CN1477104A

CN1477104A - 甘草黄酮的提取纯化方法

Info

Publication number: CN1477104A
Application number: CNA031415296A
Authority: CN
Inventors: 朱育新; 孙东海
Original assignee: SHANGHAI AOLI INDUSTRY Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI AOLI INDUSTRY Co Ltd
Priority date: 2003-07-11
Filing date: 2003-07-11
Publication date: 2004-02-25
Anticipated expiration: 2023-07-11
Also published as: CN1203068C

Abstract

本发明涉及一种甘草黄酮的提取纯化方法，本发明改进了国内外文献所叙述的以溶剂萃取后相分配及以大孔径树脂吸附杂质等制备得甘草黄酮的方法，代之以使用膜技术得甘草黄酮或再进行层析纯化，使生产工艺大为简便，流程缩短，收率提高，成本降低。

Description

甘草黄酮的提取纯化方法

技术领域

本发明涉及一种甘草黄酮(Glycyrrhiza Uralensis Fisch.，G.lnflata Bat.，G.glabra L.，等甘草)的提取及纯化新方法，本法改革了国内外文献所叙述的以溶剂萃取后相分配及以大孔径树脂吸附杂质等，以获得甘草黄酮，代之以使用膜技术或/和层析进行纯化，使生产工艺大为简便，流程缩短，收率提高，成本降低。

背景技术

自古以来，我国已将甘草作为药用植物。近年人们发现甘草中含有的各种黄酮是除甘草酸外的另一类天然活性物质。由于甘草类黄酮经研究具有许多生理活性，如抗微生物、抗氧化、抗紫外及类SOD作用。近期更发现甘草中存在的黄酮具有抗癌及抗艾滋病活性。由于合成类化学品对人体的不良副作用，寻求新的天然生理活性物质以取代或补充合成品已是大势所趋。因此，许多国家都先后对甘草中的黄酮进行提取、纯化以扩大甘草的原有使用范围，如日本、以色列、我国都先后进行甘草中黄酮的提取、纯化。以期获得商品化的甘草黄酮。获取甘草黄酮的途径都不外以甘草根为原料，先将之粉碎，然后以水或有机溶剂进行提取，再进行相分配，最后经大孔径树脂(CN 97115712.J.P 6-157277.USP 56098757)等进行脱色、纯化而得。具体流程如下：甘草根→粉碎→溶剂第一次萃取→过滤→浓缩去水得溶剂→溶剂→第二次溶解及相分配→过滤→浓缩→加入稀乙醇加温溶解→浓缩→得产品。

此工艺十分繁复，流程多，生产周期长，且得率低(按甘草黄酮含量而浮动)，并要消耗大量溶剂和昂贵的吸附材料。

发明内容

本发明的目的是提供一种甘草黄酮(Glycyrrhiza Uralensis Fisch.，G.lnflata Bat.，G.glabra L.，等甘草)的提取的方法，或进一步纯化的方法。本发明的具体流程如下所示：

本发明的方法将甘草根经干燥、粉碎后进行溶剂提取，然后过滤，滤液用膜进行超滤，浓缩得产品甘草黄酮。

所述的膜分离方法是使用孔径为分子量1000～15000的膜。该超滤压力为1～10公斤(kg)，换言之为0.1-1mPa.。

所述的溶剂萃取是用有机溶剂及它们的混合溶剂在回流温度下萃取或0～40℃时冷浸或渗漉萃取，萃取时间为1～48小时。所述的有机溶剂可以是乙醚、乙醇、氯仿、醋酸乙酯、石油醚、苯等。

本发明的方法中，所述的过滤通常用滤布予以粗过滤就能满足要求。也可以用分子筛、硅藻土或微孔膜进行过滤。

所述的浓缩可以是低温浓缩、冷冻干燥、减压浓缩或粉末喷雾干燥的方法。

经浓缩所得的甘草黄酮可以进一步柱层析纯化，所述的层析柱可以采用硅胶柱、聚酰胺柱或分子筛柱等柱层析的方法。层析溶剂为包括醇、烷烃、酯、氯代烃，芳香烃等在内的一种或二种混合有机溶剂。

此工艺所得产品和旧工艺所得产品，经HPLC和红外、质谱、核磁等光谱数据核证得到确认，无黄酮丢失。本发明所采用的工艺大为简便，收率提高。由于节省了大量溶剂和消耗性吸附材料，成本也大为降低。

