KR20020069218A - 퓨린성 수용체 작동제에 의한 위장관 질환 치료 방법 - Google Patents

퓨린성 수용체 작동제에 의한 위장관 질환 치료 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 위장관에서의 물 및 뮤신 분비와 플루이드 수송의 조절 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 위장관계의 점막 장벽이 손상된 위장 질환의 치료 방법을 제공한다. 덧붙여, 본 발명은 위장관계에서의 플루이드 분비 또는 흡수 장애의 교정 방법을 제공한다. 본 발명에는, 위장관에서 물 및 뮤신 분비를 조절하거나 비정상적인 플루이드 수송을 교정하기에 효과적인 양의 퓨린성 P2Y 수용체 작동제를 포함하는 약학 조성물을 환자에게 투여하는 것이 포함된다. 본 발명에 사용되는 약학 조성물에는 유리딘 5'-디포스페이트 (UDP), 유리딘 5'-트리포스페이트 (UTP), 시티딘 5'-디포스페이트 (CDP), 시티딘 5'-트리포스페이트 (CTP), 아데노신 5'-디포스페이트 (ADP), 아데노신 5'-트리포스페이트 (ATP) 및 이들의 유사체와 같은 P2Y 퓨린성 수용체 작동제; 및 화학식 IV 의 디뉴클레오티드 폴리포스페이트 화합물이 포함된다. 상기 화합물은 경구형, 주사형 또는 좌약형으로 제조되어, 환자에게 투여된다.

Description

퓨린성 수용체 작동제에 의한 위장관 질환 치료 방법 {METHOD OF TREATING GASTROINTESTINAL TRACT DISEASE WITH PURINERGIC RECEPTOR AGONISTS}
도입
본 출원은 그 전문이 본원에 참고문헌으로 삽입되는, 1999. 12. 22. 일자로 출원된 미국 가출원 일련번호 제 60/171,710 호를 우선권으로 청구한다.
위장관계에서 뮤신 분비량, 중탄산 분비량 및/또는 수화도를 증가시키는 것이 치료적으로 바람직한 상황이 많다. 위장관계는 기본적으로 주어지는 영양 물질로부터 에너지 및 대사성 빌딩 블록을 추출하기 위해 작동한다. 소화관에는 구강 (일차적으로 침샘), 식도, 위, 소장, 대장, 직장 및 보조 기관 (췌장, 간 및 담낭) 이 포함된다. 소화관에서 점막 장벽이 손상되는 경우, 구내 건조, 위식도 역류성 질환, 위궤양, 염증성 장질환 등과 같은 질병을 일으킨다. 하부 위장관에서의 비정상적인 플루이드 및 전해질 수송은 변비 및 설사와 같은 장애를 일으킨다.
점액은 다수의 상피 표면을 덮는 점착성 물질이며, 침과 같은 플루이드 내로 분비된다. 이는 주로 물에 현탁된 무기염 및 뮤신으로 구성된다. 점액은 다수의 상피 표면에 부착하여, 유해 물질 (예로, 위산, 소화 효소 및 박테리아) 과의 접촉에 대한 확산 장벽으로서, 및 전단 스트레스를 최소화하기 위한 윤활제로서 작용한다. 상기 점액 코팅은 특히 위장관, 호흡기관 및 생식기관의 상피 상에 현저하다. 점액은 또한 침의 풍부하고 중요한 성분으로, 침에 사실상 비할 바 없는 윤활 특성을 제공한다. 배상 세포와 같은 점액 분비 세포는 위장관의 상피에 풍부하다. 다수의 점막하 점액샘이 식도를 따라 분산되어 있으며, 특히 상부 식도 괄약근, 및 하부 식도 괄약근의 위에 축적되어 있다. 침샘 중 다수의 선방 상피 세포가 점액을 분비한다. 점액층의 주요 구조적 분자는, 크고, 많이 당화된 단백질 군인 뮤신이다. 뮤신의 조밀한 "당 코팅" 은 이들에게 상당한 물 보유력을 주며, 이들이 점막 장벽 유지에 중요할 수 있는 단백질분해 저항성이 되도록 한다.
중탄산 분비는 위장관에서 점막 건강의 유지에 중요한 역할을 한다. 국소적 산성화에 대한 반응으로 식도로부터 생성되는 중탄산 및 점액은 산 유도 손상에 저항하기 위한 내재적 기전을 제공한다. 중탄산을 포함하는 침 보호 인자뿐만 아니라 식도 하부 점액샘으로부터 분비되는 중탄산의 분비는 위장관 역류성 질환과 관련된 식도 점막 손상을 예방하는데 중요하다. 점막 중탄산은 또한, 부착된 점액이 점막 중탄산에 의한 산의 표면 중성화를 지지하는 안정한 보호층을 제공하는, 근방 십이지장에서의 산 손상에 대한 보호를 위해 중요한 기전을 제공한다[Nucleotides stimulate bicarbonate secretion in guinea pig pancreatic duct (Ishiguro 등,1999, J. Physiol. 519 Pt 2:551-558) 및 CFTR knockout mouse gall bladder epithelium (Clarke 등, 2000, Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 279:G132-138)].
위장관계를 따라 적절한 부위에서 플루이드 및 전해질의 흡수 및 분비의 적절한 조절이 정상적인 소화 기능을 위해 필요하다. 플루이드 수송의 손상은 변비 및 설사를 포함하는 다양한 장애를 일으킨다. 변비는 대장을 통한 배설물 통과의 지연에 연관된다. 대장에서 배설물의 지연된 체류 시간으로 인해, 결장 상피에 의한 플루이드 흡수가 증가되어 배설물의 탈수가 일어나며, 이에 따라 하부 결장에 건조하고 딱딱한 배설물이 만들어진다. 반대로, 설사는 대장을 통한 배설물의 급격한 이동으로 인해 생기며, 소장에서의 증가된 플루이드 분비 또는 결장에서의 감소된 플루이드 흡수로 인해 일어난다.
구내 건조 (dry mouth) 로 통상 알려져 있는 구강 건조 (Xerostomia) 는 침의 저생산으로 인해 일어난다. 구내 건조는 방사선 치료에 의해, 또는 침샘에 손상을 입혀 침 흐름을 감소시키는 질병에 의해 일어난다. 위식도 역류성 질환은 위 내용물에 대한 식도 점막의 노출 정도가 정상에서 보다 더 많은 상태이다. 가장 일반적인 징후는 가슴앓이이다. 약학적 치료에는 H2 길항제 (예로, Tagamet, Zantac, Pepcid, Axid), 및 급성 질환 치료를 위한 Prilosec또는 Prevacid와 같은 양성자 펌프 억제제가 관여된다. 위궤양 질환에는 위궤양, 유문통로궤양 및 십이지장궤양이 포함된다. 궤양은 산(酸)과, 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 감염에 의해 유도되는 만성 염증간의 복잡한 상호작용으로 인해 일어난다. 십이지장궤양 환자는 높은 산 분비를 갖는다. 증가된 산 분비는 십이지장 벽에 변화를 일으켜,H. pylori가 침입하기 위한 단계를 만들어준다. 위궤양 질환 치료용 약물에는 히스타민-2 (H2) 차단제 (Tagamet, Zantac, Axid, Pepcid등), 술크랄페이트, 양성자 펌프 억제제 및 제산제가 포함된다. 염증성 장질환은 하기의 두 가지 유형으로 분류된다: 궤양성 대장염 및 크론병 (Crohn's disease). 궤양성 대장염은 결장/직장에 영향을 미치며, 결장벽의 점막 또는 최내부층이 관여된다. 크론병은 장의 모든 층에 관여되는 통벽성 질환으로, 구강부터 항문까지 내장의 어떤 부분이라도 관여될 수 있다. 염증성 장질환의 의약 치료에는 아미노살리실레이트 및 코르티코스테로이드가 포함된다. 코르티코스테로이드는 상당한 장기 독성을 갖는다. 종래 요법에 대한 대안으로서, 의약 연구자들은 위장관 질환을 위한 새로운 치료법 개발을 추구하여 왔다.
하기 참고문헌들에는 위장관의 일부 질환에 있어서의 점액 완전성 및 뮤신 분비의 역할이 개시된다. Rhodes 등 (Gut, 26:1312-1318 (1985)) 은, 결장 점액이 배설물 효소 활성의 결과로 생체 내에서 지속적인 탈황 및 탈시알화를 겪으며; 결장 점액의 변형된 감수성이 결장 질환의 병태에 중요할 수 있다고 제시하였다. Somasundaram 등 (Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 14:309-318 (1987)) 은, 위 점막의 완전성 및 그것의 점액 분비능이 임의의 스트레스 상황에서 공격적 인자들에 의해 유도되는 궤양에 대한 위 점막의 보호에 필수적이라고 보고하였다. Desai 등 (J. Pharm. Pharmacol. 47:734-738 (1995)) 은, 특정 도파민 D1-수용체 작동제인SKF 38393 이 래트에서의 위 및 십이지장궤양 예방에 효과적이었음을 나타내었다. Sarosiek 등 (Digestion, 56 Suppl. 1:15-23 (1995)) 은, 역류성 식도염 환자에서 HCl/펩신 충격 하에, 식도 뮤신, EGF 및 PGE2 의 분비 속도가 상당히 손상되어 있음을 보고하였다. Saitoh 등 (Dig. Dis. Sci. 41:1768-1774 (1996)) 은, 건강한 대상체들과 비교하여, 궤양성 대장염 환자들로부터의 뮤신의 전체 수율이 중성 뮤신의 결핍으로 인해 낮은 반면, 크론병 환자들로부터의 경우 고분자량 뮤신으로 인해 높았음을 나타내었다. Sarosiek 등 (Gastroenterology, 110:675-681 (1996)) 은, 침에서의 무기 및 유기 보호 성분들의 분비 속도 증가가 위식도 역류성 질환의 치료에 유용할 수 있음을 제시하였다. Zeeh (Gastroenterology, 110:1077-1083 (1996)) 은, 각질세포 성장 인자의 투여가 래트의 대장염 실험 모델에서 점막 손상을 완화시킴을 보고하였다. Abbas 등 (Indian J. Exp. Biol. 36:182-186 (1998)) 은, GABA 및 바클로펜 (baclofen) 의 항궤양 효과가, 향상된 뮤신 분비 및 감소된 세포 박리 또는 점막 손상과 같은 점막 보호성 인자에 대한 이들의 현저한 효과에 기인할 수 있음을 보고하였다. Nath 등 (Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 25:564-567 (1998)) 은, 폴리리보이노신산-폴리리보시티딜산이 래트에서 강력한 항 위궤양 효과를 가지고 있으며; 폴리리보이노신산-폴리리보시티딜산이 Shay 래트에서 유리산과 전체산 및 펩신을 감소시키고 뮤신 함량을 증가시킴이 나타났다고 보고하였다. Newton 등 (Gut, 43:470-475 (1998)) 은, 생체 내H. pylori가 부착한 위 점액층에 구조적 변화를 일으키지만 점액 장벽 두께는 손상되지 않는다고 보고하였다.
