CN1413113A - 使用嘌呤能受体激动剂治疗胃肠道疾病的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种调节胃肠道中水和粘蛋白分泌以及流体移动的方法。本发明提供了一种治疗胃肠系统的粘膜屏障被削弱的胃肠道疾病的方法。本发明还提供一种矫正胃肠系统中流体分泌或吸收紊乱的方法。该方法包括以有效调节其胃肠道中水和粘蛋白分泌或矫正异常的流体移动的量给患者以含有嘌呤能P2Y受体激动剂的药物组合物。用于本发明的药物组合物含有P2Y嘌呤能受体激动剂如尿苷5′－二磷酸(UDP)、尿苷5′－三磷酸(UTP)、胞苷5′－二磷酸(CDP)、胞苷5′－三磷酸(CTP)、腺苷5′－二磷酸(ADP)、腺苷5′－三磷酸(ATP)和它们的类似物以及通式IV的二核苷多磷酸化合物。这些化合物被制备成口服形式、可注射形式或栓剂形式，并对患者给药。

Description

使用嘌呤能受体激动剂治疗胃肠道疾病的方法
                            前言
本申请要求1999年12月22日提交的美国临时申请第60/171710号的优先权，并将其公开的全部内容纳入作为参考。
技术领域
本发明涉及通过给予嘌呤能受体激动剂如某些尿苷、腺嘌呤或胞苷5′-二-或三磷酸、二核苷多磷酸或它们的类似物调节患者胃肠系统中粘液分泌和液体转运的方法。
发明背景
在许多情况下需要采用治疗的方法增加胃肠系统中粘蛋白分泌、碳酸氢盐分泌的量和/或水化的程度。胃肠系统的主要作用是从呈递给它的营养物质中吸取能量和代谢构件。消化道包括口腔(主要的唾腺)、食道、胃、小肠、大肠、直肠和附属器官(胰腺、肝和胆囊)。当消化道中粘膜屏障被削弱时，将引起诸如口干、胃-食道反流病、胃溃疡、炎性肠疾病等的疾病。下胃肠道中异常的流体和电解质转运引起诸如便秘和腹泻之类的疾病。
粘液是涂覆在许多上皮表面的粘性物质，分泌到如唾液之类的液体中。它主要由悬浮在水中的粘蛋白和无机盐组成。粘液粘附在许多上皮表面上，在那里它作为抵抗与有害物质(如胃酸、消化酶和细菌)接触的扩散性屏障和作为使切应力最小化的润滑剂。这种粘液性涂层在胃肠道、呼吸道和生殖道的上皮上特别突出。粘液也是唾液的丰富和重要成分，使它实际上与润滑特性并不平行。粘液分泌细胞如杯状细胞在胃肠道的上皮中是丰富的。大量的粘膜下层的粘液腺沿着食道散布，尤其在上食道括约肌之下和下食道括约肌之上聚集。唾腺中的许多腺泡上皮细胞分泌粘液。粘液层的主要结构分子是粘蛋白，这是一类大的、大量糖基化的蛋白质。粘蛋白的密集的“糖包衣”使得它们具有相当大的持水量，并且使它们能抵抗蛋白质水解，这一功能可能在维持粘液屏障作用方面是重要的。
碳酸氢盐的分泌在胃肠道中的粘膜健康的维持中起重要的作用。食道对局部酸化作用响应而产生的碳酸氢盐和粘液提供了一种抵制酸诱导的损伤的内在机制。唾液保护性因子的分泌(包括碳酸氢盐)以及从食道粘膜下层腺体分泌的碳酸氢盐在防止食道粘膜产生与胃肠反流该病有关的损伤方面是重要的。粘液的碳酸氢盐还提供一种保护近端十二指肠免受酸损伤的重要机制，在这种机制中，粘附的粘液提供一种稳定的保护层支持由粘液的碳酸氢盐进行的酸的表面中和作用。〔核苷酸刺激豚鼠胰腺导管中碳酸氢盐的分泌，Ishiguro等人，1999，J.Physiol.，519，Pt 2：551-558；CFTR剔除小鼠胆囊上皮，Clarke等人，2000，Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.，279：G132-138〕。
需要对流体和电解质在胃肠系统的适当区域中的吸收和分泌进行的正确调节来维持正常的消化功能。流体移动的削弱导致各种疾病，包括便秘和腹泻。便秘与排泄物在大肠中的通过被延迟有关。排泄物在大肠中的停留时间加长将导致结肠上皮增加流体的吸收，并导致排泄物脱水，接下来在降结肠中产生干燥的硬的排泄物。相反，腹泻是由排泄物在大肠中的快速运动所导致，产生于小肠中流体分泌增加或结肠中流体吸收减少。
口干燥症通常称为口干，产生于唾液的产生不足。放疗或损伤唾腺和降低唾液流动的疾病引起口干。胃食道反流病是食道粘膜暴露于胃内容物的程度大于正常的病症。最常见的表现是胃灼热。药物治疗包括使用H2拮抗剂(如Tagamet、Zantac、Pepcid、Axid)和质子泵抑制剂如Prilosec或Prevacid进行急性疾病的治疗。消化性溃疡类疾病包括胃溃疡、幽门通道溃疡和十二指肠溃疡。溃疡产生于酸和由幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)感染引起的慢性炎症的复杂相互作用。十二指肠溃疡患者的酸分泌高。酸分泌增加导致十二指肠壁的变化，给幽门螺杆菌的入侵提供了舞台。用于治疗消化性溃疡类疾病的药物包括组胺-2(H2)阻断剂(Tagamet、Zantac、Axid、Pepcid等)、硫铝糖、质子泵抑制剂和抗酸剂。炎性肠疾病被分成两类：溃疡性结肠炎和局限性回肠炎。溃疡性结肠炎影响结肠/直肠，涉及到结肠壁的粘膜或最里面的衬里。局限性回肠炎是涉及肠的所有层的透壁性疾病，并且可能涉及消化道的任何部分，包括从口到肛门的任何部分。炎性肠疾病的药物治疗包括氨基水杨酸盐和皮质类固醇。皮质类固醇具有相对大的长期毒性。医学研究者已经开发了新的用于胃肠疾病的治疗方法，以取代常规的治疗。
下述参考文献公开了粘液完整性和粘蛋白分泌在胃肠道的一些疾病中的作用。Rhodes等人(Gut，26：1312-1318，1985)提出，结肠粘液在体内进行连续的脱硫酸酯和去唾液酸(desialation)是粪便酶作用的结果，结肠粘液敏感性的改变可能对结肠疾病的致病机理是重要的。Somasundaram等人(Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.，14：309-318，1987)报道胃粘膜的完整性和它分泌粘液的能力对保护胃粘膜抵抗由在任何应激状况下的活化的侵袭性因子诱导的溃疡是必需的。Desai等人(J.Pharm.Pharmacol.，47：734-738，1995)指出，特异性多巴胺D1-受体激动剂SKF 38393在防止大鼠的胃和十二指肠溃疡方面是有效的。Sarosiek等人(Digestion，56 Suppl.，1：15-23，1995)报道了反流性食道炎患者的食道粘蛋白、EGF和PGE2在HCl/胃蛋白酶的影响下的分泌速率明显地削弱。Saitoh等人(Dig.Dis.Sci.，41：1768-1774，1996)提出，与健康的受检者相比，由于中性粘蛋白不足，溃疡性结肠炎患者的粘蛋白的总产量低，而局限性回肠炎患者由于高分子量粘蛋白的缘故其粘蛋白的总产量高。Sarosiek等人(Gastroenterology，110：675-681，1996)提出，唾液中无机和有机的保护性成分分泌速率的增加可能对胃食道反流病的治疗有用。Zeeh(Gastroenterology，110：1077-1083，1996)报道了在大鼠结肠炎的实验模型中给予角质形成细胞生长因子改善了粘膜的损伤。Abbas等人(IndianJ.Exp.Biol.，36：182-186，1998)报道了GABA和巴氯芬的抗溃疡作用可能是由于它们对粘膜防御因子的显著影响如提高粘蛋白的分泌和降低细胞脱落或粘膜损伤的缘故。Nath等人(Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.，25：564-567，1998)报道了多核糖肌苷酸-多核糖胞苷酸对大鼠具有有力的抗胃溃疡作用，该酸引起了Shay大鼠游离和总酸以及胃蛋白酶的下降和粘蛋白含量的增加。Newton等人(Gut，43：470-475，1998)报道了幽门螺杆菌在体内引起了粘附的胃粘液层的结构改变，但该粘液屏障的厚度并未受损。
