CN1431303A - 微量元素、无机营养盐类扩散型菌体培养用载体 - Google Patents

微量元素、无机营养盐类扩散型菌体培养用载体 Download PDF

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Abstract

本发明提供在生物反应器和废水处理等中实现高活性和高密度菌体的培养载体，该载体是由石绒形成的。该载体可以用于固定床甲烷发酵槽。

Description

微量元素、无机营养盐类扩散型菌体培养用载体
本申请的发明是关于微量元素无机营养盐类扩散型菌体培养用的载体。进而本发明是关于在废水处理装置、食品制造工业、医药品制造工业中用于培养微量元素无机营养盐类扩散型菌体的载体。
过去作为制造载体的方法，已知有将菌和酵素包含在高分子聚合物凝胶内的方法(包含法)，并应用于工业中。
然而，老的方法中，主要依靠的是对细菌繁殖有用的微量金属元素和无机营养盐类由外部培养液扩散移动到载体内部，所以这些物质的扩散速度决定了细菌的繁殖速度。代谢的物质产生向载体表面的扩散阻抗，所以有阻碍细菌繁殖的情况发生。气体物质在代谢时使载体向上浮起并造成破坏。进而在包含法等老方法中存在的问题是由于所用高分子的毒性，使细菌的活性显著减退，因此，即使菌密度很高，它的活性也未必与菌密度成比例。
为了解决这些问题，开发研制了将菌和载体以物理化学附着的表面结合型载体。
然而，这种方法中存在的问题是，由于菌繁殖时依赖于分泌的粘着性高分子状物质和载体的物理化学附着，所以菌的繁殖速度取决于从外部液体浸入液的无机营养盐和微量元素成分的构成。进而存在于载体表面的细菌，在生物反应器内流动时，产生细菌冒出分离，自然高密度聚集培养受到了限制。
因此，该申请的发明目的是提供一种在生物反应器或废水处理装置内能实现高活性和高密度菌体的新的微量元件无机营养盐类扩散型菌体培养用载体。
本申请的发明，作为解决上述课题提供的一种微量无机营养盐类扩散型菌体培养用的载体(权利要求1)，其特征是将菌繁殖用的微量元素和无机营养盐包含在多孔体内。
本发明提供了如下菌体培养用载体，即，将生物分解性树脂和葡萄糖等有机碳源包含在上述载体中的菌体培养用载体(权利要求2)、将菌类包含在上述载体中的菌体培养用载体(权利要求3)、在上述各载体中，利用高分子聚合物被覆表面的菌体培养用载体(权利要求4)、上述各载体中，在其表面菌体聚集繁殖，再次用高分子聚合物被覆的菌体培养用载体(权利要求5)、用生物分解性树脂被覆的菌体培养用载体(权利要求6)、在被覆高分子聚合物中含有磁性粉体的菌体培养用载体(权利要求7)等。
同样，本发明提供的是，以上述多孔体是高分子聚合物，或高分子聚合物凝胶的菌体培养用载体(权利要求8)为首、多孔体是陶瓷品、或天然石材料的菌体培养用载体(权利要求9)、将上述高分子聚合物包含在高分子聚合物凝胶内的菌体培养用载体(权利要求10)。
进而，本发明提供的是，作为由多孔体形成的载体，由石绒形成的菌体培养用载体(权利要求11)和将其作为固定床甲烷发酵槽用的载体(权利要求12)。
本申请的发明，作为如上述结合型载体，以高浓度将细菌繁殖所需要的微量元素和无机营养盐等有用物质包含在结合型载体内。据此，可防止因使用的高分子聚合物等多孔体的毒性引起细菌活性降低，通过调整构成载体的高分子聚合物等的厚度和空隙可防止繁殖受阻。进而，在载体表面上实施防止繁殖菌的物理分离的表面被覆等，细菌的种类和特性以及使用的反应器要与流动法相适应，才能防止细菌冒出分离。
本发明来自于这样的发现，基于把O2、H2作为基质的甲烷菌的谋求高浓度培养的研究上的见解，即，由于细菌繁殖所需要的微量元素无机营养盐的缺乏，细菌繁殖速度受到限制，所以通过供给控制繁殖的物质，可以使细菌的密度高密度化。
利比茨希(リ-ビツヒ)的最低原则，即，任何一种菌，作为该菌所需要的物质，欠缺一种时，细菌繁殖都会停止，符合于这种见解。根据这种见解，作为在生物反应器和废水处理装置内，进行活动的各种菌繁殖，供给必要物质的方法，是将这些物质以高浓度包含在载体内部，通过扩散，由载体内部扩散移动到表面，向表面生存的细菌供应这些物质。试验已确认，通过向其引入菌，使其连续繁殖，可维持细菌的高密度状态。
在包含了微量元素和无机营养盐类的本发明载体中，利用由高分子聚合物形成的凝胶作为多孔体使用，虽然在该凝胶中固定了微量元素和无机营养盐类，但对于多孔体的构成，可使用多孔性高分子聚合物的各种物质、高分子聚合物的凝胶，或微粒聚合物的集合体等，进而还可以是多孔性陶瓷品和轻石等天然石材料。
