MXPA02005161A

MXPA02005161A - Metodo para tratamiento de enfermedades del aparato gastrointestinal con agonistas de los receptores purinergicos.

Info

Publication number: MXPA02005161A
Application number: MXPA02005161A
Authority: MX
Inventors: Pendergast William
Original assignee: Inspire Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1999-12-22
Filing date: 2000-12-22
Publication date: 2002-12-09
Also published as: WO2001045691A2; EP1261323A2; JP2003524636A; BR0016021A; CA2395108A1; KR20020069218A; CN1413113A; AU2603101A; WO2001045691A3

Abstract

La invencion proporciona un metodo para regular las secreciones de agua y mucinas y el transporte de fluidos en el tracto gastrointestinal. La invencion tambien proporciona un metodo para tratar una enfermedad gastrointestinal en la cual la barrera mucosa del aparato gastrointestinal esta deteriorada. La invencion ademas proporciona un metodo pata corregir los trastornos de secrecion o absorcion de fluidos en el aparato gastrointestinal. El metodo consiste en administrar a un paciente una composicion farmaceutica que contenga un agonista de los receptores purinergicos P2Y, en una cantidad eficaz para regular las secreciones de agua y mucinas o para corregir el transporte anormal de fluidos en el tracto gastrointestinal. La composicion farmaceutica utilizada en esta invencion contiene un agonista de los receptores purinergicos P2Y como puede ser 5-difosfato de uridina (UDP), 5'-trifosfato de uridina (UTP), 5'-difosfato de citidina (CDP), 5'-trifosfato de citidina (CTP), 5'-difosfato de adenosina (ADP), 5'-trifosfato de adenosina (ATP) y sus analogos; y los compuestos polifosfato de dinucleotido de la formula general (IV). El compuesto se prepara en una forma oral, en una forma inyectable o en una forma de supositorio, y se administra al paciente.

Description

MÉTODO PARA TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES DEL APARATO GASTROINTESTINAL CON AGONISTAS DE LOS RECEPTORES PURINÉRGICOS INTRODUCCIÓN Esta solicitud reclama prioridad ante la solicitud provisional US serie no. 60/171,710, presentada el 22 de diciembre de 1999, la cual se incorpora por este medio en la presente en su entereza como referencia.

Campo técnico Esta invención se refiere a un método para regular secreciones mucosas y transporte de fluidos en el aparato gastrointestinal de un paciente al administrar agonistas de los receptores purinérgicos como ciertos 5' -di- y trifosfatos de uridina, adenina o citidinas, polifosfatos dinocleósidos y sus análogos.

Antecedentes de la invención Existen múltiples situaciones donde es deseable aumentar terapéuticamente la cantidad de secreción de mucinas, secreciones de bicarbonatos y/o el grado de hidratación en los aparatos gastrointestinales. El aparato gastrointestinal opera principalmente para extraer energía y los bloques constructivos metabólicos de los materiales nutrientes presentados a este. El tracto digestivo incluye la cavidad bucal (principalmente glándulas salivales) , esófago, estómago, intestino delgado, intestino grueso, recto y órganos auxiliares (páncreas, hígado y vesícula biliar) . Cuando se deteriora la barrera mucosa en el tracto digestivo, da origen a enfermedades como boca seca, enfermedades de reflujo gastroesofágico, úlcera péptica, enfermedad de intestino inflamado, etcétera. El fluido anormal y el transporte electrolítico en el tracto gastrointestinal inferior da origen a trastornos como estreñimiento y diarrea.

El moco es un material viscoso que cubre múltiples superficies epiteliales y es secretado a los fluidos como saliva. Esta compuesto principalmente de mucinas y sales inorgánicas suspendidas en agua. El moco se adhiere a múltiples superficies epiteliales, donde sirve como una barrera de difusión contra el contacto con sustancias nocivas (por ejemplo ácido gástrico, enzimas digestivas y bacterias) y como lubricante para reducir al mínimo los esfuerzos cortantes. Estos recubrimientos mucosos son particularmente importantes sobre el epitelio de los tractos gastrointestinal, respiratorio y genital. El moco también es un componente abundante e importante de la saliva, proporcionándole propiedades lubricantes casi sin paralelo. Las células secretoras de moco como las células calciformes son abundantes en el epitelio de los tractos gastrointestinales. Numerosas glándulas mucosas submucosas están dispersadas a lo largo del esófago y especialmente se acumulan por debajo de los esfínteres esofágicos superiores y por encima de los inferiores. Muchas de las células epiteliales acinares en las glándulas salivales secretan moco. Las principales moléculas estructurales de la capa de moco son las mucinas, las cuales son una familia de grandes proteínas altamente glucosiladas. El "recubrimiento de azúcar" denso de las mucinas les proporciona considerable capacidad para retener agua y las hace resistente a las proteólisis, lo cual puede ser importante para mantener las barreras mucosas.

La secreción de bicarbonato desempeña una función importante en el mantenimiento de la salud de las mucosas en el tracto gastrointestinal. La producción de bicarbonato y moco por el esófago en respuesta a la acidificación local proporciona un mecanismo inherente para resistir el daño inducido por el ácido. La secreción de los factores protectores salivales, incluido el bicarbonato, así como el bicarbonato secretado de las glándulas submucosas esofágicas, son importantes para prevenir la lesión de la mucosa esofágica asociada con la enfermedad de reflujo gastrointestinal. El bicarbonato de la mucosa también proporciona un mecanismo importante para la protección contra el daño ácido en el duodeno proximal, en el cual el moco adherente proporciona una capa protectora estable dando soporte a la neutralización superficial del ácido por el bicarbonato de la mucosa. [Nucleotides stimula te bicarbona to secretion in guinea pig pancrea tic duct (Ishiguro y col . , 1999, J. Physiol . 519 Pt 2 : 551 -558) y CFTR knockout mouse gall bladder epíthelium (Clarke y col . 2000, Am . J. Physiol . Gastrointest . Liver Physiol . 219: G132-138) ] .

La regulación adecuada el fluido y la absorción electrolítica y la secreción en regiones adecuadas a lo largo del aparato gastrointestinal es necesaria para la función normal digestiva. El deterioro del transporte de fluidos da origen a una variedad de trastornos que incluye estreñimiento y diarrea. El estreñimiento se asocia con un retrazo en el tránsito de la materia fecal a lo largo del intestino grueso. El aumento en el tiempo de estancia de las heces en el intestino grueso da origen al aumento de la absorción de fluidos por el epitelio colónico, y origina deshidratación de las heces y la producción subsiguiente de heces secas, duras en el colón descendente. Por el contrario, la diarrea resulta del movimiento rápido de la materia fecal a lo largo del intestino grueso, dando origen a un aumento en la secreción de fluidos en el intestino delgado o a la absorción de fluidos reducida en el colón.

La xerostomia, conocida comúnmente como boca seca, resulta de la subproducción de saliva. La boca seca es causada por tratamiento con irradiación o enfermedades que dañan las glándulas salivales y disminuyen el flujo salival. La enfermedad de reflujo gastroesofágico es el estado donde el grado de exposición de la mucosa esofágica al contenido gástrico es mayor que lo normal. La manifestación más común es las acedías o pirosis. El tratamiento farmacológico incluye el uso de antagonistas H2 (por ejemplo, Tagamet®, Zantac®, Pepcid®, Axid®) y los inhibidores de la bomba de protones como Prilosec® o Prevacid®, para el tratamiento de enfermedad aguda. Las enfermedades de úlcera péptica incluyen úlcera gástrica, úlcera del canal pilórico y úlcera duodenal. La ulceración resulta de una interacción compleja del ácido y la inflamación crónica inducida por la infección por Helicobacter pylori . Los pacientes con úlceras duodenales tienen alta secreción acida. La elevada secreción acida causa cambios en la pared del duodeno, estableciendo la etapa para la invasión por H. pylori . Los medicamentos para tratar enfermedades de úlcera péptica: incluye bloqueadores de histamina-2 (H2) (Tagamet®, Zantac®, Axid®, Pepcid® etcétera) , sucralfato, inhibidores de la bomba de protones, y antiácidos. La enfermedad de intestino inflamado se clasifica en dos tipos: colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn. La colitis ulcerativa afecta el colon/recto e incluye la mucosa o el revestimiento más interno de la pared del colon. La enfermedad de Crohn es una enfermedad transmural que involucra todas las capas del intestino y puede incluir cualquier parte del aparato, desde la boca hasta el ano. El tratamiento médico de la enfermedad de intestino inflamado incluye aminosalicilatos y corticosteroides. Los corticosteroides tienen toxicidad substancial a largo plazo. Como una alternativa a los tratamientos habituales, los investigadores médicos han buscado desarrollar nuevos tratamientos para las enfermedades gastrointestinales.

Las siguientes referencias describen la función de la integridad del moco y la secreción de mucina en algunas enfermedades del tracto gastrointestinal. Rhodes y col., {Gut, 26: 1312-1318 (1985)) sugieren que el moco colónico sufre de sulfatación y desialación continua in vivo como resultado de la actividad enzimática fecal; la susceptibilidad alterada del moco colónico puede ser importante en la patogénesis de la enfermedad colónica. Somasundaram y col., { Clin . Exp. Pharmacol . Physiol . , 14: 309-318 (1987) ) reportan que la integridad de la mucosa gástrica y su capacidad para secretar moco son esenciales para la protección de la mucosa gástrica contra ulceración inducida por los factores agresivos activos en cualquier situación de estrés. Desai y col., (J. Pharm . Pharmacol . 47:734-738 (1995)) mostraron que el SKF 38393, un agonista de los receptores de dopamina Di específico, fue eficaz en la prevención de ulceración gástrica y duodenal en ratas. Sarosiek y col., {Digestión, 56 Supl . 1: 15-23 (1995)) reportaron que la velocidad de secreción de la mucina esofágica, EGF y PGE2, bajo el impacto de HCl/pepsina en pacientes con esofagitis por reflujo se deterioró de manera importante. Saitoh y col., { Dig. Dis . Sci . 41: 1768-1774 (1996)) mostraron que comparado con individuos sanos, la producción total de mucina de pacientes con colitis ulcerativa fue baja debido a deficiencia de mucina neutra, mientras que los pacientes que tenían enfermedad de Crohn fueron altos los rendimientos debido a la mucina de alto peso molecular. Sarosiek y col., {Gastroenterology, 110: 675-681 (1996)) sugieren que un aumento en la tasa de secreción de los componentes protectores inorgánicos y orgánicos en la saliva puede ser útil para el tratamiento de la enfermedad de reflujo gastroesofágico. Zeeh (Gastroenterology, 110: 1077-1083 (1996)) reportaron que la administración del factor de crecimiento de los queratinocitos aminora la lesión de la mucosa en un modelo experimental de colitis en ratas. Abbas y col., { Indian J. Exp. Biol . 36: 182-186 (1998)) reportan que el efecto anti-ulcerogénico del GAB y baclofeno puede ser debido a sus efectos principales sobre los factores defensivos de la mucosa como la mejor secreción de mucina y la disminución del derrame celular o el daño a la mucosa. Nath y col., { Clin . Exp. Pharmacol . Physiol . 25: 564-567 (1998)) reportan que el ácido poliriboinosinico-poliribositidilico tuvieron un efecto anti-úlcera gástrica potente en ratas; el ácido poliriboinosinico-poliribositidilico según se mostró causa una disminución en la acidez libre y total y pepsina y un aumento en el contenido de mucina en ratas Shay. Newton y col., { Gut, 43: 470-475 (1998)) reportan que la H. pylori in vivo causa cambios estructurales en la capa mucosa gástrica adherente pero no se compromete el espesor de la barrera mucosa.

