CN1436095A - 由附着于纤维素珠表面的配体显示的蛋白质a的模拟活性 - Google Patents

由附着于纤维素珠表面的配体显示的蛋白质a的模拟活性 Download PDF

Info

Publication number
CN1436095A
CN1436095A CN01810048A CN01810048A CN1436095A CN 1436095 A CN1436095 A CN 1436095A CN 01810048 A CN01810048 A CN 01810048A CN 01810048 A CN01810048 A CN 01810048A CN 1436095 A CN1436095 A CN 1436095A
Authority
CN
China
Prior art keywords
purifying compounds
formula
molecule
superstructure
spacerarm
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN01810048A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1284622C (zh
Inventor
B·斯蒂帕诺维克
M·格里芬
I·斯卡帕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ACCURATE POLYMER Co
Original Assignee
ACCURATE POLYMER Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ACCURATE POLYMER Co filed Critical ACCURATE POLYMER Co
Publication of CN1436095A publication Critical patent/CN1436095A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1284622C publication Critical patent/CN1284622C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/02—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from eggs
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
    • B01J20/3206—Organic carriers, supports or substrates
    • B01J20/3208—Polymeric carriers, supports or substrates
    • B01J20/3212—Polymeric carriers, supports or substrates consisting of a polymer obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3214—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the method for obtaining this coating or impregnating
    • B01J20/3217—Resulting in a chemical bond between the coating or impregnating layer and the carrier, support or substrate, e.g. a covalent bond
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3214—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the method for obtaining this coating or impregnating
    • B01J20/3217—Resulting in a chemical bond between the coating or impregnating layer and the carrier, support or substrate, e.g. a covalent bond
    • B01J20/3219—Resulting in a chemical bond between the coating or impregnating layer and the carrier, support or substrate, e.g. a covalent bond involving a particular spacer or linking group, e.g. for attaching an active group
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3244—Non-macromolecular compounds
    • B01J20/3246—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure
    • B01J20/3248—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such
    • B01J20/3251—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such comprising at least two different types of heteroatoms selected from nitrogen, oxygen or sulphur
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3244—Non-macromolecular compounds
    • B01J20/3246—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure
    • B01J20/3248—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such
    • B01J20/3253—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such comprising a cyclic structure not containing any of the heteroatoms nitrogen, oxygen or sulfur, e.g. aromatic structures
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3268—Macromolecular compounds
    • B01J20/3278—Polymers being grafted on the carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)

Abstract

一种纯化蛋白质的方法和化合物，包括将非肽的小化合物(其模拟蛋白质A对免疫球蛋白的亲和性)附着于载体基质上。一旦附着在载体基质上后，所得的一氯三嗪衍生物与过量的氨基化合物在较高的温度下反应获得高水平的取代。生成的具有配体的载体基质用于抗体的亲和性分离。而且巯基杂环体系配体也可以附着于超级载体基质上，并用于抗体的亲和性分离。

