CN1442427A

CN1442427A - 重组人白细胞介素－2的三突变体及制备方法

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Publication number: CN1442427A
Application number: CN 02133533
Authority: CN
Inventors: 欧阳克清; 胡应和; 蒋红诗; 李新平; 刘堰; 蔡绍皙; 陈荣高; 唐宜国
Original assignee: Chengdu Sichuan Rong Gao Industry Group Co Ltd; Chongqing University
Current assignee: Chengdu Sichuan Rong Gao Industry Group Co Ltd; Chongqing University
Priority date: 2002-07-23
Filing date: 2002-07-23
Publication date: 2003-09-17
Anticipated expiration: 2022-07-23
Also published as: CN1208345C

Abstract

本发明涉及重组人白细胞介素－2的三突变体及制备方法，目的是利用基因工程手段对人白细胞介素－2(hIL－2)进行改造，制备的三位点突变白细胞介素－2证明比天然人白细胞介素－活性高4.3倍。通过获得三位点突变白细胞介素－2cDNA，构建pPIC9K－IL－2－3m质粒，再转入KM71巴斯德毕赤酵母，从pPIC9K－IL－2－3m KM71酵母发酵上清液中获得三位点突变白细胞介素－2蛋白。即将天然白细胞介素－2的18位、19位和125位氨基酸分别换成蛋氨酸、丝氨酸和丙氨酸。

Description

重组人白细胞介素-2的三突变体及制备方法

技术领域：

本发明涉及重组人白细胞介素-2的突变体及制备方法

背景技术：

人白细胞介素-2(hIL-2)有三个半胱氨酸残基，其中58位和105位的半胱氨酸形成分子内二硫键，而125位的巯基游离，通过定点突变的方法用丝氨酸或丙氨酸取代125位的半胱氨酸，其活性升高。用其他的氨基酸取代125位的半胱氨酸的取代物活性几乎都不变。虽然58位或105位半胱氨酸的取代物的尘物活性下降，然而58位半胱氨酸取代物的突变体与105位半胱氨酸取代物的突变体相比，活力下降20多倍。有可能58位半胱氨酸周围的氨基酸序列起着重要作用。相比之下，在hIL-2的结构功能中105位附近的氨基酸重要性差得多。另一方面，58位半胱氨酸取代物的突变体之所以失去活性可能是由于105和125位半胱氨酸之间形成错配的分子内二硫键。为了评价二硫键正确的重要性，分别用聚合酶链式反应合成丙氨酸取代半胱氨酸的三位和二位的突变蛋白，取名A58/105/125和A58/125，在CTLL-2细胞上用胸苷法掺入分析显示。虽然这两个突变体与野生型hIL-2的活力相比只有0.5-2％，但它们比A58的活力多50-200倍，A58就是在58位用丙氨酸取代半胱氨酸的突变体。受体竞争结合实验表明突变体A58/125和A58/105/125对于高亲和力的IL-2受体比A58高5-25倍。这些结果表明突变体A58活力急剧下降，可能是因为105和125位半胱氨酸形成错误的二硫键(Rang Y，Lee N，Liang S.M.Analysis of IL-2 functional structure by multiplecysteine substitutions.Biochem.Biophys.Res.1992；188(2)：945-955)。由于天然hIL-2中125Cys点突变为Ala或Ser得到的Ala¹²⁵IL-2和Ser¹²⁵IL-2具有不会形成二聚体，比活性高，热稳定性好，体内半衰期延长等优点。目前，两种新型IL-2现已通过中试，进入临床试验阶段(唐建伟，刘爱萍，虞建良.两种新型白细胞介素-2的热稳定优越性.生物工程学报1996，12(4)，448-454.)。另外，hIL-2相邻两个位点的突变体(L18M/L19S)，又名2D1，在结构完整性和与高亲和力IL-2受体结合能力两方面，都与野生型hIL-2相同。一般hIL-2/IL-2受体复合物通过受体介导的胞吞作用内化进入酸性胞内小体(acidic endosomalcompartment)后，野生型hIL-2连同IL-2Rβγ往往被分选进入溶酶体中降解，而释放的α亚基返回到细胞表面重新进入再循环(Fallon E.M，Liparoto S.F，Lee K.J et al.Increasedendosomal sorting of ligand to recycling enhances potency of an interleukin-2 analog.J.Biol.Chem.2000；275(10)：6790-6797.)。但是2D₁通过高亲和力hIL-2受体介导内化进入酸性胞内小体后，由突变蛋白带来的胞内小体中pH值的微小变化干扰了配体—受体相互作用，导致变异IL-2和IL-2受体复合物在胞内的分选运输过程改变，内化的2D1中有一部分未被分选入溶酶体中降解而存留下来，且被分选进入重新再循环。表现出经测定的2D1半衰期比野生型hIL-2长36小时，因此2D1变异蛋白的促细胞分裂增殖作用得到很大增强，生物学活性提高2倍多(Hemar A，Subtil A，Lieb，M.J et al.Endocytosis ofinterleukin-2 receptors in human T lymphocytes：distinct intracellular localizationand fate of the receptor alpha，beta and gamma chains.J.Cell.Biol.1995；129(1)：55-64.)。