下述参考文献公开了嘌呤能受体激动剂的组成和/或疾病的治疗。已显示尿苷5′-三磷酸能增加杯状细胞体外分泌粘蛋白的速率和总量(Lethem等人，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.，9：315-322，1993)。USPN5900407(Yerxa等人)公开了一种刺激需要治疗的受试者的泪液分泌的方法。该方法包括在受试者的眼表面给予其量能有效刺激泪水分泌的嘌呤能受体激动剂如尿苷5′-三磷酸、胞苷5′-三磷酸、腺苷5′-三磷酸或它们的类似物和衍生物。USPN 5837861(Pendergast等人)公开了二核苷多磷酸的P2Y2嘌呤能受体，它具有式I结构，其中，X是氧、亚甲基或二氟亚甲基；n＝0或1；m＝0或1；n+m＝0、1或2；B和B′各自独立地是通过9位或1位连接的嘌呤残基或嘧啶残基。该类化合物能用于治疗慢性阻塞性肺病、支气管炎、某些肺炎、囊性纤维化、窦炎和中耳炎。USPN 5763447(Jacobus等人)公开了一种促进固定不动的患者的充血气道中粘液分泌物的排出的方法。该方法包括在气道中给予其量能有效促进充血气道(包括窦道)中流体的排出的尿苷磷酸如尿苷5′-三磷酸(UTP)或P1，P4-二(尿苷-5′)四磷酸，这些药物在气道中通过水合粘液分泌物或刺激纤毛搏动频率而起作用。USPN 5789391、5981506、5972904和5958897提出了一种促进需要的受试者窦道中充满的粘液分泌物的排出的方法。该方法包括在受试者的窦道中给予其量能有效促进窦道中充满的流体的排出的尿苷磷酸如尿苷5′-三磷酸(UTP)或UTP的类似物P1，P4-二(尿苷-5′)四磷酸或任何其它类似物，这些药物在窦道中通过水合粘液分泌物或刺激纤毛搏动频率而起作用。USPN5968913提出了UTP的一种药学组合物，该组合物用于促进人气道、中耳/内耳或窦道的滞留粘液分泌物的增加的粘膜纤毛清除。USPN 5763447提出了一种预防或治疗需要这种治疗的卧床不起或固定不动的患者的肺炎(包括换气机相关的肺炎)的方法。该方法包括以有效促进充血气道中流体的排出的量给予患者的气道以尿苷磷酸如尿苷5′-三磷酸(UTP)、P1，P4-二(尿苷-5′)四磷酸或它们的类似物。WO99/09998公开了一种使用尿苷5′-二磷酸及其类似物治疗肺部疾病的方法。上述文献中描述的具有嘌呤能受体活性的化合物(′391、′506、′904、′897、′913和′447专利和WO 99/09998)都被纳入本文作为参考。USPN 5733916(Neely)公开了一种通过给予含有选择性A1腺苷受体拮抗剂和/或P2X嘌呤能受体拮抗剂的组合物预防和治疗局部缺血-再灌注(reperfusion)损伤或内毒素相关的肺损伤的方法。Somers等人(Laboratory Investigation，78：1375-1383，1998)报道了P2Y6受体在T细胞浸润性活动性炎性肠疾病中高度表达，而在未受影响的肠的T细胞中P2Y6表达缺乏。Boyer等人(Br.J.Pharmacol.，118：1959，1996)合成并试验了一系列腺苷单磷酸(AMP)的链延伸性2-硫醚衍生物，这些衍生物是激活火鸡红细胞膜的磷脂酶C连接的P2Y嘌呤受体、C6大鼠神经胶质瘤细胞的腺苷环化酶连接的P2Y嘌呤受体、1321N1人星形细胞瘤细胞中稳定表达的克隆的人P2U受体的激动剂。
表I列出了在其它现有技术中已知的特异性二核苷磷酸化合物和它们的相应的参考文献。这些化合物在现有技术中并没有被用来增加胃肠道中的粘液分泌或矫正流体和电解质的失衡，申请者将它们包括在本发明中。
                                     表1
                          文献中的二核苷磷酸化合物
    Np2N   Np2N’     Np3N   Np3N’    Np4N   Np4N’
    Ap2AGp2Gm7Gp2m7GUp2U(5-BrU)p2(5-BrU)(AZT)p2(AZT)(5-FU)p2(5-FU)Ip2I   Ap2NADAp2TADAp2C-NADAp2C-PADAp2BADm7Gp2GAp2GAp2UAp2(5-BrU)Up2(5-BrU)(AZT)p2(5-FU)Ap2TGp2AIp2A2dGp2AAp2C     Up3UAp3AXp3Xm7Gp3m7GGp3G(5-BrU)p3(5-BrU)Cp3CIp3IAp-CH2-ppAAp-CF2-ppA   Ap3Tm7Gp3Gm2，2，7Gp3Gm2，7Gp3GAp3UAp3(5-BrU)Up3(5-BrU)Gp3AGp3CGp3GmGp3Amm7Gp3m6Amm7Gp3GmAp3CAp3Gm7Gp3AIp3AIp3G2’dGp3A2’dGp3-2’dGm7Gp3AmGp3Um7Gp3Cmm7Gp3Umm7Gp3GApp-CH2-pTAp-CF2-ppA    Up4UAp4ACp4CGp4GXp4XDp4DeAp4eAm7Gp4m7G(5-BrU)p4(5-BrU)dAp4dA3’-dAp43’-dAdGp4dGApCH2p3AIp4IAp2CH2p2AAp2CF2p2ADp2CH2p2DDp2CF2p2D   Ap4UAp4CAp4GGp4UGp4CUp4CAp4Tm7Gp4Gm2，7Gp4Gm2，2，7Gp4G(5-BrU)p4A(5-BrU)p4UAp4(8-BrA)Ap4XAp4IAp4dAAp4d(5-FU)Ap4araAAp2CH2p2UAp2CH2p2GAp3CH2pTahaAp4AahaAp4G
    Np5N     Np5N’     Np6N   Np6N’
    Ap5AUp5U(5-BrU)p5(5-BrU)Gp5G2’dGp52’dGIp5I     Ap5TAp5UAp5(5-BrU)Up5(5-BrU)     Ap6AUp6U(5-BrU)p6(5-BrU)Gp6G   Ap4TAp6UUp6(5-BrU)Ap6(5-BrU)
A＝腺苷                eA＝亚乙烯基腺苷U＝尿苷                m7G＝7-甲基鸟苷G＝鸟苷                m2，7G＝2，7-二甲基鸟苷T＝胸苷                m2，2，7G＝2，2，7-三甲基鸟苷X＝黄苷                NAD＝烟酰胺核糖核苷TAD＝噻唑呋啉          C-NAD＝C-烟酰胺核糖核苷BAD＝苯酰胺核糖核苷    C-PAD＝C-吡啶酰胺核糖核苷D＝2，6-二氨基嘌呤     N＝核苷Gm＝2′-O-甲基鸟基     Am＝2′-O-甲基腺苷Um＝2′-O-甲基尿苷     m6Am＝N6-甲基-2′-O-甲基腺苷Cm＝2′-O-甲基胞苷     aha＝8-(6-氨基己基)X＝黄苷                AZT＝胸苷-3′-叠氮基2′，3′-二脱氧-D-核糖核苷5-BrU＝5-溴尿苷        5-FU＝5-氟尿苷
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P2Y嘌呤能受体是与G蛋白偶联的嘌呤和嘧啶核苷受体。它们在糖基化后是含308到377个氨基酸、分子量为41到53kDa的蛋白质。P2Y受体如P2Y1、P2Y2和P2Y6受体存在于胃肠道中(Ralevic等人，Pharm.Rev.，50：415-492，1998)。受到嘌呤能受体激动剂的已证明能在眼中和周围(USPN 5900407)、在肺和窦道中(USPN 5837861)刺激粘液/粘蛋白分泌的启发，申请者研究了P2Y嘌呤能受体的配体是否能影响粘液和/或粘蛋白分泌，以及矫正胃肠道中异常的流体移动，因而是否能有效治疗上部和下部胃肠道的疾病和异常。
申请者已发现所有的P2Y受体，包括P2Y4和P2Y11在内，都存在于胃肠组织中。申请者还发现通过P2Y嘌呤能受体介导的机制这些组织中的粘液和粘蛋白分泌、碳酸氢盐分泌和流体移动可被调节。口服或全身给予P2Y嘌呤能受体配体，提供了一种新颖的治疗胃肠道紊乱的方法。
                             发明概要
本发明提供了一种调节胃肠道中粘液/粘蛋白分泌和流体移动的方法。本发明提供了一种治疗胃肠系统的粘膜屏障被削弱的胃肠道疾病的方法。本发明还提供一种矫正导致腹泻或便秘的胃肠道中流体分泌或吸收紊乱的方法。该方法包括给予患者包括有效调节其胃肠道中粘液/粘蛋白和碳酸氢盐分泌以及流体移动的量的嘌呤能P2Y受体配体的药物组合物。给药的方法包括口服和全身性给药。所治疗的疾病包括口腔、食道、胃、小肠、大肠、直肠和附属器官如胰腺、肝和胆囊的病症和紊乱。
用于本发明的药物组合物含有P2Y嘌呤能受体激动剂。P2Y激动剂增加了胃肠道粘膜上皮水、碳酸氢盐和粘蛋白的分泌。P2Y激动剂包括尿苷5′-二-磷酸和三磷酸(UDP、UTP)和它们的类似物(式Ia和Ib)、腺苷5′-单磷酸(AMP)及其类似物、腺苷5′-二-和三磷酸(ADP、ATP)和它们的类似物(式IIa和IIb)、胞苷5′-二-和三磷酸(CDP、CTP)和它们的类似物(式IIIa和IIIb)以及二核苷多磷酸化合物(通式IV)。
                          附图的简短说明
本专利的文件含有至少一副彩图。在提交请求并交付必须费用后可从专利和商标局(Patent and Trademark Office)获得本专利这些彩图的复印本。
图1显示P2Y2受体与带有(a)调控有义探针和(b)反义探针的胃组织(胃上皮)的原位杂交结果。
图2显示P2Y2受体与带有(a)调控有义探针和(b)反义探针的食道上皮的原位杂交结果。