Description

由附着于纤维素珠表面的配体显示的蛋白质A的模拟活性
相关申请
根据35U.S.C§119(e)，本申请要求享有与2000年4月28日申请的临时申请US60/200591相同的申请日，并且该文件作为参考文件被引入本文。
发明背景
目前所有的蛋白质纯化体系都存在缺陷，尤其是对于大规模的纯化而言。特别是，就纯度和产量而言，对于抗体的纯化就更不充分了。因此，由于制备具有治疗和诊断目的的纯化的免疫球蛋白需要大量的溶剂和较长的生产时间，所以现有加工方法的费用很大。
在亲和分离中，待纯化的蛋白质选择性和可逆地附着至互补结合物质或亲和配体上，所述亲和配体经常数倍于抗体分子。通常，与其它的分离技术相比，亲和分离产生很低的非特异结合。这种很低的非特异结合使得从复合的生物混合物中纯化给定的蛋白质、从天然分子中分离出不正确的折叠形式并回收所述的蛋白质成为可能。
已知的纯化体系使用玻璃或金属管，其中含有填满分离介质如珠或颗粒的柱子。这些管子被称为柱式盒。由于分离介质被紧压进该柱式盒中，所以流速很慢且该柱式盒的容量也有限。因此，现有纯化技术的焦点已经集中在提高分离介质的多孔率从而增加流速和柱式盒中的容量。这些已知体系的目的是在最短的时间内纯化最大量的物质，同时产品中的污染物含量较低且产量较高。老的纯化技术的一个问题是虽然提高分离介质的多孔性使得流速加快和容量增加，但是产量和纯度却降低了。
OrbicellTM纤维素珠购自伊利诺州的Accurate Polymers有限公司，并记载在1999年6月2日由Stipanovic等人申请的美国专利申请US09/324,527中，该申请的题目为使用非多孔纤维素珠的静置分离方法，在此被引入作为参考。
一种典型的亲和附着剂由固体载体、间隔臂和配体构成。间隔臂可以通过使配体更易接近而促使蛋白质结合。某些亲和分离产品不具备足够长度或合适特性的间隔臂而有助于目标化合物如抗体的附着。为了克服这种限制，需要有一种间隔臂，它对配体具有较好的取向、使目标化合物之间位阻降低、也使配体之间的位阻下降，由此能够更好地使目标化合物附着。由于间隔臂和/或配体的几何形状使得目标化合物容易附着于配体，因此提高了目标化合物的产量。目前需要一种配体即对目标化合物如蛋白质例如抗体表现出特异和可逆的结合特性。
在固定的金黄色葡萄球菌蛋白质A(SpA)，蛋白质G和蛋白质M柱子上的亲和色谱法是当今单克隆抗体和多克隆抗体生产的纯化方法。这些来源于细菌的蛋白质不仅仅生产费用高，而且生物和化学稳定性差。对于被用来纯化治疗用途抗体的附着剂来说，具有清洁和杀菌的能力是常规管理(regulatory authority)绝对要求的。多克隆抗体以及最近开发的单克隆抗体都通过亲和柱色谱法进行常规的纯化。这些抗体已经广泛用于诊断领域，但是近来类似的抗体被越来越多地发现它们在治疗方面的用途。后者的应用很难耐受任何亲和附着剂的不稳定性，当蒸发时这种情况变得尤其关键，或者常规机构将要求进行严格的化学杀菌处理。
当然，与在诊断领域的应用相比，最终在治疗方面的应用将促进对更大量高纯度抗体的需求。但是，就未来成比例增加的需求，目前的技术现状所面对的第一个障碍是那些细菌来源的蛋白质非常昂贵。附着剂最大的费用在于常规管理即在需要杀菌操作过程中对该附着剂潜在不稳定性的全面检查。因此，目前需要解决上述现有技术存在的这些问题和其它难题。
最近在分子模型中的进展已经使得研究小组能够提供比细菌来源的蛋白质更小的分子，令人惊奇的是，对于很多免疫球蛋白来说，它们还能够模拟相应细菌蛋白质的高亲和性和选择性。所述的模型合物到短至中等长度的肽。这些肽中的一部分是直线型的，而其它则具有大环结构。
发明概述
本发明涉及新颖的配体、制备该配体的方法、使用该配体纯化化合物的方法以及该新颖配体与纤维素珠的附着。
生物分子特别是免疫球蛋白的大规模纯化是通过使用纤维素珠完成的，该纤维素珠附着于小的非肽化合物上，其对于待纯化的生物分子来说具有高亲和性和选择性。另外，带有式子I-IV附着配体的珠在严格的回收和杀菌操作中的化学稳定性也很高。纯化化合物的方法包括，为含有待分离化合物的溶液提供具有式子I-IV配体的载体基质，使得该配体与待分离的化合物相互作用，清洗该载体基质，洗脱出待分离的化合物。在另一个实施方案中，所述载体基质包括间隔臂。
参照下面详细描述的优选的实施例以及结合附图将会更好地理解本发明。以下的描述是描述性的、阐述和举例性的，并不是对所附权利要求保护范围的限制。