长期以来，人们用大肠杆菌作为宿主表达了多种蛋白，其中包括IL-2。但这一系统本身也存在着若干缺陷：①作为一种原核表达系统，缺少真核生物的蛋白翻译后修饰和加工，如剪切、糖基化，形成二硫键等；②表达的蛋白多以包含体形式存在，需要经过复杂的复性才能恢复构象和活性；③背景蛋白很多，纯化麻烦；④表达量一般不是很高。从1997年开始，发展了酵母细胞表达系统。最先使用的是酿酒酵母，并且也用于表达了IL-2，但此系统也有其局限性，并不是理想宿主。如缺乏强有力的启动子，分泌效率差，表达菌株不够稳定，表达质粒易于丢失等。有鉴于此，人们发展了新一代的酵母表达系统-Pichia Pastoris巴斯德毕赤酵母系统，即甲醇酵母表达系统。作为真核表达系统，甲醇酵母具有许多其它蛋白表达系统所不具备的优点：①具有特有的强有力的醇氧化酶基因(AOXI)启动子，用甲醇可以严格调控外源蛋白的表达；②作为真核表达系统，表达的蛋白可以进行翻译后的加工和修饰(如糖基化)，从而使表达出的蛋白具有生物活性，③有完备的发酵方法，可以高密度连续培养，在发酵罐中细胞干重甚至可达120g/L以上；④营养要求低，生长快，可以在廉价的非选择性培养基中生长，补充盐、维生素即可，便于工业化生产；⑤表达量高，许多蛋白可达到每升克以上水平；⑥在Pichia Pastoris中表达的蛋白既可存在于胞内，又可分泌至胞外。分泌的目的蛋白质占所有被分泌蛋白的30％以上，并且Pichia自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少，十分有利于纯化；⑦糖基化程度低。因此，这是一种非常先进的表达系统。由此看来，利用分泌型巴斯德毕赤酵母来表达IL-2，是非常有效的。

发明内容：

由于IL-2在实际纯化中二硫键的错配，纯化的IL-2不够稳定，终产率很低，所以本发明通过改变IL-2的结构和更换表达载体及系统来克服这些缺点。

本发明的目的在于提供一种重组人白细胞介素-2的三位点突变体及制备方法，提高人白细胞介素-2的产量和活性。

为了实现上述发明目的，本发明的技术方案是：将人天然IL-2的18位Leu换成Met，19位Leu换成Ser，125位Cys换成Ala，得到一个三位点突变重组人白细胞介素-2，如图2和图3所示。