图3显示P2Y2受体与带有(a)调控有义探针和(b)反义探针的大肠(结肠)上皮的原位杂交结果。
图4显示P2Y2受体与带有(a)调控有义探针和(b)反义探针的小肠(空肠)上皮的原位杂交结果。
图5显示由人结肠上皮细胞中的P2Y受体激动剂诱导的钙的动员。
图6显示由HT-29人结肠上皮细胞中P2Y受体激动剂诱导的钙的动员。
                          发明的详细描述
本发明提供了一种调节胃肠道中粘膜分泌物、碳酸氢盐分泌和流体移动的方法。本发明还提供了一种治疗器官的粘膜屏障受到损伤或者小肠和大肠中的流体的吸收或分泌失衡的胃肠疾病的方法。该方法包括给予哺乳动物以有效调节胃肠道中粘液或粘蛋白分泌、碳酸氢盐分泌或流体移动的量的含有嘌呤能P2Y受体配体的药物组合物。该方法提高了胃肠道中粘蛋白的释放、pH和水合作用，或者调节了流体的转运。
适合使用本发明进行治疗的胃肠疾病包括影响口腔(主要是唾腺)、食道、胃、小肠、大肠、直肠和附属器官如胰腺、肝和胆囊的病症或异常。例如，口干、口腔溃疡、牙龈疾病、食道反流疾病、消化性溃疡、炎性肠疾病(溃疡性结肠炎和局限性回肠炎)、粘膜炎、腹泻和便秘可使用本发明进行治疗。此外，也可以使用本发明治疗与囊性纤维化疾病有关的胃肠问题如干粘蛋白和胃肠道中上皮细胞对营养的吸收下降。此外，由癌症和化疗引起的胃肠问题也可使用本发明进行治疗。
已显示，粘蛋白在保护粘膜表面不暴露于环境中是重要的，它起到酸屏障的作用，并已发现它会与病原体结合。因此粘蛋白是体内天然的粘膜防御系统的一部分，刺激它分泌可引起对粘膜表面上皮的保护。本发明方法是增加胃肠道如胃和食道中粘膜分泌物，从而增强天然防御系统的方法。
人食道的上皮衬里由鳞状上皮细胞和粘膜下层腺体构成，这种衬里是管腔和血液间的天然屏障，并且起到抵抗所摄取的食物的物理扰动以及抵抗来自胃中的酸性胃液的保护性衬里作用。食道粘膜下腺含有粘液、浆液和肌上皮细胞类型。气道和结膜中的粘膜下腺含有食道的粘膜上皮细胞中的P2Y2受体。天然的和合成的激动剂对P2Y2受体的激活增加了粘液分泌到食道中，并增加了粘膜层的水合作用。
各种病理生理条件导致食道保护性粘膜屏障的腐蚀，引起胃食道反流病(GERD)。GERD的症状包括轻微到严重的胃灼热、食道炎、反胃、吞咽功能失调和胸痛。GERD由各种因素导致，包括下食道括约肌的异常功能(这种异常功能使得胃液反流到下食道中)、胃排空延迟、食道清除率减少和唾液分泌减少。当食道在胃反流过程中暴露在高酸性内容物中时，其保护性粘液层将遭到破坏。本发明公开了在食道炎的动物模型中，P2Y2受体激动剂能通过自然地刺激鳞状上皮和/或粘膜下腺产生粘蛋白、碳酸氢盐和流体来恢复遭破坏的食道粘膜层的完整性。
胃溃疡和胃反流的部分特征是上胃肠上皮的粘膜防御屏障崩溃。胃中过量的酸分泌可导致保护上皮细胞免受酸损伤的天然粘液层遭到破坏。胃溃疡与应激、食物、幽门螺杆菌感染、化疗或放疗、其它自身免疫疾病如舍格伦综合症等、外科手术、身心疾病、应激、焦虑和与药物有关的副作用有关，但并不限于这些原因。
沿着小肠的利贝屈恩腺在介导流体分泌到小肠的管腔中起了主要的作用。氯化物通过沿这些腺管的上皮细胞的顶膜上的顶膜氯化物通道流出对小肠由渗透推动的流体分泌提供了驱动力。便秘和腹泻起因于通过小肠和大肠的异常流体移动(吸收对分泌)。本发明公开了一种通过针对沿着小肠和大肠的P2Y受体激活而矫正导致便秘或腹泻的流体移动失衡的方法。在病理条件下，如暴露于霍乱毒素，顶膜氯化物通道处于构成性活跃状态，因而导致不受控制的流体分泌进入小肠、极端的腹泻和致命的全身脱水。这个观察结果给治疗便秘和腹泻提供了科学依据。
已知氯化物的激活和通过小肠的流体分泌给食糜在大肠中变成排泄物之前提供了额外的液体。因而食糜中流体的这种增加弥补了大肠中导致便秘的对流体的极度吸收。本发明公开了由激动剂引起的P2Y受体的激活给小肠中氯化物和流体分泌的这种增加提供了一种机制，并且可将其用于治疗便秘。
大肠的结肠上皮通常吸收流体，并起到从来自小肠的食糜中除去过量流体并将其转变成排泄物的作用。腹泻起因于进入的食糜中有过量的流体或结肠中对流体的吸收不良。沿着结肠上皮的流体吸收由经由顶膜钠通道和基底外侧膜钠钾转运蛋白的钠吸收介导。上皮的这种流体吸收特性可由基底外侧膜上的钙激活的钾通道经产生电荷进行调节。基底外侧膜钾导电性的增加使顶膜和基底外侧膜超极化，因而增加了钠经该顶膜内流的生电驱动力。这同时导致上皮吸收钠和钾的增加，并增加离子偶合的流体吸收。本发明公开了由激动剂引起的P2Y嘌呤受体的激活增加了基底外侧膜钾导电性，并促进了流体从排泄物中的去除。因此，可直接给予P2Y受体激动剂来治疗腹泻。
本发明包括给予患者调节胃肠道粘液/粘蛋白分泌、水合和流体移动的药物组合物。本发明相对于常用的疗法具有优点。本方法调节患者自己产生和分泌的粘液以及粘膜水合的水平。因而，本方法维持了胃肠系统的粘液的天然的保护性和润滑特性，并直接针对产生于粘液削弱的问题。本发明主要涉及人体的治疗，但用于医兽目的，也可对其它哺乳动物如狗和猫进行治疗。申请者已发现(a)在胃肠组织如唾腺、食道、胃、小肠、结肠、十二指肠和直肠中存在许多嘌呤能P2Y受体(P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6和P2Y11)；(b)一种强的嘌呤能受体激动剂增加了粘蛋白的分泌，并能调节胃肠道的粘膜上皮的流体的移动。
P2Y激动剂包括核苷单、二和三磷酸以及二核苷多磷酸。用于本发明的核苷单磷酸包括腺苷5′-单磷酸(AMP)及其衍生物如2-硫醚取代的AMP，如2-己硫基AMP(Br.J.Pharmacol.，118：1959，1996)。用于本申请的核苷二磷酸和核苷三磷酸包括尿苷5′-二-和三磷酸(UDP和UTP)和它们通式Ia和Ib的类似物、腺苷5′-二-和三磷酸(ADP和ATP)和它们的通式IIa和IIb的类似物、胞苷5′-二-和三磷酸(CDP和CTP)和它们的通式IIIa和IIIb的类似物。
UDP及其类似物由通式Ia描述：式Ia
Figure A0081760700201
式中：
X1和X2各自独立地是O-或S-；
Y是H或OH；
R1选自O、亚氨基、亚甲基和二卤代亚甲基(如二氯亚甲基、二氟亚甲基)；
R2选自H、卤素、烷基、取代的烷基、烷氧基、硝基和叠氮基；
R3选自H、烷基、酰基(包括芳酰基)和芳烷基，或者R3不存在；
R4选自-OR′、-SR′、NR′和NR′R″，其中，R′和R″独立选自H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、烷氧基和芳氧基，条件是当R4是氧或硫原子与嘧啶环上4位的碳以双键连接时，R′不存在。
本文所用术语“烷基”指C1-10(包括本数)直链、支链或环状的饱和或不饱和(即链烯基和炔基)烃链，包括如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、辛基、乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、辛烯基、丁二烯基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基、丙二烯基以及可任意取代的芳基链烯基和芳基炔基。本文所用术语“酰基”指羧基的-OH已被其它取代基取代的有机酸基(即表示为RCO-，其中，R是烷基或芳基)。同样，术语“酰基”特别包括芳基酰基。酰基的特殊例子包括乙酰基和苯甲酰基。本文所用术语“芳基”指5和6元烃环以及杂环芳环。芳基的特殊例子包括但不限于环戊二烯基、苯基、呋喃、噻吩、吡咯、吡喃、吡啶、咪唑、异噻唑、异噁唑、吡唑、吡嗪、嘧啶等。本文所用术语“烷氧基”指C1-10(包括本数)直链、支链或环状的饱和或不饱和的氧-烃链，包括如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、叔丁氧基和戊氧基。本文所用术语“芳氧基”指诸如苯氧基和烷基、卤素或烷氧基取代的芳氧基之类的芳氧基。本文所用术语“取代的烷基”和“取代的芳基”包括如本文所定义的烷基和芳基，其中，芳基或烷基的一个或多个原子或官能团被另一原子或官能团取代，包括如卤素、芳基、烷基、烷氧基、羟基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、硫酸酯(sulfate)和巯基。本文所用术语“卤素”指氟、氯、溴和碘。