하기 참고문헌들에는 퓨린성 수용체 작동제의 조성 및/또는 질환 치료가 개시되어 있다. 유리딘 5'-트리포스페이트는 시험관 내에서 배상 세포에 의한 뮤신 분비의 속도 및 총량을 둘 다 증가시키는 것으로 나타났다 (Lethem 등, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 9:315-322 (1993)). 미국 특허 제 5,900,407 호 (Yerxa 등) 에는 치료를 필요로 하는 대상체에서 눈물 분비를 자극하는 방법이 개시되어 있다. 본 방법에는 대상체의 안구 표면에, 유리딘 5'-트리포스페이트, 시티딘 5'-트리포스페이트, 아데노신 5'-트리포스페이트 또는 이들의 유사체 및 유도체와 같은 퓨린성 수용체 작동제를, 눈물 플루이드 분비를 자극하기 유효한 양으로 투여하는 것이 포함된다. 미국 특허 제 5,837,861 호 (Pendergast 등) 에는 화학식 I (식 중, X 는 산소, 메틸렌 또는 디플루오로메틸렌이며; n = 0 또는 1 이고; m = 0 또는 1 이고; n + m = 0, 1 또는 2 이고; B 및 B' 은 각각 독립적으로 9- 또는 1-위치를 통해 연결된 피리미딘 잔기 또는 퓨린 잔기이다) 의 디뉴클레오티드 폴리포스페이트의 P2Y2퓨린성 수용체가 개시되어 있다. 이 화합물들은 만성 폐색성 폐질환, 기관지염, 특정 폐렴, 낭성 섬유증, 부비강염 및 중이염의 치료에 유용하다. 미국 특허 제 5,763,447 호 (Jacobus 등) 에는, 마비 환자의 울혈 기도에서 점액 분비물의 배수를 촉진하는 방법이 개시되어 있다. 이 방법에는 환자의 기도로, 유리딘 5'-트리포스페이트 (UTP) 또는 P1,P4-디(유리딘-5')테트라포스페이트와 같은 유리딘 포스페이트를, 기도에서 점액 분비를 수화시키거나 섬모 진동 (beat) 빈도를 촉진시킴으로써, 공동 (sinus) 을 포함하는 울혈 기도에서 플루이드의 배수를촉진하기 유효한 양으로 투여하는 것이 포함된다. 미국 특허 제 5,789,391 호, 제 5,981,506 호, 제 5,972,904 호 및 제 5,958,897 호는 필요로 하는 대상체의 공동에서 울혈 점액 분비물의 배수를 촉진하는 방법에 관한 것이다. 이 방법에는 대상체의 공동에, 유리딘 5'-트리포스페이트 (UTP) 또는 P1,P4-디(유리딘-5')테트라포스페이트, UTP 유사체 또는 임의의 다른 유사체와 같은 유리딘 포스페이트를, 공동에서 점액 분비물을 수화시키거나 섬모 진동 빈도를 촉진시킴으로써, 공동에서 울혈 플루이드의 배수를 촉진하기 유효한 양으로 투여하는 것이 포함된다. 미국 특허 제 5,968,913 호는 인간 기도, 중이/내이 또는 공동의 지속된 점액 분비의 증가된 점액섬모성 제거를 촉진하는데 사용하기 위한 UTP 의 약학 조성물에 관한 것이다. 미국 특허 제 5,763,447 호는 치료를 필요로 하는 누워있거나 마비된 대상체에서, 통풍기 연관 폐렴을 포함하는 폐렴의 예방 및 치료 방법에 관한 것이다. 이 방법에는 환자의 기도에, 유리딘 5'-트리포스페이트 (UTP), P1,P4-디(유리딘-5')테트라포스페이트 또는 이들의 유사체와 같은 유리딘 포스페이트를, 울혈 기도에서 플루이드 배수를 촉진하기 유효한 양으로 투여하는 것이 포함된다. WO 99/09998 에는 유리딘 5'-디포스페이트 및 이들의 유사체를 사용하여 폐 질환을 치료하는 방법이 개시되어 있다. 퓨린성 수용체 활성을 갖는 상기 참고문헌 ('391, '506, '904, '897, '913 및 '447 특허 및 WO 99/09998) 에 기재된 화합물을 본원에 참고로서 삽입한다. 미국 특허 제 5,733,916 호 (Neely) 에는 선택성 A1아데노신 수용체 길항제 및/또는 P2X 퓨리노셉터 (purinoceptor) 길항제를 함유하는 조성물을 투여함으로써, 허혈-재관류 손상 또는 엔도톡신 관련 폐 손상을 예방 또는 치료하는 방법이 개시되어 있다. Somers 등 (Laboratory Investigation, 78:1375-1383 (1998)) 은 P2Y6수용체가 진행중인 염증성 장질환을 침윤하는 T 세포에서 고발현되어 있는 반면, P2Y6발현이 비감염 장의 T 세포에는 부재되어 있음을 보고하였다. Boyer 등 (Br. J. Pharmacol. 118:1959 (1996)) 은 칠면조 적혈구막의 포스포리파아제 C-결합 P2Y-퓨리노셉터, C6 래트 신경교종 세포의 아데닐릴 시클라아제-결합 P2Y-퓨리노셉터 및 1321N1 인간 성상세포종 세포에서 안정적으로 발현되는 클로닝된 인간 P2U-수용체의 활성화 작동제로서, 아데노신 모노포스페이트 (AMP) 의 일련의 사슬 연장 2-티오에테르 유도체를 합성 및 시험하였다.
기타 선행 기술에 공지된 특정 디뉴클레오티드 포스페이트 화합물을 해당 참고문헌과 함께 표 1 에 기재하였다. 이들 화합물은 선행 기술에서 위장관에서 점액 분비를 증가시키거나, 플루이드 및 전해질 불균형을 교정하기 위해 사용되지 않았으며, 출원인들은 본 발명에서 이들을 포함하고자 하였다.
A = 아데노신eA = 에테노아데노신
U = 유리딘m7G = 7-메틸구아노신
G = 구아노신m2,7G = 2,7-디메틸구아노신
T = 티미딘m2,2,7G = 2,2,7-트리메틸구아노신
X = 잔토신NAD = 니코틴아미드 리보시드
TAD = 티아조푸린C-NAD = C-니코틴아미드 리보시드
BAD = 벤즈아미드 리보시드C-PAD = C-피콜리아미드 리보시드
D = 2,6-디아미노퓨린N = 뉴클레오시드
Gm = 2'-O-메틸구아노신Am = 2'-O-메틸아데노신
Um = 2'-O-메틸유리딘m6Am = N6-메틸-2'-O-메틸아데노신
Cm = 2'-O-메틸시티딘aha = 8-(6-아미노헥실)
X = 잔토신AZT = 티민-3'-아지도2',3'-디데옥시-D-리보시드
5-BrU = 5-브로모유리딘5-FU = 5-플루오로유리딘
P2Y 퓨린성 수용체는 G 단백질에 커플링된 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오티드수용체이다; 이들은 당화 후 41 내지 53 kDa 의 분자량을 갖는 308 내지 377 아미노산 단백질이다. P2Y1, P2Y2및 P2Y6수용체들과 같은 P2Y 수용체는 위장관에 존재한다 (Ralevic 등, Pharm. Rev. 50:415-492 (1998)). 눈 내부 및 주위 (미국 특허 제 5,900,407 호) 및 폐와 공동 (미국 특허 제 5,837,861 호) 에서 점액/뮤신 분비를 자극하는 퓨린성 수용체 작동제의 증명된 능력으로 인해, 출원인들은 P2Y 퓨린성 수용체 리간드가 점액 및/또는 뮤신 분비에 영향을 미칠 수 있는지의 여부를 조사하고, 위장관에서 비정상적인 플루이드 수송을 교정하여 상부 및 하부 위장관 질환 및 장애의 치료에 효과적이 되도록 하는데 고무되었다.
출원인들은 P2Y4및 P2Y11을 포함하는 모든 P2Y 수용체가 위장 조직에 존재함을 발견하였다. 또한 출원인들은 상기 조직에서의 점액 및 뮤신 분비, 중탄산 분비 및 플루이드 수송이 P2Y 퓨린성 수용체 매개 기전에 의해 조절될 수 있음을 발견하였다. 경구 또는 전신 투여되는 P2Y 퓨린성 수용체 리간드는 위장 장애 치료의 신규한 방법을 제공한다.
본 발명은 유리딘, 아데닌 또는 시티딘 5'-디- 및 트리포스페이트, 디뉴클레오티드 폴리포스페이트 및 이들의 유사체와 같은 퓨린성 수용체 작동제를 투여함으로써, 환자의 위장관계에서 점액 분비 및 플루이드 수송을 조절하는 방법에 관한 것이다.
발명의 개요
본 발명은 위장관에서 점액/뮤신 분비, 및 플루이드 수송의 조절 방법을 제공한다. 본 발명은 위장관계의 점막 장벽이 손상된 위장 질환의 치료 방법을 제공한다. 더불어, 본 발명은 설사 또는 변비를 일으키는 위장관에서의 플루이드 분비 또는 흡수 장애의 교정 방법을 제공한다. 본 방법에는 환자에게, P2Y 수용체 리간드를 함유하는 약학 조성물을, 위장관에서 점액/뮤신 및 중탄산 분비와 플루이드 수송을 조절하기에 유효한 양으로 투여하는 것이 포함된다. 투여 방법에는 경구 및 전신 투여가 포함된다. 치료되는 질환에는 구강, 식도, 위, 소장, 대장, 직장, 및 췌장, 간 및 담낭과 같은 보조 장기의 질환 및 장애가 포함된다.
본 발명에서 사용되는 약학 조성물에는 P2Y 퓨린성 수용체 작동제가 함유된다. P2Y 작동제는 위장관의 점막 상피에서 물, 중탄산 및 뮤신의 분비를 증가시킨다. P2Y 작동제에는 유리신 5'-디- 및 트리포스페이트 (UDP, UTP) 및 이들의 유사체 (화학식 Ia 및 Ib), 아데노신 5'-모노포스페이트 (AMP) 및 그의 유사체, 아데노신 5'-디- 및 트리포스페이트 (ADP, ATP) 및 이들의 유사체 (화학식 IIa 및 IIb), 시티딘 5'-디- 및 트리포스페이트 (CDP, CTP) 및 이들의 유사체 (화학식 IIIa 및 IIIb), 및 디뉴클레오티드 폴리포스페이트 화합물 (화학식 IV) 이 포함된다.
도면의 간단한 설명
상기 환자의 파일에는 유색으로 그려진 하나 이상의 그림이 포함된다. 상기 환자의 유색 그림(들)의 복사본은 요청 시에 필요한 요금을 지불하여 특허 사무국에서 제공될 것이다.
도 1 은 (a) 대조 센스 탐침 및 (b) 안티센스 탐침으로 수행된 위 조직 (위 상피) 의 P2Y2수용체의 원 위치 (in situ) 혼성화 결과를 나타낸다.
도 2 는 (a) 대조 센스 탐침 및 (b) 안티센스 탐침으로 수행된 식도 상피의 P2Y2수용체의 원 위치 혼성화 결과를 나타낸다.
도 3 은 (a) 센스 탐침 및 (b) 안티센스 탐침으로 수행된 대장 (결장) 상피의 P2Y2수용체의 원 위치 혼성화 결과를 나타낸다.
도 4 는 (a) 센스 탐침 및 (b) 안티센스 탐침으로 수행된 소장 (공장) 상피의 P2Y2수용체의 원 위치 혼성화 결과를 나타낸다.
도 5 는 인간 결장 상피 세포에서 P2Y 수용체 작동제로 유도된 칼슘 가동화를 나타낸다.
도 6 은 HT-29 인간 결장 상피 세포에서 P2Y 수용체 작동제로 유도된 칼슘 가동화를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 위장관에서 점액 분비, 중탄산 분비 및 플루이드 수송의 조절 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 장기의 점막 장벽이 손상되거나, 소장 및 대장에서 플루이드 흡수 또는 분비의 불균형이 일어나는 위장관 질환의 치료 방법을 제공한다. 본 방법에는 포유류에게, 퓨린성 P2Y 수용체 리간드를 함유하는 약학 조성물을, 위장관에서 점액 또는 뮤신 분비, 중탄산 분비, 또는 플루이드 수송을 조절하기에 유효한 양으로 투여하는 것이 포함된다. 본 방법으로 위장관에서의 뮤신 방출, pH 및 수화가 증가되거나, 플루이드 수송이 조절된다.
본 발명으로 치료하기 적합한 위장관 질환에는 구강 (일차적으로 침샘), 식도, 위, 소장, 대장, 직장, 및 췌장, 간 및 담낭과 같은 보조 장기에 영향을 미치는 질환 또는 장애가 포함된다. 예를 들어 구내 건조, 구강궤양, 치은 질환, 식도역류성 질환, 위궤양, 염증성 장질환 (염증성 대장염 및 크론병), 미코스티스 (mycositis), 설사 및 변비가 본 방법으로 치료될 수 있다. 또한, 건조 뮤신 및 위장관에서의 상피 세포에 의한 영양분 흡수의 감소와 같은, 낭성 섬유증과 연관된 위장 문제도 또한 본 방법으로 치료될 수 있다. 또한, 암 및 화학치료에 의해 유도되는 위장 문제도 또한 본 방법으로 치료될 수 있다.