三位点突变重组人白细胞介素-2其制备方法是：

设计4条核苷酸引物：

(1)引物1，5′GCGAATTCTCAAGTCAGTGTTGAGATGATGCTTTGCGCAAAGG 3′

(2)引物2，3′CTGTAAATCAGACAATTAAATG 5′

(3)引物3，5′GCACGTTACGTAAGCACCTACTTCAAGTTCTAC 3

(4)引物4，5′GCATTTAATGTCTGATTTACAG 3′其中引物1和引物4为一组，引物2和引物3为一组，以天然人白细胞介素-2cDNA为模板进行PCR，将前两组的PCR产物合并，以引物1和引物3对合并的PCR产物进行第3次PCR。引物1(L₂TM3)中含EcoR I酶切位点，终止密码，125位Cys换成Ala和成熟人IL-23′末端部分氨基酸编码基因的一互补序列，引物2(L₂TMAS)，引物3(L₂TM5)含SnaB I酶切位点，起始密码和成熟人IL-25′末端部分氨基酸编码序列，引物4(L₂TMS)为突变引物，其中18位、19位亮氨酸分别突变成18位Met和19位Ser。经过3次PCR后，获得三位点突变人白细胞介素-2的DNA片段，低熔点琼脂糖电泳回收0.4kb带。最终得到的PCR产物为含有SnaBI和EcoR I酶切位点及18位、19位和125位突变的IL-2DNA片段，回收，用SnaB I和EcoRI酶切酶切，回收，然后克隆到pPIC9K真核表达质粒中，转化TOP10F‘菌株，鉴定后扩增。得到pPIC9K-¹⁸Met-¹⁹Ser-¹²⁵Ala-rhIL-2质粒，测序结果如图2所示。证明18位CTG换成了ATG，19位CTG换成了TCT，125位TGT换成了GCG，是我们需要的三位点突变人白细胞介素-2。然后将pPIC9K-¹⁸Met-¹⁹Ser-¹²⁵Ala-rhIL-2质粒转化KM71巴斯德毕赤酵母，得到宿主细胞是巴斯德毕赤酵母KM71/pPIC9K-¹⁸Met-¹⁹Ser-¹²⁵Ala-rhIL-2，通过诱导培养该宿主细胞，从其发酵上清液中获得三位点突变人白细胞介素-2蛋白，通过WESTERN BLOT检测(图4)和N端测序证明是我们的突变蛋白。通过选用强酸性阳离子交换树脂及凝胶柱纯化分离三位点突变重组人白细胞介素-2，可得到95％以上纯度的目的产物。用CTLL-2细胞对三位点突变重组人白细胞介素-2进行测活，其活性比标准品高4.3倍。

通过结构改变和更换表达载体及系统的IL-2至少有以下几个优点：

第一，提高白细胞介素-2的活性，比标准品高4.3倍左右。

第二，提高白细胞介素-2的稳定性。由于野生型白细胞介素-2分子中125位半胱氨酸是游离的，易于与58位或105位的半胱氨酸形成错配的二硫键、或分子间形成二硫键导致二聚体的形成，不利于白细胞介素-2的稳定，125位丙氨酸型白细胞介素-2则不存在二硫键错配的问题。此外，由于酵母对白细胞介素-2进行的糖基化修饰作用，使白细胞介素-2不易聚集沉淀。

第三，易于纯化，在重组白细胞介素-2的纯化过程中，白细胞介素-2要被还原剂还原为一级结构，然后再氧化为有活性的白细胞介素-2，由于125位半胱氨酸是游离的，易于与58位或105位的半胱氨酸形成错配的二硫键导致异构体的形成或分子间形成二硫键导致二聚体的形成，这些形成的异构体和二聚体一方面给纯化带来麻烦/另一方面比活性低。125位半胱氨酸被丙氨酸取代的白细胞介素-2则不存在二硫键错配的问题，因而有利于白细胞介素-2的纯化。另外，由分泌型毕赤酵母表达系统表达分泌白细胞介素-2，背景蛋白非常少，很易于纯化。