说明式(Ia)的化合物的例子包括那些在WO 99/09998中公开的化合物，本文纳入该文作为参考。式Ia化合物包括如尿苷5′-二磷酸(UDP)、尿苷5′-O-(2-硫代二磷酸)(UDPβS)、5-溴尿苷5′-二磷酸(5-BrUDP)、5-(1-苯基乙炔基)-尿苷5′-二磷酸(5-(1-苯基乙炔基)UDP)、5-甲基尿苷5℃-二磷酸(5-甲基UDP)、4-己硫基尿苷5′-二磷酸(4-己硫基UDP)、4-巯基尿苷5′-二磷酸(4-巯基UDP)、4-甲氧基尿苷5′-二二磷酸(4-甲氧基UDP)、4-(N-吗啉代)尿苷5′-二磷酸(4-(N-吗啉代)UDP、4-己基氧基尿苷5′-二磷酸(4-己基氧基UDP)、N，N-二甲基胞苷5′-二磷酸(N，N-二甲基CDP)、N-己基胞苷5′-二磷酸(N-己基CDP)和N-环戊基胞苷5′-二磷酸(N-环戊基CDP)。
式Ia的最佳化合物包括UDP和UDPβS和4-硫代UDP。式Ia的某些化合物(如UDP、dUDP、UDPβS和4-巯基UDP)是已知的，并且可以根据已知的方法或其改良法制备，这些对于本领域熟练的技术人员来说是显而易见的。例如，在美国专利第3846402号(Eckstein等人)中和R.S.Goody与F.Eckstein，J.Am.Chem.Soc.，93：6252-6257，1971)中叙述了核苷二磷酸的某些硫代磷酸类似物(如UTPβS)的鉴定和制备。或者，也可从卖主如Sigma(St.Louis，MO)和Pharmacia(Uppsala，Sweden)购得UDP或它的其它类似物。
UTP及其类似物由通式Ib描述：
                           式Ib式中：
X1、X2和X3各自独立地是O-或S-；
Y是H或OH；
R1、R2、R3和R4的定义与式Ia的相同；
最佳的是，X2和X3是O-、R1是氧或亚氨基，R2是H。
式Ib特别优选的化合物包括尿苷5′-三磷酸(UTP)和尿苷5′-O-(3-硫代三磷酸)(UTPγS)。
ADP及其类似物由式IIa描述：
                           式IIa式中：
R1、X1、X2和Y与式Ia中所定义的相同；
Z是H、Cl或SR，其中，R是烷基(C1-20，饱和的或不饱和的)；
当R2不存在且N-1和C-6之间有双键(腺嘌呤)时，R3和R4是H，或者
当R2不存在且Z是SR时，R3和R4是H，或者
当R2是O、且N-1和C-6之间是双键(腺嘌呤1-氧化物)时，R3和R4是H，或者
R3、R4和R2合在一起是-CH＝CH-，形成N-6和C-6之间为双键的从N-6到N-1的环(1，N6-亚乙烯基腺嘌呤)。
式IIa特别优选的化合物包括5′-腺苷二磷酸(ADP)和2-甲基-SADP。
ATP及其类似物由式IIb表示：
                         式IIb
Figure A0081760700231
式中：
R1、X1、X2、X3和Y的定义与式Ib相同；
R2、R3、R4和Z的定义与式IIa相同。
式IIb的优选化合物包括5′-腺苷三磷酸(ATP)。
CDP及其类似物由式IIIa描述：
                         式IIIa
Figure A0081760700232
式中：
R1、X1、X2和Y的定义与式Ia的相同；
当R7不存在并且在N-3和C-4之间存在双键(胞苷)时，R5和R6是H，或者
R5、R6和R7合在一起是-CH＝CH-，形成具有N-4和C-4之间的双键的从N-3到N-4的环(3，N4-亚乙烯基胞苷)，可任意地，亚乙烯基环上的4位或5位上的氢可被烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基(杂芳基等)、烷氧基、硝基、卤素或叠氮基取代。
CTP及其类似物由式IIIb描述：
                              式IIIb
Figure A0081760700241
式中：
R1、X1、X2、X3和Y的定义与式Ib的相同；
R5、R6和R7的定义与式IIIa的相同。
式IIIb的最佳化合物包括胞苷5′-三磷酸(CTP)和4-硝基苯基亚乙烯基胞苷5′-三磷酸。
为了简便，本文式I、II和III描述以天然的D-构型的活性化合物，但本发明也包括L-构型的化合物以及D-构型和L-构型的化合物的混合物，除非另有说明。天然的D-构型是最佳的。
P2Y激动剂也包括通式(IV)的二核苷磷酸
                            式IV
Figure A0081760700242
式中：
X是氧、亚甲基、二氟亚甲基或亚氨基；
n＝0、1或2；
m＝0、1或2；
n+m＝0、1、2、3或4；
Z＝OH或H；
Z′＝OH或H；
Y＝H或OH；
Y′＝H或OH。
糖部分以D-构型描述，但它可以是L-、或D-和L-构型。D-构型最佳。核苷残基可以是α-或β-和D-或L-构型，但最佳是β-D-构型。
B和B′各自独立是如式V和VI所定义的，分别连接于9位或1位的嘌呤残基或嘧啶残基。式V
Figure A0081760700251
式中：
R1是氢、氯、氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、烷硫基、芳硫基，芳烷硫基，其中，硫上的取代基含有至多20个碳原子，可以是饱和或不饱和的；
R2是羟基、氨基、巯基、烷硫基、芳硫基、芳烷硫基、酰硫基、烷氧基、芳基氧基、芳烷基氧基、酰氧基、单取代的烷基氨基、杂环基、单取代的环烷基氨基、单取代的芳烷基氨基、单取代的芳基氨基、二芳烷基氨基、二芳基氨基、二烷基氨基(其中，烷基可任意地连接到N7上形成取代环)、酰基氨基、二酰基氨基或NHRY；
Rx是O(腺嘌呤1-氧化物衍生物)，或者不存在(腺嘌呤衍生物)；
条件是，当R2是NHRY时，RY和Rx可一起形成5元稠合咪唑环(1，N6-亚乙烯基腺嘌呤衍生物)，如下所述，在亚乙烯基部分的4位或5位上可任意地被烷基、芳基或芳烷基部分取代；
R3是如下所述的氢、叠氮基、烷氧基、芳基氧基、芳烷基氧基、烷硫基、芳硫基或芳烷硫基；或者是ω-A(C1-6烷基)OCONH(C1-6烷基)B-，其中，A和B独立地是氨基、巯基、羟基或羧基；或者是药学上可接受的酯、酰胺或其盐；或者R3不存在。
因此，腺嘌呤的取代的衍生物包括腺嘌呤1-氧化物、1，N6-(4-或5-取代的亚乙烯基)腺嘌呤、6-取代的腺嘌呤、或8-取代的氨基腺嘌呤；其中，6-或8-HNR′基的R′选自：具有可如下所述进行官能化的芳基部分的芳烷基(C1-6)；烷基；具有官能团的烷基，如([6-氨基己基]氨甲酰基甲基)-、ω-酰化的氨基(羟基、巯基和羧基)烷基(C2-10)-和它们的ω-酰化的氨基(羟基、巯基和羧基)衍生物，其中，酰基选自并不限于乙酰基、三氟乙酰基、苯甲酰基、取代的苯甲酰基等，或者羧酸部分以酯或酰胺衍生物的形式存在，例如，乙酯或甲酯或其甲基、乙基或苯甲酰胺基衍生物。ω-氨基(羟基、巯基)部分可以用C1-4烷基烷基化；
J是碳或氮，条件是当J是氮时，R3不存在；
其中，烷基是直链、支链或环状的；
芳基可任意地被低级烷基、氨基、烷基氨基、NO2、N3、羧基、酰胺基、磺酰胺基、或者卤素基取代；
B和B′也可以是具有通式VI的嘧啶，通过1位连接到核糖残基上：
                             式VI式中：
R4是氢、羟基、氧代、巯基、氨基、氰基、C7-12芳基烷氧基、C1-6烷硫基、C1-6烷氧基、C1-6烷基氨基、或二C1-4烷基氨基，其中可任意地将烷基连接，形成杂环；
R5是氢、氧代、乙酰基、苯甲酰基、C1-6烷基、C1-5烷酰基或芳酰基；
R6是羟基、氧代、巯基、C1-4烷氧基、C7-12芳基烷氧基、C1-6烷硫基、氨基、S-苯基、C1-5二取代的氨基、三唑基、C1-6烷基氨基或二-C1-4烷基氨基，其中，可将所述二烷基任意地连接，形成杂环，或者连接到N3上，形成取代的环；或者
R5和R6一起在嘧啶环的3位和4位之间形成5元稠合咪唑环，从而形成3，N4-亚乙烯基胞苷衍生物；其中，所述亚乙烯基部分的4位或5位可任意地被C1-4烷基、苯基或苯基氧基取代，其中，所述C1-4烷基、苯基或苯基氧基中至少有一个氢被选自卤素、羟基、C1-4烷氧基、C1-4烷基、C6-10芳基、C7-12芳烷基、羧基、氰基、硝基、磺酰胺基、磺酸酯、磷酸酯、磺酸、氨基、C1-4烷基氨基和二-C1-4烷基氨基的部分任意取代，其中，所述二烷基可任意相连，形成杂环；
R7选自氢、羟基、氰基、硝基和C2-8链烯基；其中，所述链烯基部分可任意通过氧连接，形成环，其中，所述链烯基上与上述氧邻近的碳上至少有一个氢被选自C1-6烷基或苯基、取代的C2-8链烯基、卤素、取代的C1-4烷基、CF3、C2-3链烯基、C2-3炔基、烯丙基氨基、溴乙烯基、丙烯酸乙酯或丙烯酸任意取代；或者
R6和R7一起形成通过R6上的N或O或S连接的5或6元饱和或不饱和环，这个环可任意含有自身具有官能团的取代基；条件是，当R8是氨基或取代的氨基时，R7是氢；和