Las siguientes referencias describen las composiciones de los agonistas de los receptores purinérgicos y/o el tratamiento de enfermedades. Se ha demostrado que el 5' -trifosfato de puridina aumenta la velocidad y cantidad total de la secreción de mucina por las células calciformes in vi tro {Lethem y col . , Am . J. Respir. Cell Mol . Biol . 9: 315-322 (1993)) USPN 5,900,407 (Yerxa y col.) describe un método para la estimulación de la secreción de lagrimas en un individuo en necesidad de tratamiento. El método consiste en administrar a las superficies oculares del individuo un agonista de los receptores purinérgicos como 5' -trifosfato de uridina, 5' -trifosfato de citidina, 5' -trifosfato de adenosina o sus análogos y derivados, en una cantidad eficaz para estimular la secreción del fluido lagrimal. USPN 5,837,861 (Pendergast y col.) describe receptores purinérgicos P2Y2 de los polifosfatos dinucleótidos teniendo la estructura de la fórmula I, donde X es oxígeno, metíleno o difluorometileno; n = 0 ó l; m = 0 ó 1; n + m = 0, 1 ó 2; y B y B' cada uno son independientemente un residuo de purina o un residuo de pirimidina ligado a través de la posición 9 ó 1. Los compuestos son útiles en el tratamiento de las enfermedades pulmonares obstructivas crónicas, bronquitis, ciertas neumonías, fibrosis cística, sinusitis y otitis media. USPN 5,763,447 (Jacobus y col.) describe un método para favorecer el drenado de las secreciones mucosas en las vías aéreas congestionadas de un paciente inmovilizado. El método consiste en administrar a las vías aéreas del paciente un fosfato de uridina como 5' -trifosfato de puridina (UTP) o P, 1P4-di (uridina-5' ) tetrafosfato [sic], en una cantidad eficaz para promover el drenado del fluido en las vías aéreas congestionadas, incluidos los senos, hidratando las secreciones mucosas o estimulando la frecuencia de la pulsación ciliar en las vías aéreas. USPN 5,789,391, 5,981,506, 5,972,904 y 5,958,897 se dirigen a un método para favorecer el drenado de secreciones mucosas congestionadas en los senos de un individuo en necesidad de este. El método consiste en administrar a los senos del individuo un fosfato de uridina como 5' -trifosfato de uridina (UTP) o P1, P -di (uridina-5' ) tetrafosfato, un análogo de UTP o cualquier otro análogo, en una cantidad eficaz para favorecer el drenado del fluido congestionado en los senos hidratando las secreciones mucosas o estimulando la frecuencia de las pulsaciones ciliares en los senos. USPN 5,968,913 se dirige a composiciones farmacéuticas composiciones de UTP para uso en la promoción de un mayor aclaramiento mucociliar de las secreciones de mucosas retenidas de las vías aéreas humanas, los oídos medio/interno o los senos. USPN 5,763,447 se dirige a un método para la prevención o tratamiento de neumonía, incluida la neumonía asociada con ventilador, en un individuo encamado o inmovilizado en necesidad de este tratamiento. El método consiste en administrar a las vías aéreas del paciente un fosfato de updma como 5' -trifosfato de uridina (UTP), P 1,P4-(uridina-5' ) tetrafosfato, o sus análogos, en una cantidad eficaz para favorecer el drenado del fluido en las vías aéreas congestionadas. WO 99/09998 describe un método para utilizar 5' -difosfato de uridina y los análogos de este para tratar enfermedades del pulmón. Los compuestos descritos en las referencias anteriores (las Patentes '391, '506, '904, '897, '913 y '447 y WO 99/09998), que tienen actividad en los receptores purinérgicos, se incorpora en la presente como referencia. USPN 5,733,916 (Neely) describe un método para la prevención o tratamiento de lesión por isquemia-reperfusión o lesión de pulmón relacionado con endotoxinas mediante la administración de una composición que contiene un antagonista de los receptores de adenosina Ai selectivo y/o un antagonista purino receptor PX. Somers y col., (Labora tory Investigation, 78: 1375-1383 (1998)) reportan que el receptor P2Y6 se expresó altamente en la enfermedad de intestino inflamado activa infiltrando células T, mientras que la expresión de P2Yd estuvo ausente de las células T del intestino no afectado, Boyer y col., {Br. J. Pharmacol . 118:1959 (1996)) sintetizaron y probaron una serie de derivados 2-tioéter de cadena extendida del monofosfato de adenosina (AMP) como agonistas para la activación del purino receptor P2Y ligado a la fosfolipasa C de las membranas de eritrocitos de pavo, el purino receptor P2Y ligado a adenililciclasa de células de glioma de rata C6, y el receptor P2U humano clonado expresado de manera estable en células de astrocitoma humano 1321N1.

Los compuestos fosfatos de dinucléotido específicos conocidos en la técnica anterior se listan en la Tabla I, junto con sus referencias correspondientes. Estos compuestos no han sido utilizados en la técnica anterior para aumentar la secreción de moco o para corregir el fluido y el desequilibrio electrolítico en el tracto gastrointestinal, y los solicitantes proponen incluirlos en esta invención.

TABLA I COMPUESTOS FOSFATO DE DINUCLEOTIDO EN LA LITERATURA A = = Adenina U = = Uridina G = = Guanosina T = = Timidina X = Xantosina TAD = Tiazofurina BAD = Ribósido de benzamida D = 2, 6-diaminopurina Gm = 2' -O-metilguanosina Um = 2' -O-metiluridina eA = Etenoadenosina m G = 7-met?lguanosma m 2 ' 7 G = 2 , 7-d?met lguanosma m2,2,7G 2,2, 7-trimetilguanosina NAD = Ribósido nicotinamida C-NAD = Ribósido C-nicotinamida C-PAD = Ribósido C-picolinamida N = Nucleósido Am = 2' -O-metiladenosina m Am = N6-metil-2' -O-metiladenosina Cm = 2' -O-metilcitidina X = Xantosina 5-BrU = 5-bromouridina aha = 8- (6-aminohexilo) AZT = timina-3' -azido 2' , 3' -dideoxi-D-ribósido 5-FU = 5-fluorouridina (1) M.A.G. Sillero et al., Eur. J. Biochem., 76, 331 (1977) (2) C.G. Vallejo et al, Biochim. Bíophys. Acta, 483, 304 (1976) (3) H. Coste et al, J. Biol. Chem, 262, 12096 (1987) (4) K.E. Ng et al, Nucleic Acid Res, 15, 3573 (1987) (5) J. Stepinski et al, Nucleosides & Nucleotides, 14, 717 (1995) (6) A. Zatorski et al, J. Med. Chem, 39, 2422 ( 1996) (7) P. Rotilan et al, FEBS, 280, 371 (1991) (8) P.C. Zamecnik et al, Proc. Nati. Acad. Sci, 89, 2370 (1992) (9) J. Walker et al, Biochemistry, 32, 14009 (1993) (10) R.H. Hiderman et al, J. Biol. Chem, 266, 6915 (1991) (11) J. Luthje et al, Eur. J. Biochem, 173, 241 (1 88) (12) R.H. Silverman et al, Microbiological Rev, 43, 27 (1979) (13) C.D. Lobaton et al, Eur. J. Biochem, 50, 495 (1975) (14) G. Lowe et al, Nucleosides & Nucleotides, 10, 181 (1991) (15) G.M. Blackburn et al, Nucleosides & Nucleotides, 10, 549 (1991) (16) J.C. Baker et al, Mutation Res, 208, 87 (1988) (17) G. Klein et al, Biochemistry, 27, 1897 (1988) (18) E. Castro et al, Br. J. Pharmacol, 100, 360 (1990) (19) D.R. Elmaleh et al, Proc. Naü. Acad. Sci, 81, 918 (1984) (20) R. Bone et al, J. Biol. Chem, 261, 16410 (1986) (21) Fed. Amer. Soc. Exper. Bio, Abstr. Part I, no. 1878 (1991) (22) M.T. Miras-Portugal et al, Ann. NY Acad. Sci, 603, 523 (1990) (23) A. Guranowski et al, Biochemistry, 27, 2959 (1988) (24) F. Grummt et al, Plant Mol. Bio, 2, 41 (1983) (25) A.G. McLennan et al, Nucleic Acid Res, 12, 1609 (1984) (26) P. Zamecnik et al, Analytical Biochem, 134, 1 (1983) (27) E. Rapaport et al, Proc. Nati. Acad. Sci, 78, 838 (1981) (28) T. Kimura et al, Biol. Pharm. Bull, 18, 1556 (1995) (29) E. Schulze-Lohoff et al, Hypertension, 26, 899 (1995) (30) B.K. Kim et al, Proc. Nati. Acad. Sci, 89, 11056 (1992) (31) P.C. Zamecnik et al, Proc. Nati. Acad. Sci, 89, 2370 (1992) (32) H. Morii et al, Eur. J. B?ochem, 205, 979 (1992) (33) E. Castro et al, Pflugers Arch, 426, 524 (1994) (34) H. Schluter et al, Nature, 367, 186 (1994) (35) E. Castro et al, Br. J. Pharmacol, 206, 833 (1992) (36) T. Casillas et al, Biochemistry, 32, 14203 (1993) (3 ) J. Pintor et al, J. Neurochem, 64, 670 ( 1995) (38) E. Castro et al, J. Biol. Chem, 270, 5098 (1995) (39) V.A. Panchenko et al, Neuroscience, 70, 353 (1 96) (40) E. Castro et al, Br. J. Pharmacol, 100, 360 (1990) (41) J. Pintor et al. Gen. Pharmac, 26, 229 (1995) (42) J. Pintor et al, Br. J. Phamacol, 115, 895 (1995) (43) A. Kanavarioti et al, Tett. Lett, 32, 6065 (1991) (44) Stutts, M. J, III, et al. WO 96/40059 (45) Theoclitou, et al. J. Chem. Soc. Perkin Trans 1, 2009-2019 (1996) (46) Guranowski, A, et al. Nucleosides and Nucleotides, 14, 731-734 (lí (47) De Flora, A, et al. WO 96/02554A1 (48) Visscher, J. et al. Nucleic Acids Research, 20 , 5749-5752 (1992) (49) Holler, E.; Holmquist, B, et al. Biochemistry, 22, 4924-4933 (1983) (50) Orr, R. M.; et al. Biochem. Pharmacol. 673-677 (1988) (51) Plateau, P, Fromant, et al. Biochemistry, 24, 914-922 (1985) (52) Hagmeier, E, et al. Journal of Chromatography, 237, 11 A?11 (\9Í (53) Scheffzek, K, et al. Biochemistry, 35, 9716-9727 (1996) (54) Stridh, S, et al. Antiviral Research, 97-105 (1981) (55) Tarusova, N. B, et al. Zh. Org. Khim., 24(7), 1474-1480 (Russian); through Chem. Abs. 110:154770 (1988) (56) Hata, T, et al. Chem. Lett., 987-990 (1976) (57) Huh?, G. F, et al. Separation Science and Technology, 28, 1959-1970 (1993) (58) Tumanov, Yu. V, et al. Bioorg. Khim., 13, 921-927 (Russian); through Chem Abs., 109:6867d (1987) (59) Devash, Y. US Patent No.4,855,304 (60) Pintor, J, et al. Molecular Pharmacology 51, 277-284 (1997) (61) Stutts et al. US Patent No. 5,635,160. (62) Thiermermann, C, et al WO 98/55494 (63) Zamechik, P.C, et al. US Patent No. 5,049,550 (64) Pankiewicz, K.W, et al. W098/15563 (65) Kim, B.K, et al. U.S. Patent No. 5,681,823 (66) Stutts, et al., U.S. Patent No. 5,935,555 Los receptores purinérgicos P2Y son receptores de los nucleótidos purina y pirimidina que se acoplan a las proteínas G; estos son proteínas de 308 a 377 aminoácidos con pesos moleculares de 41 a 53 kDa después de la glucosilación. Los receptores P2Y, como pueden ser los receptores P2Y , P2Y2 y P2Y6 están presentes en el aparato gastrointestinal (Ralevic y col., Pharm . Rev. 50: 415-492 (1998)). Debido a la propiedad demostrada de los agonistas de los receptores purinérgicos para estimular la secreción de moco/mucina en y alrededor del ojo (USPN 5,900,407), y en el pulmón y los senos (USPN 5,837,861), los solicitantes se motivaron para investigar si los ligandos de los receptores purinérgicos P2Y podrían afectar la secreción de moco y/o mucinas, y corregir el transporte anormal de fluido en el aparato gastrointestinal, y así podrían ser eficaces en el tratamiento de enfermedades y trastornos del aparato gastrointestinal superior e inferior.

Los solicitantes han descubierto que todos los receptores P2Y, incluidos P2Y4 y P2Y1; están presentes en los tejidos gastrointestinales. Los solicitantes también describen que la secreción de moco y mucina, secreción de bicarbonato y el transporte de fluidos en estos tejidos puede ser regulado por los mecanismos mediados por los receptores purinérgicos P2Y. Los ligandos de los receptores purinérgicos P2Y administrados por vía oral o sistémica proporcionan un método novedoso para el tratamiento de trastornos gastrointestinales.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La invención proporciona un método para regular las secreciones de moco/mucinas, y el transporte de fluidos del tracto gastrointestinal. La invención propone un método para tratar la enfermedad gastrointestinal en la cual se deteriora la barrera mucosa del aparato gastrointestinal. La invención además propone un método para corregir los trastornos de secreción o absorción de fluidos en el aparato gastrointestinal que dan origen a diarrea o estreñimiento. El método consiste en administrar a un paciente una composición farmacéutica que contenga un ligando de los receptores P2Y purinérgicos en una cantidad eficaz para regular las secreciones de moco/mucina y bicarbonato y el transporte de fluidos en el aparato gastrointestinal. Los métodos de administración incluyen la administración oral y sistémica. Las enfermedades tratadas incluyen las enfermedades también trastornos de la cavidad bucal, el esófago, estómago intestino delgado, intestino grueso, recto y órganos auxiliares como páncreas, hígado y vesícula biliar.

La composición farmacéutica que se utiliza en esta invención contiene un agonista de un receptor purinérgico P2Y. Los agonistas P2Y aumentan la secreción de agua, bicarbonato y mucina en los epitelios mucosos del aparato gastrointestinal. Los agonistas P2Y incluyen 5' -di y trifosfato de uridina (UDP, UTP) y sus análogos (fórmulas la y Ib), 5' -monofosfato de adenosina (AMP) y sus análogos, 5' -di y trifosfato de adenosina (ADP, ATP) y sus análogos (fórmulas lia y Ilb) , 5' -di- y trifosfato de citidina (CDP, CTP) y sus análogos (fórmulas Illa y Illb) y los compuestos polifosfato de dinucleótido (fórmula general IV) .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra los resultados de la hibridación in situ del receptor P2Y2 de los tejidos estomacales (epitelio gástrico) con (a) sonda sentido control y (b) sonda antisentido.

La Figura 2 muestra los resultados de la hibridación in situ del receptor P2Y2 del epitelio del esófago con (a) sonda sentido control y (b) sonda antisentido.

La Figura 3 muestra los resultados de la hibridación in sítu del receptor P2Y del epitelio del intestino grueso (colon) con (a) sonda sentido y (b) sonda antisentido.

La Figura 4 muestra los resultados de la hibridación in situ del receptor P2Y2 del epitelio del intestino delgado (jejuno) con (a) sonda sentido y (b) sonda antisentido.

La Figura 5 muestra la movilización del calcio inducida por los agonistas de los receptores P2Y en células epiteliales colónicas humanas.

La Figura 6 muestra la movilización del calcio inducida por los agonistas de los receptores P2Y en células epiteliales colónicas humanas HT-29.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención proporciona un método para regular secreciones mucosas, secreción de bicarbonato y transporte de fluidos en el tracto gastrointestinal. La invención también propone un método para tratar enfermedad gastrointestinal en la que la barrera mucosa del órgano esta deteriorada, o en la cual ocurre un desequilibrio de la absorción o secreción de fluidos en el intestino delgado y grueso. El método consiste en administrar a un mamífero una composición farmacéutica que contenga un ligando de los receptores P2Y purinérgicos en una cantidad eficaz para regular las secreciones de moco o mucina, secreción de bicarbonato o transporte de fluidos en el tracto gastrointestinal. El método mejora la liberación de mucina, el pH y la hidratación o regula el transporte de fluidos en el tracto gastrointestinal.

Las enfermedades gastrointestinales convenientes para tratamiento por esta invención incluyen las enfermedades o trastornos que afectan la cavidad bucal (principalmente glándulas salivales) , esófago, estómago, intestino delgado, intestino grueso, recto y órganos auxiliares como páncreas, hígado y vesícula biliar. Por ejemplo, boca seca, úlceras de la boca, enfermedad de las encías, enfermedad de reflujo esofágico, úlcera péptica, enfermedad de intestino inflamado (colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn) , micositis, diarrea y estreñimiento pueden ser tratados por el método presente. Además, los problemas gastrointestinales asociados con fibrosis cística como mucina seca y absorción disminuida del nutriente por las células epiteliales en el tracto gastrointestinal también pueden ser tratados por el método presente. Además, también es posible' tratar por este método problemas gastrointestinales causados por cáncer y quimioterapia.

Se ha demostrado que la mucina es importante en la protección de las superficies mucosas de la exposición ambiental; actúa como una barrera acida y se ha encontrado que se une a los patógenos. La mucina así es una parte del sistema de defensa natural de la mucosa en el cuerpo, y la estimulación de su secreción puede originar protección del epitelio superficial mucoso. El método de la presente invención es para incrementar las secreciones mucosas en los tractos gastrointestinales como estómago y esófago, reforzando así el sistema de defensa natural.

El revestimiento epitelial del esófago humano consiste en epitelio escamoso y glándulas submucosas que sirven como una barrera natural entre el lumen y la sangre y actúa como revestimiento protector contra trastornos físicos del alimento ingerido y contra los jugos gástricos ácidos del estómago. Las glándulas submucosas esofágicas contienen moco, suero y tipos de células mioepiteliales. Las glándulas submucosas en las vías aéreas y la conjuntiva contienen receptores P2Y2 en los epitelios mucosos del esófago. La activación de los receptores P2Y2 por los agonistas naturales y sintéticos aumenta la secreción de moco y la hidratación de la capa mucosa del esófago.

Una variedad de estados fisiopatológicos a origen a la erosión de la barrera mucosa protectora del esófago, originando la enfermedad de reflujo gastroesofágico (GERD) . Los síntomas del GERD incluyen pirosis media a grave, inflamación esofágica (esofagitis) , regurgitación, deglución disfuncional y dolor de pecho. La GERD es causada por diversos factores que incluyen función anormal del esfínter esofágico inferior (que permite el reflujo de los jugos gástricos hacia el esófago inferior) , vaciedad retardada del estomago, tasas reducidas de aclaramiento esofágico y salivación disminuida. Cuando se expone el esófago a un alto contenido ácido durante el reflujo gástrico, se origina un rompimiento de la capa mucosa protectora. La presente invención describe que en modelo animal de esofagitis, los agonistas de los receptores P2Y2 pueden reestablecer la integridad de la capa mucosa esofágica rota estimulando naturalmente la producción de mucina, bicarbonato y fluidos por el epitelio escamoso y/o las glándulas submucosas .

Las úlceras gástricas y el reflujo gástrico son estados caracterizados en parte por un rompimiento en la barrera de defensa de la mucosa del epitelio gastrointestinal superior. Una excesiva secreción acida en el estomago puede originar un rompimiento en la capa de moco natural que protege las células epiteliales del daño ácido. La úlcera gástrica esta asociada con, pero no se limita a estrés, dieta, infección por H. pylori, quimioterapia o radioterapia, otras enfermedades auto-inmunes como el síndrome de Sjogren, etcétera, cirugía, trastornos sicosomáticos, estrés, ansiedad y efectos colaterales relacionados con medicamentos farmacológicos, Las criptas de Lieberkühn a lo largo del intestino delgado desempeñan una función importante mediando la secreción de fluidos hacia el lumen del intestino delgado. El flujo de cloruros a través de los canales de cloruros de la membrana apical de las células epiteliales a lo largo de estas criptas proporciona la fuerza motriz para la secreción de fluidos obligada por presión osmótica en el intestino delgado. El estreñimiento y diarrea resultan del transporte anormal de fluidos (absorción contra secreción) a través de los intestinos delgado y grueso. La presente invención describe un método para corregir el desequilibrio del transporte de fluidos que dan origen al estreñimiento o diarrea dirigiendo la activación de los receptores P2Y a lo largo de los intestinos delgado y grueso. En estados patológicos, como la exposición a la toxina del cólera, los canales de cloruro apicales están constitutivamente activos originando así una secreción incontrolada de fluidos hacia el intestino delgado, diarrea extrema y deshidratación corporal mortal. Esta observación ha proporcionado un razonamiento científico para tratar estreñimiento y diarrea.

La activación de la secreción de cloruros y fluidos a través de los intestinos delgados, según se sabe, proporciona fluido adicional al quimo antes de que este se convierta en materia fecal en el intestino grueso. Esta adición de fluidos al quimo de este modo desplazará la hiper-absorción de fluidos en el intestino grueso dando origen al estreñimiento. La presente invención describe que la activación de los receptores P2Y por los agonistas proporciona un mecanismo para el aumento en la secreción de cloruros y fluidos hacia el intestino delgado y puede utilizarse terapéuticamente para tratar estreñimiento .

El epitelio colónico del intestino grueso normalmente absorbe fluidos y funciona para eliminar fluidos excesivos del quimo entrante desde el intestino delgado y convertirlo en heces. La diarrea resulta del fluido excesivo en el quimo entrante, o la mala absorción del fluido a través del colon. La absorción de fluidos a lo largo del epitelio colónico es mediada por la absorción de sodio a través de los canales de sodio de la membrana apical y los transportadores de sodio potasio de la membrana basolateral. Las propiedades de absorción de fluidos de este epitelio pueden ser moduladas electrogénicamente por los canales de potasio activados con calcio en la membrana basolateral. El aumento en la conductancia de potasio en la membrana basolateral hiperpolariza las membranas apical y basolateral y de este modo aumenta la fuerza motriz electrogénica para la afluencia de sodio a través de la membrana apical. Esto da origen a un aumento concurrente en la absorción de sodio y potasio por el epitelio, y aumenta la absorción de fluidos acoplada al ion. La presente invención describe que la activación de los purino receptores P2Y por los agonistas aumenta la conductancia de potasio en la membrana basolateral y facilita la eliminación de fluidos de las heces. Por tanto, la administración directa de los agonistas de los receptores P2Y puede utilizarse terapéuticamente para tratar diarrea.

El método presente consiste en administrar a un paciente una composición farmacéutica que regule la secreción de moco/mucina, la hidratación y transporte de fluidos en el tracto gastrointestinal. El presente método tiene ventajas sobre otros tratamientos actualmente utilizados. El método regula la propia producción y secreción de moco de un paciente así como los niveles de hidratación de la mucosa. De este modo, el método mantiene las características protectoras y lubricantes naturales de la mucosa del sistema gastrointestinal y soluciona directamente el problema resultante del deterioro del moco. La presente invención esta relacionada principalmente con el tratamiento de individuos humanos, pero también puede emplearse para el tratamiento de otros individuos mamíferos como perros y gatos, para propósitos veterinarios. Los solicitantes han descubierto que (a) múltiples receptores P2Y purinérgicos (P2YX, P2Y2, P2Y4, P2Y6 y P2Yu) están presentes en los tejidos gastrointestinales como las glándulas salivales, el esófago, estómago, intestino delgado, colon, duodeno y recto; (b) un potente agonista de los receptores purinérgicos aumenta la secreción de mucina y regula el transporte de fluidos en el epitelio mucoso del tracto gastrointestinal .

Los agonistas de P2Y incluyen mono-, di- y trifosfatos de nucleótido y polifosfatos de dinucleótido. Los monofosfatos de dinucleótido útiles en esta invención incluyen 5' -monofosfato de adenosina (AMP) y sus derivados como AMP sustituido con el 2-tioéter, por ejemplo, AMP 2-hexiltio {Br. J. Pharmacol . 118: 1959 (1996)). Los di- y trifosfatos de nucleótido útiles en esta aplicación incluyen 5' -di- y trifosfato de uridina (UDP y UTP) y sus análogos de las fórmulas generales la ay Ib; 5' -di- y trifosfato de adenosina (ADP y ATP) y sus análogos de las fórmulas generales lia y Ilb; y 5' -di- y trifosfato de citosina (CDP y CTP) y sus análogos de las fórmulas generales Illa y Illb. ( El UDP y sus análogos se representan por la fórmula general la: Fórmula la en donde : X y X2 son cada una independientemente 0 ó S ; Y es H u OH; Rl se selecciona del grupo que consiste en O, imido, metileno y dihalometileno (por ejemplo, diclorometileno, difluorometileno) ; R2 se selecciona del grupo que consiste en H, halo, alquilo, alquilo sustituido, alcoxilo, nitro y azido; R3 se selecciona del grupo que consiste en nada, H, alquilo, acilo (incluido arilacilo) , y arilalquilo; y R4 se selecciona del grupo que consiste en -OR' , -SR' , -NR' y NR'R", en donde R' y R" se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, alcoxilo y ariloxilo, y con la condición de que R' este ausente cuando R4 tiene un enlace doble de un átomo de azufre o azufre al carbono en la posición 4 del anillo pirimidina.

Cuando se usa en la presente, el término "alquilo" se refiere a cadenas hidrocarburo de C1-C 0 inclusive, lineales, ramificadas o cíclicas, saturadas o insaturadas (es decir, alquenilo y alquinilo) , que incluye por ejemplo metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, ter-butilo, pentilo, hexilo, octilo, etenilo, propenilo, butenilo, pentenilo, hexenilo, octenilo, butadienilo, propinilo, butinilo, pentinilo, hexinilo, heptinilo, alenilo [sic] y opcionalmente grupos arilalquenilo y arilalquinilo sustituidos. Como se utiliza en la presente, el término "acilo" se refiere a un grupo ácido orgánico en donde el -OH del grupo carboxilo ha sido sustituido con otro sustituyente (es decir, como esta representado por RCO-, en donde R es un grupo alquilo o un grupo arilo) . Como tal, el término "acilo" específicamente incluye grupos arilacilo. Los ejemplos específicos de los grupos acilo incluyen acetilo y benzoilo. Cuando se utiliza en la presente, el término "arilo" se refiere a anillos hidrocarburos y aromáticos heterocíclicos de 5 y 6 miembros. Los ejemplos específicos de los grupos arilo incluyen, pero no se limitan a ciclopentadienilo, fenilo, furano, tiofeno, pirrol, pirano, piridina, imidazol, izotiazol, isoxazol, pirazol, pirazina, pirimidina y similares. El término "alcoxilo" cuando se utiliza en la presente se refiere a cadenas oxo-hidrocarburo de C _ Q inclusive, lineales, ramificadas o cíclicas, saturadas o insaturadas, que incluyen por ejemplo metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, butoxi, t-butoxi y pentoxi. El término "ariloxilo" cuando se utiliza en la presente se refiere a ariloxi como puede ser feniloxilo y ariloxilo sustituido con alquilo, halo o alcoxilo. Cuando se utiliza en la presente, los términos "alquilo sustituido" y "arilo sustituido" incluyen grupos alquilo y arilo, como se define en la presente, en los cuales uno o más átomos o grupos funcionales del grupo arilo o alquilo son sustituidos con otro átomo o grupo funcional, que incluye por ejemplo halógeno, arilo, alquilo, alcoxi, hidroxi, nitro, amino, alquilamino, dialquilamino, sulfato y mercapto. Los términos "halo", "haluro" o "halógeno" cuando se utilizan en la presente se refieren a grupos [sic] fluoro, cloro, bromo y yodo.

Los compuestos ilustrativos de los compuestos de la fórmula (la) incluyen los descritos en WO 99/09998; la referencia se incorpora en la presente como referencia. Los compuestos de la fórmula la, por ejemplo, incluyen: 5' -difosfato de uridina (UDP); 5' -0- (2-tiodifosfato) , de uridina (UDPßS) ; 5' -difosfato de 5-bromouridina (5-BrUDP) ; 5' -difosfato de 5- (1-feniletinil) -uridina) (5-(l-feniletinil) UDP) ; 5'-difosfato de 5-metiluridina (5-metilUDP) ; 5' -difosfato de 4-hexiltiouridina (4-hexiltioUDP) ; 5' -difosfato de 4-mercaptouridina (4-mercapto UDP) ; 5-difosfato de 4-metoxiuridina (4-metoxi UDP); 5' -difosfato de 4- (N-morfolino) uridina (4-N-morfolino) UDP; 5' -difosfato de 4-hexiloxiuridina (4-hexiloxi UDP); 5' -difosfato de N, N-dimetilcitidina (N,N-dimetil CDP); 5' -difosfato de N-hexilcitidina (N-hexil CDP); y 5' -difosfato de 5-ciclopentilcitidina (N-ciclopentil CDP) .

Los compuestos preferidos de la fórmula la incluyen UDP y UDPßS y 4-tio UDP. Si estos compuestos de la fórmula la (por ejemplo UDP, dUDP, UDPßS, y 4-mercapto UDP) son conocidos y pueden prepararse de acuerdo con los procedimientos conocidos o las variaciones de estos, los cuales serán evidentes para los expertos en la técnica. Por ejemplo, la identificación y preparación de ciertos análogos tiofosfato de los difosfatos de nucleósido (como puede ser el UTP-ß-S) se establece en la Patente US No. 3,846,402 (Eckstein y col.), y en R. S. Goody y F. Eckstein, J. Ara. Chem . Soc. 93: 6252-6257 (1971). De otro modo, el UDP, y otros análogos de estos, están a la disposición en el comercio de vendedores como Sigma (St. Louis, MO) y Pharmacia (Uppsala, Suecia) .

El UTP y sus análogos están representados por la fórmula general Ib; Fórmula Ib en donde Xl ^2 Y ^3 s on cada una independientemente 0 ó S" Y es H u OH; Rl, R2, R3 y R4 son como se define en la fórmula la.

Preferentemente, X2 y X3 son O , Ri es oxígeno o imido y R2 es H.

Los compuestos particularmente preferidos de la Fórmula Ib incluyen 5' -trifosfato de uridina (UTP) y 5'-0- (3-tiotrifosfato) de uridina (UTP?S) .

El ADP y sus análogos están representados por la fórmula lía: Fórmula lia en donde Ri, Xi, X2 y Y están definidos como en la fórmula la; Z es H, Cl ó SR, en donde R es alquilo (de C?~Co, saturado o insaturado) ; -3 y R4 son H mientras que R2 es nada y hay un doble enlace entre N-l y C-6 (adenina) , o R3 y R4 son H mientras que R2 es nada y Z es SR, o R3 y R son H mientras que R2 es O y hay un doble enlace entre N-l y C-6 (1-óxido de adenina) , o R3? R Y R2 tomados juntos son -CH=CH-, formando un anillo desde N-6 a N-l con un doble enlace entre N-6 y C-6 ( l, N6-etenoadenina) .

Los compuestos particularmente preferidos de la fórmula lia incluyen 5 ' -difosfato de adenosina (ADP) y 2-metil-SADP .

El ATP y sus análogos están representados por la fórmula general Ilb : Fórmula I Ib en donde : Ri, Xi, X2, X3 y Y están definidos como en la fórmula Ib, y R2, R3, R y Z están definidos como en la fórmula Ha .

Los compuestos preferidos de la fórmula Hb incluyen 5' -trifosfato de adenosina (ATP).

El CDP y sus análogos están representados por la fórmula general Illa: Fórmula Illa en donde : Rl, Xi, X2 y Y están definidos como en la fórmula la; R5 Y R6 son H mientras que R7 es nada y hay un doble enlace entre N-3 y C-4 (citosina) , o R5, Re y R7 tomados juntos son -CH=CH-, formando un anillo desde N-3 a N-4 con un enlace doble entre N-4 y C-4 (3,N -etenocitosina) , opcionalmente el hidrógeno de la posición 4 ó 5 del anillo eteno esta sustituido con alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido (heteroarilo, etcétera) , alcoxilo, nitro, halo o azido .

El CTP y sus análogos están representados por la fórmula general IHb : Fórmula IHb R5^ en donde : Ri/ l/ ^2 / X3 y ? están definidos como en la fórmula Ib, y R5 Rß Y R7 están definidos como en la fórmula Illa, Los compuestos preferidos de la fórmula IHb incluyen 5' -trifosfato de citidina (CTP) y 5' -trifosfato de 4-nitrofeniletenocitidina.

Para propósitos de simplicidad, las fórmulas I, II y III, en la presente ilustran los compuestos activos en la configuración D que se encuentran en la naturaleza, pero la presente invención también comprende los compuestos en la configuración L, y mezclas de compuestos en las configuraciones D y L, a menos que se especifique de otro modo. Se prefiere la configuración D que se encuentra en la naturaleza.

Los agonistas de P2Y también incluyen fosfatos de dinucleótido de la fórmula general (IV) .

Fórmula IV en donde: X es oxígeno, metileno, difluorometileno o imido; n = 0, 1 ó 2, m = 0, 1 ó 2; n + m = 0, 1, 2, 3 ó 4; Z = OH ó H; Z' = OH ó H; Y = H u OH; Y' = H u OH.

Las porciones azúcar están representadas en la configuración D, pero pueden ser L, o D y L. Se prefiere la configuración D. El residuo nucleósido puede estar en las configuraciones alfa- o beta- y D- o L-, pero más preferentemente la configuración beta-D.

B y B' son cada uno independientemente un residuo de purina o un residuo de pirimidina, como se define en la Fórmula V y VI, respectivamente, ligados a través de la posición 9 ó 1 respectivamente.

Fórmula V en donde : Rl es hidrógeno, cloro, amino, amino monosustituido, amino disustituido, alquiltio, ariltio o aralquiltio, en donde el sustituyente en el azufre contiene hasta un máximo de 20 átomos de carbono, con o sin instauración; R2 es hidroxi, amino, mercapto, alquiltio, ariltio, aralquiltio, aciltio, alquiloxi, ariloxi, aralquiloxi, aciloxi, alquilamino monosustituido, cicloalquilamino heterocíclico, monosustituido, aralquilamino monosustituido, arilamino monosustituido, diaralquilamino, diarilamino, dialquilamino (en donde los grupos alquilo están opcionalmente ligados a N para formar un anillo sustituto) , acilamino, diacilamino ó NHRY; Rx es O (derivados 1-óxido de adenina) , o está ausente (derivados de adenina) ; a condición de que cuando R2 es NHRY, R? y Rx pueden ser tomados juntos para formar un anillo imidazol fusionado de 5 miembros (derivados 1,N -etenoadenina) , opcionalmente sustituido en las posiciones 4 ó 5 de la porción eteno con alquilo, arilo o aralquilo como se define más adelante; R3 es hidrógeno, azido, alcoxi, ariloxi, aralquiloxi, alquiltio, ariltio o aralquiltio como se define más adelante; o ?-A (alquil de C?-C6) OCONH (alquil de C?-Cg)B-, en donde A y B son independientemente amino, mercapto, hidroxi o carboxilo, o los esteres, amidas o sales farmacéuticamente aceptables de estos; o está ausente.

Así pues, los derivados sustituidos de la adenina incluyen 1-óxido de adenina, 1,N -(eteno sustituido en 4 ó 5) adenina; adenina sustituida en la posición 6; o aminoadenina sustituida en la posición 8, donde R' de los grupos 6' ó 8-NHR' se eligen a partir de: grupos arilalquilo (de Ci-Cg) con la porción arilo opcionalmente funcionalizada como está descrito más adelante; alquilo; y grupos alquilo con grupos funcionales en estos, como pueden ser: ( [6-aminohexil] carbamoilmetil) -, y amino (hidroxi, tiol y carboxi) alquilo (de C1-C10) acilado en la posición ? y sus derivados amino (hidroxi, tiol y carboxi) acilados en la posición ?, donde el grupo acilo se elige de entre, pero no se limita a, acetilo, trifluoroacetilo, benzoilo, benzoilo sustituido, etc., o la porción carboxílica está presente como su éster o derivado amida, por ejemplo, el metil ó etil éster o su derivado metil, etil o benzamido. La porción ?-amino (hidroxi, tiol) puede estar alquilada con un grupo alquilo de C -C4.

J es carbono o nitrógeno, con la condición de que cuando J es nitrógeno, R3 no está presente; en donde los alquilos son de cadena lineal, ramificados o cíclicos; en donde los grupos arilo están sustituidos opcionalmente con alquilo inferior, amino, alquilamino, N02, N3, grupos carboxílicos, amido, sulfonamido o halo; Y B y B' también pueden ser una pirimidina con la fórmula general de la fórmula VI, ligada a través de la posición 1 al residuo ribosilo: Fórmula VI en donde : R4 es hidrógeno, hidroxi, oxo, mercapto, amino, ciano, arilalquiloxi de C7-C12, alquiltio de C?-C6, alcoxi de C -Cg, alquilamino de C -Cg ó dialquilamino de C?~C4, en donde los grupos alquilo están opcionalmente ligados para formar un heterociclo; R5 es hidrógeno, oxo, acetilo, benzoilo, alquilo de C?-C6, alcanoilo de C1-C5 o aroilo; Rß es hidroxi, oxo, mercapto, alcoxi de C1-C4, arilalcoxi de C -C2, alquiltio de Ci-Cg, amino, S-fenilo, amino disustituido de C1-C5 [sic] , triazolilo, alquilamino de Ci-Cg o dialquilamino de C1-C4, en donde los grupos dialquilo están opcionalmente ligados para formar un heterociclo o ligados a N para formar un anillo sustituido; ó R5 y Rg tomados juntos forman un anillo imidazol fusionado de 5 miembros entre las posiciones 3 y 4 del anillo pirimidina y forman un derivado 3,N -etenocitosina, en donde la porción eteno está opcionalmente sustituida en las posiciones 4 6 5 con alquilo de C1-C4, fenilo o feniloxi; en donde cuando menos un hidrógeno del alquilo de C1-C4, fenilo o feniloxi está opcionalmente sustituido con una porción seleccionada del grupo que consiste en: halógeno, hidroxi, alcoxi de C1-C4, alquilo de C1-C4, arilo de C6-C?o, arilalquilo de C7-C?2, carboxi, ciano, nitro, sulfonamido, sulfonato, fosfato, ácido sulfónico, amino, alquilamino de C1-C4 y di-alquilamino de C1-C4, en donde los grupos dialquilo están opcionalmente ligados para formar un heterociclo; R se selecciona del grupo que consiste en: hidrógeno, hidroxi, ciano, nitro y alquenilo de C2-C8; en donde la porción alquenilo está opcionalmente ligada por un oxígeno para formar un anillo, en donde cuando menos un hidrógeno de la porción alquenilo en el carbono adyacente al oxígeno esta opcionalmente sustituido con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en: alquilo de C?~Cg o fenilo; alquinilo de C -Cs sustituido, halógeno, alquilo de C1-C4 sustituido, CF3, alquenilo de C2-3, alquinilo de C2-3, alilamino, bromovinilo, propenoato de etilo o ácido propenóico; ó Rß Y R7 juntos forman un anillo de 5 ó 6 miembros saturado o insaturado unido por N ó 0 ó S en Rg, este anillo opcionalmente contiene sustituyentes que por sí mismos contienen funcionalidades; a condición de que cuando Rs es amino o amino sustituido, R es hidrógeno; y Rs se selecciona del grupo que consiste en: hidrógeno, amino o di-alquilamino de C1-C4, alcoxi de C1-C4, arilalcoxi de C7-C12, alquiltio de C -C4, arilalquiltio de C7-C12, carboxamidometilo, carboximetilo, metoxi, metiltio, fenoxi y feniltio.

En la estructura general de las Fórmulas I-III anteriores, las líneas punteadas en las posiciones 2 a 6 se proponen para indicar la presencia de enlaces sencillos o dobles en estas posiciones; las posiciones relativas de los enlaces dobles o sencillos siendo determinadas si los sustituyentes R4, R5 y Rg son capaces de tautomerismo ceto-enol.

En las estructuras generales de la fórmula I-III anteriores, los grupos acilo comprenden grupos alcanoilo o aroilo. Los grupos alquilo contienen de 1 a 8 átomos de carbono, particularmente 1 a 4 átomos de carbono opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes adecuados, como se describe más adelante. Los grupos arilo que incluyen las porciones arilo de estos grupos como ariloxi preferentemente son grupos fenilo opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes adecuados, como se describen más adelante. Los grupos alquenilo y alquinilo antes mencionados contienen de 2 a 8 átomos de carbono, particularmente 2 a 6 átomos de carbono, por ejemplo etenilo o etinilo, opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes adecuados co o se describe más adelante.

Los sustituyentes adecuados en los grupos alquilo, alquenilo, alquinilo y arilo antes mencionados se seleccionan de halógeno, hidroxi, alcoxi de C1-C4, alquilo de C -C4, arilo de Cg-C2, arilalcoxi de Cg-C?2, carboxi, ciano, nitro, sulfonamido, sulfonato, fosfato, sulfónico, amino y amino sustituido, en donde el amino está sustituido en forma individual o doble por un alquilo de C1-C4, y cuando está doblemente sustituido, los grupos alquilo opcionalmente están ligados para formar un heterociclo.

La invención además proporciona las composiciones farmacéuticas novedosas que comprenden los compuestos de la fórmula general IV, cuya característica reciente es: (1) un dinucleótido novedoso con una porción de azúcar seleccionada del grupo que consiste en: arabinofuranosilo, 3' -deoxiribofuranosilo, xilofuranosilo y lixofuranosilo; (2) un dinucleótido novedoso con una base azapurina; y (3) un dinucleótido novedoso con una purina sustituida en la posición 6. En el primer tipo de la composición novedosa, cuando la porción azúcar es 3'-deoxiribofuranosilo, Z y Z' son H. En el segundo tipo de composición novedosa con una base azapurina, J es nitrógeno y R3 está ausente. En el tercer tipo de composición novedosa con la purina sustituida en la posición 6, se excluye la base amino purina monosustituida en la posición 6.

Los compuestos polifosfato de dinucleótido preferidos útiles en esta invención son P , P -di (uridina-5' ) -tetrafosfato, dUP4U, U2P3, 2P5, dCP4U, CP4U, IP5I, AP4A, CP3U, UP3A y A2P3- Algunos compuestos de la fórmula I, II y III pueden prepararse por los métodos conocidos por los expertos en la técnica. Algunos compuestos están a la disposición en el comercio, por ejemplo de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO 63178). Los compuestos de las fórmulas la (UDP y sus análogos) pueden prepararse de acuerdo con WO 99/09998. Los compuestos de las fórmulas Ib, Hb y IHb (UTP, ATP, CTP y sus análogos) pueden prepararse de acuerdo con la patente US 5,763,447. Los compuestos de las fórmulas IV pueden prepararse de acuerdo con los procedimientos conocidos descritos por Zamecnik y col., Proc. Na ti . Acad. Sci . EU 89, 838-42 (1981); y Ng y Orgel, Nucleic Acids Res . 15: 3572-80 (1987), Pendergast y col., USPN 5,837,861 o variaciones de estos.

Los compuestos de la presente invención también comprenden sus sales no tóxicas aceptables para uso farmacéutico como pueden ser, pero no se limitan a, una sal de metal alcalino como de sodio o potasio; una sal de metal alcalinotérreo como de manganeso, magnesio o calcio; o una sal de amonio o tetraalquilamonio, es decir, NX4 (en donde X es C?_4) . Las sales aceptables para uso farmacéutico son sales que conservan la actividad biológica deseada del compuesto precursor y no imparten efectos toxicológicos no deseados. La presente invención también comprende los profármacos acilados de los compuestos en la presente descritos. Los expertos en la técnica . reconocerán que es posible emplear metodologías de síntesis para preparar las sales aceptables para uso farmacéutico, no tóxicas y los profármacos acilados de los compuestos.

La utilidad farmacéutica de los compuestos agonistas P2Y de esta invención está indicada por el ensayo de fosfato de inositol para la actividad de P2Y. Este ensayo utilizado ampliamente, como se describe en E. Lazarowski y col., Bri t . J. Pharm . 116, 1619-27 (1995), depende de la medición de la formación de fosfato de inositol como una medida de la actividad de los compuestos que activan los receptores ligados por las proteínas G a la fosfolipasa C.

Además, la utilidad farmacéutica de los compuestos agonistas de P2Y de esta invención está indicada por el ensayo de movilización de calcio intracelular para la actividad de P2Y. En este ensayo, se estimulan células cultivadas con concentraciones crecientes de agonistas del receptor P2Y. Los niveles de calcio intracelular se verifican midiendo los cambios en la intensidad de la fluorescencia de un colorante sensible al calcio utilizando FLIPR (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA) o un instrumento equivalente.

Los compuestos agonistas de P2Y aumentan la producción de moco en preparaciones in vi tro de epitelio esofágico, de la mucosa gástrica, yeyuno, colon proximal y distal. La secreción de moco puede evaluarse por una variedad de técnicas que incluyen la citología de impresión, ensayo inmunoabsorbente de enzimas ligadas (ELISA) , y ensayos inmunoabsorbentes utilizando anticuerpos específicos de mucina. (Véase Danjo y col., Ophthalmol . Vis . Sci . , 39: 2602-2609 (1988); Jumblatt y col., Invest . Ophthalm?l . Vis . Sci . 40: 43-49 (1999); y Jumblatt y col., Invest . Ophthalmol . Vis . Sci . 39: 5803 (1988)). Nuestros resultados muestran aumentos robustos, prolongados e importantes en la producción de moco con los agonistas de los receptores P2Y después de administración a la superficie luminal de las preparaciones epiteliales. La producción de mucina puede aumentar repetidamente por estimulación repetida con los agonistas .

Los agonistas de P2Y alteran significativamente las corrientes de corto circuito (Isc) en preparaciones epiteliales del tracto gastrointestinal, incluido el esófago, yeyuno y colon proximal y distal. Los cambios en la Isc son consistentes con los aumentos en el flujo de cloruro transluminal o el flujo de potasio transeroso, y de este modo se espera que movilicen la absorción o secreción de fluidos a través del epitelio en consecuencia.

La eficacia de los agonistas de P2Y para aminorar los síntomas asociados con enfermedad gastrointestinal puede mostrarse en un modelo animal. Por ejemplo, la infección por Helicobacter pylori por administración de ácido acético a la mucosa antral de monos cynomolgus es un modelo para gastritis crónica; el modelo muestra fenotipo histológico y clínico semejante al de las úlceras gástricas humanas. La administración oral de los agonistas de los receptores P2Y a monos con gastritis muestra recuperación importante de la tinción de sustancias positivas al ácido-Schiff periódicas y aumenta la inmuno-reactividad antimucina, lo cual refleja un aumento en la secreción de mucina. Los incidentes histológicos reducidos de ulceraciones gástricas también son un indicio de la eficacia de los agonistas de los receptores P2Y.

Los compuestos deseados de la presente invención pueden administrarse por vía oral, sistémica, intraoperatoria o rectal, en formulaciones unitarias para dosificación conteniendo los portadores, adyuvantes y vehículos aceptables para uso farmacéutico, no tóxicos, habituales. El término sistémico cuando se utiliza en la presente incluye inyecciones subcutáneas, intravenosas, intramuscular, intraesternal o técnicas de infusión.

La formulación farmacéutica de esta invención comprende un compuesto ligando y un portador aceptable para uso farmacéutico. Uno o más compuestos ligandos pueden estar presentes junto con uno o más portadores o diluyentes o adyuvantes aceptables para uso farmacéutico, no tóxicos y, si se desea, otros ingredientes activos. Un portador así sería azúcar, donde los compuestos pueden estar íntimamente incorporados en la matriz por glasificación o simplemente en mezcla con el portador (por ejemplo lactosa, sacarosa, trealosa, manitol) u otros excipientes aceptables para suministro oral o sistémico.

Para el uso oral, la composición farmacéutica es una forma conveniente como tabletas, grageas, suspensiones acuosas u oleosas, geles viscosos, gomas masticables, polvos o granulos dispersables, emulsión, cápsulas duras o blandas, jarabes o elíxires. Las composiciones propuestas para uso oral se preparan de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas. Estas composiciones pueden contener uno o más agentes seleccionados del grupo que consiste en agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes y agentes preservadores para proporcionar preparaciones elegantes y agradables desde el punto de vista farmacéutico. Las tabletas por lo regular contienen el ingrediente activo en mezcla con excipientes aceptables para uso farmacéutico, no tóxicos, convenientes para la fabricación de tabletas. Estos excipientes incluyen, por ejemplo, diluyentes inertes como carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de sodio; agentes granuladores y desintegradores, por ejemplo almidón de maíz o ácido algínico; agentes aglutinantes, por ejemplo almidón, gelatina o acacia; y agentes lubricantes, por ejemplo estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Las tabletas pueden ser no cubiertas o pueden ser cubiertas por las técnicas conocidas para proporcionar una acción sostenida durante un periodo prolongado. Por ejemplo, es posible emplear un material de retardo como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo.

Para uso oral se preparan cápsulas de gelatina dura mezclando el ingrediente activo con un diluyente sólido inerte, por ejemplo carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín. Las cápsulas de gelatina blanda se preparan mezclando el ingrediente activo con agua o un medio oleoso, por ejemplo aceite de cacahuate, parafina líquida o aceite de oliva.

Para uso oral se preparan gomas masticables incrustando el ingrediente activo en gomas; el ingrediente activo se libera lentamente al ser masticado. Esta forma es conveniente para tratar úlceras de la boca.

Para uso oral, se prepara una suspensión acuosa adicionando agua a los polvos y granulos dispersables con un agente dispersante o humectante, agente suspensor y uno o más preservadores. Los agentes suspensores incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa y alginato de sodio. Los agentes dispersantes o humectantes incluyen los fosfátidos naturales, productos de condensación de un óxido de alileno con ácidos grasos, productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, productos de la condensación de óxido de etileno con esteres parciales de ácidos grasos y un hexitol, y los productos de condensación de óxido de etileno con esteres parciales provenientes de ácidos grasos y anhídridos de hexitol. Los preservadores incluyen, por ejemplo, p-hidroxibenzoato de etilo y de n-propilo. Una suspensión acuosa puede también contener uno o más agentes colorantes, uno o más agentes saborizantes y uno o más agentes edulcorantes, como sacarosa o sacarina. Los expertos en la técnica reconocerán que los múltiples excipientes específicos y agentes edulcorantes están comprendidos por la descripción general anterior.

Para administración sistémica, la formulación farmacéutica se prepara en un medio estéril. El ingrediente activo, dependiendo del vehículo y concentración utilizada, puede estar suspendido o disuelto en el vehículo. Los adyuvantes como anestésicos locales, preservadores y agentes amortiguadores también pueden estar disueltos en el vehículo. La preparación inyectable estéril puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o solvente aceptable, no tóxico. Entre los vehículos y solventes aceptables que pueden emplearse están el agua estéril, solución salina o solución de Ringer.

La aplicación farmacéutica también puede ser administrada en la forma de supositorios para administración rectal. Estas composiciones pueden prepararse mezclando el ingrediente activo con un excipiente no irritante conveniente que sea sólido a las temperaturas comunes pero líquido a la temperatura rectal y por tanto se fundirá en el recto para liberar el compuesto. Estos excipientes incluyen manteca de cacao y polietilen glicoles.

Los niveles de dosificación del orden desde cerca de 10-2000 mg de los ingredientes activos son útiles en el tratamiento de los estados antes indicados. Las dosis preferidas son cerca de 50-1000 mg, y las dosis más preferidas son cerca de 75-850 mg de los ingredientes activos. Estas dosis pueden darse varias veces al día según sea necesario. La cantidad del ingrediente activo que puede estar combinada con los materiales portadores para producir una forma de dosificación unitaria variará dependiendo del hospedero tratado y el modo de administración específico. Sin embargo, se entenderá que el nivel de dosis específico para algún paciente particular dependerá de diversos factores que incluyen la actividad del compuesto específico que se emplee, la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, tiempo de administración, vía de administración y velocidad de excreción, la combinación de medicamentos y la gravedad de la enfermedad particular de que se trate.

La invención se ilustrará más mediante los siguientes ejemplos que no se consideran como limitantes de la invención en su alcance o espíritu a los procedimientos específicos descritos en la presente.

EJEMPLOS Ejemplo 1. Identificación del receptor P2Y en tejidos humanos La presencia de los receptores purinérgicos P2Y?, P2Y2, P2Y , P2Yg y P2Yn en tejidos gastrointestinales se determinó in vitro utilizando técnicas de la RP-PCR de RNA humano adquirido de fuentes comerciales. El poli A mRNA de estómago normal humano fue adquirido de Clontech (Palo Alto, CA) . La primera hebra de cDNA fue sintetizada (kit PCR para Advantage RT; Clontech, Palo Alto, CA) de 100 ng de poliA mRNA de estómago utilizando un cebador oligo (dT) 18 y la transcriptasa inversa MMLV (60 min, 42 °C) . Las reacciones control en ausencia de transcriptasa inversa también se realizaron. El cDNA de esófago, recto, duodeno y glándula salival normales humanas fueron adquiridos de Invitrogen (Carlsbad, CA) . Las primeras hebras de cDNA de colon, hígado e intestino delgado humano normal fueron de paneles de cDNA de tejido múltiple de Clontech. Se realizó la RT-PCR con tejidos de estómago y se realizó la PCR con otros tejidos.

Los cebadores específicos de las secuencias para los genes P2YX, P2Y2, P2Y4, P2Y6 y P2Yn se enlistan como sigue: P2Y? (No. de acceso U42029) de avance 5' CGATCTGTATCAGCGTGCTGGTGTG 3' inversa 5' TCTAGAAGCTTTCCTTGTGGCTCGG 3' P2Y2 (No. de acceso S74902) de avance 5' AGGAGATGTGTTGGGCAGCAGTGAGGAC 3' inversa 5' ACCAGGGTTTTCTGGCCAACCTGTGACT 3' P2Y4 (No. de acceso X91852) de avance 5' ATGCAACGGCCACCTACATGTTCC 3' inversa 5' GTACTCGGCAGTCAGCTTCCAACA 3' P2Y6 (No. de acceso U52464) de avance 5' ATGGCATGGCTCTCACTGTCATCG 3' inversa 5' TTGGTGAGCTTCTGGGTCCTGTGAG 3' P2Yn (No. de acceso AF030335) de avance 5' ATACTGGTGGTTGAGTTCCTGG 3' inversa 5' ACCAGGCTATACGCTCTGTAGG 3' .

Se realizó la PCR en 3 µL de cDNA de todos los tejidos antes mencionados utilizando la serie de cebadores de avance e inversos (1 µL de cada cebador) designada para amplificar cada cDNA parcial de P2Y (P2Y?, P2Y2, P2Y4, P2Y6, P2Yn) . La reacción también contenía 400 mM de cada trifosfato de deoxi nucleótido, MgCl2 3.5 mM y 1 µL de mezcla de cDNA polimerasa Advantage (Clontech, Palo Alto, CA) . Las condiciones de reacción fueron: inicial 2.5 min a 94°C y luego 30 seg a 94°C, 30 segundos a 60°C (P2Y4, P2Yn) ó 65°C (P2YX, P2Y2, P2Y6) , un minuto a 72°C durante 35 ciclos y por último 10 minutos a 72°C. Algunos de los productos de la PCR fueron clonados en el vector pCR 2.1-TOPO (kit TOPO TA Cloning; Invitrogen, Carlsbad, CA) y secuenciado completamente utilizando un secuenciador de DNA automatizado.

Todos los tejidos probados fueron positivos para los receptores P2Y. Los resultados se resumen en la Tabla 2.

Tabla 2 Identificación del receptor P2Y en tejidos humanos Ejemplo 2. Localización celular de la expresión génica de los receptores de nucleótidos P2Y en tejidos epiteliales gastrointestinales de mono por hibridación no isotópica in situ Tejidos. Los tejidos para el estudio fueron obtenidos de la Pathology Associates International, Frederick, MD. Los tejidos incluidos en este estudio fueron estómago, esófago, intestino delgado (yeyuno) e intestino grueso (colon). Los tejidos fueron tomados de un macaco rhesus de la India de 3.25 años de edad inmediatamente después de eutanasia y congelamiento instantáneo en medio de incrustación O.C.T. Los tejidos congelados fueron almacenados a -80 °C antes de la criosección. Se cortaron los tejidos en secciones de 5 µm y se montaron en portaobtejos de microscopio para tinción con hematoxilina y toxina (H&E) y para hibridación in sítu (ISH) .

Evaluación de las secciones de tejido. Las secciones de tejido teñidas con H&E fueron preparadas para evaluar la calidad y orientación de los tejidos en estudio. El examen de los portaobjetos H&E indicó que todos los tejidos eran convenientes para ISH.

Síntesis de la ribosonda. Un producto de la PCR conteniendo 253-651 nucleótidos de un cDNA para un P2Y2-humano se obtuvo de un patrocinador. Los 272-627 nucleótidos para el P2Y2-R fueron reamplificados con los cebadores de P2Y2 (secuencia cebadora de avance: 5' AGGAGATGTGTTGGGCAGCAGTGAGGAC 3' secuencia cebadora inversa: inversa 5' ACCAGGGTTTTCTGGCCAACCTGTGACT 3') diseñados para incorporar un promotor T3 corriente arriba o un promotor T7 corriente abajo. Los productos de la PCR resultantes fueron utilizados para sintetizar ribosondas marcadas con digoxigenina mediante transcripción in vitro (IVT) . Las ribosondas antisentido y sentido fueron sintetizadas utilizando RNA polimerasas T7 y T3, respectivamente, en presencia de digoxigenina-11-UTP (Roche Molecular) utilizando un kit MEGAscript IVT (Ambion) de acuerdo con el fabricante. Después de la IVT, el DNA plantilla fue degradado con DNasa-1, y la digoxigenina no incorporada fue eliminada por ultrafíltración. Se evaluó la integridad de la ribosonda por electroforesis a través de un gel de poliacrilamida desnaturalizante. Se estimó el tamaño molecular aparente por comparación con la movilidad electroforética de un RNA escalera de 100-1000 pares de bases (Ambion) . El rendimiento y etiquetado de la sonda fue evaluado por inmunoquímica de absorción. Las ribosondas fueron dosificadas en alícuotas de 5 µL y almacenadas a -80 °C hasta su uso para ISH.

Hibridación in situ. Se cortaron los tejidos congelados en secciones de 5 µm, se montaron en portaobjetos SuperFrost Plus (Fisher Scientific) , y se fijaron posteriormente durante 15 minutos en paraformaldehído al 4% en PBS a pH 7.4. Las secciones de tejido entonces fueron tratadas durante 30 minutos con dietilpirocarbonato activo al 0.1% en PBS a pH 7.5. Las secciones fueron prehibridadas en ausencia de sonda, luego se incubaron durante la noche en el buffer de hibridación conteniendo 400 ng/mL de sonda antisentido o sentido. Después de la hibridación, los portaobjetos fueron sometidos a una serie de lavados rigurosos posteriores a la hibridación para reducir la tinción no específica. Se observó la hibridación por inmunohistoquímica utilizando Fab anti-digoxigenina conjugado con fosfatasa alcalina y cloruro de tetrazolio nitroazul-fosfato de bromocloroindolilo (Roche Molecular) de acuerdo con el fabricante. Las secciones de tejido fueron contrateñidas con rojo rápido nuclear. Los controles negativos incluyeron estómago y esófago teñidos con la sonda P2Y2-R sentido.

Resultados. Los resultados de los experimentos de hibridación in situ se muestran para la sonda sentido (control negativo) y la sonda antisentido para el estómago (Figura 1), esófago (Figura 2), colon (Figura 3) y yeyuno (Figura 4). Todos los tejidos muestran tinción positiva en el epitelio mucoso, indicio de expresión génica de los receptores P2Y , con la sonda antisentido (Figuras Ib, 2b, 3b y 4b) , mientras que no se observó tinción con la sonda sentido control (Figuras la, 2a, 3a y 4a) . Más específicamente, la expresión génica de P2Y2 se observó en el epitelio de la cavidad gástrica en el cuello y base de la glándula gástrica en el estómago; en el epitelio escamoso estratificado del esófago; en entericitos absorbentes y en las células calciformes secretoras de moco del epitelio velloso y el epitelio de la cripta secretora del yeyuno; y en las células absorbentes de la columna, las células calciformes secretoras de moco y las células de la cripta enteroendócrina secretora del colon. La demostración de la expresión génica de los receptores P2Y2 en el epitelio gastrointestinal, incluidos los tipos de células secretoras y absorbentes, da soporte a una función para los receptores P2Y2 en la fisiología de la mucosa gastrointestinal, y como un objetivo para el tratamiento de enfermedades gastrointestinales en las cuales son terapéuticas la mejor secreción de moco y/o mejor secreción de fluidos.

Ejemplo 3: Medición de la movilización del calcio intracelular en las células epiteliales cultivadas del tracto gastrointestinal Se utiliza una técnica común para detectar la movilización de calcio intracelular inducida por los agonistas de los receptores P2Y. La técnica es familiar para los conocedores en la técnica. Las células se siembran en placas de 96 pozos y se utilizan para ensayos de movilización de calcio. Durante el día del ensayo, se aspira el medio de crecimiento y se sustituye con una solución de Fluo-3 AM (concentración final 2.5 µM) en una solución amortiguadora para el ensayo consistente en (mM) : KCl (10.0), NaCl (118), CaCl2 (2.5), MgCl2 (1.0), HEPES (20), glucosa (10), pH 7.4. Se adiciona Probenecid (Sigma Chemical Co.) a la carga de colorantes y medio de lavado del colorante en una concentración de trabajo de 2.5 mM para aumentar la retención del colorante en las células. Después de un periodo de incubación de 60 minutos con Fluo-3 AM a 25 °C, las células se lavan para eliminar el colorante (Columbus Píate Washer, TECAN US, Inc., Research Triangle Park, N. C.) y se estimulan con concentraciones crecientes de los agonistas de los receptores P2Y. Se supervisan al mismo tiempo las concentraciones de calcio intracelular en cada pozo midiendo los cambios en la intensidad de la fluorescencia utilizando el FLIPR (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA) .

Las células T84, una línea de células epiteliales colónicas humanas, fueron sometidas a un ensayo de movilización de calcio como el antes descrito. Los resultados muestran que los agonistas de los receptores P2Y ATP y UTP estimulan la movilización de calcio en estas células, consistentes con la activación de los receptores P2Y2 (Figura 5) . Un agonista selectivo de los receptores P Y?, 2-metiltio ADP, no estimuló la movilización de calcio, indicando la falta de receptores P2Y? en estas células. Del mismo modo, las células HT-29 colónicas humanas presentan una respuesta P2Y robusta al ATP y UTP, consistente con la activación de los receptores P2Y2 (Figura 6) . La activación de la movilización de calcio intracelular por el ATP y UTP en células T84 y HT29 indica la utilidad farmacéutica de los agonistas de los receptores P2Y en el tracto gastrointestinal. [UTP-stimula ted calcium mobilization has been reported in HT-29 cells : Otero y col . Mol Cell Biocehm 2000 Feb; 205 (1 -2) : 115-23] , Ejemplo 4: Medición de la producción de modo epitelial y gastrointestinal, secreción de bicarbonato y corriente de corto circuito en cultivos epiteliales y explantes Se utilizan las técnicas habituales para investigar las respuestas eléctricas epiteliales mediadas por los agonistas de los purinoceptores P2Y2 y P2Y4. Las técnicas son comunes para los expertos en la técnica. Explantes nativos y células epiteliales mucosas cultivadas de esófago, estómago, yeyuno y epitelio de colon se aislan o crecen como monocapas, donde la integridad de los complejos de unión que separan las membranas apical (mucosa) y basolateral (serosas) permanecen intactos. Los tejidos epiteliales o monocapas se montan en una cámara Ussing modificada que permite mantenimiento de la polaridad epitelial y proporciona la capacidad para prefundir por separado solución de Ringer a las superficies apical y basolateral. Las corrientes de corto circuito y las resistencias transepiteliales totales se miden continuamente utilizando técnicas electrofisiológicas habituales. Se mide la secreción de bicarbonato supervisando el pH utilizando un sistema pH-stat. Los cambios en estos parámetros que son consistentes con la secreción de iones cloruro, la secreción de bicarbonato o la alteración del flujo a través de la membrana de otros iones indica que los agonistas de los receptores P2Y modifican la secreción, absorción y/o hidratación mucosa en el tracto gastrointestinal .

La producción de moco por las células calciformes que residen en las glándulas epiteliales se evalúa mediante una variedad de técnicas conocidas para los expertos. Explante nativo y monocapas cultivadas de epitelio esofágico y de la mucosa gástrica se evalúan para la producción de mucinas mediante la citología de impresión, la cual consiste en exponer el área superficial fijada del epitelio con una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) y teñir la membrana de PVDF con un reactivo ácido peryódico y de Schiff (PAS) . La cantidad de tinción positiva para el PAS es inversamente proporcional a la secreción de mucina. En el epitelio esofágico y de la mucosa gástrica, los agonistas de los purinoceptsres P2Y2 y P2Y4 se muestran con disminución de la tinción PAS, lo cual es consistente con un aumento en la secreción de moco. Los aumentos inducidos por el purinoceptor P2Y en la secreción de moco se verifican por el ensayo de inmunoabsorción de enzimas ligadas (ELISA) e inmunoabsorciones utilizando anticuerpos específicos de mucinas. Los resultados positivos indican aumentos robustos, prolongados e importantes en la producción de moco cuando los agonistas de los purinoceptores se administran a la superficie luminar de la preparación epitelial. La producción de mucinas puede aumentarse repetidas veces por estimulación repetida con los agonistas de los purinoceptores.

Ejemplo 5: Agonistas de los purinoceptores para aminorar los síntomas asociados con colitis ulcerativa La infección de Helicobacter pylori por administración de ácido acético a la mucosa antral de los monos cynomolgus es un modelo para gastritis crónica y muestra el fenotipo histológico y clínico similar a los de úlceras gástricas humanas. La administración oral de los agonistas de los receptores P2Y a monos con gastritis muestra recuperación importante de la tinción de las sustancias positivas al ácido peryódico-Schiff y aumentos en la inmuno-reactividad anti-mucina, los cuales manifiestan un aumento en la secreción de mucinas. Los incidentes histológicos reducidos de las ulceraciones gástricas también es un indicio de la eficacia de los agonistas de los receptores P2Y.

Un individuo humano, padeciendo colitis ulcerativa o gastritis crónica, se trata por un método de la presente invención. Se proporciona al paciente una endoscopia, seguido por una biopsia de la mucosa gástrica. Se diagnostica colitis ulcerativa después de confirmación de inflamación mucosa y erosión de la capa mucosa gástrica. La presente invención trata al paciente mediante una administración oral de una formulación conveniente del agonista del receptor P2Y que cubre la capa esofágica y de la mucosa gástrica y estimula la producción de moco bajo la mucosa gástrica. La composición se administra como una forma oral de liberación lenta, preferentemente en la forma de una goma masticable o gragea, y se administra muchas veces durante el día según sea necesario. La actividad de la enfermedad se monitorea con base en el índice de la Actividad Clínica, índice Endoscópico, índice Histológico y Evaluaciones de la Eficacia Global por parte del investigador clínico. Los mejoramientos en uno o más de estos parámetros indican que los agonistas de P2Y aminoran los síntomas de la colitis ulcerativa.

Ejemplo 6: Agonistas de los purinoceptores para modificar la absorción de fluidos por el intestino delgado y el colon distal y para aminorar los síntomas asociados con diarrea o estreñimiento Un individuo humano, presentando estreñimiento o diarrea, es tratado por los métodos de la presente invención como sigue. Al paciente que presenta síntomas de diarrea o estreñimiento se le da una formulación oral del compuesto, el compuesto formulado co o tableta que puede descargar el compuesto activo en una cantidad terapéutica y específica en el intestino delgado (para estreñimiento) o el intestino grueso (para diarrea) . El compuesto activo es antagonista específico de los receptores P2Y en el tejido respectivo y favorece la secreción de fluidos en el intestino delgado y la absorción de fluidos en el intestino grueso. La producción de heces a las 48 horas, medida en gramos, y la duración de la diarrea o el estreñimiento, se evalúan mediante un cuestionario para el paciente y/o observación clínica, se determinan después de tratamiento. Los resultados positivos indican que los agonistas de P2Y son eficaces en el tratamiento de diarrea y/o estreñimiento.

La invención, y la manera y proceso para preparar y utilizarla, ahora se describen en términos tan completos, claros, concisos y exactos para permitir que cualquier persona experta en la técnica a la que pertenece haga uso de la misma.

Se entenderá que lo anterior describe las modalidades preferidas de la presente invención y que es posible hacer modificaciones en esta sin apartarse del espíritu o alcance de la presente invención como se establece en las cláusulas. Para indicar particularmente y reclamar de manera distinta el tema considerado como invención, las siguientes cláusulas concluyen esta especificación .

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para regular secreciones de moco o mucinas, secreción de bicarbonato o transporte de fluidos en el aparato gastrointestinal de un mamífero, el método comprende : la administración al mamífero de una composición farmacéutica que contenga un ligando de los receptores P2Y purinérgicos, en una cantidad eficaz para regular las secreciones de moco o mucina, la secreción de bicarbonato o el transporte de líquidos en el aparato gastrointestinal .

2. Un método para tratar enfermedades o trastornos gastrointestinales en los cuales la barrera mucosa o la secreción de bicarbonato del aparato gastrointestinal es anormal, o en las cuales el transporte de fluidos a través del tracto luminal es anormal, el método comprende : la administración a un paciente de una composición farmacéutica que contiene un compuesto agonista de los receptores P2Y purinérgicos, en una cantidad eficaz para regular las secreciones de moco o mucinas o corregir el transporte anormal de fluidos en el aparato gastrointestinal.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde el receptor P2Y se selecciona del grupo que consiste en: P2YX, P2Y2, P2Y4, P2Y6 y P2Yn.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el agonista de los receptores purinérgicos es un difosfato de nucleótido seleccionado del grupo consistente en compuestos de la Fórmula la, Ha y Illa: Fórmula la en donde: Xi y X2 son cada una independientemente O ó S ; Y es H u OH; Rl se selecciona del grupo que consiste en O, imido, metileno y dihalometileno (por ejemplo, diclorometileno, difluorometileno) ; R2 se selecciona del grupo que consiste en H, halo, alquilo, alquilo sustituido, alcoxilo, nitro y azido; R3 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo, acilo (incluido arilacilo) , y arilalquilo; y R4 se selecciona del grupo que consiste en -OR' , -SR' , -NR' y NR'R", en donde R' y R" se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, alcoxilo y ariloxilo, y con la condición de que R' este ausente cuando R4 tiene un enlace doble de un átomo de azufre o azufre al carbono en la posición 4 del anillo pirimidina; Fórmula Ha en donde Rl, Xi, X2 y Y están definidos como en la fórmula la; Z es H, Cl ó SR, en donde R es alquilo de C1-C20 saturado o insaturado; R3 y R son H mientras que R2 es nada y hay un doble enlace entre N-l y C-6, o R3 y R son H mientras que R2 es 0 y hay un doble enlace entre N-l y C-6, o 3 Y R2 tomados juntos son -CH=CH-, formando un anillo desde N-6 a N-l con un doble enlace entre N-6 y C-6; Fórmula Illa en donde: Ri, Xi, X2 y Y están definidos como en la fórmula la; R5 y R6 son H mientras que R7 es nada y hay un doble enlace entre N-3 y C-4, o R5, Rg y R7 tomados juntos son -CH=CH-, formando un anillo desde N-3 a N-4 con un enlace doble entre N-4 y C-4 (3,N -etenocitosina) , opcionalmente el hidrógeno de la posición 4 ó 5 del anillo eteno esta sustituido con alquilo, alquilo sustituido, alcoxilo, nitro, halo y azido.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el difosfato de nucleótido se selecciona del grupo consistente en: difosfato de 5' -uridina, difosfato de 5'-adenosina y difosfato de 5'-citidina.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el agonista de los receptores purinérgicos es un trifosfato de nucleótido seleccionado del grupo que consiste en: compuestos de la fórmula Ib, Hb y IHb: Fórmula Ib en donde Xl/ 2 Y 3 son cada una independientemente 0 ó S ; Y es H u OH; Ri es O, imido, metileno o dihalometileno; R2 es H ó Br; R3 se selecciona del grupo que consiste en nada, H, alquilo, acilo y arilalquilo; y R4 se selecciona del grupo que consiste en -OR' , -SR' , NR' y NR'R'', en donde R' y R" se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, alcoxilo y ariloxilo, y con la condición de que R' esté ausente cuando R tenga un doble enlace desde un átomo de oxígeno o de azufre al carbono en la posición 4 del anillo pirimidina; Fórmula Hb en donde : Rl/ i X2 X3 y Y están definidos como en la fórmula Ib, Z es H, Cl ó Sr, en donde R es alquilo de C1-C20 saturado o insaturado; R3 y R son H, mientras que R2 es O y hay un doble enlace entre N-l y C-6; ó R3, R4 y R2 tomados juntos son -CH=CH-, formando un anillo desde N-6 a N-l con un doble enlace entre N-6 y C-6; Fórmula IHb en donde : Rl, Xi, X2, X3 y Y están definidos como en la fórmula Ib, y R5 y Rg son H, mientras que R7 es nada y hay un doble enlace entre N-3 y C-4; ó R5, Rg y R7 tomados juntos son -CH=CH-, formando un anillo desde N-3 a N-4 con un doble enlace entre N-4 y C-4, opcionalmente el hidrógeno de la posición 4 ó 5 del anillo eteno está sustituido con alquilo, alquilo sustituido, alcoxilo, nitro, halo y azida.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el trifosfato de nucleótido se selecciona del grupo consistente en: trifosfato de 5' -uridina, trisfosfato de 5' -adenina y trifosfato de 5'-citidina.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el agonista del receptor purinérgico es un polifosfato de dinucleótido seleccionado del grupo consistente en: compuestos de la fórmula IV: Fórmula IV en donde : X es oxígeno, metileno, difluorometileno o imido; n = 0, 1 ó 2, m = 0, 1 ó 2; n + m = 0, 1, 2, 3 ó 4; Z = OH ó H; Z' = OH ó H; Y = H u OH; Y' = H u OH las porciones azúcar están representadas en la configuración D, pero pueden ser L, o D y L y se prefiere la configuración D; el residuo nucleósido puede estar en las configuraciones alfa- o beta- y D- o L-, y se prefiere más la configuración beta-D; B y B' son cada uno independientemente un residuo de purina o un residuo de pirimidina, como se define en la Fórmula V y VI, respectivamente, ligados a través de la posición 9 ó 1 respectivamente. Fórmula V en donde : Rl es hidrógeno, cloro, amino, amino monosustituido, amino disustituido, alquiltio, ariltio o aralquiltio, en donde el sustituyente en el azufre contiene hasta un máximo de 20 átomos de carbono, con o sin instauración; R2 es hidroxi, amino, mercapto, alquiltio, ariltio, aralquiltio, aciltio, alquiloxi, ariloxi, aralquiloxi, aciloxi, alquilamino monosustituido, cicloalquilamino heterocíclico, monosustituido, aralquilamino monosustituido, arilamino monosustituido, diaralquilamino, diarilamino, dialquilamino (en donde los grupos alquilo están opcionalmente ligados a N7 para formar un anillo sustituto) , acilamino, diacilamino ó NHRY; R es O como en los derivados 1-óxido de adenina, o está ausente como en los derivados de adenina; a condición de que cuando R2 es NHRY, R? y Rx pueden ser tomados juntos para formar un anillo imidazol fusionado de 5 miembros como en los derivados 1,N -etenoadenina, opcionalmente sustituido en las posiciones 4 ó 5 de la porción eteno con alquilo, arilo o aralquilo como se define más adelante; R3 es hidrógeno, azido, alcoxi, ariloxi, aralquiloxi, alquiltio, ariltio o aralquiltio como se define más adelante; o ?-A (alquil de C?-C6) OCONH (alquil de C?-Cg)B-, en donde A y B son independientemente amino, mercapto, hidroxi o carboxilo, o los esteres, amidas o sales farmacéuticamente aceptables de estos; o está ausente; en donde, los derivados sustituidos de la adenina incluyen 1-óxido de adenina, 1,N -(eteno sustituido en 4 ó 5) adenina; adenina sustituida en la posición 6; o aminoadenina sustituida en la posición 8, donde R' de los grupos 6' ó 8-NHR' se eligen del grupo que consiste en: grupos arilalquilo (de C?~Cg) con la porción arilo opcionalmente funcionalizada como está descrito más adelante; alquilo; y grupos alquilo con grupos funcionales en estos, como en: ([6-aminohexil] carbamoilmetil) -, y amino (hidroxi, tiol y carboxi) alquilo (de C -Cio) acilado en la posición ? y sus derivados amino (hidroxi, tiol y carboxi) acilados en la posición ?, donde el grupo acilo se elige de entre, pero no se limita a, acetilo, trifluoroacetilo, benzoilo, benzoilo sustituido, o la porción carboxílica está presente como su éster o derivado amida, como puede ser el metil ó etil éster o su derivado metil, etil o benzamido y la porción ?-amino (hidroxi, tiol) puede estar alquilada con un grupo alquilo de C1-C4; J es carbono o nitrógeno, con la condición de que cuando J es nitrógeno, R3 no está presente; en donde los alquilos son de cadena lineal, ramificados o cíclicos; en donde los grupos arilo están sustituidos opcionalmente con alquilo inferior, amino, alquilamino, NO2, N3, grupos carboxílicos, amido, sulfonamido o halo; y B y B' también pueden ser una pirimidina con la fórmula general de la fórmula VI, ligada a través de la posición 1 al residuo ribosilo: Fórmula VI 1 en donde: R4 es hidrógeno, hidroxi, oxo, mercapto, amino, ciano, arilalquiloxi de C7-C12, alquiltio de C?~Cg, alcoxi de C?~Cg, alquilamino de C -C6 ó dialquilamino de C1-C4, en donde los grupos alquilo están opcionalmente ligados para formar un heterociclo; R5 es hidrógeno, oxo, acetilo, benzoilo, alquilo de C?~Cg, alcanoilo de C1-C5 o aroilo; Rg es hidroxi, oxo, mercapto, alcoxi de C1-C4, arilalcoxi de C7-C?2, alquiltio de Ci-C , amino, S-fenilo, amino disustituido de C -C5 [sic] , triazolilo, alquilamino de C?~C o dialquilamino de C1-C4, en donde los grupos dialquilo están opcionalmente ligados para 3 formar un heterociclo o ligados a N para formar un anillo sustituido; ó R5 y R6 tomados juntos forman un anillo imidazol fusionado de 5 miembros entre las posiciones 3 y 4 del anillo pirimidina y forman un derivado 3,N -etenocitosina, en donde la porción eteno está opcionalmente sustituida en las posiciones 4 ó 5 con alquilo de C1-C4, fenilo o feníloxi; en donde cuando menos un hidrógeno del alquilo de C1-C4, fenilo o feniloxi está opcionalmente sustituido con una porción seleccionada del grupo que consiste en: halógeno, hidroxi, alcoxi de C1-C4, alquilo de C1-C4, arilo de Cß-Cio, arilalquilo de C7-C?2/ carboxi, ciano, nitro, sulfonamido, sulfonato, fosfato, ácido sulfónico, amino, alquilamino de C1-C y di-alquilamino de C1-C4, en donde los grupos dialquilo están opcionalmente ligados para formar un heterociclo; R7 se selecciona del grupo que consiste en: hidrógeno, hidroxi, ciano, nitro y alquenilo de C2-Cs; en donde la porción alquenilo está opcionalmente ligada por un oxígeno para formar un anillo, en donde cuando menos un hidrógeno de la porción alquenilo en el carbono adyacente al oxígeno esta opcionalmente sustituido con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en: alquilo de C ~Cg o fenilo; alquinilo de C2-C8 sustituido, halógeno, alquilo de C -C sustituido, CF3, alquenilo de C2-3, alquinilo de C2-3, alilamino, bromovinilo, propenoato de etilo o ácido propenóico; ó R6 y R7 juntos forman un anillo de 5 ó 6 miembros saturado o insaturado unido por N ó O ó S en Rg, este anillo opcionalmente contiene sustituyentes que por sí mismos contienen funcionalidades; a condición de que cuando Rs es amino o amino sustituido, R7 es hidrógeno; y Rs se selecciona del grupo que consiste en: hidrógeno, amino o di-alquilamino de C1-C4, alcoxi de C1-C4, arilalcoxi de C7-C12, alquiltio de C1-C4, arilalquiltio de C7-C12, carboxamidometilo, carboximetilo, metoxi, metiltio, fenoxi y feniltio.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el polifosfato de dinucleótido se selecciona del grupo que consiste en: U2P4, dUP4U, U2P3, U2P5/ dCP4U, CP4U, IP5I, AP4A, CP3U, UP3A y A2P3.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde la administración es administrar una forma oral de la composición farmacéutica, de modo que una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto haga contacto con los tejidos del aparato gastrointestinal del mamífero.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde la administración es inyectar la composición farmacéutica en una forma inyectable, de modo que una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto haga contacto con los tejidos del aparato gastrointestinal a través de la absorción sistémica y la circulación.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde la administración se efectúa administrando una forma de supositorio de la composición farmacéutica, de modo que una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto haga contacto con los tejidos del aparato gastrointestinal por absorción sistémica y circulación.

13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-9, en donde el trastorno gastrointestinal es la enfermedad de reflujo gastroesofágico (GERD) .

14. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-9, en donde la enfermedad gastrointestinal es enfermedad de boca seca.