附图说明

图1是本发明的方法所得的甘草黄酮的谱图。

其中，①甘草酸；②芒柄花黄素Formononetin⑧甘草啶Licoricidin；④甘草醇Glycyrol：⑤甘草利酮Licoricone：⑥光甘草定Glabridine；⑦光甘草醇Glabrol；⑧HISPA光甘草定HISPA Glabridin；⑨4′-O-甲基光甘草啶(4′-O-Methylglabridin)；⑩3′-甲氧基光甘草啶(3′-Methoxyglabridin)。

具体实施方式

通过下述实施例将有助于理解本实用新型，但並不能限制本实用新型的内容

实施例1

将甘草根经干燥、粉碎后，以每100公斤加100-1000公斤乙醇进行回流萃取5～12小时，以滤布予以粗过滤，然后以10000分子量的膜进行超滤，(外压3kg，温度25～30℃)滤液经减压(温度35～100℃下)浓缩得产品甘草黄酮3.5公斤。

实施例2

按实施例1的操作得乙醇提取液，以0.5μM微孔膜作预滤，然后以2000分子量膜进行超滤，(外压4kg，温度25～40℃)滤液经减压(温度35～100℃下)浓缩得产品甘草黄酮2.3公斤。

实施例3

按实施例1操作，先以水提取除去极性有机物质，干燥后再以乙醇萃取，萃取液以0.5μM微孔膜过滤，然后以10000分子量膜进行超滤，(外压3kg，温度25～30℃)滤液经减压浓缩(温度35～100℃下)，得产品甘草黄酮1.56公斤。

实施例4

5g上述实施例3萃取得到的粗甘草黄酮，用氯仿溶解，加入含250ml聚酰胺柱，然后用氯仿-甲醇(94∶4～80∶20)进行洗脱，得各种活性甘草黄酮，共1.56g(化合物1～10)。

实施例5

5g上述实施例3萃取得到的粗甘草黄酮，用氯仿溶解，加入装有150g硅胶的柱，用氯仿-甲醇(99∶1～90∶10)进行洗脱，得各种(化合物1～10)含量不同的甘草黄酮。

实施例6

以上实施例1采用西北兰州产甘草所得甘草黄酮经高压液相色谱(HPLC)并和标准样品对照得谱图如图1所示。

HPLC条件如下：

仪器：Agilent 1100 Series，流速：1.8ml/min，

柱：150×4.6mm 5μ C₁₈，进样量：0.4mg/ml；10μl，

流动相CH₃CN∶2％CH₃COOH＝1∶1，压力：150bar，

波长：282nm，滞留时间：2.6min。

经层析得样品，分析数据如下：

甘草醇(Glycyrol)

紫外，u.vλ^ETOH _maxnm：228，247，256inf，349，358inf.

红外，Rν^KBr _maxcm^-1：3400，2920，1715，1612，1595，1516，1446.

核磁，N.M.Rδ^4-DXSO _PPm：1.62(3H，S，CH₃ ofγ，γ-dimethylallyl)，1.73(3H，S，CH₃ ofγ，γ

-dimethylallyl)，3.24(2H，d，8，CH₂ ofγ，γ

-dimethylallyl)，3.86(3H，S，Ome)，5.15(1H，b.s，OH-5 and OH-4′，exchangeable with D.Q).

质谱，M.S m/e：366(M⁺).

甘草利酮(Licoricone)

紫外，UVλ^ETOH _maxnm(ε)：238(20640)，248(19720)，284(10240)，302(7800)；

红外，λ^EtOH-NaoaC _maxnm：250，253(inf.)，303(sh.)，330.IRγ^chcl _maxcm^-1：3500，3160，1631，1612，1585，1570；γ^KBr _maxcm^-1：3140，1628，1611，1584.

核磁NMR(60MC，d_δ-DMSO)：δ1.63(3H，br.s)，1.69(3H，br.s，-CH₂-CH＝C(CH₃)₂，3.20(2H，

br.d，J＝7Hz，-CH₂-CH＝C(CH₃)₂)，3.40(3H，s)(OCH₃)，5.14(1H，brt，J＝7Hz，-CH₂＝CH-C(CH₃)2)，6.35(1H，s，H-3)，6.89(1H，d，J＝2.5Hz，H-8)，6.96(1H，d.d，J＝9，2.5Hz，H-6)，7.92(1H，d，J＝9Hz，H-5)，8.01(1H，s，H-2)，9.2(1H，br.)，10.6(1H，br.)(-OH，disappeared after the addition of D₂O).