R8选自氢、氨基或二-C1-4烷基氨基、C1-4烷氧基、C7-12芳基烷氧基、C1-4烷硫基、C7-12芳基烷硫基、羧酰胺基甲基、羧甲基、甲氧基、甲硫基、苯氧基和苯硫基。
在上述式I-III的一般结构中，2位至6位的虚线表示在这些位置中存在单键或双键；由R4、R5和R6取代基是否能形成酮-烯醇互变异构现象决定该双键或单键的相对位置。
在上述式I-III的一般结构中，酰基包括烷酰基或芳酰基。如下所述烷基含有1-8个碳原子，特别是1-4个碳原子可被一个或多个适当的取代基任意取代，如下所述，包括如芳氧基的芳基部分的芳基最佳是被一个或多个适当的取代基任意取代的苯基。如下所述，上述链烯基或炔基含有2-8个碳原子，特别是2-6个碳原子(如乙烯基或乙炔基)可被一个或多个适当的取代基任意取代。
上述烷基、链烯基、炔基和芳基上的适当取代基选自卤素、羟基、C1-4烷氧基、C1-4烷基、C6-12芳基、C6-12芳基烷氧基、羧基、氰基、硝基、磺酰胺基、磺酸酯、磷酸酯、磺酸、氨基和取代的氨基，其中氨基被C14烷基单取代或双取代，当氨基被双取代时，该烷基可任意地被连接成杂环。
本发明还提供含有通式IV化合物的新颖的药物组合物，它们具有新的特征：(1)具有糖部分的新颖的二核苷酸，该糖部分选自呋喃阿糖基、3′-脱氧呋喃核糖基、呋喃木糖基和呋喃来苏糖基；(2)具有氮杂嘌呤碱基的新颖的二核苷酸；(3)具有6-取代的嘌呤的新颖的二核苷酸。在第一类型的新颖的组合物中，当糖部分是3′-脱氧呋喃核糖基时，Z和Z′是H。在具有氮杂嘌呤碱基的第二类型的新颖组合物中，J是氮，没有R3。在具有6-取代的嘌呤的第三类型的新颖组合物中，不包括6-单取代的氨基嘌呤碱基。
用于本发明的最佳二核苷多磷酸化合物是P1，P4-二(尿苷-5′)-四磷酸、dUP4U、U2P3、U2P5、dCP4U、CP4U、IP5I、AP4A、CP3U、UP3A和A2P3。
可采用本领域熟练的技术人员周知的方法制备式I、II和III的一些化合物；一些化合物可从市售购得，例如，从Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO 63178)。可根据WO 99/09998制备式Ia的化合物(UDP及其类似物)。可根据USPN 5763447制备式Ib、IIb和IIIb的化合物(UTP、ATP、CTP和它们的类似物)。可根据Zamecnik等人〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，838-42(1981)〕、Ng与Orgel〔Nucleic AcidsRes.，15：3572-80(1987)〕和Pendergast等人(USPN 5837861)所述的已知方法或其改良法制备式IV的化合物。
本发明的化合物也包括它们的无毒性的药学上可接受的盐，如碱金属如钠或钾的盐、碱土金属如锰、镁或钙的盐、或者铵或四烷基铵盐即NX4 +(其中X是C1- 4)，但并不限于这些盐。药学上可接受的盐是那些保留了所需的母体化合物的生物学活性但不产生毒理作用的盐。本发明也包括本文所公开的化合物的酰化的前体药物。本领域熟练技术人员将会认识到可采用各种合成法制备这些化合物的无毒性的药学上可接受的盐和酰化的前体药物。
P2Y活性的肌醇磷酸测定指出了本发明的P2Y激动剂化合物的药学用途。如E.Lazarowski等人〔Brit.J.Pharm.，116，1619-27(1995)〕所述的这种广泛使用的测定依赖于作为激活经由G蛋白连接于磷脂酶C的受体的化合物的活性的量度的肌醇磷酸形成的测量。
此外，P2Y活性的胞内钙动员测定也指出了本发明P2Y激动剂化合物的药学用途。在这个实验中，用浓度增加的P2Y受体激动剂刺激培养的细胞。通过使用FLIPR(Molecular Devices Corp.，Sunnyvale，CA)或相当的设备测量钙敏感性染料的荧光强度的变化监测胞内钙水平。
P2Y激动剂化合物增加了食道、胃粘膜、空肠、近端和远端结肠上皮体外标本的粘液产生。可使用各种技术检测粘液分泌，包括压迹细胞学、酶联免疫吸附测定(ELISA)和使用粘蛋白特异性抗体的斑点印迹〔参见Danjo等人，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，39：2602-2609(1988)；Jumblatt等人，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，40：43-49(1999)；和Jumblatt等人，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，39：5803(1988)〕。我们的结果显示，当在上皮标本的腔表面给予P2Y受体激动剂后，粘液的产生出现强烈的、长时间的和显著的增加。通过使用激动剂反复刺激可使粘蛋白的产生反复增加。
P2Y激动剂显著改变从胃肠系统(包括食道、空肠和近端结肠和远端结肠)获得的上皮标本的短路电流(short circuit current，Isc)。Isc的改变与跨腔的氯化物流动或跨浆膜的钾流动的增加一致，因此认为这种变化动员了跨上皮的流体吸收或分泌。
可在动物模型中显示P2Y激动剂改善与胃肠疾病有关的症状的药效。例如，由给予食蟹猴的窦粘膜乙酸而引起的幽门螺杆菌感染是用于慢性胃炎的模型；此模型显示出与人的胃溃疡类似的组织学和临床表型。给患胃炎的猴子口服P2Y受体激动剂，其结果显示，高碘酸希夫阳性物质的染色有明显的恢复，并且抗粘蛋白免疫反应性增加，这两个结果反映了粘蛋白分泌增加。胃溃疡的组织学事件减少也表明P2Y受体激动剂的药效。
可口服、全身给予、手术中给予或直肠给予本发明的所需化合物，其单位剂型含有常规的无毒药用载体、佐剂和赋形剂。本文所用术语全身包括皮下注射、静脉注射、肌肉内注射、胸骨内注射或输注技术。
本发明的药剂含有配体化合物和药用载体。一种或多种配体化合物可以与一种或多种无毒药用载体或稀释剂或佐剂一起存在，如果需要，还可存在其它活性成分。这样的载体可以是糖，其中，该化合物可以通过glassification被紧密地掺入基质中，或者简单地与用于口服或全身给药的载体(如乳糖、蔗糖、海藻糖、甘露醇)或其它可接受的赋形剂混合。
对于口服，该药物组合物可为合适的形式，如片剂、锭剂、水性或油性悬浮液、粘性凝胶、可咀嚼的口香糖、可分散的粉末或颗粒、乳剂、硬或软的胶囊、糖浆或酏剂。根据本领域中已知的任何制备药物组合物的方法制备用于口服的组合物。这种组合物可含有一种或多种选自甜味剂、增香剂、着色剂和防腐剂的物质，以提供上等的和可口的药物制品。片剂通常含有活性成分和无毒的适合用于制备片剂的药用赋形剂。这些赋形剂包括惰性稀释剂(如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠)、造粒剂或崩解散剂(如玉米淀粉或藻酸)、粘合剂(如淀粉、明胶或阿拉伯树胶)和润滑剂(如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉)。可以不包衣片剂，或者使用已知的技术将其包衣，以提供长时间的持续作用。例如，可以使用延时材料如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
对于口服，通过将活性成分与惰性固体稀释剂(如碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合可制备硬明胶胶囊。通过将活性成分与水或油介质(如花生油、液态石蜡或橄榄油)混合制备软明胶胶囊。
对于口服，通过将活性成分包埋到树胶中可制备可咀嚼的口香糖，该活性成分在咀嚼后慢慢释放。这种形式适合用于治疗口腔溃疡。
对于口服，通过将水加到可分散的粉末或颗粒以及分散剂或润湿剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂中可制备水性悬浮液。悬浮剂包括如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素和藻酸钠。分散剂或润湿剂包括天然磷脂、丙炔化氧与脂肪酸的缩合产物、环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物、环氧乙烷与脂肪酸和己糖醇的部分酯化产物的缩合产物、环氧乙烷与脂肪酸和己糖醇酐的部分酯化产物的缩合产物。防腐剂包括如对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸正丙酯。水性悬浮液还可含有一种或多种着色剂、一种或多种增香剂和一种或多种甜味剂，如蔗糖或糖精。本领域熟练的技术人员将会认识到许多特殊的赋形剂和润湿剂包括在上述一般描述中。