关于高分子聚合物或其凝胶，例如，作为吸水性聚合物等，以代表例示出，已知有丙烯酸系、甲基丙烯酸系、乙烯醇系、乙烯酯系、聚醚系、聚酯系、聚烯烃系等各种聚合物或共聚聚合物等。
关于菌体及其物质，对于具有上述多孔体的本发明载体，例如，在其表面、内部细孔内间隙内，如通过共价键、物理吸附、或离子键，进行键固定，菌体可包含在载体中、可聚集在载体表面上，也可以两种情况共存。
关于被覆表面的高分子聚合物，起到控制包含在多孔体内的微量元素、无机营养盐类、进而生物分解性树脂和葡萄糖等有机碳源等的扩散达到所要目的的作用。生物分解性树脂，通过它的缓慢分解可向菌体供给有机碳源。
作为模式如图示说明，首先，该发明的基本构成如图1所示(权利要求1)。在高分子聚合物的凝胶等多孔体内，包含载带了微量金属元素和无机营养盐的菌体培养用载体(A)。图2表示还包含有有机碳源、生物分解性树指等的载体(A)(权利要求2)。图3是包含了菌体的状态，例如在生物分解性塑料和有机碳源中植入了菌体状态的载体(A)示例(权利要求3)。
图4是在上述任何一个载体中，在其表面有控制扩散用被覆(1层以上)，由高分子聚合物构成的该发明载体(B)示例(权利要求4)。
图5是关于以上载体(A)、(B)，表面聚集菌体，再在其上设置被覆高分子聚合物时的载体(c)示例(权利要求5)。图6是关于载体(A)、(B)、(C)中任何一个被覆了生物分解性树脂的载体示例(权利要求6)。
同样，图7是有关图5示例的放大模式示例。
在由高分子聚合物被覆的本发明载体中，聚合物中分散含有铁氧体等磁性粉体，通过来自外部的磁场可控制载体的移动。图8是另一模式示例。
附加图9～11是将本发明载体用于反应器时的示例。另外，图9和图10中所示的「再反应物」的词是指废水处理中的分解物(degraded product)。
根据本发明载体的应用，例如可期待菌体浓度为20～40g-dry·cell/l。使用老方法为1～5g-dry·cell/l。
将废水处理等分解系统内基质量定为S，其分解以下式表示 ( dS dt ) = - μ · X / Y x / s
其中，μ表示菌的比繁殖速度、X表示菌密度，Yx/s表示菌收率(根据菌取一定值)。
根据本发明，μ接近于μmax时，由于运转可能，菌密度X比过去要高8～20倍，悬浮培养装置的分解速度，指数函数比过去增加了50～200倍，和利用老载体的生物反应器比较可增加数倍。
在多孔体中，提高了菌密度，以高浓度提高微量元素和无机营养盐类才能发挥作用，所以还要考虑这种多孔体存在于菌体繁殖培养液中的有效性。其中，陶瓷或天然石材作载体非常有效，特别是石绒在固定床甲烷发酵中极为有效。
实施例1
附图12是作为本发明的载体，将重量平均分子量约2000、皂化(クンイ)度98％的，以约16(重量)％溶解于水中，用饱和硼酸交联得到的PVA(聚乙烯醇)聚合物凝胶中，载持作为微量元素和无机营养盐的金属盐类，进行甲烷菌培养时的配方浓度的关系。下表1是微量金属元素的各示例。表2是基础无机盐类的各示例，表3是维生素溶液组成的各示例。表1组份                        浓度(μg/l)MgCl·6H2O                       410MnCl·4H2O                       50FeCl2·4H2O                     50NiCl2·6H2O                     12ZnSO4·7H2O                     10CoCl2·6H2O                     10CaCl2·2H2O                     10Na2SeO3                         8Na2MoO4·2H2O                  2.4CuSO4·5H2O                     1AlK(SO4)2                       1H3BO3                           1.8NaWO4·2H2O                     1表2组份                           浓度(mg/l)KH2PO4                           3400K2HPO4                           3400NH4Cl                             2130Na2CO3                           2540Resazurin                           2表3
