基本融合 （覆盖率约为 80%), 弃原培养液， 换成含 0. 4%FBS 的培养液 继续培养 24-72小时， 使细胞处于生长静止期。
5. 4 ox-LDL与大豆金雀异黄素刺激细胞
用 200ug/ml浓度的 ox-LDL分别刺激细胞 12小时， 18小时， 36小时。 12小时， 同时加入大豆金雀异黄素至终浓度为 100uM。 37 °C , C02浓度为 5%， 孵育箱内培养， 留取上清后， GTC收获细胞。 收集 3瓶细胞， 备作 Northern杂交。
5. 5 Northern杂交：
收集上述步骤的细胞 3瓶。 其余步骤参见实施例 3. 2。
结果: 如图 3所示， ox-LDL可以刺激内皮细胞 Fwal l6的表达。 ox-LDL与抗 氧化剂大豆金雀异黄素同时作用于细胞后， Fwal l6表达增高 10倍以上。
上述结果提示： 氧化低密度脂蛋白诱发的 Fwall6表达是氧化低密度脂蛋白引 起的抗氧化代偿反应， Fwal l6 可能是一个抗氧化因子。 大豆金雀异黄素的抗氧化 作用，对动脉硬化的保护作用可能是通过上调 Fwal 16基因来实现的。因此，使 Fwal 16 产物上调有可能保护血管， 对抗动脉硬化的一些危险因素。 实施例六、 Fwal l6基因在正常、 慢性心衰和亚急性心衰动物心脏中的表达
6. 1 慢性心衰模型的建立
50只雄性 Sprague- Dawley (SD)大鼠 （250— 300克 /只） 购自本院动物房。 标准 块料由北京动物中心提供， 饮水为自来水， 水与饲料由动物随意摄取。
称重， 根据体重以氯胺酮和安定腹腔内注射全麻大鼠。 行气管内插管并接小 型动物呼吸机。 在心电监护仪的监护下左侧开胸， 以 6-10手术缝线结扎左冠状动脉 前降支， 关胸。 以心电监护仪上有明显 ST段升高为结扎成功的标志。 待其苏醒后撤 除呼吸机。 术后饲养条件同术前， 50天后模型即建成。
6. 2 亚急性心衰模型的建立
10只雄性 Wistar大鼠 （250克 /只） 购自解放军 301医院， 饲养条件同慢性心衰 模型。
腹腔注射去甲肾上腺素 30mg/日 /只， 连续注射 4天， 第 5天模型即可以使用。 6. 3 RNA-RNA 原位杂交
原位杂交技术基于碱基互补的原理， 通过探针特异性地与细胞内特定的 mRNA 或 DNA杂交， 而显现出细胞内的基因及表达产物。 该反应灵敏度极高， 而且可检 测出组织分化过程中仅瞬间表达的基因。 杂交试剂盒 DIG RNA Labeling kit (Cat. No.1175025) 购自德国 Boehringer Mannheim 公司。
6.3.1探针制备
特异引物 PCR， 将 200— 300bp的 Fwall6核酸片段 （1371至 1632位核苷酸） 克隆入 T Vectoro 重组质粒扩增后纯化； 用 T7和 SP6引物进行 PCR扩增； 用特异 引物和载体 T7和 SP6引物 PCR确定基因插入方向， 测序 （mRNA和 Ant i- mRNA)。 加 T7 RNA聚合酶合成反义探针， SP6 RNA聚合酶正义探针（检查杂交系统的可靠性） 。 6.3.2探针标记
先用酚 /氯仿抽提被转录的线形 DNA， 再用酒精沉淀。 将无 RNA酶的离心管置 冰上， 向管内加入 1μ 1纯化的线性 DNA， 2u 1 ΝΤΡ标记混合液， 2μ1 10X转录缓 冲液， Ιμΐ RNA酶抑制剂， 2 μ 1 (40U) SP6或 T7 ΤΝΑ聚合酶， 共 20μ1。 混匀， 稍 加离心，加入 20u不含 RNA的 DNA酶 I，37°C15分钟。加入 2μ 10.2mol/L EDTA (pH8.0) 以终止聚合反应。