对于全身性给药，该药剂用无菌介质制备。根据赋形剂及其浓度，活性成分可悬浮或溶解在该赋形剂中。佐剂如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂也可溶解在该赋形剂中。无菌的可注射的制剂可以是无菌的可注射的在无毒的可接受的稀释剂或溶剂中的溶液或悬浮液。在可接受的赋形剂和溶剂中，可使用的有无菌水、盐水溶液或林格溶液。
也可以用于直肠给药的栓剂的形式给予药剂。可通过混合活性成分和合适的无刺激性的赋形剂制备这些组合物，该赋形剂在常温下是固体，但是在直肠温度下是液体，因此将在直肠中熔化并释放出化合物。这种赋形剂包括可可油和聚乙二醇。
用于治疗上述病症的活性成分的剂量水平约为10-2000mg数量级。活性成分的剂量较佳约为50-1000mg，更佳约为75-850mg。需要时可在一天中分几次给予这些剂量。与载体材料混合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的宿主和给药的具体方式而改变。但是，可以理解的是，用于任何具体患者的具体的剂量水平将依赖于各种因素，包括所使用的具体化合物的活性、年龄、体重、一般的健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径和排泄速率、合用的药物以及所治疗的具体疾病的严重性。
本发明将进一步由下述实施例进行阐述，但是本发明的范围或实质并不受到这些实施例中所述的具体方法所限制。
实施例 实施例1：人组织中P2Y受体的鉴定
使用从商业来源购得的人RNA的RT-PCR技术体外测定胃肠组织中P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6和P2Y11嘌呤能受体的存在。从Clontech(Palo Alto，CA)购得人正常的胃多聚A+mRNA。使用寡(dT)18引物和MMLV反转录酶(60分钟，42℃)从100ng胃多聚A+mRNA合成第一链cDNA(Advantage RT-for PCR kit，Clontech，Palo Alto，CA)。也进行没有反转录酶的对照反应。从Invitrogen(Carlsbad，CA)购得人正常的食道、直肠、十二指肠、唾腺cDNA。从Clontech的一系列多组织cDNA获得正常的人结肠、肝和小肠的第一链cDNA。使用胃组织进行RT-PCR，使用其它组织进行PCR。
P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6和P2Y11基因的序列特异性引物如下：
      P2Y1(登记号码U42029)
         正向：5′CGATCTGTATCAGCGTGCTGGTGTG3′；
         反向：5′TCTAGAAGCTTTCCTTGTGGCTCGG3′
      P2Y2(登记号码S74902)
         正向：5′AGGAGATGTGTTGGGCAGCAGTGAGGAC3′
         反向：5′ACCAGGGTTTTCTGGCCAACCTGTGACT3′
      P2Y4(登记号码X91852)
         正向：5′ATGCAACGGCCACCTACATGTTCC3′
         反向：5′GTACTCGGCAGTCAGCTTCCAACA3′
      P2Y6(登记号码U52464)
         正向：5′ATGGCATGGCTCTCACTGTCATCG3′
         反向：5′TTGGTGAGCTTCTGGGTCCTGTGAG3′
      P2Y11(登记号码AF030335)
         正向：5′ATACTGGTGGTTGAGTTCCTGG3′
           反向：5′ACCAGGCTATACGCTCTGTAGG3′
使用设计来扩增P2Y(P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6、P2Y11)部分cDNA的正向和反向引物组(各引物使用1μl)对上述所有组织的3μl cDNA进行PCR。反应液中还含有400mM的各脱氧核苷三磷酸、3.5mM的MgCl2和1μl的Advantage cDNA聚合酶混合物(Clontech，Palo Alto，CA)。反应条件是：开始时在94℃2.5分钟，然后在94℃30秒钟，在60℃(P2Y4、P2Y11)或65℃(P2Y1、P2Y2、P2Y6)30秒钟，在72℃1分钟，进行这样的循环35轮，最后在72℃10分钟。将一些PCR产物克隆到pCR2.1-TOPO载体(TOPO TA克隆盒，Invitrogen，Carlsbad，CA)中，并使用自动DNA测序仪进行完全测序。
所检测的所有组织中P2Y受体都呈阳性。结果归纳在表2中。
                           表2：人组织中P2Y受体的鉴定
  人P2Y1   人P2Y2   人P2Y4   人P2Y6   人P2Y11
    胃     +     +     +     +     +
    唾腺     +     +     +     +     +
    食道     +     +     +     +     +
    十二指肠     +     +     +     +     +
    小肠     +     +     +     +     +
    结肠     +     +     +     +     +
    直肠     +     +     +     +     +
    肝     +     +     +     +     +
    胰腺     +     +     +     +     +
实施例2：通过非同位素原位杂交进行的猴胃肠上皮组织中P2Y核苷酸受体基因 表达的细胞定位
组织：从Pathology Associates International(Frederick，MD)获得研究用的组织。用于此研究的组织包括胃、食道、小肠(空肠)和大肠(结肠)。使3.25岁的印度猕猴安乐死后立即从其身上取得组织，并将其在O.C.T.包埋介质中骤冻。在进行冷冻切片前-80℃保存该冷冻组织。将组织切成5μm切片，固定在显微镜载片上，进行苏木精及曙红(H&E)染色，然后进行原位杂交(ISH)。
组织切片的评估：制备H&E染色的组织切片，以评估其质量和取向。H&E载片的检测表明所有的组织适合于进行ISH。
核酸探针(riboprobe)合成：从赞助者获得含有人P2Y2-R cDNA的第253-651个核苷酸的PCR产物。使用设计来掺入上游T3启动子或下游T7启动子的P2Y2引物(正向引物序列：5′AGGAGATGTGTTGGGCAGCAGTGAGGAC3′，反向引物序列：5′ACCAGGGTTTTCTGGCCAACCTGTGACT3′)再扩增P2Y2-R的第272-627个核苷酸。使用体外转录(IVT)将所得的PCR产物用于合成洋地黄毒苷标记的核酸探针。在洋地黄毒苷-11-UTP(Roche Molecular)存在的情况下根据制造商的说明使用MEGAscript IVT盒(Ambion)，并分别使用T7和T3 RNA聚合酶合成反义和有义核酸探针。进行IVT后，用DNA酶-1降解模板DNA，超滤除去未掺入的洋地黄毒苷。在变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，以评估核酸探针的完整性。通过与100-1000碱基对RNA梯(Ambion)的电泳迁移率比较估计表观分子大小。采用印迹免疫化学评估探针产率和标记。将核酸探针分成每份5μL，并在-80℃保存，直到用于进行ISH。
原位杂交：将冷冻组织切成5μm切片，将切片固定在SuperFrost Plus载片(Fisher Scientific)上，在4％低聚甲醛在pH为7.4的PBS溶液中经15分钟进行后固定(post-fix)。然后用0.1％活性焦碳酸二乙酯在pH为7.4的PBS溶液处理组织切片30分钟。在无探针的情况下先将切片进行预杂交，然后将其放置在含有400ng/mL的反义或有义探针的杂交缓冲液中保温过夜。杂交后，对载片连续进行杂交后的严格洗涤，以减少非特异性染色。采用免疫组织化学方法，根据制造商的说明使用碱性磷酸酶连接的抗洋地黄毒苷Fab和氯化氮蓝四唑-溴氯吲哚基磷酸酯(Roche Molecular)观察杂交。用核固红对组织切片复染色。用有义P2Y2-R探针染色包括胃和食道组织在内的阴性对照。