       组份                  浓度(μg/l)
Biolin                            20
Folic acid                        20
Pyridoxine hydrochloride          100
Thiamine hydrehloride             50
Riboflavin                        50
Nicotinic acid                    50
Calcium DL-pantothenate           50
p-Aminobenzoic acid               50
Lipoicacid                        50
根据老的配方浓度，可知浓度增大150倍时，甲烷生成速度约增大3.7倍。据此，可确认本发明的优良作用效果。
图13是在NH4 +(氨)浓度非常高的废水处理中使用和上述相同的载体，在利用氢生产菌(Enterobactor aerogenes)产生氢试验中，使用本发明载体的氢生产菌的固定化培养和没有使用载体的氢生产菌的悬浊培养进行比较的结果。氢生产菌很容易受氨态氮气阻碍繁殖的影响。为观察这种现象调节PH容许范围进行比较的结果。使用载体的氢生产菌的PH容许范围和悬浮培养的范围比较，非常宽。最适宜的PH同为5.2～5.3，但此时，前者的氢生产速度是后者的约2倍，可以确认这是本发明的效果。
实施例2
在总容积31、液容积2.5l的玻璃制圆筒型发酵槽内，悬挂加工成圆柱型(120mm直径×70mm高)的石绒(日东纺绩制)，体积占据0.8l(液容积的32％)。为了使固定床甲烷发酵槽的性能和完全混合甲烷发酵槽比较，并用在相同容量的发酵槽内，不设置石绒的完全混合甲烷发酵槽。
在固定床材料中使用水耕栽培用石绒。它的物理性状示于表4。在预备试验中，从合成废水取出的石绒的水，直到不再从石绒浸出的计量结果，作为自由水，占83％(V/V)的比率。
表4石绒的物理特性和构成
密度(kg/m2) 80±12
真比重                      2.9
空隙率(％)                      97
组成(％) SiO2；42，Al2O3；15，CaO；33，MgO；6，Fe；0.5；TiO2；0.9，MnO；0.2，Na2O；1，K2O；0.8
将含有表5所示的微量金属盐和维生素类无机碱溶解于蒸馏水中，在灭菌器内进行灭菌(121℃、16分钟)。根据发酵槽的醋酸负荷。向其中滴加醋酸。将此用作甲烷发酵的合成废水。
                       表5基质的组成
成分   濃度(mg/L) 成分     濃度(mg/L)-
NH4HCO3K2HPO4(NH4)2SO4MgSO4·7H2ONaClKH2PO4Na2CO3CaCl2·2H2OCysteine·HClNa2S·9H2OFeSO4·7H2ON(CH2COOH)2ZnSO4·7H2OMnSO4·5H2OCoCl2·6H2OYeast extract     300045045021090045032012025025021151512  ReSaZurinVitaminB1Alk(SO4)2·12H2OCuSO4·5H2OH2BO3VitaminB6NiacinThioctio aoidFolic acidVitamin B2P-aminobenzoic acidBiotinVitaminB12NiCl2·6H2ONa2MoO4·2H2O     1.0000.1000.1000.1000.1000.1000.0500.0500.0200.0500.0500.0200.0050.0300.100
在由其它用途的消化槽采取的消化污泥中，以一天一次的排和充方式，半连续加入醋酸浓度5g/l的合成废水，从将水理学的滞留时间(HRT)设定为30小时开始缩短到16小时，于35℃下在液容积2.5l的发酵槽内进行约6个月的污泥培养。在得到培养甲烷菌稳定生成甲烷后，进行位相差和荧光显微镜(Olympus，BS50)的观察。确认Methanosarcina和Methanothrix属是优占菌，将此作为种菌用于甲烷发酵槽的启动运转。