质谱，M.S m/e：382(M⁺，base peak)，

367(M-CH₃，57％)，351(m-och₃，44)，327(M-CH＝C(CH₃)₂，17)，314(M-CHCH＝C(CH₃)₂，19)，257(25)，137(37).元素分析：计算值：C₂₂H₂₂O₆：C，69.10；H，5.80.分析值：C，68.95；H，5.87.

光甘草定(Glabridin)

紫外，UVλ^Etoh _maxnm(logε)：281.5(4.18)，288(4.13inf)，312(3.47sh.).

红外，IRγ^KBr _maxcm^-1：3270，2940，1611，1587，1526，1480.

核磁，NMRδ^CDCL _PPM：1.42(3H×2，s，CH₃-2″)，2.87(1H，d，6.0，H-4eq)，2.89(1H，d，10.0，H-4ax)，3.3-3.4(1H，m，H-3ax)，4.00(1H，t，10，H-2ax)，4.35(1H，q，10 and 3.5，H-2eq)，5.53(1H，d，10，H-3″)，5.80(2H，broad s，OH-2′and 4′，disappeared by the addition of D₂O)，6.23(1H，d，2，H-3′)，6.31(1H，d.d，8 and 2，H-5′)，6.34(1H，d，8H-6)，6.61(1H，d，10，H-4″)，6.76(1H，d，8，H-5)，6.86(1H，d，8，H-6′).M.S m/e：324(M⁺).

元素分析：计算值：C₂₀H₂₀O₄：C，74.05；H，6.22.分析值：C，74.33；H，6.23

光甘草醇(Grabrol)

紫外，UVλ^Etoh _maxnm(logε)：281(4.35)，312.5(4.06).

红外，IRγ^KBr _maxcm^-1：3360，2920，1649，1586，1505，1442.

核磁，NMRδ^CDCL _PPM：1.70(3H×2，broad s，CH₃ of dimethylallyl)，1.76(3H×2，broad s，CH₂of dimethylallyl)，2.8-2.9(2H，m，H-3)，3.38(4H，d，7，benzylic of dimethylallyl)，5.3(2H，m，H-2 and

olefinic of dimethylallyl)，5.54(1H，s，OH-4′)，6.48(1H，s，OH-7，exchangeable with D₂O)，6.52(1H，d，8.5，H-6)，6.80(1H，d，8.5，H-5′)，7.18(1H，d.d，8.5)HISPAGLABRIDIN A；ir(KBr)υmax3500，3350，2920，1632，1610，1582，1500，and 1472cm^-1；pmr(CDCL₃，100mHz)δ1.38(s，6H，C(CH₃)₂)，1.75(s，3H，CH₃)，1.81(s，3H，CH₃)，2.85(dd，1H，J＜1Hz，A of ABMXX′)，2.88(dd，1H，J＝10Hz，J＜1Hz，B of ABMXX′)，3.30-3.50(m，1H，MofABMXX′)，3.42(br.d.，2H，J＝7Hz，CH₂-CHC(CH₃)₂)，3.97(t，1H，J＝10Hz，X of AMBXX′)，4.36(br.dd，1H，J＝10 and 4Hz，X′of ABMXX′)，4.87(s，1H，exchange D₂O)，5.24(br.t.，1H，J＝7Hz，CH₂-CHC(CH₃)₂)，5.42(s，1H，exchangesD₂O)，5.51(d，1H，J＝10Hz，HC＝)，6.32(d，1H，J＝8Hz，HC＝)，6.35(d，1H，J＝8Hz，HC＝)，6.65(d，1H，J＝10Hz，HαC＝)，and 6.78(d，2H，J＝8Hz，2Xhc＝)；

紫外，uv λmax(MeOH)281nm(logε4.05)，290infl.(3.95)and 312(3.14)；

质谱，ms，m/e 392(M⁺，23％)，377(76％)，204(5％)，189(30％)，187(39％)，174(23％)，173(100％)，and 47(19％)；ord(C＝0.000036，mEoh)，

[φ]₃₀₆ O，[φ]₂₉₅+2725，[φ]₂₇₈-7625，[φ]₂₆₈-1850，

元素分析：计算值：C₂₅H₂₈O₄：C，76.50；H，7.19.C.H分析值：C，76.47；H，7.39.