发明详述
在一个实施方案中，式子I表示模拟蛋白质A对免疫球蛋白的亲和性的非肽小化合物。模拟蛋白质A亲和性的化合物还可以叫做蛋白质A模拟物(PAM)。如反应1所示，可以制备式子I的配体并固定在OrbicellTM珠上，其具有间隔臂表面化学，终端为分子量范围在64和2000道尔顿之间的直线聚乙二醇分子上的氨基。肼可以与终端酯反应，产生以酰肼官能团为终端的分子超结构。在另一个实施方案中，该分子超结构所具有的终端官能团选自由以下基团组成的组：琥珀酰亚胺基、苯硫基、2，4-二甲氧-s-三嗪基、氰甲基(cynomethyl)、氯甲酰基和对-硝基苯(phynel)酯。该纤维素珠的大小范围在约0.1微米至20微米。该分子超结构改善了所得的附着配体的几何形状。该分子超结构的两个终端肼基团使大量的配体能够附着。
在一个优选的实施方案中，待分离的免疫球蛋白是IgG。在IgG分子和附着于载体基质如OrbicellTM珠上的模拟SpA配体之间发生疏水性作用。因此，从添加具有附着模拟SpA配体的非多孔纤维素珠的溶液中能够分离出IgG。IgG附着到珠上的模拟SpA上。从具有配体-lgG复合物的珠上清洗出杂质，继续洗脱得到lgG，以及可重复使用的珠，该珠具有再生的配体用于重复结合IgG。该配体更容易附着于载体基质，并且与IgG的反应性较大。
如反应1所示，一旦以酰肼官能团为终端，s-三嗪基部分(b)就可以附着。在二氯-s-三嗪阶段产生与肼的反应，因为第二个氯化物比第三个氯化物的反应性要大。由于氯化物没有全部反应，所以该化合物的反应性高且这种高反应性提高了产量。一旦附着在珠表面，所得的单氯三嗪衍生物(c)在比该反应其它阶段的所用温度要高的反应温度下被迫与过量的氨基化合物(d)反应。
本发明式子I的配体在较好的空间控制条件下附着到固体状态的复合物上(载体基质，或例如OrbicellTM珠)，并且与IgG(或其它待纯化的目标化合物)具有更高的反应性。至少这些因素增加了纯化IgG的总产量。纤维素表面上的肼部分容易与二氯三嗪分子的易反应氯化物反应。所需的两个相邻配体基团的分子几何形状产生IgG与配体的多个附着点。肼表示最短的双官能NH2基团连接，其使得空间排列最佳并且配体最接近。因此，在表面上添加空间排列得到改善的改进的配体并结合使用改进的非多孔OrbicellTM珠能够提高所述基质和IgG(即其它抗体或目标化合物)之间的相互作用。
Figure A0181004800111
                                        式I
                         反应1
获得了很高水平的单氯三嗪衍生物的取代。为检验抗体的亲和性分离而测试式I的配体。该附着剂表现出很高的活性(抗体产量是44mg/g珠)和选择性(经HPLC分析的纯抗体：没有发现存在杂质峰(shoulders))。
在另一个实施方案中，对免疫球蛋白的模拟蛋白质A活性的另一个配体来自邻苯二甲酸衍生物。如反应2所示，过量摩尔的二甲基-5-硝基间苯二甲酸盐与甲醇中的三胺反应，分离出单酰胺并结晶(a)。间苯二甲酸酯的5-硝基单酰胺进一步与过量的苯胺反应，提供混合的5-硝基二酰胺(b)。在氢气压力下经Pd催化剂进行氢化反应得到混合的5-氨基二酰胺化合物(c)，SA-B。
Figure A0181004800121
                     反应2
现在化合物SA-B能够被接枝到纤维素珠表面上，该纤维素珠具有间隔臂，其是通过N-琥珀酰亚胺酯被官能活化的羧基，如图所示，产生通式II的配体。
在另一个实施方案中，制备式子II配体的方法包括使(4’羟基)乙氧苯基酰氨基(phenetyalmido)-1-羧基-苯胺基-3-羧基苯基-5-胺与终端活化的酯官能团反应。
Figure A0181004800122
                 式II
                      反应3
在另一个实施方案中，制备式子III配体的方法包括在肽-偶联剂存在的情况下，使(4’羟基)乙氧苯基酰氨基-1-羧基-苯胺基-3-羧基苯基-5-胺与终端的叔二羧基-乙基胺反应。
另一个可选择的移植方法是基于在使用常规的碳二亚胺试剂的条件下羧基官能化的珠与氨基SA-B的偶联，如反应4所示，产生下面的通式III的配体。
Figure A0181004800132
                      反应4