뮤신은 환경 노출로부터 점막 표면을 보호하는데 중요한 것으로 나타나고 있다; 이것은 산 장벽으로서 작용하며, 병원체와 결합하는 것으로 발견되었다. 따라서, 뮤신은 체내에서 천연 점막 방어 체계의 일부이며, 그 분비의 자극은 점막 표면 상피의 보호를 야기시킨다. 본 발명의 방법은 위 및 식도와 같은 위장관에서 점액 분비를 증가시켜, 천연 방어 체계를 강화시키는 것이다.
인간 식도의 상피층은 관강과 혈액 간의 천연 장벽으로 작용하며, 소화된 음식의 물리적 섭동에 대한 및 위로부터 산성 위액에 대한 보호층으로서 작용하는, 편평 상피 및 점막하선으로 구성된다. 식도 점막하선에는 점액, 장액 및 근상피 세포 유형이 포함된다. 기도 및 결막에서의 점막하선에는 식도 점막 상피에서의 P2Y2수용체가 포함된다. 천연 및 합성 작동제에 의한 P2Y2수용체의 활성화는 식도 점막층으로의 점액 분비 및 수화를 증가시킨다.
다양한 병태생리적 조건들이 식도의 보호 점막 장벽의 침식을 일으켜, 위식도 역류성 질환 (GERD) 을 일으킨다. GERD 의 증상은 경증 내지 중증의 가슴앓이, 식도 염증 (식도염), 구토, 삼키기 장애 및 흉통이다. GERD 는 하부 식도 괄약근의 비정상적 작용 (위액이 하부 식도로 역류하게 됨), 지연된 위 비우기, 식도 제거 속도의 감소 및 감소된 침 분비를 포함하는 다수 요인에 의해 발생한다. 식도가 위 역류 중에 고산성 내용물에 노출되는 경우, 보호 점액층의 파손이 일어난다. 본 발명에는, 식도염의 동물 모델에서, P2Y2수용체 작동제가 편평 상피 및/또는 점막하선에 의한 뮤신, 중탄산 및 플루이드 생성을 자연적으로 자극함으로써, 손상된 식도 점막층의 완전성을 복구시킬 수 있음이 개시되어 있다.
위궤양 및 위 역류는 부분적으로 상부 위장 상피의 점막 방어 장벽이 파손됨을 특징으로 하는 상태이다. 위에서의 과도한 산 분비는 산 손상으로부터 상피 세포를 보호하는 천연 점액층의 파손을 일으킨다. 위궤양은 이에 제한되지는 않지만, 스트레스, 식사,H. pylori감염, 화학치료 또는 방사선치료, 스조그렌 (Sjogren's) 증후군 등과 같은 기타 자가면역 질환, 수술, 정신신체적 장애, 스트레스, 불안 및 약학 약물 관련 부작용에 연관된다.
소장을 따라 있는 장샘 (crypts of Lieberkuehn) 은 소장의 관강 내로의 플루이드 분비를 매개하는 데 주요한 역할을 담당한다. 상기 장샘을 따라 있는 상피 세포의 정단막에서 정단막 클로라이드 채널을 통과하는 클로라이드 유출은 소장에서 삼투압으로 강제되는 플루이드 분비의 추진력을 제공한다. 변비 및 설사는 소장 및 대장을 통한 비정상적인 플루이드 수송 (흡수 대 분비) 으로 인해 일어난다. 본 발명에는 소장 및 대장을 따라 있는 P2Y 수용체의 표적 활성화에 의해 변비 또는 설사를 일으키는 플루이드 수송의 불균형을 교정하는 방법이 개시되어 있다.콜레라 독소로의 노출과 같은 병태 상태에서, 정단 클로라이드 채널은 항상 활성화되어 있어, 소장내로 조절되지 않는 플루이드 분비, 심각한 설사 및 치명적인 신체 탈수를 일으킨다. 상기 관찰은 변비 및 설사를 치료하기 위한 과학적 논리를 제공하였다.
소장을 통한 클로라이드 및 플루이드 분비의 활성화는, 유미즙이 대장에서 배설물이 되기 전에 추가적인 플루이드를 제공하는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 유미즙으로의 상기 플루이드의 추가는 변비를 일으키는 대장에서의 플루이드 과다흡수를 상쇄시킬 것이다. 본 발명에는, 작동제에 의한 P2Y 수용체의 활성화가 소장으로의 클로라이드 및 플루이드 분비 증가와 같은 기전을 제공하며, 변비 치료에 치료학적으로 사용될 수 있음이 개시되어 있다.
대장의 결장 상피는 보통 플루이드를 흡수하고, 소장에서 들어오는 유문즙으로부터 과량의 플루이드를 제거하여 배설물로 전환시키는 작용을 한다. 설사는 들어오는 유문즙 중 과량의 플루이드, 또는 결장을 통한 플루이드의 흡수장애로 인해 일어난다. 결장 상피를 따른 플루이드 흡수는 정단막 소듐 채널 및 기저측막 소듐 포타슘 전달체를 통한 소듐 흡수에 의해 매개된다. 상기 상피의 플루이드 흡수능은 기저측막에서의 칼슘-활성화된 포타슘 채널에 의해 전기적으로 조정될 수 있다. 기저측막에서의 포타슘 전도성 증가는 정단막 및 기저측막을 과다분극화시켜, 정단막을 통한 소듐 유입의 전기적 추진력이 증가된다. 이로 인해, 동시에 상피에 의한 소듐 및 포타슘 흡수가 증가하며, 이온과 커플링된 플루이드 흡수가 증가된다. 본 발명에는, 작동제에 의한 P2Y 퓨리노셉터의 활성화가 기저측막 포타슘 전도성을증가시키고, 배설물로부터의 플루이드 제거를 촉진함이 개시되어 있다. 따라서, P2Y 수용체 작동제의 직접적인 투여를 설사를 치료하기 위해 치료학적으로 사용할 수 있다.
본 방법은 환자에게, 위장관에서 점액/뮤신 분비, 수화 및 플루이드 수송을 조절하는 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 본 방법은 기타 통상적으로 사용되는 치료에 비해 장점을 갖는다. 본 방법은 환자의 자체 점액 생산 및 분비 뿐만 아니라, 점액 수화도를 조절한다. 따라서, 본 방법으로 위장관계 점막의 천연 보호 및 윤활 특징이 유지되며, 점액 손상으로 일어나는 문제가 직접 처리된다. 본 발명은 일차적으로 인간 대상체의 치료에 관한 것이지만, 또한 개 및 고양이와 같은 기타 포유류 대상체의 수의학적 목적의 치료를 위해서도 사용될 수 있다. 출원인들은 (a) 다수의 퓨린성 P2Y 수용체 (P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6, 및 P2Y11) 가 침샘, 식도, 위, 소장, 결장, 십이지장 및 직장과 같은 위장 조직에 존재하며; (b) 강력한 퓨린성 수용체 작동제가 위장관의 점막 상피에서 뮤신 분비를 증가시키고 플루이드 수송을 조절한다는 것을 발견하였다.
P2Y 작동제에는 뉴클레오티드 모노-, 디-, 및 트리포스페이트 및 디뉴클레오티드 폴리포스페이트가 포함된다. 본 발명에 유용한 뉴클레오티드 모노포스페이트에는 아데노신 5'-모노포스페이트 (AMP), 및 2-티오에테르 치환된 AMP, 예컨대 2-헥실티오 AMP (Br. J. Pharmacol. 118:1959 (1996)) 와 같은 그의 유도체가 포함된다. 본 출원에 유용한 뉴클레오티드 디- 및 트리포스페이트에는 유리딘 5'-디- 및트리포스페이트 (UDP 및 UTP), 및 화학식 Ia 및 Ib 인 이들의 유사체; 아데노신 5'-디- 및 트리포스페이트 (ADP 및 ATP), 및 화학식 IIa 및 IIb 인 이들의 유사체; 및 시토신 5'-디- 및 트리포스페이트 (CDP 및 CTP), 및 화학식 IIIa 및 IIIb 인 이들의 유사체가 포함된다.
UDP 및 그의 유사체를 하기 화학식 Ia 로 나타낸다:
(식 중:
X1및 X2는 각각 독립적으로 O-또는 S-이며;
Y 는 H 또는 OH 이고;
R1은 O, 이미도, 메틸렌 및 디할로메틸렌 (예컨대 디클로로메틸렌, 디플루오로메틸렌) 으로 구성된 군으로부터 선택되고;
R2는 H, 할로, 알킬, 치환 알킬, 알콕시, 니트로 및 아지도로 구성된 군으로부터 선택되고;
R3은 무(無), H, 알킬, 아실 (아릴아실 포함) 및 아릴알킬로 구성된 군으로부터 선택되고; 및
R4는 -OR', -SR', NR' 및 NR'R" (식 중, R' 및 R" 은 독립적으로 H, 알킬, 치환 알킬, 아릴, 치환 아릴, 아릴알킬, 알콕실 및 아릴옥실로 구성된 군으로부터 선택되며, 단 R4가 피리미딘 고리의 제 4 위치의 탄소에 대해 산소 또는 황 원자로부터 이중 결합되는 경우 R' 은 없다) 으로 구성된 군으로부터 선택된다).
본원에서 사용되는 용어 "알킬" 은, 예를 들어 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, tert-부틸, 펜틸, 헥실, 옥틸, 에테닐, 프로페닐, 부테닐, 펜테닐, 헥세닐, 옥테닐, 부타디에닐, 프로피닐, 부티닐, 펜티닐, 헥시닐, 헵티닐, 알레닐 및 임의 치환된 아릴알케닐 및 아릴알키닐기를 포함하는, 선형, 분지형 또는 고리형, 포화 또는 불포화 (즉, 알케닐 및 알키닐) 탄화수소쇄를 포함하는 C1-10을 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "아실" 은 카르복실기의 -OH 기가 또다른 치환기로 대체된 유기산기 (즉, RCO- 로 나타냄 (여기서, R 은 알킬 또는 아릴기이다)) 를 의미한다. 이와 같이, 용어 "아실" 에는 구체적으로 아릴아실기가 포함된다. 아실기의 구체예에는 아세틸 및 벤조일이 포함된다. 본원에서 사용되는 용어 "아릴" 은, 5- 및 6-원 탄화수소 및 헤테로시클릭 방향족 고리를 의미한다. 아릴기의 구체예에는 이에 제한되지는 않지만, 시클로펜타디에닐, 페닐, 푸란, 티오펜, 피롤, 피란, 피리딘, 이미다졸, 이소티아졸, 이속사졸, 피라졸, 피라진, 피리미딘 등이 포함된다. 본원에서 사용되는 용어 "알콕실" 은, 예를 들어 메톡시, 에톡시,프로폭시, 이소프로폭시, 부톡시, t-부톡시 및 펜톡시를 포함하는, 선형, 분지형 또는 고리형, 포화 또는 불포화 옥소-탄화수소쇄를 포함하는 C1-10을 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "아릴옥실" 은, 페닐옥실과 같은 아릴옥시, 및 알킬, 할로 또는 알콕실 치환 아릴옥실을 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "치환 알킬" 및 "치환 아릴" 에는, 아릴 또는 알킬기의 하나 이상의 원자 또는 관능기가, 예를 들어 할로겐, 아릴, 알킬, 알콕시, 히드록시, 니트로, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 술페이트 및 메르캅토를 포함하는 또다른 원자 또는 관능기로 대체된, 본원에서 정의된 바와 같은 알킬 및 아릴기가 포함된다. 본원에서 사용되는 용어 "할로", "할라이드" 또는 "할로겐" 은, 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도기를 의미한다.