在上述物质中加入 2.5μ 1 4 mol/L LiCl、 和 75μ 1酒精（- 20°C)的充分混匀， -70°C放置至少 30分钟 （或- 20°C放置至少 2h)。 12， OOOrpm离心， 70%冷乙醇洗 涤， 干燥后。 加 ΙΟΟμΙ DEPC水和 20 u RNase, 37°C静置 30分钟后分装， -20Ό保 存。
6.3.3 玻片处理及标本制备
彻底清洗玻片， 高压消毒 30 分钟， 将玻片在含有多聚赖氨酸 （0.01%) 的溶 液中浸蘸几下， 干燥， 4°C备用。
取鼠主动脉和心脏血管 （正常、 亚急性心衰和慢性心衰动物模型） 制作新鲜 标本， 0.4cmX0.4cm, 用 1XPBS 冲洗两次， 置于冰冻切片机固定头上。 行 8-lOum 切片， 置有 1 mg/ml 多聚赖氨酸的载玻片上晾干， 4 %多聚甲醛固定 15-20分钟。 1 XPBS冲冼 2次，每次 5分钟.
6.3.4 杂交前处理
用 0.2N HC1浸泡 25分钟。 0.3%的 Triton X-100浸泡 5分钟。 用 1XPBS洗 两次， 每次 5分钟。 用 4% 的多聚甲醛后固定 6分钟。 用 1XPBS洗两次， 每次 5 分钟。 在 1000ml 0. lmol/L三乙醇胺 (pH8.0)溶液中加入 5ml 乙酸酐， 待其完全溶 解将切片置于 10分钟。 以上反应在室温进行。
6.3.5杂交反应
杂交液含有 5ml去离子甲酰胺， 2.5ml 20XSSC, 500 ul lOOXDenhardt's液 (10g聚蔗糖， 10g聚乙烯吡咯垸酮， 10g牛血清白蛋白， 500ml消毒双蒸水）， 500 ul 10% SDS, 100 ul 10mg/ml变性的鲱鱼精子 DNA， 400 ul经 DEPC处理的水。
将切片从乙酰化溶液中捞出， 用滤纸吸干标本四周液体， 用在标本周围画一 小圈。加预杂交液 30ul在小圈内，湿盒内 42°C温育 2小时。甩去预杂交液， 用 25ul 杂交液覆盖 Parafilm膜， 湿盒内 42Ό温育 16小时， 封闭湿盒。
6.3.6杂交后处理
将玻片从温盒取出， 去掉 Parafilm膜。 2XSSC室温冲洗三次， 每次 10分钟。
1XSSC室温冲洗三次， 每次 10分钟。 0.1XSSC 冲洗 15分钟， 两次， 50°C。
若本底过高， 则将玻片置于含 20wg/ml RNA 酶的溶液（0.5mol/L NaCl, 10 隱 ol/L Tris CI, pH8.0)中， 37°C消化 30分钟。 再用不含 RNA酶的溶液 37°C冲洗 30分钟， 洗膜。
6.3.7 显色反应
玻片浸泡于清洗液 （1M顺丁烯二酸， 0.15M NaCl; 0.3%(V/V) Tween_20)。 在 100ml封闭液 (试剂盒中的阻断剂按 10% (W/V)加入顺丁烯二酸缓冲液 (0. lmol/L 顺丁烯二酸， 0.15 mol/L NaCl), 使用时 1:10稀释） 中温育 30分钟。 加 20ml抗 体溶液，温育 30分钟。用 100ml清洗液洗两次，每次 15分钟。加 20ml检测液（0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, pH 9.5) 平衡 2-5分钟。 在 10ml 新配制的显色液 (10 ml 检测液中加 200ul NBT/BCIP) 中温育， 避光， 勿摇动。 用消毒双蒸水或 TE冲洗。