结果：从原位杂交得到的结果显示了用于胃(图1)、食道(如2)、结肠(图3)和空肠(图4)的有义探针(阴性对照)和反义探针。所有的组织的粘膜上皮显示阳性染色，这表明在反义探针的存在下P2Y2受体基因的表达(图1b、2b、3b和4b)，而对照有义探针观察到没有染色(图1a、2a、3a和4a)。更具体而言，在胃小凹的上皮和胃中胃腺的颈部和底部、在食道的复层鳞状上皮、在空肠的绒毛上皮和分泌腺管上皮的吸收性肠细胞和分泌粘液的杯状细胞中以及在结肠的柱状吸收细胞、分泌粘液的杯状细胞和分泌性肠内分泌腺管细胞中有显著的P2Y2基因的表达。P2Y2受体基因在胃肠上皮(包括分泌性和吸收性细胞类型)中的表达的证据支持了P2Y2受体在胃肠粘膜生理学方面所起的作用，以及作为治疗增加粘液分泌和/或流体分泌具治疗作用的胃肠疾病的靶标的角色。实施例3：来自胃肠道的培养的上皮细胞中胞内钙动员的测量
使用常规的技术检测由P2Y受体激动剂诱导的胞内钙动员。本领域熟练技术人员熟知该技术。在96孔平板中培养细胞，并用它们来进行钙动员实验。在实验的当天，抽掉生长培养基，用Fluo-3 AM(最终浓度为2.5μM)在含有(mM)KCl(10.0)、NaCl(118)、CaCl2(2.5)、MgCl2(1.0)、HEPES(20)、葡萄糖(10)、pH为7.4的测定缓冲液中的溶液替换。将丙磺舒(Sigma Chemical Co.)加到染料负荷和染料洗涤介质中，使其工作浓度为2.5mM，以增加染料在细胞中的滞留时间。与Fluo-3AM在25℃培育60分钟后，洗涤细胞，使染料完全去除(Columbus PlateWasher，TECAN U.S.，Inc.，Research Triangle Park，N.C.)，然后用浓度增加的P2Y受体激动剂刺激该细胞。同时通过使用FLIPR(Molecular Devices Corp.，Sunnyvale，CA)测量荧光强度的变化监测各孔中胞内钙的水平。
在上述钙动员实验中使用人结肠上皮细胞系T84细胞。结果显示P2Y受体激动剂ATP和UTP刺激了这些细胞中的钙动员，这与P2Y2受体的激活一致(图5)。P2Y1受体的选择性激动剂2-甲硫基ADP不刺激钙的动员，这表明这些细胞缺乏P2Y1受体。类似地，人结肠HT-29细胞对于ATP和UTP具有强烈的P2Y响应，这与P2Y2受体激活一致(图6)。T84和HT-29细胞中由ATP和UTP引起的胞内钙动员的激活表明胃肠道中P2Y受体激动剂的药用性(已报道了HT-29细胞中UTP刺激的钙动员，Otero等人，Mol Cell Biochem 2000Feb，205(1-2)：115-23)。实施例4：上皮培养物和外植块中胃肠上皮的粘液产生、碳酸氢盐分泌和短路电 流的测量
使用常规的技术研究P2Y2和P2Y4嘌呤受体激动剂介导的上皮的电效应。本领域熟练的技术人员熟知这种技术。从食道、胃、空肠和结肠上皮分离出天然的外植物和培养粘膜上皮细胞，或者使其以单层生长，其中，分隔顶膜(粘膜)和基底外侧膜(浆膜)的连接复合体仍保持完整。将上皮组织或单层安放在能维持上皮极性并提供分别灌注林格溶液到顶面和其底外侧表面的能力的改良的Ussing室中。使用常规的电生理技术连续测量短路电流和总的跨上皮电阻。通过使用pH-固定(pH-stat)系统监测pH来测量碳酸氢盐分泌。与氯离子分泌、碳酸氢盐分泌或其它离子的跨膜流动的改变一致的这些参数的变化表明，P2Y受体激动剂改变了胃肠道中的分泌、吸收和/或粘膜水合。
使用本领域熟练技术人员熟悉的各种技术检测由存在于上皮腺体中的杯状细胞粘液的产生。使用压迹细胞学方法检测食道和胃粘膜上皮的天然外植块与培养单层的粘蛋白的产生，该方法包括使一定表面积的上皮暴露在聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，并用高碘酸和希夫试剂(PAS)将该PVDF膜染色。PAS阳性染色的量与粘蛋白分泌量成反比。在食道和胃粘膜上皮中，P2Y2和P2Y4嘌呤受体的激动剂使PAS染色减少，这与增加的粘蛋白分泌一致。酶联免疫吸附测定(ELISA)和使用粘蛋白特异性抗体的免疫印迹证明了粘液分泌由P2Y嘌呤受体诱导的增加。阳性结果表明，当向上皮标本的腔表面给予嘌呤受体激动剂后粘液的产生出现了强烈的、长时间的和显著的增加。通过使用嘌呤受体激动剂进行反复刺激可反复增加粘蛋白产生。实施例5：用于改善溃疡性结肠炎相关症状的嘌呤受体激动剂
由给予食蟹猕猴窦粘膜乙酸引起的幽门螺杆菌感染是一种慢性胃炎模型，这种模型显示出与人胃溃疡类似的组织学和临床表型。给患胃炎的猴口服P2Y受体激动剂，其结果是，高碘酸-希夫阳性物质的染色有明显的恢复，并且抗粘蛋白免疫反应性有所增加，这两者反映了粘蛋白分泌的增加。胃溃疡组织学事件的减少也表明了P2Y受体激动剂的药效。
采用本发明方法治疗患有溃疡性结肠炎或慢性胃炎的人。对患者进行内窥镜检查，接着进行胃粘膜的活检。在证实了粘膜炎症和胃粘膜层的侵蚀后可诊断出溃疡性结肠炎。本发明给患者口服P2Y受体激动剂的合适制剂，这些制剂涂覆在食道和胃粘膜层上并在胃粘膜下刺激粘液的产生。以缓释口服剂型给予该组合物，较佳是以咀嚼口香糖或锭剂的形式给予，根据需要可在一天中分几次给药。临床研究者可根据临床活动性指数、内窥镜指数、组织学指数和总的疗效评价监测疾病活动性。一个或多个这种参数的改善表明P2Y激动剂改善了溃疡性结肠炎的症状。实施例6：用于改变小肠和近端结肠的流体吸收和改善腹泻或便秘相关症状的嘌 呤受体激动剂
如下采用本发明方法治疗患有便秘或腹泻的人。给腹泻或便秘患者口服化合物制剂；该化合物被制成片剂，可使活性化合物以显示疗效且特定的量在小肠(治疗便秘)或大肠(治疗腹泻)中释放。该活性化合物在相应组织中特异地激活P2Y受体，并促进小肠中流体的分泌和大肠中流体的吸收。以克为单位测量48小时内排出的粪便，并根据患者调查问卷和/或临床观察评估腹泻或便秘的持续时间，根据这些结果进行下一步的治疗。阳性结果表明P2Y激动剂在对腹泻和/或便秘的治疗中是有效的。
现已使用完全、清楚、简要和准确的术语对本发明和使用本发明的方式和方法进行了描述，以使本发明所属领域的熟练的技术人员能以与发明者相同的理解使用本发明。应理解上面描述了本发明的最佳实施例，在不偏离本发明权利要求所提出的实质和范围的情况下可对本发明作出改动。为了具体指出和清楚表明本发明的主旨，由权利要求对此说明书进行概括。

Claims (13)

1.一种调节哺乳动物胃肠道中粘液或粘蛋白分泌、碳酸氢盐分泌或流体移动的方法，它包括：
以有效调节该哺乳动物胃肠道中粘液或粘蛋白分泌、碳酸氢盐分泌或流体移动的量给予该哺乳动物以含有嘌呤能P2Y受体配体的药物组合物。
2.一种治疗胃肠系统的粘膜屏障或碳酸氢盐分泌异常、或者流体通过腔道转运异常的胃肠疾病或功能失调的方法，该方法包括：
以有效调节胃肠系统中粘液或粘蛋白分泌物或矫正异常的流体移动的量给予患者以含有嘌呤能P2Y受体激动剂化合物的药物组合物。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述P2Y受体选自P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6和P2Y11。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述嘌呤能受体激动剂是选自式Ia、IIa和IIIa的化合物的核苷二磷酸：
                              式Ia式中：
X1和X2各自独立地是O-或S-；
Y是H或OH；
R1选自O、亚氨基、亚甲基和二卤代亚甲基(如二氯亚甲基、二氟亚甲基)；
R2选自H、卤素、烷基、取代的烷基、烷氧基、硝基和叠氮基；
R3选自H、烷基、酰基(包括芳酰基)和芳烷基；
R4选自-OR′、-SR′、NR′和NR′R″，其中，R′和R″独立选自H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、烷氧基和芳氧基，条件是当R4是氧或硫原子与嘧啶环上4位的碳以双键连接时，R′不存在；
                           式IIa
Figure A0081760700031
式中：
R1、X1、X2和Y如式Ia中的定义相同；
Z是H、Cl或SR，其中，R是饱和的或不饱和的C1-20烷基；
当R2不存在且N-1和C-6之间是双键时，R3和R4是H，或者
当R2是O、且N-1和C-6之间是双键时，R3和R4是H，或者
R3、R4和R2合在一起是-CH＝CH-，形成N-6和C-6之间为双键的从N-6到N-1的环；
                             式IIIa式中：
R1、X1、X2和Y的定义与式Ia中的相同；
当R7不存在并且N-3和C-4之间为双键时，R5和R6是H，或者
R5、R6和R7合在一起是-CH＝CH-，形成N-4和C-4之间为双键的从N-3到N-4的环(3，N4-亚乙烯基胞苷)，亚乙烯基环上的4位或5位上的氢可任意地被烷基、取代的烷基、烷氧基、硝基、卤素或叠氮基取代。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述核苷二磷酸选自5′-尿苷二磷酸、5′-腺苷二磷酸和5′-胞苷二磷酸。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述嘌呤能受体激动剂是选自式Ib、IIb和IIIb的化合物的核苷三磷酸：
                              式Ib 式中：
X1、X2和X3各自独立地是O-或S-；
Y是H或OH；
R1是O、亚氨基、亚甲基或二卤代亚甲基；
R2是H或Br；
R3选自H、烷基、酰基和芳烷基，或者不存在；
R4选自-OR′、-SR′、NR′和NR′R″，其中，R′和R″独立选自H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、烷氧基和芳氧基，条件是当R4是氧或硫原子与嘧啶环上4位的碳以双键连接时，R′不存在；
                               式IIb
Figure A0081760700051
式中：
R1、X1、X2、X3和Y的定义与式Ib中的相同；
Z是H、Cl或SR，其中，R是饱和或不饱和的C1-20烷基；
当R2不存在并且N-1和C-6之间是双键时，R3和R4是H，或者
当R2是O、且N-1和C-6之间是双键时，R3和R4是H，或者
R3、R4和R2合在一起是-CH＝CH-，形成N-6和C-6之间为双键的从N-6到N-1的环；
                              式IIIb
Figure A0081760700052
式中：
R1、X1、X2、X3和Y的定义与式Ib中的相同；
当R7不存在并且在N-3和C-4之间存在双键时，R5和R6是H，或者
R5、R6和R7合在一起是-CH＝CH-，形成N-4和C-4之间为双键的从N-3到N-4的环，亚乙烯基环上的4位或5位上的氢可任意地被烷基、取代的烷基、烷氧基、硝基、卤素或叠氮基取代。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述核苷三磷酸选自5′-尿苷三磷酸、5′-腺苷三磷酸和5′-胞苷三磷酸。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述嘌呤能受体激动剂是选自式IV的化合物的二核苷多磷酸：
                             式IV
Figure A0081760700061
式中：
X是氧、亚甲基、二氟亚甲基或亚氨基；
n＝0、1或2；
m＝0、1或2；
n+m＝0、1、2、3或4；
Z＝OH或H；
Z′＝OH或H；
Y＝H或OH；
Y′＝H或OH；
糖部分以D-构型表示，但它可以是L-型、或D-和L-构型，以D-构型为佳；
核苷残基可以是α-或β-和D-或L-构型，但最佳是β-D-构型；
B和B′分别如式V和VI中所定义的，各自是分别通过9位或1位连接的嘌呤残基或嘧啶残基。
                            式V
Figure A0081760700071
式中：
R1是氢、氯、氨基、单取代的氨基、二取代的氨基、烷硫基、芳硫基或芳烷硫基，其中，硫上的取代基含有至多20个碳原子，可以是饱和或不饱和的；
R2是羟基、氨基、巯基、烷硫基、芳硫基、芳烷硫基、酰硫基、烷氧基、芳基氧基、芳烷基氧基、酰氧基、单取代的烷基氨基、杂环基、单取代的环烷基氨基、单取代的芳烷基氨基、单取代的芳基氨基、二芳烷基氨基、二芳基氨基、二烷基氨基，其中，烷基可任意地连接到N7上形成取代环、酰基氨基、二酰氨基或NHRY；
RX是腺嘌呤1-氧化物衍生物中的O，或者在腺嘌呤衍生物中，Rx不存在；
条件是，当R2是NHRY时，RY和RX可一起形成1，N6-亚乙烯基腺嘌呤衍生物中的5元稠合咪唑环，在亚乙烯基部分的4位或5位上可任意地被如下定义的烷基、芳基或芳烷基部分取代；
R3是如下定义的氢、叠氮基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷硫基、芳硫基或芳烷硫基；或者是ω-A(C1-6烷基)OCONH(C1-6烷基)B-，其中，A和B独立地是氨基、巯基、羟基或羧基；或者是其药学上可接受的酯、酰胺或盐；或者R3不存在；
其中，腺嘌呤的取代的衍生物包括腺嘌呤1-氧化物、1，N6-(4-或5-取代的亚乙烯基)腺嘌呤、6-取代的腺嘌呤、或8-取代的氨基腺嘌呤；其中，6-或8-HNR′基的R′选自：具有可如下所述进行官能化的芳基部分的芳烷基(C1-6)；烷基；具有官能团的烷基，如([6-氨基己基]氨甲酰基甲基)-、ω-酰化的氨基(羟基、巯基和羧基)烷基(C2-10)-和它们的ω-酰化的氨基(羟基、巯基和羧基)衍生物，其中，酰基选自但不限于乙酰基、三氟乙酰基、苯甲酰基、取代的苯甲酰基，或者羧酸部分以酯或酰胺衍生物的形式存在，例如，乙酯或甲酯或其甲基、乙基或苯甲酰胺基衍生物，并且ω-氨基(羟基、巯基)部分可以用C1-4烷基进行烷基化；
J是碳或氮，条件是当J是氮时，R3不存在；
上述烷基是直链、支链或环状的；
上述芳基可任意地被低级烷基、氨基、烷基氨基、NO2、N3、羧基、酰胺基、磺酰胺基、或者卤素取代；
B和B′也可以是具有通式VI的嘧啶，通过1位连接到核糖残基上：
                             式VI 式中：
R4是氢、羟基、氧代、巯基、氨基、氰基、C7-12芳基烷氧基、C1-6烷硫基、C1-6烷氧基、C1-6烷基氨基、或二C1-4烷基氨基，其中可任意地将烷基连接，形成杂环；
R5是氢、氧代、乙酰基、苯甲酰基、C1-6烷基、C1-5烷酰基或芳酰基；
R5是羟基、氧代、巯基、C1-4烷氧基、C7-12芳基烷氧基、C1-6烷硫基、氨基、S-苯基、C1-5二取代的氨基、三唑基、C1-6烷基氨基或二-C1-4烷基氨基，其中，可将所述二烷基任意地连接，形成杂环，或者连接到N3上，形成取代的环；或者
R5和R6一起在嘧啶环的3位和4位之间形成5元稠合咪唑环，从而形成3，N4-亚乙烯基胞苷衍生物；其中，所述亚乙烯基部分的4位或5位可任意地被C1-4烷基、苯基或苯基氧基取代，其中，所述C1-4烷基、苯基或苯基氧基中至少有一个氢被选自卤素、羟基、C1-4烷氧基、C1-4烷基、C6-10芳基、C7-12芳烷基、羧基、氰基、硝基、磺酰胺基、磺酸酯、磷酸酯、磺酸、氨基、C1-4烷基氨基和二-C1-4烷基氨基的部分任意取代，其中，所述二烷基可任意相连，形成杂环；
R7选自氢、羟基、氰基、硝基和C2-8链烯基；其中，所述链烯基部分可任意通过氧连接形成环，其中，所述链烯基上与上述氧邻近的碳上至少有一个氢被选自C1-6烷基或苯基、取代的C2-8链烯基、卤素、取代的C1-4烷基、CF3、C2-3链烯基、C2-3炔基、烯丙基氨基、溴乙烯基、丙烯酸乙酯或丙烯酸任意取代；或者
R6和R7一起形成通过R6上的N或O或S连接的5或6元饱和或不饱和环，这个环可任意含有自身具有官能团的取代基；条件是，当R8是氨基或取代的氨基时，R7是氢；和
R8选自氢、氨基或二-C1-4烷基氨基、C1-4烷氧基、C7-12芳基烷氧基、C1-4烷硫基、C7-12芳基烷硫基、羧酰胺基甲基、羧甲基、甲氧基、甲硫基、苯氧基和苯硫基。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述二核苷多磷酸选自U2P4、dUP4U、U2P3、U2P5、dCP4U、CP4U、IP5I、AP4A、CP3U、UP3A和A2P3。
10.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述给药方式是口服形式，使治疗有效量的化合物与所述哺乳动物的胃肠系统的组织接触。
11.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述给药方式是注射形式，使治疗有效量的化合物通过全身性的吸收和循环与所述哺乳动物的胃肠系统的组织接触。
12.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，以栓剂的形式给予所述药物组合物，使治疗有效量的化合物通过全身性的吸收和循环与胃肠系统的组织接触。
13.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述胃肠疾病是胃食道反流性疾病(GERD)。
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