附着剂的另一个实施方案包括具有分子量高达大约60至2000道尔顿的α，ω-二氨基聚乙二醇基团的固定(pegylated)在其表面上的直径大约0.1-20μ的非多孔纤维素珠。伯胺与三环氧化物反应形成氨基-2-羟基加合物。剩余的环氧化物与硫醇(巯基)杂环化合物反应，其中R基团包括pi富电子体系，产生通式IV的配体。巯基杂环化合物可以选自：巯基-N-甲基咪唑(imidiazol)、2-巯基吡啶、巯基吡啶-N氧化物、2-巯基咪唑、2-巯基苯并咪唑、2-巯基-5-苯并咪唑磺酸钠、2-巯基-苯并噻唑、2-巯基苯并噁唑、2-巯基-5-甲基苯并咪唑、2-巯基-1-甲基咪唑、2-巯基-4-甲基嘧啶、2-巯基-5-硝基苯并咪唑、2-巯基吡啶、2-巯基吡啶N-氧化物、2-巯基-嘧啶、2-巯基-4(3H)-奎宁-锌(quinalo-zine)、2-巯基噻唑啉、2-巯基-噻唑、2-巯基噻二唑(thiadiazol)和5-甲基-1，3，4-噻二唑-2-硫醇以及本领域技术人员已知的其它巯基杂环化合物。接枝的巯基杂环化合物选择与生物分子结合，其除整个IgG分子之外包括IgM、IgY(鸡蛋)、Fab和Fc抗体片段。
Figure A0181004800141
RsH＝巯基杂环体系
                      反应5
本领域的技术人员能够用硫醇、酰胺或其它等同物完成式I-IV的苯酚基团的取代。而且，还包括式I-IV的盐。
在一个实施方案中，纯化方法包括提供能够结合免疫球蛋白的模拟蛋白质A(SpA)。该模拟蛋白A与载体基质结合。在一个优选的实施方案中，所述载体基质是纤维素珠。在一个优选的实施方案中，待分离的免疫球蛋白是IgG。IgG分子和模拟SpA配体之间发生相互反应。从带有配体-IgG复合物的珠上清洗出杂质，使得以后的洗脱液产生纯的IgG和可再利用的具有能够与IgG重复结合的再生配体的珠。
实施例1
在实施例1的蛋白质纯化方法中，200g的氨基官能化的OrbicellTM珠在真空和温和加热的条件下放置于2升的丙醇中。绝大部分水通过大约200ml的共沸物的蒸馏作用去除。向丙醇中的悬浮液添加大约100g的丙烯酸甲酯，所得的悬浮液在旋转或搅拌的情况下在约68℃的水浴中进行加热长达约36小时，使之进行反应。该反应完成后(根据对在该OrbicellTM珠上的氨基的阴性试验所表明)，该悬浮液进行搅拌直到冷却至约35℃。冷却后，该反应混合物进行旋转蒸发，蒸馏出约1000至1200ml的共沸物(5％丙烯酸甲酯-95％正-丙醇)。在蒸馏过程，另一部分1L正-丙醇添加进该蒸馏液中，并持续蒸馏直至共沸蒸馏液的总体积达到2.1-2.2升。此时剩下的悬浮液只是具有微弱气味的丙烯酸甲酯。
实施例2
用正-丙醇调节由实施例1获得的悬浮液的总体积，使总体积范围在1100至1200ml。在剧烈混合下，添加70g的无水肼，在约45℃下搅拌该悬浮液约14-16小时。所得的反应产物被离心，并用丙醇清洗该酰肼珠三次。丙醇清洗后，用水彻底清洗珠直到过滤物对肼的试验是阴性为至。
实施例3
将含有约100g干珠的来自实施例2的湿润的酰肼官能化的珠分布于400ml的0.1mol的二乙酸钠中(5.7g的商购二乙酸钠结晶，在395ml蒸馏水中)。向该水悬浮液中添加1000ml二甲氧乙烷和53g(0.22mol)的苯胺基-二氯-s-三嗪。在45℃下搅拌该悬浮液约6-8小时。对酰肼试验为阴性后，经离心分离珠，并用二甲氧乙烷清洗一次。然后用乙醇清洗珠5次，接着用N-甲基吡咯烷酮清洗一次。
实施例4
将来自实施例3的珠分散于1升的N-甲基吡咯烷酮中，并添加25g(0.2mol)的三嗪。该反应混合物在搅拌下被加热并维持在68℃大约36小时。冷却到室温后，在篮式离心机中，用N-甲基吡咯烷酮清洗珠三次，再用正-丙醇清洗三次。在切向流系统中用水彻底清洗得到式I的配体。
实施例5
用98％的乙醇清洗约23.27g的3-7μOrbicallTM珠6次，该珠上含有伯氨或仲氨基团。将该悬浮液置于200ml的乙醇中，该乙醇添加了7.8g的三环氧化物，该混合物在约64℃下搅拌约18小时。2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)试验表明所述珠上的胺已完全反应。在台架式离心机(benchtop centrifuge)上用乙醇清洗所述混合物，然后用水清洗，最后用pH9.7的0.15M碳酸钠清洗，并悬浮在包括65ml乙醇和pH9.5的35ml的0.15M碳酸钠缓冲液的100ml混合物中。向该悬浮液中添加约2.7g的硫代咪唑，在室温下搅拌该悬浮液约18小时。然后用水清洗该悬浮液。无需进一步的清洗，所述具有式IV配体的珠能够用于结合实验中。