结果: 如图 4和 5所示， 正常大鼠心脏血管及主动脉内皮表达 Fwall6基因 (图 4A, 5A),但较低。在亚急性心衰模型， 心脏血管及主动脉内皮均高表达 Fwall6 基因 （图 4B， 5B)。 结扎冠状动脉， 造成室壁瘤一慢性心衰模型大鼠， 主动脉及心 脏血管高表达 Fwall6基因 （图 4C， 5C)。 实例七、 免疫组织化学分析
7.1实验材料
人急性心肌梗塞并发症室壁瘤组织。
7.2免疫组织化学分析
用重组正确的原核表达质粒转染 E.coli B121 感受态细胞， 超声破碎细胞， 经 10%变性聚丙烯酰胺电泳， 确定目的基因条带， 选用超声和电洗脱法， 从包涵体 中获取融合蛋白经 Western 印迹鉴定目的蛋白后， 免疫动物获得的血清即为本实 验的一抗。
石蜡切片 5微米， 贴附于包被有多聚赖氨酸的 APES玻片上， 75°C烤片 2小时。 二甲苯脱蜡后经梯度酒精后切片入水。 3%H202内 10分钟。 蒸馏水洗三遍， 放入 EDTA 抗原修复液内 （pH8.0)， 置微波炉中烘烤（96Ό— 98°C) 10分钟。 室温冷却 20— 30 分钟， 蒸馏水洗三遍。 入 1XPBS缓冲液 5分钟。 10% 正常兔血清 20分钟。 加适当 稀释的一抗， 4°C内孵育过夜。 PBS 洗三次后， 加生物素标记的羊抗兔二抗， 室
27 温 10分钟。 lxPBS洗三次， 加酶联链霉亲和素三抗， 室温 10分钟。 lxPBS洗三次， DAB显色。 蒸馏水三次， 苏木素浅染胞核、 脱水、 封片。
结果: 如图 6所示， 人急性心肌梗塞室壁瘤组织血管内皮高表达 Fwall6基因。 实施例八、 过度表达 Fwall6基因诱发 ECV304细胞增殖
8.1 实验材料：
ECV304细胞株（购自 ATCC)
8.2细胞培养与 Fwall6基因转染：
8.2.1 ECV304细胞培养：
6孔培养皿板， 每个孔 5X10S个细胞， 在 0.5ml RPMI1640培养液 （GIBC0) 及
10%胎牛血清中。
8.2.2 Fwall6基因转染：
Fwall6 基因开放读码框架被构建到 pcDJA3.1^1yc-His(-)A( ONTECH)载体 上。 细胞生长 20小时后， 按照 Clonfectin试剂盒 （CLONTECH, 美国） 的方法把携 带 Fwall6基因的载体导入 ECV304细胞。 转染 48小时后， 用 G418 (200μβ/πι1) 挑 选稳定表达 Fwall6基因的克隆。 空载体转染的细胞为对照。 用 Northern blot选 出表达 Fwall6 基因最高的克隆， 繁殖， 用以观察细胞生长曲线。 稳定并高表达的 Fwall6基因的克隆细胞被接种到 24孔培养板。 以含有 10%FBS的 RPMI1640培养液 来哺育细胞。 每 48小时换液一次。 每 24小时从每组取 3个孔进行以蛋白酶消化细 胞计数。
胰蛋白酶消化方法：倒掉细胞培养液，用 1XPBS洗细胞 2次（0.5ml/cm2培养皿）， 加入含 0.125%胰蛋白酶的 1XPBS消化细胞 5分钟， 反复用吸管吹打， 混匀。 然后 用血球计数板计数。
细胞计数方法：将细胞滴入血球计数板内，放置在光学显微镜 (Nikon 日本）上数 细胞,细胞数的计算公式为：细胞数的计算公式为：
细胞数 /毫升 == 4大格细胞数 /4X10,000X稀释倍数 结果:
细胞计数结果 （X104)
如图 7所示， 从第四天开始， 高表达 Fwall6基因的细胞增殖比空载体对照细胞
增高 2倍。 (P<0. 05) 实施例九、 细胞存活 (MTT)试验：