화학식 Ia 의 화합물을 예시하는 화합물에는 본원에 참고문헌으로 삽입된, WO 99/09998 에 개시된 것들이 포함된다. 화학식 Ia 화합물에는, 예를 들어 하기가 포함된다: 유리딘 5'-디포스페이트 (UDP); 유리딘 5'-O-(2-티오디포스페이트) (UDPβS); 5-브로모유리딘 5'-디포스페이트 (5-BrUDP); 5-(1-페닐에티닐)-유리딘 5'-디포스페이트 (5-(1-페닐에티닐)UDP); 5-메틸유리딘 5'-디포스페이트 (5-메틸UDP); 4-헥실티오유리딘 5'-디포스페이트 (4-헥실티오UDP); 4-메르캅토유리딘 5'-디포스페이트 (4-메르캅토UDP); 4-메톡시유리딘 5'-디포스페이트 (4-메톡시UDP); 4-(N-모르폴리노)유리딘 5'-디포스페이트 (4-(N-모르폴리노)UDP); 4-헥실옥시유리딘 5'-디포스페이트 (4-헥실옥시UDP); N,N-디메틸시티딘 5'-디포스페이트 (N,N-디메틸CDP); N-헥실시티딘 5'-디포스페이트 (N-헥실CDP); 및 N-시클로펜틸시티딘 5'-디포스페이트 (N-시클로펜틸CDP).
바람직한 화학식 Ia 의 화합물에는 UDP 및 UDPβS, 그리고 4-티오UDP 가 포함된다. 특정한 화학식 Ia 의 화합물 (예커대, UDP, dUDP, UDPβS 및 4-메르캅토UDP) 들이 공지되어 있으며, 당업자에게 자명한 공지된 절차 또는 이의 변법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오시드 디포스페이트의 특정 티오포스페이트 유사체 (예컨대 UTPβ-S) 의 동정 및 제조는 미국 특허 제 3,846,402 호 (Eckstein 등) 및 [R.S. Goody 및 F. Eckstein,J. Am. Chem. Soc. 93: 6252-6257 (1971)] 에 나타나있다. 이와는 달리, UDP 및 이들의 기타 유사체는 또한 Sigma (St. Louis, MO) 및 Pharmacia (Uppsala, Sweden) 와 같은 공급자로부터 시판되고 있다.
UTP 및 그의 유사체를 하기 화학식 Ib 로 나타낸다;
(식 중:
X1, X2및 X3은 각각 독립적으로 O-또는 S-이며;
Y 는 H 또는 OH 이고;
R1, R2, R3및 R4는 화학식 Ia 에 정의된 바와 같다).
바람직하게는, X2및 X3은 O-이며, R1은 산소 또는 이미도이고, R2는 H 이다. 특히 바람직한 화학식 Ib 의 화합물에는 유리딘 5'-트리포스페이트 (UTP) 및 유리딘 5'-O-(3-티오트리포스페이트) (UTPγS) 가 포함된다.
ADP 및 그의 유사체를 하기 화학식 IIa 로 나타낸다:
(식 중:
R1, X1, X2및 Y 는 화학식 Ia 에 정의된 바와 같으며;
Z 는 H, Cl 또는 SR 이고 (여기서, R 은 알킬 (C1-C20, 포화 또는 불포화) 이다);
R2가 없고, N-1 및 C-6 (아데닌) 간에 이중 결합이 있을 때, R3및 R4는 H 이거나,
R2가 없고 Z 가 SR 일 때, R3및 R4는 H 이거나,
R2가 O 이고, N-1 및 C-6 (아데닌 1-옥시드) 간에 이중 결합이 있을 때 R3및 R4는 H 이거나,
R3, R4및 R2가 함께 취해져서, N-6 및 C-6 (1,N6-에테노아데닌) 간 이중 결합을 갖는 N-6 부터 N-1 의 고리를 형성하는 -CH=CH- 이다).
특히 바람직한 화학식 IIa 의 화합물에는 5'-아데노신 디포스페이트 (ADP) 및 2-메틸-SADP 가 포함된다.
ATP 및 그의 유사체를 하기 화학식 IIb 로 나타낸다:
(식 중:
R1, X1, X2, X3및 Y 는 화학식 Ib 에 정의된 바와 같으며;
R2, R3, R4및 Z 는 화학식 IIa 에 정의된 바와 같다).
바람직한 화학식 IIb 의 화합물에는 5'-아데노신 트리포스페이트 (ATP) 가 포함된다.
CDP 및 그의 유사체를 하기 화학식 IIIa 로 나타낸다:
(식 중:
R1, X1, X2및 Y 는 화학식 Ia 에 정의된 바와 같으며;
R7이 없고, N-3 및 C-4 (시토신) 간에 이중 결합이 있을 때, R5및 R6은 H 이거나,
R5, R6및 R7이 함께 취해져서, N-4 및 C-4 (3,N4-에테노시토신) 간 이중 결합을 갖는 N-3 부터 N-4 의 고리를 형성하는 -CH=CH- 이며, 에테노 고리의 제 4 또는 제 5 위치의 수소는 알킬, 치환 알킬, 아릴, 치환 아릴 (헤테로아릴 등), 알콕실, 니트로, 할로 또는 아지도로 임의 치환된다).
CTP 및 그의 유사체를 하기 화학식 IIIb 로 나타낸다:
(식 중:
R1, X1, X2,X3및 Y 는 화학식 Ib 에 정의된 바와 같으며;
R5, R6및 R7은 화학식 IIIa 에 정의된 바와 같다).
바람직한 화학식 IIIb 의 화합물에는 시티딘 5'-트리포스페이트 (CTP) 및 4-니트로페닐 에테노시티딘 5'-트리포스페이트가 포함된다.
간단하게 하기 위해, 본원의 화학식 I, II 및 III 을 천연 생성 D-입체배치로 나타내었지만, 달리 명시되지 않는 한, 본 발명에는 L-입체배치의 화합물, 및 D- 및 L-입체배치 화합물의 혼합물도 또한 포함된다. 천연 생성 D-입체배치가 바람직하다.
P2Y 작동제에는 또한 하기 화학식 IV 의 디뉴클레오티드 포스페이트가 포함된다:
(식 중:
X 는 산소, 메틸렌, 디플루오로메틸렌 또는 이미도이며;
n = 0, 1 또는 2 이고;
m = 0, 1 또는 2 이고;
n + m = 0, 1, 2, 3 또는 4 이고;
Z = OH 또는 H 이고;
Z' = OH 또는 H 이고;
Y = OH 또는 H 이고;
Y' = OH 또는 H 이다.
당(糖)은 D-입체배치로 나타내었지만, L-, 또는 D- 및 L- 일 수 있다. D-입체배치가 바람직하다. 뉴클레오시드 잔기는 알파- 또는 베타- 및 D- 또는 L-입체배치일 수 있지만, 베타-D-입체배치가 가장 바람직하다.
B 및 B' 은 각각 제 9 또는 제 1 위치를 통해 연결된, 각각 독립적으로 화학식 V 및 VI 에 각각 정의된 바와 같은 퓨린 잔기 또는 피리미딘 잔기이다).
(식 중:
R1은 수소, 염소, 아미노, 모노치환 아미노, 디치환 아미노, 알킬티오, 아릴티오 또는 아랄킬티오이며 (여기서, 황 상의 치환기는 포화 또는 불포화의 20 개 이하 탄소수를 포함한다);
R2는 히드록시, 아미노, 메르캅토, 알킬티오, 아릴티오, 아랄킬티오, 아실티오, 알킬옥시, 아릴옥시, 아랄킬옥시, 아실옥시, 모노치환 알킬아미노, 헤테로시클릭, 모노치환 시클로알킬아미노, 모노치환 아랄킬아미노, 모노치환 아릴아미노, 디아랄킬아미노, 디아릴아미노, 디알킬아미노 (여기서, 알킬기는 N7에 임의 결합하여 치환 고리를 형성한다), 아실아미노, 디아실아미노 또는 NHRγ이고;
RX는 O 이거나 (아데닌-1-옥시드 유도체) 없고 (아데닌 유도체);
단, R2가 NHRγ인 경우, Rγ및 RX는 함께 취해져서 에테노 부분의 제 4 또는 제 5 위치가 하기에 정의된 바와 같은 알킬, 아릴 또는 아랄킬 부분으로 임의치환된 5-원 융합 이미다졸 고리를 형성할 수 있고 (1,N6-에테노아데닌 유도체);
R3은 하기에 정의된 바와 같은 수소, 아지도, 알콕시, 아릴옥시, 아랄킬옥시, 알킬티오, 아릴티오 또는 아랄킬티오이거나; ω-A(C1-6알킬)OCONH(C1-6알킬)B- (여기서, A 및 B 는 독립적으로 아미노, 메르캅토, 히드록시 또는 카르복실이다) 이거나; 약학적으로 허용가능한 에스테르, 아미드 또는 이들의 염이거나; 없다.
따라서, 아데닌의 치환 유도체에는 아데닌 1-옥시드; 1,N6-(4- 또는 5-치환 에테노)아데닌; 6-치환 아데닌; 또는 8-치환 아미노아데닌이 포함된다 (여기서, 6- 또는 8-HNR' 기의 R' 은 하기로부터 선택된다: 하기 기재된 바와 같이 임의 관능화된 아릴 부분을 갖는 아릴알킬(C1-6)기; 알킬; 및 ([6-아미노헥실]카르바모일메틸)- 및 ω-아실화-아미노(히드록시, 티올 및 카르복시)알킬(C2-10)- 같이, 내부에 관능기를 갖는 알킬기, 및 아실기가 이에 제한되지는 않지만 아세틸, 트리플루오로아세틸, 벤조일, 치환 벤조일 등으로부터 선택되거나, 예를 들어 에틸 또는 메틸 에스테르 또는 그의 메틸, 에틸 또는 벤즈아미도 유도체와 같이, 카르복실 부분이 그 에스테르 또는 아미드 유도체로서 존재하는, 이들의 ω-아실화-아미노(히드록시, 티올 및 카르복시)유도체). ω-아미노(히드록시,티올) 부분은 C1-4알킬기로 알킬화될 수 있다.