实施例6
使用OrbicellTMSimul-M珠的蛋黄IgY的分离
用pH8的150ml0.05M的磷酸盐缓冲液提取商购的蛋黄，并用聚苯乙烯珠摇动脱脂。通过添加固体盐调节该提取液至0.5M硫酸钠。添加具有式IV配体的OrbicellTM珠，振动/搅拌该悬浮液1小时。将该悬浮液引入分离设备中(例如在台架篮式离心机中的TAPS或交叉流动系统)，用0.5M的硫酸钠清洗该珠。用0.01M pH7.5的磷酸钠从清洗过的珠上洗脱出IgY。通过SDS/(聚丙烯酰胺凝胶电泳)PAGE和/或HPLC检验纯化IgY的纯度。
                     表1
                蛋黄IgY的纯化
步骤          每份蛋黄的IgY量    ％纯度
   脱脂蛋黄      100mg      15
  硫酸铵沉淀     ＞70mg     70-80
Simul-M亲和性    ＞60mg     ＞90
实施例7
从OrbicellTM亲和珠上分离溶液的几种方法的用途
将2.00mg商购的人类免疫球蛋白G(所有类别)[hlgG]溶解在pH为7.5的1.5ml的150mM氯化钠的10mM磷酸氢钠(pBS)中。向该溶液添加0.125ml用式I接枝的湿润的OricellTM珠(等于25mg的干珠)，经旋涡混合悬浮珠。在台式摇摆机中缓慢地摇动该悬浮液。大约1小时后，使珠离心分离为小颗粒(在微离心机(microfuge)上中等速度下)，去除上清液，在分光光度计上280nm读数。在280nm处的光密度的降低(OD280)表明85％以上的IgG结合到珠上。然后，用pBS通过在pBS离心分离的悬浮作用清洗该珠5次，倾析，再次悬浮在pBS中并再次离心。经第四次或第五次清洗，被清洗物的OD280降低至空白值，表明几乎没有或没有未结合的IgG。将所述珠悬浮在0.2M甘氨酸HCL，pH2.5(1.5ml)，并离心分离。含有IgG的分离上清液用2M的Tris.Cl，pH8中和。重复该提取步骤两次获得多于90％的IgG(1.8mg)。
对于含有免疫球蛋白的其它溶液，该离心分离方法也能够成功地使用。例如，将商购的IgA添加到玉米胚乳提取液中(对免疫球蛋白分泌的基因工程获得的玉米进行原型纯化，)。添加用式I型亲和珠接枝的珠，然后进行培养(23±2℃)，离心分离，倾析，用pBS清洗5次，接着提取珠结合的IgA，产率以起始IgA计大约是97％。对分离IgA样品的PAGE分析表明代表起始原料的三个带都仅具有痕量的玉米提取蛋白质。
除了交叉流动和直接离心(以获得小颗粒料)，其它从OrbicellTM珠分离溶液(或水)的方法包括：篮式离心(液体通过珠原料和编织篮过滤器)，移动，多孔带式分离(液体通过所述的带)，连续的离心分离，滤器)，移动，多孔带式分离(液体通过所述的带)，连续的离心分离，液体穿过珠的移动物料的灌注方法和很多其它的方法。
实施例8
在含有40μg/ml单克隆IgG抗体(MoAb)和约20μg污染物的400mlCHO细胞灌注液样品中，添加600mg接枝式I配体的OrbicellTM干珠。在室温下(大约28℃)温和搅拌该悬浮液约1个半小时直到MoAb附着完成。在交叉流动微过滤系统中将该悬浮液浓缩至60ml(约1％的悬浮液)。然后，在pH7.5(微碱性)下用10体积(600ml)的50mol的磷酸盐缓冲液与200mmol/L的氯化钠清洗该珠的污染物。在pH大约2.5下用10体积(600ml)的0.2mol的甘氨酸盐酸缓冲液洗脱附着的抗体，将该来自过滤器的渗透液引入到pH约8.5的摩尔tris-缓冲溶液中立即进行中和。中和的MoAb溶液经超滤浓缩(50,000分子量截断膜)，用十二烷基硫酸钠/巯基乙醇分离样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行表征。而且，高压配体色谱(HPLC)(尺寸-排除类型)也可以用于一些样品的表征和定量。经HPLC的MoAb纯度约96％，产率约92％。
对在此引用或引入的任何专利或专利申请没有表示或暗示认可。如上所述，上述的讨论仅是阐述性的、说明性的和举例性的，并不视为对本申请任何权利要求保护范围的限制。