将 ECV304细胞 5000/孔培养在 96孔板中， 分别于接种后 24小时、 48小时、 72 小时和 96小时， 用 20μ1 MTT (5ng/ml , Sigma) 染色， 用美国 Bio-Rad 酶标仪于 490nm处进行观察， 着色细胞为存活细胞。
结果：
MTT实验数据见下表：
均数士 SD， n=3
*与对照组 （转空载体克隆） 比较： P<0.05
如图 8所示， 高表达 Fwal l6基因的细胞比空载体对照细胞增殖明显。 本发明并不限于上述具体的实施例， 实施例仅用于说明本发明的某些方面。 功 能上等同的方法和物质己包括在本发明的范围内。事实上， 根据本文的描述和附图， 基于本发明的各种改变对本领域的技术人员而言是显而易见的。 这样的改变已包括 在本发明权利要求的范围内。
Claims (20)
- 权利要求书1. 一种分离的多核苷酸， 它包括选自下列组中的一个成员：(a) 一种多核苷酸， 其编码如 SEQ ID N0: 2所示的多肽；(b) 一种多核苷酸， 其是 (a)天然存在的多核苷酸变异体；(c) 一种多核苷酸， 其能够与（a)杂交， 并且与（a)具有至少 85%的同源性。
- 2. 权利要求 1的多核苷酸， 其中所说的多核苷酸是 DNA。
- 3. 权利要求 1的多核苷酸， 其中所说的多核苷酸是 RNA。
- 4. 权利要求 1的多核苷酸， 其中所说的多核苷酸是基因组 DNA。
- 5. 权利要求 1的多核苷酸， 所说的多核苷酸具有如 SEQ ID NO: 1所示的序列。
- 6. 权利要求 1的多核苷酸， 所说的多核苷酸包含如 SEQ ID NO: 1所示的从 1002 至 2261位核苷酸。
- 7. 权利要求 2的多核苷酸， 其编码如 SEQ ID NO: 2所示的多肽。
- 8. 一种载体， 所说的载体包含权利要求 2的 DNA。
- 9. 一种宿主细胞， 所说的宿主细胞由权利要求 8的载体转化或者转染过。
- 10. 一种产生多肽的方法， 所说的方法包括在权利要求 9 的宿主细胞中表达由 所述 DNA编码的多肽。
- 11. 一种多肽， 它包含选自下列组中的一个成员：(a)—种多肽， 其具有推定的如 SEQ ID N0: 2所示的氨基酸序列；(b)—种多肽， 其是 (a)的活性片段、 类似物或衍生物；(c)一种多肽， 其与 SEQ ID N0: 2所示的氨基酸序列具有至少 85%的同源性。
- 12. 一种权利要求 11之多肽的抗体。
- 13. 一种化合物， 所说的化合物抑制权利要求 11之多肽的激活。
- 14.一种药物组合物， 所说的药物组合物包含有效量的权利要求 11 的多肽或其 活性片段， 以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
- 15. 权利要求 11 的多肽在制备治疗心血管炎症性动脉粥样硬化疾病和肿瘤的 药物组合物中的用途。
- 16. 权利要求 15 的用途， 其中的心血管炎症性动脉粥样硬化疾病包括脑中风、 冠心病、 心绞痛和心肌梗塞。
- 17. 一种治疗需要 Fwal l6 之患者的方法， 所说的方法包括： 对患者施用治疗 有效量的权利要求 11的多肽。
- 18. 权利要求 17的方法， 所说的方法包括： 向患者提供编码所述多肽的 DNA， 并在患者体内表达所述的多肽。
- 19. 一种诊断疾病或者对疾病的易感性的方法， 所说的方法包括： 测定权利要 求 1的多核苷酸中的突变。
- 20. 一种诊断方法， 所说的方法包括： 分析来源于宿主细胞的样品中是否存在 权利要求 11的多肽。
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