HISPAGLABRIDIN B；

红外，ir(KBr)υmax3400，1635，1605，1583，1497，and 1475cm^-1；pmr(CDCL₃，60mHz)δ1.40(s，12H，2＝C(CH₃)₂)，2.83(2H，AB of ABMXX′)，3.3-3.5(1H，M of ABMXX)，3.97(1H，X ofABMXX′)，4.33(1H，X′of ABMXX′)，5.00(s，1H，exchangesD₂O)，5.47(d，1H，J＝9.5Hz，HβC＝)，5.50(d，1H，J＝10Hz，HβC)，6.13(d，1H，J＝8Hz，HC＝)，6.28(d，1H，J＝8Hz，HC＝)，6.57(d，1H，J＝9.5Hz，HαC＝)，6.60(d，1H，J＝10Hz，HαC＝)，6.71(d，1H，J＝8Hz，HC＝)，and 6.74(d，1H，J＝8Hz，HC＝)；紫外，uvλmax(MeOH)280nm(logε4.17)，290infl.(4.11)and 309(3.67)；ms，m/e390(M⁺，29％)，375(100％)，202(2％)，189(29％)，187(67％)，180(38％)，173(100％)，and 147(17％)；ord(C＝0.000043，MeOH)，[φ]₃₁₀-8350，[φ]₃₀₀-10875，[φ]₂₉₂ O，[φ]₂₈₀+14500，and[φ]₂₆₄ O.

元素分析：计算值：C₂₅H₂₄O₄：C，76.88；H，6.71.C.H分析值：C，77.16；H，7.21.

3′-甲氧基光甘草定(3′-METHOXYGLABRIDIN)；

红外，ir(KBr)maxυ3480，2980，2940，2850，1630，1610，1580，1508 and1476cm^-1；pmr(CDCL₃，100mHz)δ1.38(s，6H，C(CH₃)₂)，2.87(1H，A of ABMXX′)，2.91(1H，B ofABMXX′)，ca.3.5(m，of M of ABMXX′)，3.78(s，3，OCH₃)，4.02(1H，X of ABMXX′)，4.37(1H，X′of ABMXX′)，5.51(d，1H，J＝10Hz，HβC＝)，5.58(s，2H，2xOH，D₂Oexchangeable)，6.34(d，1H，J＝8Hz，HC＝)，6.38(d，1H，J＝8.5Hz，HC＝)，6.58(d，1H，J＝8.5Hz，HC＝)，6.65(d，1H，J＝10Hz，HαC＝)，6.78(d，1H，J＝8Hz，HC＝)；

紫外，uvλmax(MeOH)280nm(logυ3.98)，289 infl.(3.89)and 311(3.36)(uv maxima werenot shifted by an addition of excess AlCl₃ solution.)；ms，m/e354(M⁺，23％)，339(78％)，189(10％)，187(29％)，173(100％)，166(5％)，153(18％)and 147(6％)；

元素分析：计算值：C₂₁H₂₂O₅：C，71.19；H，6.25.分析值：C，71.21；H，6.42.

4′-O-甲基光甘草定(4′-O-METHYLGLABRIDIN)；

红外，ir(KBr)υmax 3410，2980，2920，2860，1615，1600，1583 and1515cm^-1；pmr(CDCL₃，100mHz)δ1.40(s，6H，C(CH₃)₂)，290(2H，AB of ABMXX′)，3.3-3.6(1H，M of ABMXX′)，3.70(s，3H，OCH₃)，4.05(1H，X of ABMXX′)，4.38(1H，X′ofABMXX′)，5.20(s，1H，exchangeable D₂O)，5.50(d，1H，J＝10Hz，HβC＝)，6.29(d，1H，J＝2Hz，HC＝)，6.32(d，1H，J＝8Hz，HC＝)，6.41(dd，1H，J＝2 and 8Hz，HC＝)，6.61(d，1H，J＝10Hz，HαC＝)，6.77(d，1H，J＝8Hz，HC＝)and 6.96(d，1H，J＝8Hz，HC＝)；

紫外，uvλmax(MeOH)281nm(logε4.07)，290 sh(3.96)and 312(3.34)；ms，m/e338(M⁺，25％)，323(91％)，187(32％)，173(100％)，150(12％)，149(22％)and 137(15％)；元素分析：计算值：C₂₁H₂₂O₄：C，74.53；H，6.55；分析值：C，74.47；H，6.51.

异甘草黄酮醇

核磁，NMRδ_H(DMSO-d₆)：1.68(6H，s，(CH₃)₂O＝CHCH₂)，3.28(2H，d，J＝7Hz，(CH₃)₂C＝CHCH₂)，5.28(1H，t，J＝7Hz，(CH₃)₂C＝CHCH₂)，6.15(1H，d，J＝2Hz，6-H)，6.37(1H，d，J＝2Hz，8-H)，6.90(1H，d，J＝8Hz，5′-H)，7.85(1H，dd，J＝8，2Hz，6-H)，7.87(1H，d，J＝2Hz，2′-H)，9.16，9.98，10.64，12.44(均为1H，bs，OH，D₂O交换消失).