同样，将上述固定床甲烷发酵槽和完全混合甲烷发酵槽设置成35℃水槽。以相同的初期接种量、槽酸负荷和水理学的平均滞留时间的操作，同时运转2基的甲烷发酵槽。
1)启动运转：首先，将发酵槽气相部分的空气置换成无O2的N2气，用1N盐酸将发酵槽中的PH调节为中性，将合成废水、无槽酸基质转化成2250ml，在厌气下接种。之后，从第3天开始连续加入含槽酸的合成废水。逐渐增加连续加入合成废水的速度，用2周时间达到目的槽酸负荷和HRT。
2)连续操作试验：发酵槽中甲烷生成速度达到正常状态后，在HRT2倍以上期间中，研究发酵槽运转时甲烷发酵槽中的特征颜色。实验条件示于表6中。作为判断在正常状态下发酵槽适用的指标、可用作为发酵槽中菌体密度的挥发性悬浮诱发物的密度(MLVSS)、醋酸浓度及气体的生成速度。表6固定床和完全混合甲烷发酵槽的操作条件
实验号       HRT(day)     醋酸负荷(g/l·day)  運耘時間(day)
    1       16.0      0.54     32
    2       16.0      2.50     32
    3       16.0      5.00     32
    4       16.0      7.00     32
    5       5.0      0.54     15
    6       5.0      2.50     15
    7       5.0      5.00     15
    8       5.0      7.00     15
    9       1.0      0.54     10
    10       1.0      2.50     10
    11       1.0      5.00     10
    12       1.0      7.00     10
    13       0.5      0.54     10
    14       0.5      2.50     10
    15       0.5      5.00     10
    16       0.5      7.00     10
发酵结果如下。
1、醋酸的去除率和稀释率
图14中示出了醋酸负荷为2.5(g/l·天)时的醋酸去除率和稀释率之间的关系。固定床甲烷发酵槽以稀释率为1(l/天)运转实验中大致100％的醋酸被去除，对此，完全混合甲烷发酵槽接近于发酵停止状态。当稀释率为2(l/天)时，固定床甲烷发酵槽的醋酸去除率在85％以上。我们认为其原因是由于固定床甲烷发酵槽在石绒上固定了大量的菌体，微生物滞留时间(MRT)要比水理学的平衡滞留时间(HRT)更长。即，可以认为使用石绒能效果显著地防止菌体被冲洗。
2、醋酸去除率和醋酸负荷
图15示出了稀释率为0.2(l/天)时醋酸去除率和醋酸负荷之间的关系。固定床甲烷发酵槽的醋酸去除部分很少，达到醋酸负荷为5(g/l·天)。即使醋酸负荷增加到7(g/l·天)，得到的醋酸去除率为88％。完全混合型甲烷发酵槽中的醋酸去除率受醋酸负荷的影响很大。当醋酸负荷从0.54增大到2.6(g/l·天)时，固定床甲烷发酵槽的醋酸去除率保持100％。而另一方面，完全混合甲烷发酵槽的醋酸去除率减少到95％。醋酸负荷从2.5到7(g/l·天)时，固定床甲烷发酵槽的醋酸去除率从98％减少到88％，而完全混合甲烷发酵槽的醋酸去除率从95％急据降到52％。这是因为在固定床上充分保持了捕捉的菌体密度，当促进醋酸分解时，如图16所示，对于醋酸负荷的变化，固定床甲烷发酵槽的PH变化要小于完全混合甲烷发酵槽的PH变化。在预备试验中，加入了石绒的发酵液PH和总碱度分别增加0.2和50(CaCO2mg/l)，可以认为石绒对发酵槽的醋酸负荷引起的PH变化起到了缓冲作用。
3、甲烷生成速度和稀释率
图17中示出了醋酸负荷为5(g/l·天)时，发酵槽的甲烷生成速度和稀释率之间的关系。稀释率从0.05增大到2(l/天)时，固定床甲烷发酵槽的甲烷生成速度降低很微小。对此。完全混合甲烷发酵槽，以低于0.3(l/天)的稀释率，甲烷生成速度，比固定床甲烷发酵槽稍快。当稀释率超过0.2(l/天)时，会急速减少。正如图18中明确的，菌体密度达到最高时的稀释率，完全混合甲烷发酵槽为0.2(l/天)、固定床甲烷发酵槽为1(l/天)，当比较各自的甲烷生成速度时，以石绒作载体的固定床甲烷发酵槽比完全混合甲烷发酵槽分别高1.2倍和8.5倍。可以认为这就证明了，如前所述，石绒捕捉了甲烷菌，防止了“被冲洗掉”。