第四，翻译后加工修饰能力强。酵母表达系统为真核表达系统，可对表达产物进行糖基化修饰，从而得到更接近于人体内源性IL-2的产物。

通过本发明的特别设计，充分体现出本发明IL-2的高活性和表达载体和/或工程菌的高效性。

附图说明：

图1是pPIC9K-¹⁸Met-¹⁹Ser-¹²⁵Ala-rhIL-2质粒的构建示意图。

图2是天然hIL-2和三位点突变rhIL-2基因的序列比较。

图3是人IL-2的氨基酸序列与三位点突变rhIL-2氨基酸序列的比较。

图4是三位点突变rhIL-2表达产物印迹分析图。

图5是MTT法测定三位点突变rhIL-2活性图

图6是三位点突变rhlL-2活性单位的直接作图法

具体实施方式：

实施例I一、三位点突变hIL-2基因的克隆、扩增及pPIC9K质粒(Invitrogen)的构建

我们设计并用亚磷酸三酯法在DNA合成仪自动合成，经20％丙烯酰胺7mol/L尿素变性胶纯化得到四条引物，引物1，5′GCGAATTCTCAAGTCAGTGTTGAGATGATGCTTTGCGCAAAGG 3′，引物2，3′CTGTAAATCAGACAATTAAATG5′，引物3，5′GCACGTTAC↓GTAAGCACCTACTTCAAGTTCTAC 3，引物4，5′GCATTTAATGTCTGATTTACAG 3′。引物1(L2TM3)中含EcoR I酶切位点，终止密码，¹²⁵Ala和成熟人IL-23′末端部分氨基酸编码基因的一互补序列，共43个碱基，引物2(L₂TMAS)，共22个碱基，引物3(L₂TM5)含SnaB I酶切位点，起始密码和成熟hIL-25′末端部分氨基酸编码序列，共33个碱基，引物4(L₂TMS)为突变引物，其中18、19亮氨酸突变成¹⁸Met，¹⁹Ser，共22个碱基。从hIL-2全长cDNA序列以上述四条引物做PCR扩增，扩增的PCR产物除含有突变基因区域外，两端还带有限制性内切酶位点SnaB I和EcoRI。PCR扩增反应，模板：人IL-2 cDNA，94℃变性5′，然后94℃ 45秒 60℃ 45秒 72℃ 1分，25个循环扩增产物在琼脂糖电泳中呈现0.4Kb大小的致密区带，与设计的结果相符。扩增的0.4Kb片段的产物先用SnaB I酶切三位点突变IL-2插入子(⁸Met-¹⁹Ser-¹²⁵Ala-rhIL-2)和pPIC9K空载体。按表1程序