Claims (53)

1.一种纯化化合物，包括
载体基质；
分子超结构；和
附着到分子超结构上的式I配体。
2.权利要求1的纯化化合物，其中所述载体基质是纤维素珠。
3.权利要求2所述的纯化化合物，其中所述纤维素珠基本上是非多孔的。
4.权利要求1所述的纯化化合物，还包括在接枝点与具有分子超结构的载体基质相连接的间隔臂。
5.权利要求4所述的纯化化合物，其中所述的间隔臂具有终端酯基团。
6.权利要求4所述的纯化化合物，其中所述间隔臂是线性聚乙二醇分子，其分子量范围在约64和2000道尔顿之间。
7.权利要求1的纯化化合物，其中所述的分子超结构具有终端酰肼基团。
8.权利要求1的纯化化合物，其中所述的纤维素珠的尺寸范围在约0.1微米至20微米之间。
9.权利要求1的纯化化合物，其中所述分子超结构选自由通过C-C，C-O，C-N和C-S键相链接的线性或支链组成的基团。
10.权利要求1的纯化化合物，其中所述分子超结构具有选自琥珀酰亚胺基、苯硫基、2，4-二甲氧-s-三嗪基、氰甲基、氯甲酰基和对-硝基苯酯的终端官能基团。
11.权利要求1的纯化化合物，其中所述配体是式I的同类物。
12.权利要求1的纯化化合物，其中所述配体以及与配体相附着的分子超结构形成亚氨基-双-[2-(2’-丙酰基)酰肼-4-苯胺基-6-(4”-羟基)乙氧苯基胺-s-三嗪]。
13.权利要求12的纯化化合物，其中s-三嗪部分至少被一个与另一个氮原子连接的氮原子取代。
14.制备式I产品的方法，包括：
使2-苯胺基-4，6-二氯-s-三嗪与具有终端酰肼官能团的分子超结构反应。
15.制备式I纯化化合物的方法，包括：
使s-三嗪基部分与肼官能团反应。
16.一种纯化化合物，包括：
载体基质；
分子超结构，和
式II配体。
17.权利要求16的纯化化合物，其中所述载体基质是纤维素珠。
18.权利要求17的纯化化合物，其中所述纤维素珠基本上是非多孔的。
19.权利要求16的纯化化合物，还包括在接枝点与具有分子超结构的载体基质相连接的间隔臂。
20.权利要求19所述的纯化化合物，其中所述间隔臂是线性聚乙二醇分子，其分子量范围在约64和2000道尔顿之间。
21.权利要求17的纯化化合物，其中所述的纤维素珠的尺寸范围在约0.1微米至20微米之间。
22.一种制备式II配体的方法，包括：
使(4’羟基)乙氧苯基酰氨基-1羧基-苯胺基-3-羧基苯基-5-胺与终端活化的酯官能团反应。
23.权利要求22的方法，其中所述终端活化的酯官能基团选自琥珀酰亚胺基、苯硫基、2，4-二甲氧-s-三嗪基、氰甲基、氯甲酰基和羧酸的对-硝基苯酯的基团。
24.制备式II配体的方法，包括使5-氨基二酰胺与羰基反应。
25.一种纯化化合物，包括：
载体基质；和
式III配体。
26.权利要求25的纯化化合物，其中所述载体基质是纤维素珠。
27.权利要求26的纯化化合物，其中所述的纤维素珠基本上是非多孔的。
28.权利要求25的纯化化合物，还包括与具有分子超结构的纤维素珠相连接的间隔臂。
29.权利要求28的纯化化合物，其中所述间隔臂是线性聚乙二醇分子，其分子量范围在约64和2000道尔顿之间。
30.权利要求26的纯化化合物，其中所述的纤维素珠的尺寸范围在约0.1微米至20微米之间。
31.制备式III配体的方法，包括使5-氨基二酰胺与羰基反应。
32.制备式III配体的方法，包括在肽偶联剂存在下，使4’(羟基)乙氧苯基酰氨基-1-羧基-苯胺基-3-羧基苯基-5-胺与终端叔二羧基-乙基胺反应。
33.权利要求32的方法，其中所述肽偶联剂是二环己基碳二亚胺。
34.一种纯化化合物，包括：
载体基质；和
式IV配体。
35.权利要求34的纯化化合物，其中所述的载体基质是纤维素珠。
36.权利要求35的纯化化合物，其中所述的纤维素珠基本上是非多孔的。
37.权利要求34的纯化化合物，还包括与具有分子超结构的纤维素珠相连接的间隔臂。
38.权利要求37的纯化化合物，其中所述的间隔臂是线性聚乙二醇分子，其分子量范围在约64和2000道尔顿之间。
39.权利要求36的纯化化合物，其中所述的纤维素珠的尺寸范围在约0.1微米至20微米之间。
40.权利要求34的纯化化合物，还包括一种分子超结构，其中该分子超结构是与所述间隔臂相连的终端反应的环氧官能基团。
41.一种制备式IV配体的方法，包括：使间隔臂上的伯氨基团与三环氧化合物反应形成终端的二环氧化合物；使该终端的二环氧化合物与巯基杂环化合物反应。
42.权利要求41的制备方法，其中所述巯基杂环化合物选自巯基-N-甲基咪唑、2-巯基吡啶、巯基吡啶-N-氧化物、2-巯基咪唑、2-巯基苯并咪唑、2-巯基-5-苯并咪唑磺酸钠、2-巯基-苯并噻唑、2-巯基苯并噁唑、2-巯基-5-甲基苯并咪唑、2-巯基-1-甲基咪唑、2-巯基-4-甲基嘧啶、2-巯基-5-硝基苯并咪唑、2-巯基吡啶、2-巯基吡啶N-氧化物、2-巯基-嘧啶、2-巯基-4(3H)-奎宁-锌、2-巯基噻唑啉、2-巯基-噻唑、2-巯基噻二唑和5-甲基1，3，4-噻二唑-2-硫醇以及它们的组合。
43.一种纯化化合物，包括式I的配体。
44.一种纯化化合物，包括式II的配体。
45.一种纯化化合物，包括式III的配体。
46.一种纯化化合物，包括式IV的配体。
47.一种纯化化合物，包括载体基质和非肽配体。
48.权利要求47的纯化化合物，其中所述载体基质是纤维素珠。
49.权利要求47的纯化化合物，还包括间隔臂。
50.权利要求47的纯化化合物，其中所述间隔臂具有终端肼基团。
51.权利要求47的纯化化合物，其中所述非肽化合物选自式I、式II、式III、式IV的基团和它们的组合。
52.一种纯化化合物，包括使用中间5-氨基二酰胺化合物而形成的配体。
53.一种纯化方法，包括：
提供具有结合有非肽配体的载体基质；
将上述结合有非肽配体的载体基质引入含有目标化合物的溶液中；
使得在所述配体和目标化合物之间发生相互作用；
清洗具有其上结合目标化合物的配体的珠，使得目标化合物从上述溶液中洗脱出，其中所述其上具有配体的载体基质可再利用。
CNB018100481A 2000-04-28 2001-04-30 由附着于纤维素珠表面的配体显示的蛋白质a的模拟活性 Expired - Fee Related CN1284622C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US20059100P 2000-04-28 2000-04-28
US60/200,591 2000-04-28