质谱，M.S.m/z：354.1103(M⁺-C₄H₇)，285.0345(M⁺-C₅H₉)，269.0482，189.0939，189.0939，153.0188，134.0313，106.0195.

甘草西定(Licoricidin)：

[α]²⁵ _D+19.26(MeOH，C＝1)，UVλ^EtOH _maxnm(logε)282(3.86)。I.R.γ^KBr _maxcm^-13500，3285，1615，1504.NMR(DMSO-d₆，δ)1.70(6H.br.S. Ar)，3.25(2H，d，J＝6Hz，-CH₂-Ar)，5.12(1H，t，J＝6Hz，-CH＝C)，5.00(1H，J＝6Hz -CH＝C)，3.63(3H，s，OCH₃)，6.08(1H，s)，6.23(1H，d，J＝8Hz)，6.67(1H，d，J＝8Hz)，5.36，4.80(各1H，dd，J＝10，3Hz)，3.84(1H，d，J＝10Hz)，2.80(2H，m)。M.S.m/z424.2192(分子式为C₂₆H₃₂O₅)，NMR(CDCl₃，δ)，1.61(6H，br.s)，1.67(6H，br.s)，2.20，2.24(各3H，s，3xCOCH₃)，2.80(2H，m)，3.08，3.15(各1H，d，J＝6Hz)，3.64(3H，s)，3.90(1H，d，J＝10Hz)，4.20(1H，dd，J＝10，3.5Hz)，6.32(1H，s)，6.95(1H，d，J＝8Hz)，7.02(1H，d，J＝8Hz)。

芒柄花黄素(Formononetin)

UVλ^EtOH _maxnm(logε)255(4.45)，310(4.08)。M.S.m/z268(M⁺)，253，240，225，132。NMR(DMSO-d₆，δ)3.73(3H，s)，6.8-6.96(4H，H_{3′，5′，6，8})，7.43(2H，d，J＝8Hz，H_2′.6′)，7.90(1H，d，J＝8Hz)，8.26(1H，s，H₂)。

元素分析：计算值C₂₁H₂₂O₄·1/2H₂O：C，72.63；H，6.67

分析值：c，72.82；72.71；H，7.03，6.91

UV：λ^MeoHnm(logε)：256(4.04)，315(4.15)，380(4.46)；

λ^MeONanm(logε)：252(4.07)，355(4.04)，456(4.65)

IR：υ^KCl _max1576，1595，1613，1660，3190-3280厘米^-1

NMR：

M.S.m/e：M⁺338(M⁺，)，307(M-OCH₃)，121(HO-C₆H₄-C≡O⁺，).

Claims

1、种甘草黄酮的提取纯化的方法，包括甘草根干燥、粉碎、溶剂萃取、过滤和浓缩，其特征是溶剂萃取液过滤后用膜进行超滤，再浓缩得产品甘草黄酮。

2、如权利要求1所述的一种甘草黄酮的提取纯化的方法，其特征是所述的溶剂萃取是用有机溶剂及它们的混合溶剂在回流温度下萃取或0～40℃时冷浸或渗漉萃取，萃取时间为1～48小时。

3、如权利要求1所述的一种甘草黄酮的提取纯化的方法，其特征是所述的超滤膜具有孔径为分子量1000-15000的膜。

4、如权利要求1所述的一种甘草黄酮的提取纯化的方法，其特征是所述的超滤压力为0.1～1mPa.。

5、如权利要求1所述的一种甘草黄酮的提取纯化的方法，其特征是所述的浓缩是低温浓缩、冷冻干燥、减压浓缩或粉末喷雾干燥的方法。

6、如权利要求1所述的一种甘草黄酮的提取纯化的方法，其特征是所述的过滤通是用滤布予以粗过滤。

7、如权利要求1所述的一种甘草黄酮的提取纯化的方法，其特征是所述的经超滤、浓缩所得的甘草黄酮再经柱层析纯化。

8、如权利要求1所述的一种甘草黄酮的提取纯化的方法，其特征是使用的层析为聚酰胺或硅胶或分子筛层析，使用的层析溶剂为有机溶剂(包括醇、烷烃、酯、氯化烃、芳香烃等)或它们的混合物。