表1 SnaB I酶切DNA和载体

内容物管3加入体积管4加入体积

三位点突变rhIL-2

20μL(约5μg) pPIC9K空载体(5.25μg)10μL

插入子

SnaB I 1.5μL 1.5μL

buffer 4μL 4μL

重蒸水 14.5μL 24.5μL

总体积 40μL 40μL用SnaB I酶切IL-2插入子和pPIC9K空载体。表1中管3和管4分别在37℃酶切2h。使用Silver Beads DNA胶回收试剂盒(NSBC and Sangon)，从反应体系中去除限制性内切酶，回收和浓缩DNA(clean)。其具体操作如下：在管3和管4中分别依次加入10μL双蒸水(总体积50μL)，从回收试剂盒加入3倍体积溶解液，离心去掉上清液，加入10μL玻璃珠悬液，最后分别用洗脱液洗脱吸附到玻璃珠上的DNA，用双蒸水定容到34.5μL。而后用EcoR I酶切。在管3(含三位点突变IL-2插入子)和管4(含pP[C9K)34.5μL体积中分别依次加入缓冲溶液4.0μL，EcoR I 1.5μL，加入20μL玻璃珠悬液，离心弃去上清液，用洗脱液洗脱玻璃珠，用双蒸水定容到15μL。从管3和管4中(终体积15μL)中各取5μL，以1％的琼脂糖凝胶进行电泳。查看载体与三位点突变IL-2插入子的量，一般三位点突变IL-2插入子∶载体＝3∶1。最后限制性内切酶平端连接。在Ep管中依次加入三位点突变IL-2插入子10μL，去磷酸化(使用试剂盒)的质粒载体1μL，T₄DNA连接酶，1μL，50％聚乙二醇4000(PEG4000)缓冲液2μL，浓缩10倍体积的连接缓冲液2μL，双蒸水4μL，终体积为20μL。在14～16℃孵浴过夜，1.5％的低熔点琼脂糖凝胶电泳。电泳后，以Silver Beads DNA胶回收试剂盒回收重组子。得到pPIC9K-¹⁸Met-¹⁹Ser-¹²⁵Ala-rhIL-2质粒(图1)。然后该质粒以CaCL₂法转化大肠杆菌Top10F′，扩增，大量提取pPIC9K-¹⁸Met-¹⁹Ser-¹²⁵Ala-rhIL-2重组子。对它进行DNA序列分析。采用Sanger的双脱氧末端终止法和Messing的M13克隆一测序系统，使用TaqDNA聚合酶催化反应，并通过荧光标记进行PAGE自动测序(图2)。二、pPIC9K-¹⁸Met-¹⁹Ser-¹²⁵Ala-rhIL-2质粒转化Pichia Pastoris菌株KM71(Invitrogen)1取足够纯的约8μg的pPIC9K-¹⁸Met-¹⁹Ser-¹²⁵Ala-rhIL-2和空pPIC9K质粒(浓度约1ng/μL)，用Sal I酶切线性化之后，用华舜试剂盒做低熔点的Agrose胶回收，为转化作好准备。2挑取KM71毕赤菌株细胞接种到10mL YPD中，28～30℃ 250～300rpm摇培过夜。3稀释10mL YPD过夜培养的KM71酵母菌细胞液到OD₆₀₀＝0.1～0.2。28～30℃摇培让KM71细胞生长直到OD₆₀₀达到0.6～1.0，这过程大约需4～6hr。4500xg室温离心5min沉淀KM71细胞，弃去上清液。5将KM71细胞沉淀悬浮在10 mL缓冲液I中，不要求培养。6500xg室温离心5min沉淀KM71细胞，弃去上清液。7KM71细胞沉淀悬浮在1mL缓冲液I中，此时感受态KM71细胞制备好。8将KM71感受态细胞50μL转到200分装到有标签的1.5mL灭菌并带有螺旋帽的离心管中。9加5μL(约4μg)线性化的pPIC9K-¹⁸Met-¹⁹Ser-¹²⁵Ala-rhIL-2到50μL感受态KM71细胞中。10加1mL溶液II到pPIC9K-¹⁸Met-¹⁹Ser-¹²⁵Ala-rhIL-2/KM71细胞混合液中，旋涡器或手指弹试管混匀。11在冰浴或培养箱中30℃保温培养转化反应1小时。每15分钟旋涡或弹动试管混合转化反应。以免转化效率降低。12在42℃加热设备或水浴中42℃热休克10分钟。133000xg室温离心10min沉淀pPIC9K-¹⁸Met-¹⁹Ser-¹²⁵Ala-rhIL-2/KM71细胞，弃去上清液。14悬浮pPIC9K-¹⁸Met-¹⁹Ser-¹²⁵Ala-rhIL-2/KM71细胞于1mL溶液III中。153000xg室温离心10min，沉淀细胞，弃去上清液。16悬浮pPIC9K-¹⁸Met-¹⁹Ser-¹²⁵Ala-rhIL-2/KM71细胞，沉淀于1O0～150μL溶液III中。17将整个转化液涂布于RDB上，30℃培养2～4天。18两套96孔板共6个，一套三个。用灭菌的枪头(Tip)，在每个微孔中加入200μLYPD。19用灭菌牙签在第一套96孔板的每一个孔中接种单个His-转化子并搅动以悬浮细胞。20盖上96孔板盖子，30℃培养2天(不必振荡)。21 2天后，取新的96孔板并在每个孔内加入190μLYPD。22用多道移液器从第一套96孔板中取10μL接种到第二套微孔板。要确保第二套96孔板做好标记并按一定方式排列以便能保持孔的路线。23盖上盖并在30℃过夜培养第二套板。24第二天，重复第5、6步，得到第三套微孔板。注意克隆连续生长和取液会使它们所有的克隆达到相同的细胞密度。25培养后，取第三套96孔板并用多道枪在100μL容量处上下用枪吹打每个孔悬浮细胞。26从每个孔中点10μL到YPD板上，YPD板含有G418终浓度分别为0，0.25，0.50，0.75，1.00，1.50，1.75，2.00，3.00和4.00mg/mL。用多道枪按固定模式点样或在平板下打上格子。27让液体渗入，然后30℃培养平板，2，3，4或5天后检查抗G418克隆，得到高拷贝的克隆，即含有三位点突变重组人白细胞介素-2(三位点突变rhIL-2)基因的巴斯德毕赤酵母宿主细胞-巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)KM71/pPIC9K-¹⁸Met-¹⁹Ser-¹²⁵Ala-rhIL-2。三、三位点突变rhIL-2在甲醇酵母KM71中的表达