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1436095A true CN1436095A (zh) 2003-08-13
CN1284622C CN1284622C (zh) 2006-11-15

Family

ID=22742353

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB018100481A Expired - Fee Related CN1284622C (zh) 2000-04-28 2001-04-30 由附着于纤维素珠表面的配体显示的蛋白质a的模拟活性

Country Status (6)

Country Link
US (2) US6572767B2 (zh)
EP (1) EP1276557A2 (zh)
CN (1) CN1284622C (zh)
AU (1) AU2001259293A1 (zh)
CA (1) CA2407276A1 (zh)
WO (1) WO2001083515A2 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100577283C (zh) * 2008-06-16 2010-01-06 厦门大学 用作亲和吸附介质的聚n-2-羧乙基吡咯金属螯合纳米管的制备方法
CN107866206A (zh) * 2017-10-31 2018-04-03 苏州博进生物技术有限公司 一种环氧活化的亲和层析介质
CN108341750A (zh) * 2017-01-21 2018-07-31 浙江海洲制药有限公司 一种制备碘化造影剂中间体时所产生的杂质的合成方法

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2500903A1 (en) * 2002-09-13 2004-03-25 Pall Corporation Preparation and use of mixed mode solid substrates for chromatography adsorbents and biochip arrays
US7045366B2 (en) * 2003-09-12 2006-05-16 Ciphergen Biosystems, Inc. Photocrosslinked hydrogel blend surface coatings
CN1777435B (zh) * 2002-09-13 2011-01-12 拜奥根Idec公司 通过模拟移动床层析纯化多肽的方法
US20060292701A1 (en) * 2002-09-13 2006-12-28 Ciphergen Biosystems Inc. Photocrosslinked hydrogel blend surface coatings
US20050025970A1 (en) * 2002-12-06 2005-02-03 Bozidar Stipanovic Carbon beads
US7439062B2 (en) * 2004-12-23 2008-10-21 Biocept, Inc. Beads for capturing target cells from bodily fluid
GB0518460D0 (en) * 2005-09-09 2005-10-19 Univ Nottingham Trent Protein assay
WO2009007993A2 (en) * 2007-04-23 2009-01-15 Arvind Mallinath Lali A process for purification of immunoglobulins using a pseudobioaffinity adsorbent
ITMI20071119A1 (it) * 2007-06-01 2008-12-02 Tecnogen Spa Nuovi ligandi sintetici per immunoglobuline e composizioni farmaceutiche che li comprendono
WO2009141384A2 (en) * 2008-05-21 2009-11-26 Novo Nordisk A/S Process for the purification of factor vii polypeptides using affinity resins comprising specific ligands
AU2010278295A1 (en) * 2009-07-28 2012-02-23 Instraction Gmbh Specific sorbent for binding proteins and peptides, and separation method using the same
EP2812346A1 (en) * 2012-02-08 2014-12-17 Graffinity Pharmaceuticals GmbH Ligands for antibody and fc-fusion protein purification by affinity chromotography iv
WO2014020152A1 (en) * 2012-08-02 2014-02-06 Graffinity Pharmaceuticals Gmbh Ligands for apheresis and immunoabsorption
GB2513405A (en) 2013-04-26 2014-10-29 Adc Biotechnology Ltd Method of synthesising ADCs using affinity resins
JP6245688B2 (ja) * 2013-10-09 2017-12-13 国立大学法人 鹿児島大学 ＩｇＹ特異的結合ペプチド及びそれによるＩｇＹの精製法
GB201419185D0 (en) * 2014-10-28 2014-12-10 Adc Biotechnology Ltd Method of synthesising ADCs using affinity resin
GB201419184D0 (en) 2014-10-28 2014-12-10 Adc Biotechnology Ltd Method of synthesising biomolecule-effector/reporter-conjugates using affinity resins
CN105833848A (zh) * 2016-03-19 2016-08-10 复旦大学 一种分离巯基和非巯基肽段的填料及其制备方法
CN108314701A (zh) * 2018-04-09 2018-07-24 青岛汉德森生物科技有限公司 一种利用磁珠提取和纯化抗体的方法
CN109621908B (zh) * 2018-12-28 2021-07-16 陕西师范大学 一种自组装寡肽功能化磁性碳复合纳米粒子及其制备方法和应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5240602A (en) 1987-06-08 1993-08-31 Chromatochem, Inc. Chromatographic material
US4981961A (en) 1988-09-12 1991-01-01 Bioprobe International, Inc. Synthetic affinity ligand compositions and methods for purification and recovery of organic molecules
SE9401960L (sv) 1994-06-07 1995-12-08 Sven Oscarsson Alkalibeständigt proteinadsorbent
GB9519197D0 (en) * 1995-09-20 1995-11-22 Affinity Chromatography Ltd Novel affinity ligands and their use
US6315900B1 (en) * 1998-06-03 2001-11-13 Accurate Polymers Static separation method using non-porous cellulose beads