J 는 탄소 또는 질소이며, 단 J 가 질소인 경우 R3은 없고;
여기서, 알킬은 선형, 분지형 또는 고리형이고;
여기서, 아릴기는 저급 알킬, 아미노, 알킬아미노, NO2, N3, 카르복실릭, 아미도, 술폰아미도 또는 할로기로 임의 치환되고; 및
B 및 B' 은 또한 리보실 잔기에 제 1 위치를 통해 연결되는, 화학식 VI 의 피리미딘일 수 있다:
(식 중:
R4는 수소, 히드록시, 옥소, 메르캅토, 아미노, 시아노, C7-12아릴알콕시, C1-6알킬티오, C1-6알콕시, C1-6알킬아미노 또는 디C1-4알킬아미노이며 (여기서, 알킬기는 임의 연결되어 헤테로사이클을 형성한다);
R5는 수소, 옥소, 아세틸, 벤조일, C1-6알킬, C1-5알카노일 또는 아로일이고;
R6은 히드록시, 옥소, 메르캅토, C1-4알콕시, C7-12아릴알콕시, C1-6알킬티오, 아미노, S-페닐, C1-5디치환 아미노, 트리아졸릴, C1-6알킬아미노 또는 디C1-4알킬아미노이거나 (여기서, 상기 디알킬기는 임의로 연결되어 헤테로사이클을 형성하거나,N3로 연결되어 치환고리를 형성한다);
R5및 R6은 함께 취해져서 피리미딘 고리의 제 3 및 제 4 위치 사이에 5-원 융합 이미다졸 고리를 형성하고 3,N4-에테노시토신 유도체를 형성하고 (여기서, 상기 에테노 부분은 제 4 또는 제 5 위치에서 C1-4알킬, 페닐 또는 페닐옥시로 임의 치환된다 (여기서, 상기 C1-4알킬, 페닐 또는 페닐옥시의 하나 이상의 수소는 할로겐, 히드록시, C1-4알콕시, C1-4알킬, C6-10아릴, C7-12아릴알킬, 카르복시, 시아노, 니트로, 술폰아미도, 술포네이트, 포스페이트, 술폰산, 아미노, C1-4알킬아미노 및 디C1-4알킬아미노로 구성된 군으로부터 선택되는 부분으로 임의 치환된다 (여기서, 상기 디알킬기는 임의 연결되어 헤테로사이클을 형성한다)));
R7은 수소, 히드록시, 시아노, 니트로 및 C2-8알케닐로 구성된 군으로부터 선택되거나 (여기서, 상기 알케닐 부분은 산소를 통해 임의 연결되어 고리를 형성한다 (여기서, 상기 산소에 인접한 탄소 상의 상기 알케닐 부분의 하나 이상의 수소는 C1-6알킬 또는 페닐; 치환 C2-8알키닐, 할로겐, 치환 C1-4알킬, CF3, C2-3알케닐, C2-3알키닐, 알릴아미노, 브로모비닐, 에틸 프로페노에이트 또는 프로펜산으로 구성된 군으로부터 선택되는 치환기로 임의 치환된다));
R6및 R7이 함께 R6에서 N 또는 O 또는 S 를 통해 결합된 5 또는 6-원 포화 또는 불포화 고리를 형성하고, 상기 고리는 자체가 관능성을 갖는 치환기를 임의로포함하며; 단, R8이 아미노 또는 치환 아미노일 때, R7은 수소이고;
R8은 수소, 아미노 또는 디-C1-4알킬아미노, C1-4알콕시, C7-12아릴알콕시, C1-4알킬티오, C7-12아릴알킬티오, 카르복스아미도메틸, 카르복시메틸, 메톡시, 메틸티오, 페녹시 및 페닐티오로 구성된 군으로부터 선택된다)).
상기 화학식 I 내지 III 에서, 제 2 내지 제 6 위치의 점선은 상기 위치에서 단일 또는 이중 결합의 존재를 나타내고자 하는 것이며, 이중 또는 단일 결합의 상대적 위치는 R4, R5및 R6치환기가 케토-에놀 호변이성이 가능한지의 여부에 따라 결정된다.
상기 화학식 I 내지 III 에서, 아실기에는 알카노일 또는 아로일기가 포함된다. 알킬기에는 하기 기재되는 바와 같이 하나 이상의 적절한 치환기로 임의 치환된 1 내지 8 개 탄소수, 특히 1 내지 4 개 탄소수가 포함된다. 아릴옥시와 같이 상기 기의 아릴 부분을 포함하는 아릴기는 하기 기재되는 바와 같이, 바람직하게는 하나 이상의 적절한 치환기로 임의 치환된 페닐기이다. 상기 언급된 알케닐 및 알키닐기에는 하기 기재되는 바와 같이 하나 이상의 적절한 치환기로 임의 치환된 에테닐 또는 에티닐과 같이, 2 내지 8 개 탄소수, 특히 2 내지 6 개 탄소수가 포함된다.
상기 언급된 알킬, 알케닐, 알키닐 및 아릴기 상의 적절한 치환기는 할로겐, 히드록시, C1-4알콕시, C1-4알킬, C6-12아릴, C6-12아릴알콕시, 카르복시, 시아노, 니트로, 술폰아미도, 술포네이트, 포스페이트, 술포닉, 아미노 및 치환 아미노 (여기서, 아미노는 C1-4알킬로 단일 또는 이중 치환되며, 이중 치환되는 경우, 알킬기가 임의 연결되어 헤테로사이클을 형성한다) 로부터 선택된다.
나아가, 본 발명은 하기와 같은 새로운 특징을 갖는, 화학식 IV 의 화합물을 함유하는 신규 약학 조성물을 제공한다: (1) 아라비노푸라노실, 3'-데옥시리보푸라노실, 자일로푸라노실 및 릭소푸라노실로 구성된 군으로부터 선택되는 당 부분을 갖는 신규 디뉴클레오티드; (2) 아자퓨린 염기를 갖는 신규 디뉴클레오티드; 및 (3) 6-치환 퓨린을 갖는 신규 디뉴클레오티드. 신규 조성물의 제 1 유형에서, 당 부분이 3'-데옥시리보푸라노실인 경우, Z 및 Z' 은 H 이다. 아자퓨린 염기를 갖는 신규 조성물의 제 2 유형에서, J 는 질소이고 R3는 없다. 6-치환 퓨린을 갖는 신규 조성물의 제 3 유형에서, 6-모노치환 아미노 퓨린 염기는 제외된다.
본 발명에 유용한 바람직한 디뉴클레오티드 폴리포스페이트 화합물은 P1,P4-디(유리딘-5')-테트라포스페이트, dUP4U, U2P3, U2P5, dCP4U, CP4U, IP5I, AP4A, CP3U, UP3A 및 A2P3이다.
화학식 I, II 및 III 의 일부 화합물은 당분야에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다; 일부 화합물은, 예를 들어 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO 63178) 에서 시판된다. 화학식 Ia 의 화합물 (UDP 및 그 유사체) 은 WO 99/09998 에 따라 제조될 수 있다. 화학식 Ib, IIb 및 IIIb 의 화합물 (UTP, ATP, CTP 및 이들의 유사체) 은 미국 특허 제 5,763,447 호에 따라 제조될 수 있다. 화학식 IV 의 화합물은 문헌 [Zamecnik 등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 838-42 (1981); Ng 및 Orgel,Nucleic Acids Res. 15:3572-80 (1987)], Pendergast 등의 미국 특허 제 5,837,861 호에 기재된 공지된 절차 또는 이들의 변법에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 화합물에는 또한 여기에 제한되는 것은 아니지만, 소듐 또는 포타슘과 같은 알칼리 금속염; 망간, 마그네슘 또는 칼슘과 같은 알칼리 토금속염; 또는 암모늄 또는 테트라알킬 암모늄염, 즉, NX4 +(여기서, X 는 C1-4이다) 와 같은, 화합물들의 비독성인 약학적으로 허용가능한 염이 포함된다. 약학적으로 허용가능한 염은 모(母) 화합물의 목적하는 생물학적 활성을 보유하면서, 목적하지 않는 독성 효과를 부여하지 않는 염이다. 본 발명에는 또한 본원에 개시된 화합물의 아실화 전구약물이 포함된다. 당업자는 화합물의 비독성인 약학적으로 허용가능한 염 및 아실화 전구약물을 제조하는데 사용될 수 있는 다양한 합성 방법을 인지할 것이다.
본 발명의 P2Y 작동제 화합물의 약학적 유용성은 P2Y 활성에 대한 이노시톨 포스페이트 분석에 의해 나타난다. 문헌 [E. Lazarowski 등,Brit. J. Pharm. 116, 1619-27 (1995)] 에 기재된 바와 같은 널리 사용되는 상기 분석은, G-단백질을 통해 포스포리파아제 C 에 연결된 수용체를 활성화시키는 화합물의 활성 측정으로서, 이노시톨 포스페이트 형성을 측정하는 데 근거한다.
또한, 본 발명의 P2Y 작동제 화합물의 약학적 유용성은 P2Y 활성의 세포내칼슘 가동화 분석에 의해 나타난다. 상기 분석에서, 배양 세포는 P2Y 수용체 작동제의 증가되는 농도로 자극된다. 세포내 칼슘 수준은 FLIPR (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA) 또는 동등한 장비를 이용하여, 칼슘 민감성 염료의 형광 강도 변화를 측정함으로써 모니터링된다.
P2Y 작동제 화합물은 식도, 위 점막, 공장, 근방 및 원방 결장 상피의 시험관내 표본에서 점액 생산을 증가시킨다. 점액 분비는 임프레션 (impression) 세포학, 효소 면역측정법 (ELISA), 및 뮤신-특이적 항체를 사용하는 도트 블롯을 포함하는 다양한 기법에 의해 분석될 수 있다 (Danjo 등,Invest, Ophthalmol. Vis. Sci., 39: 2602-2609 (1988); Jumblatt 등,Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40:43-49 (1999); 및 Jumblatt 등,Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39:5803 (1988) 참조). 우리의 결과에서, 상피 표본의 관강 표면으로 P2Y 수용체 작동제를 투여하는 경우, 강력하고 연장되며 유의미한 점액 생산 증가가 나타난다. 뮤신 생산은 작동제로의 반복적 자극에 의해 반복적으로 증가될 수 있다.
P2Y 작동제는 식도, 공장, 및 근방 및 원방 결장을 포함하는 위장관계의 상피 표본에서 유의미하게 단락 전류 (short circuit currents, ISC) 를 변화시킨다. ISC의 변화는 관강 통과 클로라이드 흐름 또는 장막 통과 포타슘 흐름의 증가와 일치되며, 따라서 상피를 통한 플루이드 흡수 또는 분비를 변형시키리라고 추정된다.
위장 질환과 연관된 증상의 완화를 위한 P2Y 작동제의 효능을 동물 모델에서 나타낼 수 있다. 예를 들어, 시노몰구스 (cynomolgus) 원숭이의 상악동 점막으로의 아세트산 투여에 의한 헬리코박터 필로리 감염은 만성 위염의 모델이다; 본 모델은 인간 위궤양에서와 유사한 조직학적 및 임상학적 표현형을 나타낸다. 위염 원숭이로의 P2Y 수용체 작동제의 경구 투여는, 과요오드산-시프 (Schiff) 양성 물질의 염색의 유의미한 회복을 나타내고, 항뮤신 면역반응성을 증가시키며, 이 둘은 뮤신 분비의 증가를 반영한다. 위궤양의 감소된 조직학적 빈도 또한 P2Y 수용체 작동제의 유효성을 나타낸다.
본 발명의 바람직한 화합물은, 통상적인 비독성의 약학적으로 허용가능한 담체, 보조제 및 비히클 (vehicle) 을 함유하는 투여 단위 제제로, 경구, 전신, 수술 중, 또는 직장 투여할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 '전신' 에는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 흉골내 주사 또는 주입 기법이 포함된다.
본 발명의 약학 제제에는 리간드 화합물 및 약학적으로 허용가능한 담체가 포함된다. 하나 이상의 리간드 화합물이 하나 이상의 비독성인 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제 또는 보조제, 및 필요하다면 기타 활성 성분들과 함께 존재할 수 있다. 상기 담체의 하나는 당으로서, 화합물은 유리화 (glassification) 를 통해 매트릭스 중에 친밀하게 함입되거나, 경구 또는 전신 투여를 위한 담체 (예컨대, 락토오스, 수크로오스, 트레할로오스, 만니톨) 또는 기타 적합한 부형제와 함께 간단히 혼합될 수 있다.
경구 용도를 위해, 약학 조성물은 정제, 마름모형 정제 (lozenges), 수성 또는 유성 현탁액, 점성 겔, 씹는 검, 분산성 분말 또는 과립, 에멀젼, 경질 또는 연질 캡슐, 시럽 또는 엘릭서와 같은 적당한 형태이다. 경구 용도를 위한 조성물은약학 조성물 제조 분야에 공지된 임의 방법에 따라 제조된다. 상기 조성물에는, 약학적으로 훌륭하고 맛좋은 제제를 제공하기 위해, 감미제, 향미제, 착색제 및 방부제로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제제가 함유될 수 있다. 정제에는 보통 활성 성분과 함께 정제 제조에 적합한 비독성의 약학적으로 허용가능한 부형제가 함유된다. 상기 부형제에는, 예를 들어 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토오스, 인산칼슘 또는 인산나트륨과 같은 불활성 희석제; 예를 들어 옥수수 전분 또는 알긴산과 같은 과립제 및 붕해제; 예를 들어 전분, 젤라틴 또는 아카시아와 같은 결합제; 및 예를 들어 스테아르산마그네슘, 스테아르산 및 활석과 같은 윤활제가 포함된다. 정제는 코팅되지 않거나, 장기간에 걸친 서방 작용을 제공하기 위해 공지된 기법으로 코팅될 수 있다. 예를 들어, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 시간 지연 물질이 사용될 수 있다.
경구 용도를 위해, 경질 젤라틴 캡슐은 활성 성분을, 예를 들어 탄산칼슘, 인산칼슘 또는 카올린과 같은 불활성 고체 희석제와 혼합하여 제조된다. 연질 젤라틴 캡슐은 활성 성분을 물, 또는 예를 들어 땅콩 오일, 액체 파라핀 또는 올리브유와 같은 오일 매질과 혼합하여 제조된다.
경구 용도를 위해, 씹는 검은 활성 성분을 검 중에 끼워넣어 제조된다; 활성 성분은 씹으면서 서서히 방출된다. 상기 형태는 구강 궤양이 치료에 적합하다.
경구 용도를 위해, 분산제 또는 습윤제, 현탁화제 및 하나 이상의 방부제와 함께 분산성 분말 및 과립에 물을 첨가하여, 수성 현탁액을 제조한다. 현탁화제에는, 예를 들어 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스 및 알긴산나트륨이포함된다. 분산제 또는 습윤제에는 천연 생성 포스파티드, 알릴렌 옥시드와 지방산의 축합 산물, 에틸렌 옥시드와 장쇄 지방족 알콜의 축합 산물, 에틸렌 옥시드와, 지방산 및 헥시톨의 부분 에스테르의 축합 산물, 및 에틸렌 옥시드와, 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유래된 부분 에스테르의 축합 산물이 포함된다. 방부제에는, 예를 들어, 에틸 및 n-프로필 p-히드록시벤조에이트가 포함된다. 수성 현탁액에는 또한 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 향미료, 및 수크로오스 또는 사카린과 같은 하나 이상의 감미제가 함유될 수 있다. 당업자는 상기 일반적 설명에 포함되는 다수의 구체적 부형제 및 습윤제를 인지할 것이다.
전신 투여를 위해, 약학 제제를 무균 매질 중에 제조한다. 사용되는 비히클 및 농도에 따라, 활성 성분은 비히클 중에 현탁되거나 용해될 수 있다. 국소 마취제, 방부제 및 완충제와 같은 보조제도 또한 비히클 중에 용해될 수 있다. 무균 주사 제제는 비독성의 적합한 희석제 또는 용매 중의 무균 주사 용액 또는 현탁액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매 중에는 멸균수, 식염수 또는 링거 용액이 있다.
약학 적용은 직장 투여용 좌약의 형태로도 또한 투여될 수 있다. 상기 조성물은 활성 성분을, 일상 온도에서는 고체이지만 직장 온도에서는 액체이고, 따라서 직장 내에서 녹아 화합물을 방출하는, 적합한 비자극성 부형제와 혼합하여 제조될 수 있다. 상기 부형제에는 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다.
약 10 - 2000 mg 의 활성 성분 투여 수준이 상기 제시된 상태의 치료에 유용하다. 바람직한 용량은 활성 성분 약 50 - 1000 mg, 보다 바람직한 용량은 약 75- 850 mg 이다. 상기 용량은 필요하다면 1 일 수회로 주어질 수 있다. 담체 물질과 배합되어 단일 투여형을 제조할 수 있는 활성 성분의 양은 치료할 숙주 및 특정 투여 방식에 따라 다양할 것이다. 그러나, 임의의 특정 환자의 구체적 투여 수준은, 사용되는 구체적 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반 건강, 성별, 식사, 투여 회수, 투여 경로 및 배출 속도, 약물 병용 및 치료를 받고 있는 특정 질환의 중증도를 포함하는 다양한 요인에 근거할 것이다.
본 발명은 하기 실시예들에 의해 더욱 예시되지만, 기재되는 구체적 절차에 의해 발명의 범위나 요지가 제한되는 것으로 간주될 수 없다.
실시예 1. 인간 조직에서 P2Y 수용체의 동정
위장 조직 중 P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6및 P2Y11퓨린성 수용체의 존재를 시판원에서 구매한 인간 RNA 의 RT-PCR 기법을 이용하여 시험관 내에서 결정하였다. 인간의 정상 위 폴리 A+mRNA 는 Clontech (Palo Alto, CA) 로부터 구매하였다. 올리고(dT) 18 프라이머 및 MMLV 역전사효소를 이용하여 (60 분, 42℃), 위 폴리 A+mRNA 100 ng 으로부터, 제 1 쇄 cDNA 를 합성하였다 (Advantage RT-for PCR 키트; Clontech, Palo Alto, CA). 역전사효소 없이 대조 반응을 또한 수행하였다. 인간의 정상 식도, 직장, 십이지장 및 침샘 cDNA 는 Invitrogen (Carlsbad, CA) 로부터 구매하였다. Clontech 의 다중 조직 cDNA 패널로부터, 정상 인간 결장, 간 및 소장의 제 1 쇄 cDNA 를 합성하였다. 위 조직을 가지고 RT-PCR 을 수행하고, 다른조직을 가지고 PCR 을 수행하였다.
P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6및 P2Y11유전자에 대한 서열 특이적 프라이머를 하기에 기재한다:
P2Y1(승인 번호 U42029)
전방
후방
P2Y2(승인 번호 S74902)
전방
후방
P2Y4(승인 번호 X91852)
전방
후방
P2Y6(승인 번호 U52464)
전방
후방
P2Y11(승인 번호 AF030335)
전방
후방
각각의 P2Y (P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6및 P2Y11) 부분 cDNA 를 증폭하도록 고안된 전방 및 후방 프라이머 세트 (각 프라이머 1㎕ 씩) 를 이용하여, 상기 기재된 모든 조직의 cDNA 3㎕ 상에서 PCR 을 수행하였다. 반응물에는 또한 400 mM 의 각각의 데옥시 뉴클레오티드 트리포스페이트, 3.5 mM MgCl2및 Advantage cDNA 폴리머라아제 믹스 (Clontech, Palo Alto, CA) 1㎕ 가 포함되었다. 반응 조건은 하기와 같았다: 94℃ 에서 초기 2.5 분, 이어서 94℃ 에서 30 초, 60℃ (P2Y4, P2Y11) 또는 65℃ (P2Y1, P2Y2, P2Y6) 에서 30 초, 72℃ 에서 1 분으로 35 주기, 최종적으로 72℃ 에서 10 분. 일부 PCR 산물을 pCR 2.1-TOPO 벡터 (TOPO TA 클로닝 키트; Invitrogen, Carlsbad, CA) 내로 클로닝하여 자동 DNA 서열분석기를 이용하여 완전 서열분석하였다.
시험한 모든 조직은 P2Y 수용체에 대해 양성이었다. 결과를 표 2 에 요약한다.
실시예 2. 비동위원소성 원 위치 혼성화에 의한 원숭이 위장 상피 조직 중 P2Y 뉴클레오티드 수용체 유전자 발현의 세포 내 위치 측정
조직.연구 조직은 Pathology Associates International 의 MD, Frederick 에게서 수득하였다. 본 연구에 포함되는 조직은 위, 식도, 소장 (공장) 및 대장 (결장) 이었다. 3.25 년생 인디안 붉은털 짧은꼬리 원숭이 (Rhesus Macaque) 를 안락사시킨 직후 조직을 절단하여 O.C.T. 임베딩 (embedding) 매질 중에 스냅 냉동시켰다. 냉동 조직을 냉동절단 (cryosectioning) 전까지 -80℃ 에서 보관하였다. 조직을 5㎛ 절편으로 자르고, 헤마톡실린 & 에오신 (H & E) 염색 및 원 위치 혼성화 (ISH) 를 위해 현미경 슬라이드에 올려놓았다.
조직 절편의 평가.H & E 염색된 조직 절편을 제조하여, 연구 조직의 질 및 방향을 평가하였다. H & E 슬라이드의 조사는 모든 조직이 ISH 를 위해 적합함을나타내었다.
리보탐침 (Riboprobe) 합성.스폰서로부터, 인간 P2Y2-R cDNA 의 뉴클레오티드 253-651 을 포함하는 PCR 산물을 수득하였다. 상류에 T3 프로모터 또는 하류에 T7 프로모터를 삽입하도록 고안된 P2Y2프라이머 (전방 프라이머 서열: 5' AGGAGATGTGTTGGGCAGCAGTGAGGAC 3', 후방 프라이머 서열: 5' ACCAGGGTTTTCTGGCCAACCTGTGACT 3') 를 가지고, P2Y2-R 뉴클레오티드 272-627 을 재증폭하였다. 생성 PCR 산물을 사용하여, 시험관 내 전사 (IVT) 에 의해 디곡시제닌-표지된 리보탐침을 합성하였다. 제조자의 지시에 따라 MEGAscript IVT 키트 (Ambion) 을 이용하여, 디곡시제닌-11-UTP (Roche Molecular) 의 존재 하에, 각각 T7 및 T3 RNA 폴리머라아제를 이용하여 안티센스 및 센스 리보탐침을 합성하였다. IVT 후, 주형 DNA 를 DNase-1 로 분해시키고, 삽입되지 않은 디곡시제닌은 초여과에 의해 제거하였다. 리보탐침 완전성은 변성 폴리아크릴아미드 겔을 통한 전기영동으로 평가하였다. 100 - 1000 염기쌍 RNA 래더 (ladder) (Ambion) 의 전기영동상 이동성과 비교하여, 외견상 분자 크기를 추정하였다. 탐침 수율 및 표지는 블롯 면역화학에 의해 평가하였다. 리보탐침을 5㎕ 부분으로 나누어 ISH 에 사용할 때까지 -80℃ 에서 보관하였다.
원 위치 혼성화.냉동 조직을 5㎛ 절편으로 자르고, SuperFrost Plus 슬라이드 (Fisher Scientific) 에 올려놓아, pH 7.4 의 PBS 내 4% 파라포름알데히드 중에서 15 분 동안 후고정시켰다. 이어서, 조직 절편을 pH 7.4 의 PBS 내 0.1% 활성디에틸피로카르보네이트로 30 분 동안 처리하였다. 절편을 탐침 부재 하에서 예비혼성화시킨 후, 안티센스 또는 센스 탐침 400 ng/mL 을 함유하는 혼성화 완충액 중에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 혼성화 후, 슬라이드에 일련의 후혼성화 스트린전시 세척을 수행하여, 비특이적 염색을 감소시켰다. 제조자의 지시에 따라, 알칼린 포스파타아제-접합 항-디곡시제닌 Fab 및 니트로블루 테트라졸륨 클로라이드-브로모클로로인돌릴 포스페이트 (Roche Molecular) 를 사용한 면역조직화학에 의해 혼성화를 시각화하였다. 조직 절편을 뉴클리어 패스트 레드로 역염색하였다. 음성 대조군에는 센스 P2Y2-R 탐침으로 염색된 위 및 식도 조직이 포함되었다.
결과.원 위치 혼성화 실험의 결과를 위 (도 1), 식도 (도 2), 결장 (도 3) 및 공장 (도 4) 에 대한 센스 탐침 (음성 대조군) 및 안티센스 탐침으로 나타낸다. 모든 조직은 점막 상피에서, 안티센스 탐침을 가지고 P2Y2수용체 유전자 발현을 나타내는 양성 염색을 나타내었으며 (도 1b, 2b, 3b 및 4b), 반면에 대조 센스 탐침을 가지고는 염색이 관찰되지 않았다 (도 1a, 2a, 3a 및 4a). 보다 구체적으로, 위에서 위소와(胃小窩)의 상피 및 위선의 목과 기저부에; 식도의 중층 편평 (stratified squamous) 상피에; 공장의 융모 상피 및 분비 상피의 흡수 장세포 및 점액분비 배상세포에; 및 결장의 원주 흡수 세포, 점액 분비 배상 세포 및 분비성 장내분비샘 세포에 P2Y2유전자 발현이 나타났다. 분비 및 흡수 세포 유형 둘 다를 포함하는 위장 상피에서의 P2Y2수용체 유전자 발현의 증거는, 위장관 점막 생리에서, 및 증가된 점액 분비 및/또는 플루이드 분비가 치료적인 위장관 질환의 치료용표적으로서의 P2Y2수용체 역할을 지지한다.
실시예 3: 위장관의 배양 상피 세포 중 세포내 칼슘 가동화의 측정
통상적 기법을 사용하여, P2Y 수용체 작동제에 의해 유도되는 세포 내 칼슘 가동화를 측정하였다. 이 기법은 당업자에게 익숙한 것이다. 세포를 96 웰 플레이트에 시딩하여 칼슘 가동화 분석에 사용하였다. 분석 당일에, 배양 배지를 흡입제거하고, KCl (10.0), NaCl (118), CaCl2(2.5), MgCl2(1.0), HEPES (20), 글루코오스 (10) 로 구성된 pH 7.4 의 분석 완충액 (mM 임) 중 Fluo-3AM (최종 농도 2.5 μM) 의 용액으로 교체하였다. 프로벤시드 (Probenecid, Sigma Chemical Co.) 를 염료 충전(充塡) 및 염료 세척 매질에 작용 농도 2.5 mM 로 첨가하여, 세포 내 염료 보유를 증가시킨다. 25℃ 에서 Fluo-3 AM 과 60 분 동안 인큐베이션한 후, 세포에 염료가 없도록 세척하고 (Columbus Plate Washer, TECAN U.S., Inc., Research Triangle Park, N.C.), 증가하는 농도의 P2Y 수용체 작동제로 자극한다. FLIPR (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA) 를 사용하여 형광 강도 변화를 측정함으로써, 각 웰 내의 세포 내 칼슘 수준을 동시에 모니터링한다.
인간 결장 상피 세포주 T84 세포로 상기 기재된 칼슘 가동화 분석을 하였다. 결과는, P2Y 수용체 작동제인 ATP 및 UTP 가, P2Y2수용체의 활성화와 일치하게, 상기 세포에서 칼슘 가동화를 자극한다는 것을 나타낸다 (도 5). P2Y1수용체 선택적 작동제인 2-메틸티오ADP 는 칼슘 가동화를 자극하지 않아서, 상기 세포에 P2Y1수용체가 부재함을 시사한다. 유사하게, 인간 결장 HT-29 세포는 P2Y2수용체의 활성화와 일치하게, ATP 및 UTP 에 대한 강력한 P2Y 반응을 나타낸다 (도 6). T84 및 HT-29 세포에서 ATP 및 UTP 에 의한 세포 내 칼슘 가동화의 활성화는, 위장관에서 P2Y 수용체 작동제의 약학적 유용성을 시사한다.[UTP stimulated calcium mobilization has been reported in HT-29 cells: Otero 등, Mol Cell Biochem 2000. 2.; 205(1-2):115-23)]
실시예 4: 상피 배양물 및 추출물 중 위장 상피 점액 생산, 중탄산 분비 및 단락 전류의 측정
통상적 기법을 이용하여, P2Y2및 P2Y4퓨리노셉터 작동제에 의해 매개되는 상피 전기 반응을 연구한다. 이 기법은 당업자에게 널리 알려진 것이다. 식도, 위, 공장 및 결장 상피의 천연 추출물 및 배양 점막 상피 세포를, 정단막 (점막) 및 기저측막 (장막) 을 분리하는 연접 복합체의 완전성이 유지되도록 단리하거나 단일층으로 배양한다. 상피 조직 또는 단일층을, 상피 세포 극성이 유지되게 하고, 링거 용액을 정단 및 기저측 표면으로 개별 관류시키는 능력이 있는 변형 유싱 (Ussing) 챔버 중에 올려놓는다. 단락 전류 및 전체 상피 통과 저항을 통상적 전기생리 기법을 이용하여 연속 측정한다. pH-스태트 (stat) 시스템을 이용한 pH 모니터링으로 중탄산 분비를 측정한다. 클로라이드 이온 분비, 중탄산 분비 또는 기타 이온의 막통과 흐름의 변화와 일치하는 상기 파라미터의 변화는, P2Y 수용체 작동제가 위장관에서 분비, 흡수, 및/또는 점액 수화를 조절함을 시사한다.
상피샘에 존재하는 배상 세포에 의한 점액 생산은 당분야에 널리 알려진 다양한 기법으로 분석된다. 식도 및 위 점막 상피의 천연 추출물 및 배양 단일층을, 상피의 고정된 표면적을 폴리비닐리덴 디플루오레이드 (PVDF) 막에 노출시키고, PVDF 막을 과요오드산 및 시프 (PAS) 시약으로 염색하는 것으로 구성되는 임프레션 세포학으로, 뮤신 생산에 대해 분석한다. PAS-양성 염색량은 뮤신 분비와 반비례한다. 식도 및 위 점막 상피에서, P2Y2및 P2Y4퓨리노셉터의 작동제는 뮤신 분비의 증가와 일치하는 PAS 염색의 감소를 나타낸다. 점액 분비에서의 P2Y 퓨리노셉터 유도 증가는 효소 면역측정법 및 뮤신-특이적 항체를 사용하는 이뮤노블롯으로 확인된다. 양성 결과는, 상피 표본의 관강 표면에 퓨리노셉터 작동제를 투여 시에, 점액 생산의 강력하고 지연되며 유의미한 증가를 시사한다. 뮤신 생산은 퓨리노셉터 작동제로의 반복적인 자극에 의해 반복적으로 증가될 수 있다.
실시예 5: 궤양성 대장염과 연관된 증상의 완화를 위한 퓨리노셉터 작동제
시노몰구스 원숭이의 상악동 점막으로의 아세트산 투여에 의한 헬리코박터 필로리 감염은 만성 위염의 모델로, 인간 위궤양과 유사한 조직학적 및 임상학적 표현형을 나타낸다. 위염 원숭이로의 P2Y 수용체 작동제의 경구 투여는, 과요오드산-시프 양성 물질의 염색의 유의미한 회복을 나타내고, 항뮤신 면역반응성을 증가시키며, 이 둘은 뮤신 분비의 증가를 반영한다. 위궤양의 감소된 조직학적 빈도 또한 P2Y 수용체 작동제의 유효성을 나타낸다.
궤양성 대장염 또는 만성 위염을 겪는 인간 대상체를 본 발명의 방법으로 치료한다. 환자는 내시경 후 위 점막을 생검한다. 점막 염증 및 위 점막층의 마모를 확인한 후 궤양성 대장염이 진단된다. 본 발명은, 식도 및 위 점막층을 코팅하고 위 점막 하의 점액 생성을 자극하는 P2Y 수용체 작동제의 적합한 제제를 경구 투여함으로써 환자를 치료한다. 본 조성물은 서방성 경구형, 바람직하게는 츄잉 검 또는 마름모형 정제의 형태로 투여되며, 필요한 날에 다회 투여된다. 임상 조사자에 의해, 임상 활성 지표, 내시경 지표, 조직학적 지표 및 통합 유효성 평가를 기준으로 질환 활성을 모니터링한다. 상기 파라미터 중 하나 이상의 개선은 P2Y 작동제가 궤양성 대장염의 증상을 완화시킴을 시사한다.
실시예 6: 소장 및 원방 결장의 플루이드 흡수를 변화시키고, 설사 또는 변비와 연관된 증상을 완화시키기 위한 퓨리노셉터 작동제
변비 또는 설사를 겪는 인간 대상체를 하기와 같이 본 발명의 방법으로 치료한다. 설사 또는 변비 증상을 나타내는 환자에게 화합물의 경구 제제를 제공하며, 상기 제제는 소장 (변비용) 또는 대장 (설사용) 내로 치료학적 및 특이적 양의 활성 화합물을 방출시킬 수 있는 정제로서 제제화된다. 활성 화합물은 해당 조직에서 P2Y 수용체를 특이적으로 작동시키고, 소장에서의 플루이드 분비 및 대장에서의 플루이드 흡수를 촉진한다. 치료 후, 환자 설문지 및/또는 임상적 관찰에 의해 평가되는, 그램으로 측정되는 48 시간 대변 결과, 및 설사 또는 변비 기간을 결정한다. 양성 결과는, P2Y 작동제가 설사 및/또는 변비 치료에 유효함을 시사한다.
본 발명, 및 이를 제조하고 이용하는 방식 및 방법을, 이제 관련된 임의 당업자가 제조하고 이용할 수 있도록 완전하고 명확하며 정확하고 확실한 용어로 기재한다. 상기에는 본 발명의 바람직한 구현예가 기재되어 있고, 이들을 청구범위에 나타낸 본 발명의 요지 또는 범위에서 벗어나지 않으면서 변형시킬 수 있음이 이해되어야 한다. 본 발명에 관련된 요지물을 특히 지적하고 뚜렷이 청구하기 위해, 하기 청구범위로 본 명세서를 완결한다.

Claims (13)

  1. 포유류의 위장관에서 점액 또는 뮤신 분비, 중탄산 분비 또는 플루이드 수송을 조절하는 방법에 있어서, 하기를 포함하는 방법:
    퓨린성 P2Y 수용체 리간드를 함유하는 약학 조성물을 위장관에서 점액 또는 뮤신 분비, 중탄산 분비 또는 플루이드 수송을 조절하기 유효한 양으로 상기 포유류에 투여함.
  2. 위장관계의 점막 장벽 또는 중탄산 분비가 비정상이거나 관강관을 통한 플루이드 수송이 비정상인 위장 질환 또는 장애의 치료 방법에 있어서, 하기를 포함하는 방법:
    퓨린성 P2Y 수용체 리간드 화합물을 함유하는 약학 조성물을, 위장관계에서 점액 또는 뮤신 분비를 조절하거나 비정상적인 플루이드 수송을 교정하기 유효한 양으로 환자에 투여함.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 P2Y 수용체가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 방법: P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6, 및 P2Y11.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 퓨린성 수용체 작동제가 하기 화학식 Ia, IIa 및IIIa 의 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 디포스페이트인 방법:
    [화학식 Ia]
    (식 중:
    X1및 X2는 각각 독립적으로 O-또는 S-이며;
    Y 는 H 또는 OH 이고;
    R1은 O, 이미도, 메틸렌 및 디할로메틸렌 (예컨대 디클로로메틸렌, 디플루오로메틸렌) 으로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R2는 H, 할로, 알킬, 치환 알킬, 알콕실, 니트로 및 아지도로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R3은 H, 알킬, 아실 (아릴아실 포함) 및 아릴알킬로 구성된 군으로부터 선택되고; 및
    R4는 -OR', -SR', NR' 및 NR'R" (식 중, R' 및 R" 은 독립적으로 H, 알킬,치환 알킬, 아릴, 치환 아릴, 아릴알킬, 알콕실 및 아릴옥실로 구성된 군으로부터 선택되며, 단 R4가 피리미딘 고리의 제 4 위치의 탄소에 대해 산소 또는 황 원자로부터 이중 결합되는 경우 R' 은 없다) 으로 구성된 군으로부터 선택된다);
    [화학식 IIa]
    (식 중:
    R1, X1, X2및 Y 는 화학식 Ia 에 정의된 바와 같으며;
    Z 는 H, Cl 또는 SR 이고 (여기서, R 은 C1-C20포화 또는 불포화 알킬이다);
    R2가 없고, N-1 및 C-6 간에 이중 결합이 있을 때, R3및 R4는 H 이거나,
    R2가 O 이고, N-1 및 C-6 간에 이중 결합이 있을 때, R3및 R4는 H 이거나,
    R3, R4및 R2가 함께 취해져서, N-6 및 C-6 간 이중 결합을 갖는 N-6 부터 N-1 의 고리를 형성하는 -CH=CH- 이다);
    [화학식 IIIa]
    (식 중:
    R1, X1, X2및 Y 는 화학식 Ia 에 정의된 바와 같으며;
    R7이 없고, N-3 및 C-4 간에 이중 결합이 있을 때, R5및 R6은 H 이거나,
    R5, R6및 R7이 함께 취해져서, N-4 및 C-4 간 이중 결합을 갖는 N-3 내지 N-4 의 고리를 형성하는 -CH=CH- 이며, 에테노 고리의 제 4 또는 제 5 위치의 수소는 알킬, 치환 알킬, 알콕실, 니트로, 할로 또는 아지도로 임의 치환된다).
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 디포스페이트가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 방법: 5'-유리딘 디포스페이트, 5'-아데노신 디포스페이트 및 5'-시티딘 디포스페이트.
  6. 제 3 항에 있어서, 상기 퓨린성 수용체 작동제가 하기 화학식 Ib, IIb 및IIIb 의 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 트리포스페이트인 방법:
    [화학식 Ib]
    (식 중:
    X1, X2및 X3은 각각 독립적으로 O-또는 S-이며;
    Y 는 H 또는 OH 이고;
    R1은 O, 이미도, 메틸렌 및 디할로메틸렌이고;
    R2는 H 또는 Br 이고;
    R3은 무(無), H, 알킬, 아실 및 아릴알킬로 구성된 군으로부터 선택되고; 및
    R4는 -OR', -SR', NR' 및 NR'R" (식 중, R' 및 R" 은 독립적으로 H, 알킬, 치환 알킬, 아릴, 치환 아릴, 아릴알킬, 알콕실 및 아릴옥실로 구성된 군으로부터 선택되며, 단 R4가 피리미딘 고리의 제 4 위치의 탄소에 대해 산소 또는 황 원자로부터 이중 결합되는 경우 R' 은 없다) 으로 구성된 군으로부터 선택된다);
    [화학식 IIb]
    (식 중:
    R1, X1, X2, X3및 Y 는 화학식 Ib 에 정의된 바와 같으며;
    Z 는 H, Cl 또는 SR 이고 (여기서, R 은 C1-C20포화 또는 불포화 알킬이다);
    R2가 없고, N-1 및 C-6 간에 이중 결합이 있을 때, R3및 R4는 H 이거나,
    R2가 O 이고, N-1 및 C-6 간에 이중 결합이 있을 때, R3및 R4는 H 이거나,
    R3, R4및 R2가 함께 취해져서, N-6 및 C-6 간 이중 결합을 갖는 N-6 부터 N-1 의 고리를 형성하는 -CH=CH- 이다);
    [화학식 IIIb]
    (식 중:
    R1, X1, X2,X3및 Y 는 화학식 Ib 에 정의된 바와 같으며;
    R7이 없고, N-3 및 C-4 간에 이중 결합이 있을 때, R5및 R6은 H 이거나,
    R5, R6및 R7이 함께 취해져서, N-4 및 C-4 간 이중 결합을 갖는 N-3 부터 N-4 의 고리를 형성하는 -CH=CH- 이며, 에테노 고리의 제 4 또는 제 5 위치의 수소는 알킬, 치환 알킬, 알콕실, 니트로, 할로 및 아지도로 임의 치환된다).
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 트리포스페이트가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 방법: 5'-유리딘 트리포스페이트, 5'-아데닌 트리포스페이트 및 5'-시티딘 트리포스페이트.
  8. 제 2 항에 있어서, 상기 퓨린성 수용체 작동제가 하기 화학식 IV 의 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 디뉴클레오티드 폴리포스페이트인 방법:
    [화학식 IV]
    (식 중:
    X 는 산소, 메틸렌, 디플루오로메틸렌 또는 이미도이며;
    n = 0, 1 또는 2 이고;
    m = 0, 1 또는 2 이고;
    n + m = 0, 1, 2, 3 또는 4 이고;
    Z = OH 또는 H 이고;
    Z' = OH 또는 H 이고;
    Y = H 또는 OH 이고;
    Y' = H 또는 OH 이고;
    당은 D-입체배치로 묘사되었지만 L-, 또는 D- 및 L- 일 수 있고, D-입체배치가 바람직하고;
    뉴클레오시드 잔기는 알파- 또는 베타- 및 D- 또는 L-입체배치이지만, 베타-D-입체배치가 가장 바람직하고;
    B 및 B' 은 각각 제 9 또는 제 1 위치를 통해 연결된, 각각 독립적으로 하기화학식 V 및 VI 에 각각 정의된 바와 같은 퓨린 잔기 또는 피리미딘 잔기이다;
    [화학식 V]
    (식 중:
    R1은 수소, 염소, 아미노, 모노치환 아미노, 디치환 아미노, 알킬티오, 아릴티오 또는 아랄킬티오이며 (여기서, 황의 치환기는 포화 또는 불포화의 20 개 이하 탄소수를 포함한다);
    R2는 히드록시, 아미노, 메르캅토, 알킬티오, 아릴티오, 아랄킬티오, 아실티오, 알킬옥시, 아릴옥시, 아랄킬옥시, 아실옥시, 모노치환 알킬아미노, 헤테로시클릭, 모노치환 시클로알킬아미노, 모노치환 아랄킬아미노, 모노치환 아릴아미노, 디아랄킬아미노, 디아릴아미노, 디알킬아미노 (여기서, 알킬기는 N7에 임의 결합하여 치환 고리를 형성한다), 아실아미노, 디아실아미노 또는 NHRγ이고;
    RX는 아데닌-1-옥시드 유도체에서와 같이 O 이거나, 아데닌 유도체에서와 같이 없고;
    단, R2가 NHRγ인 경우, Rγ및 RX는 함께 취해져서, 에테노 부분의 제 4 또는 제 5 위치가 하기에 정의된 바와 같은 알킬, 아릴 또는 아랄킬 부분으로 임의 치환된, 1,N6-에테노아데닌 유도체에서와 같은 5-원 융합 이미다졸 고리를 형성할 수 있고;
    R3은 하기에 정의된 바와 같은 수소, 아지도, 알콕시, 아릴옥시, 아랄킬옥시, 알킬티오, 아릴티오 또는 아랄킬티오이거나; ω-A(C1-6알킬)OCONH(C1-6알킬)B- 이거나 (여기서, A 및 B 는 독립적으로 아미노, 메르캅토, 히드록시 또는 카르복실이다); 이들의 약학적으로 허용가능한 에스테르, 아미드 또는 염이거나; 없고;
    여기서, 아데닌의 치환 유도체에는 아데닌 1-옥시드; 1,N6-(4- 또는 5-치환 에테노)아데닌; 6-치환 아데닌; 또는 8-치환 아미노아데닌이 포함되고 (여기서, 6- 또는 8-HNR' 기의 R' 은 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 하기 기재된 바와 같이 임의 관능화된 아릴 부분을 갖는 아릴알킬(C1-6)기; 알킬; 및 ([6-아미노헥실]카르바모일메틸)- 및 ω-아실화-아미노(히드록시, 티올 및 카르복시)알킬(C2-10)- 에서와 같이, 내부에 관능기를 갖는 알킬기, 및 아실기가 이에 제한되지는 않지만 아세틸, 트리플루오로아세틸, 벤조일, 치환 벤조일로부터 선택되거나, 예컨대 에틸 또는 메틸 에스테르 또는 그의 메틸, 에틸 또는 벤즈아미도 유도체와 같이, 카르복실 부분이 그 에스테르 또는 아미드 유도체로서 존재하는 이들의 ω-아실화-아미노(히드록시, 티올 및 카르복시)유도체), ω-아미노(히드록시,티올) 부분은 C1-4알킬기로 알킬화될 수 있고).
    J 는 탄소 또는 질소이며, 단 J 가 질소인 경우 R3은 없고;
    여기서, 알킬은 선형, 분지형 또는 고리형이고;
    여기서, 아릴기는 저급 알킬, 아미노, 알킬아미노, NO2, N3, 카르복실릭, 아미도, 술폰아미도 또는 할로기로 임의 치환되고; 및
    B 및 B' 은 또한 리보실 잔기에 제 1 위치를 통해 연결되는, 하기 화학식 VI 의 피리미딘일 수 있다;
    [화학식 VI]
    (식 중:
    R4는 수소, 히드록시, 옥소, 메르캅토, 아미노, 시아노, C7-12아릴알콕시, C1-6알킬티오, C1-6알콕시, C1-6알킬아미노 또는 디C1-4알킬아미노이며 (여기서, 알킬기는 임의 연결되어 헤테로사이클을 형성한다);
    R5는 수소, 옥소, 아세틸, 벤조일, C1-6알킬, C1-5알카노일 또는 아로일이고;
    R6은 히드록시, 옥소, 메르캅토, C1-4알콕시, C7-12아릴알콕시, C1-6알킬티오, 아미노, S-페닐, C1-5디치환 아미노, 트리아졸릴, C1-6알킬아미노 또는 디C1-4알킬아미노이거나 (여기서, 상기 디알킬기는 임의로 연결되어 헤테로사이클을 형성하거나 N3로 연결되어 치환고리를 형성한다);
    R5및 R6은 함께 취해져서 피리미딘 고리의 제 3 및 제 4 위치 사이에 5-원 융합 이미다졸 고리를 형성하고 3,N4-에테노시토신 유도체를 형성하고 (여기서, 상기 에테노 부분은 제 4 또는 제 5 위치 상에서 C1-4알킬, 페닐 또는 페닐옥시로 임의 치환된다 (여기서, 상기 C1-4알킬, 페닐 또는 페닐옥시의 하나 이상의 수소는 할로겐, 히드록시, C1-4알콕시, C1-4알킬, C6-10아릴, C7-12아릴알킬, 카르복시, 시아노, 니트로, 술폰아미도, 술포네이트, 포스페이트, 술폰산, 아미노, C1-4알킬아미노 및 디C1-4알킬아미노로 구성된 군으로부터 선택되는 부분으로 임의 치환된다 (여기서, 상기 디알킬기는 임의 연결되어 헤테로사이클을 형성한다)));
    R7은 수소, 히드록시, 시아노, 니트로 및 C2-8알케닐로 구성된 군으로부터 선택되거나 (여기서, 상기 알케닐 부분은 산소를 통해 임의 연결되어 고리를 형성한다 (여기서, 상기 산소에 인접한 탄소 상의 상기 알케닐 부분의 하나 이상의 수소는 C1-6알킬 또는 페닐; 치환 C2-8알키닐, 할로겐, 치환 C1-4알킬, CF3, C2-3알케닐,C2-3알키닐, 알릴아미노, 브로모비닐, 에틸 프로페노에이트 또는 프로펜산으로 구성된 군으로부터 선택되는 치환기로 임의 치환된다));
    R6및 R7이 함께 R6에서 N 또는 O 또는 S 를 통해 결합된 5 또는 6-원 포화 또는 불포화 고리를 형성하고, 상기 고리는 자체가 관능성을 갖는 치환기를 임의로 포함하며; 단, R8이 아미노 또는 치환 아미노일 때 R7은 수소이고;
    R8은 수소, 아미노 또는 디-C1-4알킬아미노, C1-4알콕시, C7-12아릴알콕시, C1-4알킬티오, C7-12아릴알킬티오, 카르복스아미도메틸, 카르복시메틸, 메톡시, 메틸티오, 페녹시 및 페닐티오로 구성된 군으로부터 선택된다))).
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 디뉴클레오티드 폴리포스페이트가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 방법: U2P4, dUP4U, U2P3, U2P5, dCP4U, CP4U, IP5I, AP4A, CP3U, UP3A 및 A2P3.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 투여가 상기 화합물의 치료적 유효량이 상기 포유류의 상기 위장관계 조직과 접촉하도록 하는 상기 약학 조성물의 경구형 투여인 방법.
  11. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 투여가 상기 화합물의 치료적 유효량이 전신 흡수 및 순환에 의해 상기 위장관계 조직과 접촉하도록 하는 주사형의 상기 약학 조성물의 주사인 방법.
  12. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 투여가 상기 화합물의 치료적 유효량이 전신 흡수 및 순환에 의해 상기 위장관계 조직과 접촉하도록 하는 상기 약학 조성물의 좌약형을 투여하여 수행되는 방법.
  13. 제 2 항에 있어서, 상기 위장 장애가 위식도 역류성 질환 (GERD) 인 방법.
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