外源蛋白在甲醇酵母中的表达分两步，即菌体生长和蛋白诱导表达。先在以甘油为碳源的培养基上培养菌体，达到一定OD值后，离心，弃去上清液，菌体悬浮于以甲醇为碳源的培养基中诱导表达，每隔24小时加一次甲醇，以弥补甲醇的损失。首先优化表达的条件，如通气状况、pH值、培养基的组成等。一旦最佳条件确定，则可以按比例放大，从摇瓶培养转至大规模发酵。

1将筛选出His⁺Mut^s单克隆(三位点突变rhIL-2)接种于2mL YPD试管，30℃ 300rpm培养过夜，以1％接种入含100mL BMGY的500三角瓶。30℃ 300rpm培养至OD₆₀₀＝3～6(大约16～18小时)。

2室温下1500～3000xg离心5min收集菌体细胞。诱导表达，弃去上清液并将菌体细胞沉淀悬浮在BMMY培养基中，用1/5到1/10的原初始培养液体积(大约10～20mL)。

3将菌体悬浮液置于100mL三角瓶中，用2层灭菌的纱布或沙罩盖上三角瓶，再放回培养箱继续生长。

4每24小时加100％甲醇至终浓度为0.5％，保持诱导。

5下列的每个时间都要转移1mL表达液到1.5mL离心管中，时间点(小时)为：0，24(1天)，48(2天)，72(3天)，96(4天)，120(5天)和144(6天)。这些样品将用来分析表达水平并确定诱导后最合适的时间来收获上清液。室温下用台式离心机以最大速度离心2～3min。

6转移上清液到不同的管子里，-80℃贮存上清液和细胞沉淀直至准备分析。液氮或干冰/乙醇浴快速冷冻。

7 SDS-PAGE用银染或考马斯亮蓝染色和Western-blot活性分析来分析三位点突变rhIL-2的表达。

8按照SDS-PAGE要求对三位点突变rhIL-2进行电泳分离。

9电转移

通过电流使凝胶相中的蛋白质转移到硝酸纤维素薄膜(NC膜)上。将凝胶从玻璃板内取出后，将凝胶紧贴于硝酸纤维素薄膜上(先用电转移缓冲液浸泡硝酸纤维素薄膜30分钟)，用夹心方法把滤纸、凝胶、硝酸纤维素薄膜、滤纸依顺序放好，然后用海绵布、筛孔板固定好，插入电转移槽中，并加入转移缓冲液，保证凝胶在阴极、NC膜在阳极方向。电转移条件为90伏，2小时，4℃。电转移操作不要有气泡出现在里面。

10电转移完毕后，将NC膜置于10mL对NC膜合适的封闭液中，放在塑料盘里，置于摇床上旋转，大约1次/秒，摇动30min。这一步封闭后，弃去封闭液。

11用20mL双蒸水漂洗膜5min，然后弃去水，重复操作一次。

12将膜放在10mL一抗缓冲液，37℃孵育1小时与第一抗体反应，然后弃去溶液。

13用20mL稀释的抗体洗液洗膜5min，弃去洗液，重复操作三次。

14将膜放在10mL二抗缓冲液，37℃孵育30min，与酶标记第二抗体反应，然后弃去溶液。

15用20mL抗体洗液洗膜5min，弃去洗液，重复操作三次以上。

16用20mL双蒸水漂洗膜2min，然后弃去水。重复两次。

17将膜放在5mL显色底物缓冲液里孵育直到紫色条带出现在膜上。这种变化可以在1～60min内完成。

18用20mL双蒸水漂洗膜2min，然后弃去水。重复两次。

19将膜放在一张干净的滤纸上在空气中吹干，也可以通过一束经微的热空气吹干或置于红外灯下干燥(图4)。

实施例II

一、三位点突变rhIL-2的纯化及活性测定

有关rhIL-2的纯化多限于从大肠杆菌中提取，用巴斯德毕赤酵母表达及纯化分泌型天然及突变型rhIL-2还是首次，从该表达系统中纯化三位点突变rhIL-2是一个全新的探索过程。我们摸索了一套最简单，快速的纯化步骤。

甲醇诱导3天后，4℃，15000rpm离心10min，上清液立即加入PMSF(丝氨酸蛋白酶的抑制剂)至1mmol/L或者5～10mmol/L EDTANa₂，防止蛋白酶的作用，-20℃冻存。分泌型表达产物的发酵液的体积很大，但浓度较低，因此必须在纯化前进行浓缩，纯化时在冷柜操作，上清液用0.45μm膜过滤以防微小颗粒对滤膜堵塞。过滤后得到备好的发酵上清液200mL，用MW＝30000的膜截流，加双蒸水(相当于5个体积的发酵液)，循环滤过，最后弃去杯中浓缩液(很少)。除去MW大于30000的杂质。收集过滤液(含有三位点突变rhIL-2)，冷冻干燥浓缩至200mL，电泳检测。

再用MW＝10000的膜截流，加50mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液(pH3.5)约5～10个体积(将杯内的滤过液替换成缓冲液)，浓缩成约200mL(或更少)，除去MW小于10000的杂质并浓缩，取微量进行电泳检测。余下的用于离子交换。离子交换柱层析我们选用强阳离子交换柱，pH3.5，在这个pH下三位点突变rhIL-2是可溶的，而且大多数毕赤酵母蛋白不会吸附到这种树脂上，可以获得很好的纯化效果，洗脱后可以得到85％纯度的三位点突变rhIL-2。凝胶排阻色谱这类分离规模小、分离速度慢的操作单元放在最后，这样可以提高分离效果。凝胶过滤色谱放在最后一步不仅起到进一步纯化的结果，而且可以直接过渡到适当的缓冲体系中，以利于产品成形保存。我们选用SephadexG-100分子筛柱层析作为纯化三位点突变rhIL-2的最后一步，根据分子量的大小进行分离纯化，经凝胶过滤层析可以得到95％以上纯度的三位点突变rhIL-2(图4)。其操作过程如下：

1处理好的发酵液(其中含三位点突变rhIL-2)

2选用强酸性阳离子交换树脂(Bio-Rad公司提供的Macro-PrepS Support，作用基团：-SO₃ ^-)50mmol/L乙酸乙酸钠缓冲液(PH3.5)平衡柱体，柱体大小：2.5×30cm

3上处理好的发酵液(其中含三位点突变rhIL-2)，50mmol/l乙酸-乙酸钠缓冲液(PH3.5)冲洗，同时使三位点突变rhIL-2结合S柱。

4用50mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液(含0～1mol/L NaCL)进行连续梯度洗脱

5收集含三位点突变rhIL-2洗脱液(电泳检测其存在部位)

6脱盐，冷冻干燥后的样品溶于少量pH7.0(0.1mol/L)乙酸铵缓冲液

7上SephadexG-100层析柱(1.5×80cm)

8柱子经平衡液(0.1mol/L N₄HA_C缓冲液pH7.0，内含5mmol/LEDTANa₂，2mmol/L巯基乙醇)平衡过夜。上样后，用上述平衡液进行洗脱。

9收集含三位点突变rhIL-2洗脱液(电泳检测其存在部位)

10取适量Eppendof管，96孔细胞培养板等做相应标记。

11制备细胞悬液：收集CTLL-2细胞，用基础培养液{1640培养液加10％小牛血清(V/V，GIBCO 26140-079)或新生小牛血清(无支原体)。4℃条件下保存}洗3次，每次2000rpm离心5min。用基础培养液配成5.0×6.0×10⁵/mL的细胞悬液，置于37℃条件下保存备用。

12制备样品溶液：取一支标准品按说明书配成标准样品溶液。取规定数量的待检测样品按说明书配成待检样品溶液。

13制备样本溶液：用基础培养液将标准样品溶液稀释至200IU/mL。根据情况用基础培养液将待检三位点突变rhIL-2溶液稀释至约200IU/mL，每步稀释不得超过10倍。按以上预稀释程序制备的溶液称为样本溶液。

14制备样本梯度：在96孔细胞培养板中，每孔加入50μL完全培养液。在A4～6各孔加入50μL标准品溶液，在A1～3，A7～9，A10～12各孔中每孔加入50μL三位点突变rhIL-2溶液，每个待检样品做3个复孔，自A行到H行作对倍稀释，每孔留50μL余液。其中H4～6三孔留作空白。

15加入细胞悬液并培养：每孔加入50μL细胞悬液，37℃，5％CO₂条件下培养18～24小时(至第H4～6各孔存活细胞不足A4～6各孔的110％)。

(第二天)

16加入MTT溶液并培养：每孔加入20μL MTT溶液，37℃，5％CO₂条件下培养4～6小

时。

17加入裂解液(十二烷基磺酸钠SDS，分析纯产品，用蒸馏水配成15％的溶液。使用期限不得超过12个月)并保温。每孔加入150μL裂解液，37℃条件下保温18～24小时。

(第三天)

18测定OD值：在酶标仪上比色，测定波长570nm，参比波长690 nm，记录测定结果(图5)。

19生物学活性检测法的结果可用能诱导50％最大反应的待测样品最高稀释浓度作为参考效价(或滴度)，或者以此稀释度中所包含细胞因子的量为1单位(U)，即以此稀释度的倒数为待测样品中所含细胞因子所含的单位数。通常用直接作图法来计算待测样品的活性单位或浓度。用IL-2标准品和三位点突变rhIL-2待测样品的稀释度为横坐标，MTT的测定值(OD值)为纵坐标作图。在IL-2标准品最大OD值的50％处作一条与横坐标平行的直线，此直线与各曲线有相交点，分别相交点向横坐标作垂线，得到IL-2标准品和各三位点突变rhIL-2待测样品的与50％最大OD值相对应的稀释度。测定的三位点突变rhIL-2活性比天然IL-2活性高4.3倍左右(图6)。

Claims

1.一种重组人白细胞介素-2的三突变体，其特征在于将天然人白细胞介素-2(hIL-2)的18位亮氨酸(Leu)换成蛋氨酸(Met)，19位亮氨酸换成丝氨酸(Ser)、125位半胱氨酸(Cys)换成丙氨酸(Ala)。

2.一种重组人白细胞介素-2的三突变体制备方法，其特征在于：

(1)引物设计

设计4条核苷酸引物：引物1，5′GCGAATTCTCAAGTCAGTGTTGAGATGATGCTTTGCGCAAAGG 3′引物2，3′CTGTAAATCAGACAATTAAATG5′，引物3，5′GCACGTTACGTAAGCACCTACTTCAAGTTCTAC 3，引物4，5′GCATTTAATGTCTGATTTACAG 3′。其中引物1和引物4为一组，引物2和引物3为一组，以天然人白细胞介素-2cDNA为模板进行PCR，将前两组的PCR产物合并，以引物1和引物3对合并的PCR产物进行第3次PCR，引物1(L₂TM3)中含EcoR I酶切位点，终止密码，125位Cys变为Ala和成熟人IL-23′末端部分氨基酸编码基因的一互补序列，引物2(L₂TMAS)，引物3(L₂TM5)含SnaB I酶切位点，起始密码和成熟人IL-25′末端部分氨基酸编码序列，引物4(L₂TMS)为突变引物，其中18位、19位亮氨酸分别突变成18位Met和19位Ser。经过3次PCR后，获得三位点突变人白细胞介素-2的DNA片段，低熔点琼脂糖电泳回收0.4kb带，最终得到的PCR产物为含有SnaB I和EcoR I酶切位点及18位、19位和125位突变的IL-2DNA片段；

(2)亚克隆

将三位点突变人白细胞介素-2的DNA片段用SnaB I和EcoR I酶切，回收，然后克隆到pPIC9K真核表达质粒中，转化TOP10F‘菌株，鉴定后扩增。得到pPIC9K-¹⁸Met-¹⁹Ser-¹²⁵Ala-rhIL-2质粒。测序结果如图2所示。证明18位CTG换成了ATG，19位CTG换成了TCT，125位TGT换成了GCG，是我们需要的三位点突变人白细胞介素-2；

(3)转化、诱导表达然后将pPIC9K-¹⁸Met-¹⁹Ser-¹²⁵Ala-rhIL-2质粒转化KM71巴斯德毕赤酵母，得到宿主细胞是巴斯德毕赤酵母KM71/pPIC9K-¹⁸Met-¹⁹Ser-¹²⁵Ala-rhIL-2，通过诱导培养该宿主细胞，从其发酵上清液中获得三位点突变人白细胞介素-2蛋白。