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100577283C (zh) * 2008-06-16 2010-01-06 厦门大学 用作亲和吸附介质的聚n-2-羧乙基吡咯金属螯合纳米管的制备方法
CN108341750A (zh) * 2017-01-21 2018-07-31 浙江海洲制药有限公司 一种制备碘化造影剂中间体时所产生的杂质的合成方法
CN108341750B (zh) * 2017-01-21 2020-10-23 浙江海洲制药有限公司 一种制备碘化造影剂中间体时所产生的杂质的合成方法
CN107866206A (zh) * 2017-10-31 2018-04-03 苏州博进生物技术有限公司 一种环氧活化的亲和层析介质
CN107866206B (zh) * 2017-10-31 2020-07-31 苏州博进生物技术有限公司 一种环氧活化的亲和层析介质

Also Published As

Publication number Publication date
US20010045384A1 (en) 2001-11-29
US6572767B2 (en) 2003-06-03
CA2407276A1 (en) 2001-11-08
CN1284622C (zh) 2006-11-15
US6919021B2 (en) 2005-07-19
US20030209491A1 (en) 2003-11-13
AU2001259293A1 (en) 2001-11-12
WO2001083515A3 (en) 2002-07-04
WO2001083515A2 (en) 2001-11-08
EP1276557A2 (en) 2003-01-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1284622C (zh) 由附着于纤维素珠表面的配体显示的蛋白质a的模拟活性
DE69634142T2 (de) Neuartige affinitatsliganden und ihre verwendung
US7833723B2 (en) Affinity chromatography matrices and methods of making and using the same
JP4776615B2 (ja) 抗体精製
CN104039808B (zh) 用bis-tris缓冲液的蛋白纯化
EP1778651B1 (en) Multivalent chelators for modifying and organizing of target molecules
CN1972746B (zh) 分离基质和纯化方法
CN104603144A (zh) 混合模式抗体亲和分离基质和使用其的纯化方法及靶分子
CN101415692B (zh) 用于蛋白质纯化的吸附剂
DE602004013040T2 (de) Aufreinigung von immunglobulinen
JPH0632790A (ja) ビオチン導入試薬およびそれを用いる合成ペプチド精製法
JPH04187646A (ja) 光学異性体用分離剤
US20220048010A1 (en) Ligand linker substrate
JP2006522332A (ja) アフィニティリガンドの製造法
YANG et al. Preparation and characterization of monoclonal antibodies to cephalexin-synthesizing enzyme from Acetobacter turbidans
JPH01175945A (ja) 抗ビリルビンモノクローナル抗体固定担体およびその製造方法
WO2004039765A1 (en) Use of urea variants as affinity ligands
CN105980485A (zh) 使用特定的蒽醌染料配体结构来纯化抗体、抗体片段或其工程变体的方法
JPH0544960B2 (zh)
JPH04139200A (ja) タンパク質の固定方法
JPH03169899A (ja) 高分子に抗体を結合させる方法
JPH0867640A (ja) 光学異性体用分離剤
JPH03257368A (ja) 蛍光標識剤、蛍光標識抗体および該蛍光標識抗体の調製法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C19 Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee