CN1491958A

CN1491958A - 人参三醇型皂苷Re2结构修饰富集人参皂苷Rg2工艺

Info

Publication number: CN1491958A
Application number: CNA031194656A
Authority: CN
Inventors: 孙桂芳; 李向高
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-03-13
Filing date: 2003-03-13
Publication date: 2004-04-28

Abstract

现已知人参皂苷Rg₂是良好的强心剂与毛地黄毒苷作用强度近似，但无毛地黄毒苷的毒副作用，对失血性与心源性休克具有较好急救作用；人参皂苷Rg₂是中药“人参四逆汤”先导化合物之一。此外Rg₂对冠心病和心绞痛、心肌梗塞有很好疗效。由于该有效成分在人参、西洋参、人参三七中含量均较低，阻碍了规模化提取、分离、精制，难以实现工业化生产。故对药理活性低的，但含量很高的人参皂苷Re，进行分子结构的修饰改造，使Re转化为人参皂苷－Rg₂，这样就可将转化得到的人参皂苷Rg₂和原生药存在的Rg₂归一同步，在同一工序中得富集分离，达到规模化工业化生产的目的，便于新药制剂与应用。

Description

人参三醇型皂苷Re结构修饰、富集人参皂苷Rg2工艺

一、所属技术领域

该发明创造属于医药工业领域中药物分子结构修饰工艺。

二、背景技术

现以查明人参皂苷Rg₂(ginsenoside-Rg₂)具有强心作用又能改善肌体周围血管的微循环，对救治失血性休克和心源性休克有很好疗效，又是“人参四逆汤”中的先导化合物之一。另外，人参皂苷Rg₂具有抗缺氧作用，可提高心肌对氧的利用律，对高血脂、冠心病、心肌梗塞、心肌炎有良好治疗效果。但该化合物在人参和西洋参中含量较低，只有0.1-0.3％的含量，给工业生产人参皂苷Rg₂带来困难，阻碍了规模化生产；而人参和西洋参中人参皂苷Re含量虽较高，因其对心血管药理活性不强，且不能与Rg₂在同一工序中分离、精制，而被遗弃掉，造成资源浪费。所以单纯分离精制原存在的人参皂苷Rg₂的工艺技术势必增加成本，价格过高患者难以承受，不好推广且不易打开市场。

三、发明目的

本发明的目的就是要解决人参皂苷Rg₂含量少，收率低的问题，使不能工业化生产的原工艺技术转化为规模化生产新工艺的目的。因为人参皂苷Re与Rg₂均为人参三醇型皂苷，而人参皂苷Re在人参和西洋参中均含量较高，在人参根中含量为0.6-1.0％；在西洋参根中含量1.0-2.0％；特别是在二者茎叶、花蕾、果肉、果浆中含量更高，达4-6％。然而，尽管人参皂苷Re含量高，但它对心血管生理活性较低，远不及人参皂苷Rg₂药理活性强，甚至没有人参皂苷Rg₂特有的药理活性。因为两者虽属同系列的皂苷，但在化学结构上有明显差异，即人参皂苷Rg₂在C-20位上是羟基(-OH)，不结合葡萄糖基；而人参皂苷Re在C-20位结合一分子的葡萄糖基(-glucosyl)。本发明特征在于用稀酸水解法将Re的C-20位葡萄糖切掉，一步就可使人参皂苷Re改造转化为人参皂苷Rg₂，即可实现原生药存在的Rg₂和修饰转化来Rg₂两部分的归一性发明了新工艺技术，可实现在同一工序中达到提取富集分离人参皂苷Rg₂的目的。

四、技术方案

人参皂苷-Re与-Rg₂同为人参三醇型皂苷，而人参皂苷-Re在人参和西洋参中均含量较高，在人参中含量为0.6～1.0％，在西洋参中含量1.0～2.0％。然而一般认为人参皂苷Re生理活性较低，远不及人参皂苷Rg₂的药理活性强。本发明特征之一是采用稀酸水解人参皂苷Re的C-20位多1分子的葡萄糖基，而有别于Rg₂，如果切掉C-20位葡萄糖基即可转化为人参皂苷Rg₂(见附图1)。这样就实现了原存在的人参皂苷Rg₂和结构修饰转化成的Rg₂归一性，即可实现在同一工序中富集、分离人参皂苷Rg₂。(详见附图2)

实施方案一：

提取与分离

1、人参皂苷Re的提取分离为现有技术特征，利用西洋参的支根、须根叶、果肉、花蕾研成粗粉(60目)，加6倍量水，80℃提取3次，合并提取液，通过板框压滤机，使滤液通过大孔树脂D₁₀₁层析柱，用清水冲洗层析柱，去掉糖分无机盐和水溶性色素类杂质。用60％乙醇洗脱，洗脱液回收乙醇，得Re粗结晶，经甲醇-水重结晶得人参皂苷Re精品，其收率为2％。90％乙醇洗脱液合并于步骤2的90％洗脱液中。

2、具有本发明特征的是对人参皂苷Re分子结构修饰改造

取人参皂苷Re加5倍量0.1克当量(N)的盐酸(HCL)，加热恒温至37℃，经4小时水解后，将水解母液用0.1克当量(N)NaOH中调酸碱度至PH＝7，通过大孔树脂柱吸附，用水洗涤去掉糖分和无机盐，然后以60％、90％乙醇梯度洗脱，洗脱液经硅胶柱层析，用正丁醇∶醋酸乙酯∶水＝4∶1∶5(上层)洗脱，再通过乙醇重结晶依次分别得人参皂苷Rg₂和少量的-Re和Rh₁。

实施方案二

1、提取与分离：取西洋参(支根、须根、茎叶、花蕾、果肉)粉碎为40或60目，加1/100的(熟石灰∶硫酸亚铁＝2∶1)做为黄酮类物质和酚类物质的沉淀剂、固定剂以保持提取液清洁，减少杂质。加6倍量的水以80-85℃提取3次，每次60分钟，合并提取液，过滤后上D₁₀₁型或D₁₀₁A型或AB₈型大孔树脂柱进行层析，吸附人参皂苷。用水洗涤树脂柱，去掉糖分、无机盐等水溶性杂质，以60％和90％乙醇进行梯度洗脱，分别收集。60％洗脱液经回收乙醇，用甲醇——水重结晶得人参皂苷Re纯品备用。

2、结构修饰与转化：取人参皂苷Re粉末加0.1克当量(N)盐酸恒温至37度，水解4小时，水解母液用0.1克当量(N)氢氧化钠(NaOH)中和至PH＝7过滤，滤液上D₁₀₁型或D₁₀₁A型或AB₈型大孔树脂柱进行层析依法清水洗柱，然后用60％乙醇洗脱，洗脱液蒸去醇浓缩原体积1/2。

3、精制浓缩液通过制备性高效液相色谱仪，色谱条件为：固定相为Bondapak-C₁₈(Waters公司生产)，流动相为乙腈∶水＝30∶70；检测波长202-210nm，流速100ml/分钟。按保留时收集人参皂苷-Re组分，回收溶剂，用甲醇-水重结晶得人参皂苷Rg₂纯品。

实施方案三：

1、提取与分离：取西洋参(支根、须根、茎叶、花蕾、果肉)粉碎为40或60目，加1/100的(熟石灰∶硫酸亚铁＝2∶1)做为黄酮类物质和酚类物质的沉淀剂、固定剂以保持提取液清洁，减少杂质。加6倍量的水以80-85℃提取3次，每次60分钟，合并提取液，过滤后上D₁₀₁型或D₁₀₁A型或AB₈型大孔树脂柱进行层析，吸附人参皂苷。用水洗涤树脂柱，去掉糖分、无机盐等水溶性杂质，以60％和90％乙醇进行梯度洗脱，分别收集。60％洗脱液经回收乙醇用甲醇-水重结晶得人参皂苷Re纯品备用。

2、结构修饰与转化：取人参皂苷Re粉末加0.1克当量(N)浓度盐酸恒温至37度，水解4小时，水解母液用0.1克当量(N)氢氧化钠(NaOH)中和至PH＝7过滤，滤液上D₁₀₁型或D₁₀₁A型或AB₈型大孔树脂柱进行层析依法清水洗柱，然后用60％乙醇洗脱，洗脱液蒸去醇浓缩至原体积1/2。

3、精制：上述浓缩原体积1/2的洗脱液，上高速逆流色谱仪(HSCCC)。

色谱条件：以水为固定相，以水饱和的下丁醇∶乙酸乙酯＝4∶1为流动相，在加压下收集人参皂苷-Re馏分，回收溶剂，用甲醇-水重结晶得人参皂苷Rg₂纯品。

五、发明创造的优点和有益的效果，积极性。

1、本发明解决了生产人参皂苷Rg₂收率低的问题，使不能工业化生产的原工艺技术达到规模化生产之目的，其特点在于将存在于人参、西洋参根中对心血管生理活性低，但含量高的人参皂苷Re，经过结构修饰和改造后，转化为人参皂苷-Rg₂新工艺技术，经Re结构改造后形成Rg₂，与生药中原存在的Rg₂归一同步，形成新的工艺技术，提高收率达1.3-2％，是原收率的8-10倍。

2、本发明尚可采用人参及西洋参地上部位(茎叶、花蕾、果肉或果浆)为原料，它们的人参皂苷Re含量更高，该分子修饰改造后，其收率达4-6％。这对工业规模化生产十分有利，使利用价值不大的人参皂苷Re转化为生理活性强的人参皂苷-Rg₂数量十分可观。

六、详细说明发明创造最好方式，具体参数材质、尺寸等。

本发明是基于人参皂苷对酸作用敏感，易发生水解反应，特别是C₂₀-位原是叔羟基，它所结合的糖是不安定的，容易被酸水解掉，技术关键参数为(1)酸的种类：最好选用盐酸(HCl)，(2)浓度至关重要，即采用0.1N浓度的盐酸，(3)水解温度不宜过高，要控制在37℃左右。(4)水解时间为4小时。既不得超过时间，也不允许缩短这个时间，时间不够，转化量降低；时间太长容易使C₆-位末端糖分子脱掉，生成人参皂苷-Rh₁，因此会降低人参皂苷的收率。其反应式如图1所示。(5)本发明最好方式是采用上述方案二的提取、富集分离流程，该流程水解母液一定要用0.1N的(NaOH)中和，使PH值达到7(中性)，方可上D₁₀₁型大孔树脂柱分离。树脂柱的直径与高度比为1∶8-15，如树脂柱口内径为32cm，高度可确定为256cm。其设流程图见下页。(6)精制：①采用硅胶柱层析，柱口直径与高度比为1∶8。②采用制备性高效液相色谱仪(HPLC)，色谱条件为流出速度100-150ml/min固定相为Bondapak-C18(Waters公司生产)，流动相为乙腈∶水＝30∶70，检测波长为202-210nm。③采用高效逆流色谱(HSCCC)，以正丁醇∶醋酸乙酯∶水＝4∶1∶5，下层为固定相。在加压下，收集溜分，所获人参皂苷Rg₂纯度达97％左右，收率按生药计不得少于3.5％，熔点(mp)为187-189℃；比旋度为[α]_D ²²(甲醇)+5-6(C＝1.0)。(7)产品规格：人参皂苷Rg₂的性状为无色针状结晶，分子式为C₄₂H₇₂O₁₃，分子量为784。

Claims

1.人参三醇型皂苷Re结构修饰、富集人参皂苷Rg₂工艺包括：将西洋参支根、须根、茎叶、花蕾、果肉任何一种或多种原料粉碎后加入总量为原料1/100的黄酮类、酚类色素物质的沉淀及固定剂，沉淀剂为熟石灰，固定剂为硫酸亚铁，二者之比例即熟石灰∶硫酸亚铁＝2∶1，加入6-8倍量水，在80-85℃下提取3次，每次60分钟，合并提取液，过滤后上D₁₀₁型大孔树脂柱，吸附人参皂苷，用清水洗涤树脂柱去掉糖分、无机盐等水溶性杂质，以60％、90％乙醇洗脱，分别收集，60％乙醇洗脱液经回收乙醇后，该组分用甲醇-水重结晶得到性状洁白纯净人参皂苷Re；对包括主根、支根、须根、芦头、茎叶、花蕾、果肉、果浆的人参、西洋参进行稀酸水解，水解剂为盐酸或硫酸或醋酸，通过对原料中的人参皂苷Re的稀酸水解可获得大量的人参皂苷Rg₂；应用稀盐酸水解，其浓度为1克当量，调PH为3-4，水解温度37-40℃，恒温下搅拌4小时，得到人参皂苷Re；

本工艺的特征在于：取人参皂苷Re加5倍量0.1克当量的盐酸，加热恒温至37℃，经4小时水解后，将水解母液用0.1克当量氢氧化钠中调酸碱度至PH＝7，通过大孔树脂柱吸附，用水洗涤去掉糖分和无机盐，然后以60％、90％乙醇梯度洗脱，洗脱液经硅胶柱层析，用正丁醇∶醋酸乙酯∶水＝4∶1∶5洗脱，以上比例是指上层而言，再通过乙醇重结晶依次分别得人参皂苷Rg₂和少量的人参皂苷-Re和人参皂苷-Rh₁；然后再通过分离精制工艺得到高纯度的人参皂苷Rg₂。

2.根据权利要求1的人参三醇型皂苷Re结构修饰、富集人参皂苷Rg₂工艺，其特征在于其中所说的分离精制工艺采用硅胶柱层析精制，柱的直径与高度比不得大于1∶8，不得小于1∶15。

3.根据权利要求1的人参三醇型皂苷Re结构修饰、富集人参皂苷Rg₂工艺，其特征在于其中所说的分离精制工艺采用制备性高效液相色谱仪HPLC，色谱条件：流出速度100-150ml/min，固定相为Bondapak-C18柱，或CLC-NH₂氨基键合柱，流动相为乙腈∶水＝30∶70，检测波长：202-210nm。

4.根据权利要求1的人参三醇型皂苷Re结构修饰、富集人参皂苷Rg₂工艺，其特征在于其中所说的分离精制工艺采用高效逆流色谱仪HSCCC，实行液液分配，固定相为水，流动相为氯仿∶甲醇＝36∶10，在加压下收集馏分，可使人参皂苷Rg₂纯度达97％左右；收率按生药计不少于3.5％。

5.根据人参三醇型皂苷Re结构修饰、富集人参皂苷Rg₂工艺制造的人参皂苷Rg₂可应用治疗失血性和心原性休克，还可以治疗冠心病、心绞痛和心肌梗塞，以及心肌炎或心力衰竭。