4.菌体密度和稀释率
图18示出了醋酸负荷为5(g/l.天)时菌体密度和稀释率之间的关系。稀释率从0.06增加到1(1/天)时，固定床内部石绒空隙间液体的菌体密度增加到13.2(g/l)。当稀释率增加到2(l/天)时，固定床内部石绒空隙间液体的菌体密度降低到12.2(g/l)，而从固定床甲烷发酵槽排出的脱离液菌体密度几乎不变，为0.8(g/l)。完全混合甲烷发酵槽的菌体密度，当稀释率从0.06增加到0.2(l/天)时，从3.1增加到3.3(g/l)，但，稀释率超过0.2时，会急剧减少，稀释率为1(l/天)时，菌体密度为0.2(g/l)，稀释率为2(l/天)时，菌体密度为0.0(g/l)。这可以认为，在固定床甲烷发酵槽中，由于捕捉了大量的甲烷菌，而防止了菌体的洗脱，在完全混合甲烷发酵槽中，甲烷菌体的洗脱现象，在稀释率为0.2(l/天)以上时会发生。
另外，稀释率为1(l/天)时，固定床甲烷发酵槽的有效容积的平均甲烷菌体密度为
0.32×13.50+(1-0.32)×1＝5.00(g/l)。这可以认为，稀释率为0.2(l/day)时，是完全混合甲烷发酵槽的菌体浓度3.3(g/l)的1.5倍的密度，石绒具有优良的保持甲烷菌体的能力。
5、菌体密度和醋酸负荷
图19示出了稀释率为0.2(l/天)时固定床内部液体中的菌体密度、固定床甲烷发酵槽脱离液的菌体密度和完全混合甲烷混合槽的菌体密度与醋酸负荷之间的关系。作为醋酸负荷增加到5(g/l天)，之后，醋酸负荷达到7(g/l.天)时，固定床内部液中的菌体密度和完全混合甲烷发酵槽的菌体密度，双方的菌体密度都有减少。这时固定床内部液体中的菌体密度比完全混合甲烷发酵槽的菌体密度约高8倍。
在醋酸负荷为7(g/l、天)、稀释率为2(l/天)的苛刻条件下，进行测定固定床甲烷发酵实验结束后立即测定的附着在石绒表面上的菌体密度、滞留在石绒内部液体中的菌体密度、固定床甲烷发酵槽脱离液的菌体密度，结果示于图20。附着在石绒表面上的菌体密度是从固定床洗出的菌体，即固定床中液体所含的菌体，以式(1)的方法计算出。
附着在石绒上的菌体密度(g/l)＝(洗出的菌体一固定床中的液体体积×固定床内部中的液体菌体密度)/固定床体积
固定床内部中液体的菌体密度，分别是石绒上附着的菌体密度、固定床甲烷发酵槽脱离液菌体密度的4倍、12倍。作为载体的石绒到实验结束时变成了黑色，但没观察到变形和损坏等，可以认为是既廉价，耐久性又好的固定床材料。
从以上结果可知，在将石绒作载体的发酵槽内，通过维持大量的菌体，将石绒作载体的固定床内，很容易物理补足甲烷菌，对于甲烷菌要考虑对生物生息稳定的环境，对于较高的稀释率和醋酸负荷，可维持很高的菌体密度。该方法启发我们利用醋酸同化甲烷菌实现高速甲烷发酵的可行性非常高。
正如以上详细说明，根据本申请的发明，由于能在生物反应器和废水处理装置内实现高活性和高密度的菌体，所以能提高流动床和固定床培养装置等各种生物反应器的能力。通过将这种载体应用于生态系统等环保中，可用来恢复恶化了的环境和提高恢复环境的速度。
图1是本发明载体(A)的示例图。
图2是在载体(A)中载带生物分解性树脂/有机碳源的示例图。
图3是在载体(A)上生物分解性树脂和有机碳源中栽植细菌的示例图。
图4是具有控制扩散用被覆的载体(B)示意图。
图5是在表面菌体上具有被覆的载体(C)示意图。
图6是在载体(A)、(B)、(C)任何一个上被覆了生物分解性树脂的示例图。
图7是对图5的放大模拟示意图。
图8是具有磁性体被覆的示例图。
图9是流动床生物反应器示例图。
图10是固定床生物反应器示例图。
图11是间断气硝化、脱氮装置示例图。
图12是作为实施例的甲烷生成结果示例图。
图13是(A)、(B)分别对氢发生速度的PH影响示例图。
图14是表示使用石绒载体的甲烷发酵中醋酸去除率和稀释率之间关系图。
图15是表示稀释率为0.2(l/day)时，醋酸去除率和醋酸负荷之间关系图。
图16是表示醋酸负荷和PH之间关系图。
图17是表示醋酸负荷为5(g/l.day)时，甲烷生成速度和稀释率之间关系图。
图18是表示菌体密度和稀释率之间关系图。
图19是表示菌体密度和醋酸负荷之间关系图。
图20是表示固定床甲烷发酵槽的菌体分布图。

Claims (2)

1.由石绒形成的菌体培养用载体。
2.权利要求1的菌体培养用载体用于固定床甲烷发酵槽。
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